專利名稱：組合了黏性補充劑和成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基的關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用的可注射組合物的制作方法
組合了黏性補充劑和成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基的關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用的可注射組合物本發(fā)明涉及關(guān)節(jié)內(nèi)注射溶液的開發(fā)以供治療關(guān)節(jié)退化，尤其是骨關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明提出將黏性補充劑，例如透明質(zhì)酸或其一種鹽和組成明確的成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基以及可能的另一種多糖(優(yōu)選天然來源的)組合起來。
現(xiàn)有技術(shù)在一些四肢關(guān)節(jié)中，關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)的相對骨末端封閉在內(nèi)襯有結(jié)締組織的囊內(nèi)，稱為滑膜?；菏翘畛潢P(guān)節(jié)腔的黏性液體；它由滑膜的成纖維細(xì)胞(滑膜細(xì)胞)分泌的透明質(zhì)酸(HA)與血漿中濾出的組織間隙液組成。由于軟骨中沒有血管，滑液的功能是通過潤滑關(guān)節(jié)以減少摩擦，吸收沖擊，給關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細(xì)胞提供氧和養(yǎng)分，和從后者中消除二氧化碳和代謝廢物。骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的多病因退行性關(guān)節(jié)疾病，涉及關(guān)節(jié)軟骨的物質(zhì)喪失。隨著病情發(fā)展，觀察到滑液中HA的濃度和分子量降低。這種現(xiàn)象解釋為通過透明質(zhì)酸的內(nèi)源性合成減少和廣生自由基的炎癥，該自由基造成氧化退化。這些變化導(dǎo)致HA粘彈特性降低，漸漸導(dǎo)致其保護(hù)關(guān)節(jié)的基本功能喪失。它們可導(dǎo)致軟骨侵蝕，關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在軟骨或骨碎片，疼痛和僵硬。黏性補充是一種良好建立的理論，包括將HA注射入關(guān)鍵以便幫助其更好地潤滑關(guān)節(jié)、提高流動性和減少疼痛。根據(jù)骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，例如，每周連續(xù)3-5次注射入膝蓋，對于大多數(shù)病人在6個月到I年內(nèi)是有效的。這種治療相當(dāng)有用，尤其是對不能忍受、或?qū)χT如抗炎藥和口服鎮(zhèn)痛藥之類的常規(guī)治療方法不再有反應(yīng)，但其疾病還不適合假肢治療的病人。直到現(xiàn)在，對黏性補充溶液的改進(jìn)涉及延長HA的停留時間以便提高HA功效。化學(xué)修飾HA、交聯(lián) HA (W0 2007/070547)或?qū)?HA 與多元醇組合(W02009/024670)的方法已見諸描述以便減緩HA凝膠的體內(nèi)機(jī)械或熱降解或其被自由基降解。然而，無論是否被修飾，HA黏性補充產(chǎn)品的半衰期只有幾天，其關(guān)節(jié)內(nèi)存留仍然遠(yuǎn)短于它們的治療功效期，事實上，所述治療功效期取決于多個累積的作用-對于軟骨的沖擊是直接的震動吸收器的角色；-捕獲關(guān)節(jié)內(nèi)碎片的性能，從而減少其摩擦作用；-抵御炎癥細(xì)胞和它們所分泌的酶的保護(hù)作用；和-對痛感受體的可能的直接作用。因此，本領(lǐng)域急需開發(fā)用于治療關(guān)節(jié)退化，尤其是骨關(guān)節(jié)炎的新治療溶液。發(fā)明描述 考慮到該情況，申請人采取了一種全新的方法。本發(fā)明預(yù)計應(yīng)在兩個不同的水平上起作用，以重建良好的關(guān)節(jié)功能，尤其是治療關(guān)節(jié)退化，特別是骨關(guān)節(jié)炎。因此，本發(fā)明涉及組合了黏性補充劑和成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基的注射組成物，以使關(guān)節(jié)結(jié)締組織的細(xì)胞組分，特別是滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞恢復(fù)活力，從而保證它們的細(xì)胞再生和刺激它們(透明質(zhì)酸和GAG，關(guān)節(jié)的基本功能成分)的內(nèi)源性合成。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明的關(guān)節(jié)內(nèi)可注射組合物中可能起到黏性補充劑作用的組分選自透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、角質(zhì)素、硫酸角質(zhì)素、肝素、纖維素及其衍生物、殼聚糖、黃原膠、半乳甘露聚糖、海藻酸鹽和它們各自的鹽。實際上，這種關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用中常用的黏性補充劑是透明質(zhì)酸或其鹽的一種。由于這個原因，在一具體的實施方式中，目標(biāo)組合物僅包含透明質(zhì)酸或其鹽的一種作為黏性補充齊U，與成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基組合。 另一實施方式會在設(shè)想的組合物中采用透明質(zhì)酸或其鹽的一種作為主要的黏性補充劑，組合至少一種其它的多糖，優(yōu)選天然來源的以保證其生物相容性、非致免疫的特性。所述的其它多糖優(yōu)選聚硫酸化的粘多糖-特別是硫酸軟骨素、角質(zhì)素、硫酸角質(zhì)素、或甚至是肝素、纖維素及其衍生物、殼聚糖、黃原膠、半乳甘露聚糖、海藻酸鹽和它們各自的鹽。該組合物還包含成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基，和可能的其它成分。事實上，本發(fā)明因此包括將潤滑和保護(hù)關(guān)節(jié)的機(jī)械作用與促進(jìn)滑膜和關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)細(xì)胞合成的成纖維細(xì)胞刺激的營養(yǎng)作用組合起來。第一種作用是由黏性補充劑確保，優(yōu)選透明質(zhì)酸-交聯(lián)的或未交聯(lián)的，或其鹽的一種，-可能與一種或多種其它的天然來源多糖組合。第二種作用由如下定義的成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基提供。眾所周知，本發(fā)明所用的透明質(zhì)酸可以不同形式存在作為鹽，如酯類或酰胺之類的衍生物，和線性或化學(xué)交聯(lián)的形式。所有這些形式在本發(fā)明設(shè)想之內(nèi)。雖然交聯(lián)提高透明質(zhì)酸分子在生物體內(nèi)的壽命，但這些修飾影響其物理/化學(xué)特性，生物性質(zhì)和潛在的免疫原性。如透明質(zhì)酸所述，一種多糖或多種多糖(優(yōu)選天然來源的)可以采用現(xiàn)有技術(shù)所述的交聯(lián)和嫁接技術(shù)作成交聯(lián)的或未交聯(lián)的，嫁接的或未嫁接的。由于關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)需要盡可能中性的技術(shù)方案，即，仿生的技術(shù)方案，優(yōu)選未交聯(lián)的透明質(zhì)酸及其生理上可接受的鹽作為第一組分，因該分子為滑膜液的天然組分。我們利用透明質(zhì)酸的生理上可接受的鹽特別指代鈉鹽和鉀鹽，以及它們的混合物。組合物中，黏性補充劑，優(yōu)選透明質(zhì)酸的存在濃度優(yōu)選為I至100mg/ml，更優(yōu)選10至 25mg/ml。本發(fā)明組合物中的第二基本成分是成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基。對于本發(fā)明，成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基定義為完全培養(yǎng)基，不僅保持成纖維細(xì)胞活性，而且刺激其擴(kuò)增和細(xì)胞內(nèi)合成(胞外基質(zhì)和滑液的諸組分)。進(jìn)行功能性生長試驗可確定給出的培養(yǎng)基是否是本發(fā)明的成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適功能試驗是利用試劑WST-I并在450nm讀取結(jié)果的比色觀察活細(xì)胞的密度。(Berridge，M.V.等.(1996): “利用四唑鎗鹽的細(xì)胞增殖試驗的生物化學(xué)和細(xì)胞基礎(chǔ)” (The Biochemical and Cellular Basis of Cell Proliferation AssaysThat Use Tetrazolium Salts). Biochemica 4,15-19.)例如，成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基是市售可得的S卩，西格瑪公司(Sigma)的DMEM標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，其補充有10重量％的FCS(胎牛血清)細(xì)胞生長因子?？偟膩碚f，此類培養(yǎng)基包含動物或細(xì)胞來源的提取物，它們確實刺激成纖維細(xì)胞、的生長，但其缺點在于缺乏確定的組成或包含諸如FCS、牛腦垂體提取物，細(xì)胞生長因子EGF(表皮生長因子)、FGF(成纖維細(xì)胞生長因子)、胰島素或霍亂毒素、皮質(zhì)醇、哌嗪等難以示蹤的外源性元素。本發(fā)明所用的成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基優(yōu)選不含有細(xì)胞生長因子或動物或細(xì)胞來源的生物提取物，尤其是如果它們未經(jīng)示蹤或不可示蹤的和/或不具有確定的組成。“未示蹤”或“不可示蹤的”表示所述生物材料的來源和/或隨后經(jīng)歷的處理不能確定或檢測。事實上，所述培養(yǎng)基優(yōu)選不包含動物或細(xì)胞來源的生物提取物，細(xì)胞化合物或生長因子或荷爾蒙。在優(yōu)選的實施方式中，通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射將與關(guān)節(jié)的天然環(huán)境最大程度相容的成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基，即，包含仿生的和/或生物相容組分的培養(yǎng)基(生物體中天然存在的或?qū)ζ渲行缘?、不引起過敏或免疫反應(yīng)的生物材料)引入關(guān)節(jié)。優(yōu)選，該培養(yǎng)基優(yōu)選包含結(jié)締組織的基本物質(zhì)的成分。這樣的培養(yǎng)基可為成纖維細(xì)胞特別提供維生素、微量元素、氨基酸、礦物鹽、單糖(如葡萄糖、核糖、脫氧核糖)和/或復(fù)合糖(如HA)形式的優(yōu)化營養(yǎng)物質(zhì)，和核酸成分(形成核苷酸和核苷所需的含氮堿基和戊糖)形式的天然生長因子。優(yōu)選地，它也會具有6. 5至7. 9的生理pH，較佳地為7. 4至7. 6，和280至450m0sm的克分子滲透壓濃度，較佳地為300至 350m0sm。應(yīng)該注意的是，HA既可以是生長培養(yǎng)基的組分，也可以是黏性補充劑。不同之處是HA的形式(培養(yǎng)基中必須是生理上的透明質(zhì)酸鹽)及其含量(培養(yǎng)基中含量低很多)。為了刺激成纖維細(xì)胞生長，這樣的培養(yǎng)基可補充某種物質(zhì),該物質(zhì)對于生物體是外源性的但是中性、可跟蹤來源的且組成明確。滿足該定義的物質(zhì)為，例如牛奶中提取的肽混合物，或通過先從牛奶中連續(xù)沉淀然后分離經(jīng)過酶水解的某些蛋白獲得的MPC復(fù)合物(牛奶肽復(fù)合物)。脫水粉末形式的該物質(zhì)優(yōu)選按0. 5至5mg/ml加至培養(yǎng)基，更優(yōu)選地按4至5mg/ml o例如，申請人已開發(fā)了滿足這樣定義的復(fù)合培養(yǎng)基，其具有了約60種精確定量的以下組分。
終濃度
化妝品成分的國際命名溶、液1 x
(INCI)__(mg/1)水__適量I升
氯化鈉__5000至8000
L-谷氨酰胺或__100至3000
權(quán)利要求
1.關(guān)節(jié)內(nèi)注射用的組合物，其包含 至少ー種以下所列類型的黏性補充劑 透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、角質(zhì)素、硫酸角質(zhì)素、肝素、纖維素及其衍生物、殼聚糖、黃原膠、半乳甘露聚糖、海藻酸鹽和它們各自的鹽；和 不含未經(jīng)示蹤和/或具有不定組成的任何細(xì)胞生長因子或任何動物或細(xì)胞來源的生物提取物的成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述組合物由以下組成 透明質(zhì)酸或其鹽的ー種作為黏性補充劑；以及 成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含 透明質(zhì)酸或其鹽的ー種作為黏性補充劑； 至少ー種其它多糖，優(yōu)選天然來源的，更優(yōu)選選自下組硫酸軟骨素、角質(zhì)素、硫酸角質(zhì)素、肝素、纖維素及其衍生物、殼聚糖、黃原膠、半乳甘露聚糖、海藻酸鹽和它們各自的鹽；和成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述組合物由以下組成 透明質(zhì)酸或其鹽的ー種作為黏性補充劑； 至少ー種其它多糖，優(yōu)選天然來源的，更優(yōu)選選自下組硫酸軟骨素、角質(zhì)素、硫酸角質(zhì)素、肝素、纖維素及其衍生物、殼聚糖、黃原膠、半乳甘露聚糖、海藻酸鹽和它們各自的鹽；和成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基。
5.如以上權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物為凝膠的形式，優(yōu)選滅菌水凝膠。
6.如以上權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，所述黏性補充劑，優(yōu)選透明質(zhì)酸，在所述組合物中的存在濃度是I至100mg/ml,優(yōu)選10至25mg/ml。
7.如以上權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其特征在干，所述成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基由結(jié)締組織的基本物質(zhì)的成分組成，優(yōu)選富集了牛奶肽(MPC)的混合物。
8.如以上權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其特征在干，所述成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基包含 核酸的成分， 氨基酸， 單糖和復(fù)合糖， 維生素， 和包含微量元素及礦物鹽的無機(jī)部分。
9.注射器形式的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-8中任一項所述的組合物。
10.醫(yī)學(xué)裝置，其包含權(quán)利要求1-8中任一項所述的組合物。
11.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的組合物或如權(quán)利要求9所述的試劑盒或如權(quán)利要求10所述的醫(yī)學(xué)裝置，用于治療關(guān)節(jié)退化，尤其是骨關(guān)節(jié)炎。
12.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的組合物的用途，用于制備意欲治療關(guān)節(jié)退化，尤其是骨關(guān)節(jié)炎的醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。
13.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的組合物作為同時、分別或在整個時期使用的組合產(chǎn)品，用于治療關(guān) 節(jié)退化、尤其是骨關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
關(guān)節(jié)內(nèi)注射用的組合物，其包含至少一種選自下組的黏性補充劑透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、角質(zhì)素、硫酸角質(zhì)素、肝素、纖維素及其衍生物、殼聚糖、黃原膠、半乳甘露聚糖、海藻酸鹽和它們各自的鹽；和成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基。
文檔編號A61K8/73GK102630157SQ201080054035
公開日2012年8月8日 申請日期2010年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者H·加托, J-N·托雷爾 申請人:J-N·托雷爾