專利名稱：用于檢測生物膜在培養(yǎng)基中形成與生長的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測培養(yǎng)基粘度(粘滯性)的領(lǐng)域。
更具體地，本發(fā)明涉及生物膜(biofilm)在均質(zhì)或非均質(zhì)培養(yǎng)基中生長的研究領(lǐng)域。當(dāng)該生物膜生長時(shí)，其阻礙可在磁場、電場或電磁場中移動(dòng)的顆粒的運(yùn)動(dòng)，例如帶電顆粒(由于正和/或負(fù)離子的存在而造成)或者磁性或可磁化顆粒或者覆蓋磁性層或可磁化層的顆粒。
背景技術(shù)：
在這方面，在本文中，術(shù)語“粘度”的含義應(yīng)該理解為與可磁化顆粒在生物膜中的自由度相關(guān)。在閱讀了本文后，我們理解，本發(fā)明的目的并非如我們原本理解的該術(shù)語“粘度”的一般含義來測量培養(yǎng)基的粘度，而是通過測量一種(或多種)可磁化顆粒的自由度來證明微生物的生長(développement)，該顆粒的運(yùn)動(dòng)受或不受生物膜阻礙，該生物膜本身對生長中的微生物的存在與否是非常重要的。
同樣，術(shù)語“培養(yǎng)基”的含義應(yīng)該理解為至少一種微生物能夠存在并生長的任何介質(zhì)，因此可以為天然的或者合成的介質(zhì)。由此，例如水包括在該定義中。接下來，在本文中，通過參考該定義，術(shù)語“培養(yǎng)基”或者“介質(zhì)”或“培養(yǎng)介質(zhì)”可以無差別地使用。
由此，根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“培養(yǎng)基”，“介質(zhì)”或“培養(yǎng)介質(zhì)”可以理解為一種微生物及其存在的介質(zhì)，或者可能僅指介質(zhì)。
微生物是微觀的活體，例如細(xì)菌，酵母，真菌，藻類，原生生物。微生物可以是單細(xì)胞的或者多細(xì)胞的。多細(xì)胞微生物(后生動(dòng)物)的幼體階段也可以作為生物膜的來源。
迄今為止，大多數(shù)微生物(病原體或者非病原體)已經(jīng)以在介質(zhì)中游離的或者分離的(懸浮培養(yǎng)的或者選擇培養(yǎng)基上的)“浮游生物(planctonique)”的形式進(jìn)行了研究。然而，在實(shí)驗(yàn)室外的自然環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌群固定在載體上(“固著”狀態(tài))并且在稱為“ 生物膜”的有序共同體中生長。這種細(xì)菌共同體通常包含在胞外多糖基質(zhì)(matrice d’exopolysaccharide)中，該基質(zhì)限制了其與周圍介質(zhì)的交換(A.Filloux，I.Vallet.Biofilm“Mise en place etorganization d’une communauté bactérienne”.Médecine/Sciences 2003；1977-83)。
生物膜生長時(shí)，細(xì)菌首先附著到載體上然后在該載體上定植(colonisation)。繁殖的細(xì)菌快速形成由細(xì)胞體層構(gòu)成的膜，該細(xì)胞體層分泌一層起保護(hù)作用免受周圍介質(zhì)侵襲的胞外多糖外鞘(gangue d’exopolysaccharides)(Costerton et al.Bacterial Biofilm.Sciences 1999；284-6)。生物膜形成的動(dòng)力學(xué)可以分成5個(gè)步驟-表面的調(diào)節(jié)存在于液相中的有機(jī)或礦物分子被吸附在表面上，從而形成“調(diào)節(jié)膜(film conditionnant)”。
-黏附或可逆附著存在的微生物通過重力作用、布朗運(yùn)動(dòng)或者通過趨化性(如果具有鞭毛)而靠近表面。在該連接(或固定)的第一步驟，僅僅涉及純粹的物理現(xiàn)象以及發(fā)生微弱的物理化學(xué)相互作用，微生物仍能很容易地脫離出來。
-附著這個(gè)更慢的步驟涉及與更強(qiáng)能量的相互作用以及微生物代謝和微生物的細(xì)胞附屬物(鞭毛、纖毛，...)。附著是一個(gè)活躍且特異的現(xiàn)象。特別是由于胞外多糖的合成，第一批移生菌(colonisateurs)將不可逆地連接到表面上。這個(gè)過程相對緩慢，并依賴于環(huán)境因素和所存在的微生物。
生物膜的成熟(生長和表面掛膜)附著到表面之后，細(xì)菌繁殖并且重新集聚以形成被聚合物圍繞的微菌落。該聚合物基質(zhì)(或糖萼)將起如同膠合劑的作用，并加強(qiáng)細(xì)菌彼此間的聯(lián)系以及與表面的聯(lián)系以最終形成生物膜，并達(dá)到平衡狀態(tài)。該生物膜通常以構(gòu)成限制點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)生長。該微環(huán)境將是浮游生物生長方式相關(guān)的多種生理修飾和分子修飾的場所。如果條件允許，以這種方式形成的生物膜將占據(jù)提供給它的所有表面。盡管某些種類的微生物不合成EPS或者只有很少的聚合物同樣能夠在表面上附著并形成生物膜，生物膜的成熟一般均與EPS的生成相關(guān)。
脫落生物膜是永久動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)構(gòu)并作為載體、微生物和環(huán)境的函數(shù)而變化。前述變化可以表示為細(xì)胞或者聚集體的脫落。
作為其他表面污染的結(jié)果，細(xì)胞這樣釋放到液體基質(zhì)中是可實(shí)現(xiàn)的，通常是醫(yī)療環(huán)境中多種復(fù)發(fā)性疾病(耐藥性的起源)的起因。
生物膜的本質(zhì)有很大差異，一些富含胞外多糖(EPS)，其他的主要由細(xì)菌體構(gòu)成。
在人類健康中，生物膜引起了越來越難以抑制的感染在整個(gè)ORL球體中(聽覺通道，鼻膜，眼結(jié)膜，...)，在牙齒上(牙垢的出現(xiàn)，牙蛀蝕，...)，在支氣管上，肺上(遭受囊性纖維變性的病人，...)，在尿道系統(tǒng)中(...)。
另外，生物膜通過在導(dǎo)管或者植入物(心瓣膜，人工髖部，尿道探針)上形成，成為大多數(shù)醫(yī)院內(nèi)病理(pathologies nosocomiales)的根源(每年死亡人數(shù)超過10,000)(J.W.Costerton，P.Stewart andE.P.Greenberg，Bacterial Biofilms“A common cause of persistentinfections”，Science，vol.284，PP.1318-1322)。
生物膜還存在于冷卻塔中，從而引起軍團(tuán)病菌傳染。
它們同樣影響農(nóng)產(chǎn)品工業(yè)，因?yàn)樗鼈儬可媸称分卸?當(dāng)冷鏈打斷時(shí)形成，在切割工具、研磨工具上和操作表面上生長)。
同樣，生物膜可在管子上形成，尤其導(dǎo)致腐蝕現(xiàn)象。
生物膜也在浸沒物體例如船體的表面形成，引起“結(jié)垢(fouling)”問題(由于船體上聚集各種微生物使船體表面變臟)。
應(yīng)該指出，并非只有細(xì)菌產(chǎn)生生物膜真菌、藻類和原生動(dòng)物也可以組織成生物膜。
因此，生物膜在很多地方是無處不在的，表現(xiàn)出健康危害性并引起相對顯著的損害。
然而，由于生物膜研究的復(fù)雜性，雖然實(shí)現(xiàn)了多種研究生物膜生長的方法，但是對生物膜的生長和行為仍知之甚少。
生物膜的研究方法仍主要基于在干燥箱(或恒溫箱)中振搖時(shí)，浸沒于小瓶(或燒瓶)內(nèi)培養(yǎng)基中的玻璃片或者塑料片的掛膜，以便接下來用結(jié)晶紫染色或者在顯微鏡下進(jìn)行觀察。
存在其他更加復(fù)雜的檢測方法，例如通過石英晶體的微量天平(Q-CMD，分散監(jiān)測的石英晶體微量天平)來檢測，通過MTA(質(zhì)量傳遞分析)、UFDR(超聲波頻率域反射計(jì))、原位PCR(在功能基因Amo A上)、FISH(熒光原位雜交)、CLSM(共聚焦激光掃描顯微鏡)、PAS(光聲光譜法)...來檢測。
還有其他一些方法采用覆蓋有植物凝血素或者抗體的磁性顆粒/磁珠，以分離引起生物膜形成的細(xì)菌，以便接下來能夠通過免疫分析或者分子生物學(xué)的經(jīng)典方法(雜交或者PCR)表征微生物。
然而，已經(jīng)證明這些方法難于實(shí)施并且相對繁瑣。另外，它們無法給出關(guān)于細(xì)菌行為的充分的探索性教導(dǎo)，因此無法給出關(guān)于生物膜形成與生長的充分的探索性教導(dǎo)。事實(shí)上，這些方法無法實(shí)現(xiàn)生物膜生長的追蹤，無論它是簡單地由細(xì)胞體(李斯特氏桿菌類型)或者EPS(胞外多糖)構(gòu)成還是由定植的微生物(假單胞菌型)分泌的類似基質(zhì)構(gòu)成。
本發(fā)明涉及可以檢測均質(zhì)或非均質(zhì)、渾濁的和/或不透明的培養(yǎng)基粘度發(fā)展(或變化)的方法和裝置以及該方法和/或該裝置在具體應(yīng)用中的使用。
術(shù)語“非均質(zhì)的培養(yǎng)基”在本申請中應(yīng)該理解為其最廣的意思。具體而言，非均質(zhì)的培養(yǎng)基可以包括在其中微生物懸浮生長的清澈培養(yǎng)基。
從現(xiàn)有技術(shù)，法國專利申請F(tuán)R2555316已為人們所熟知。該專利申請涉及用于確定流體介質(zhì)粘度的方法和裝置，該方法包括將傳導(dǎo)珠浸沒在流體介質(zhì)中，施加給小珠一個(gè)基本上以其為中心的旋轉(zhuǎn)磁場，使得與旋轉(zhuǎn)的小珠接觸的流體的流動(dòng)保持薄片狀，以及確定與由于流體介質(zhì)的粘度而施加到小珠上的力偶相關(guān)的大小。因此，投入粘滯介質(zhì)的小珠承受與粘度成比例的制動(dòng)減速力矩，并呈現(xiàn)速度恒定的旋轉(zhuǎn)，該旋轉(zhuǎn)持續(xù)的時(shí)間也與待分析介質(zhì)的粘度成比例。借助于沿著其旋轉(zhuǎn)軸的激光束照亮小珠而獲得的衍射盤(tchesde diffraction)來使小珠的旋轉(zhuǎn)可視化。
但是，這樣的方法僅僅適合在均質(zhì)粘滯介質(zhì)中實(shí)施。然而，細(xì)菌培養(yǎng)基是乳白、渾濁而不透明的。因此，該方法不能夠確定生物膜在培養(yǎng)基中形成與否。
在日本專利申請JP61161436的摘要中也提供了基于磁吸引原理用于測量非牛頓流體粘度的一種方法。該方法包括通過測定磁棒在磁場作用下的位移和位移速度來測量粘度。
在日本(專利申請)摘要中提供的方法可以確定與粘滯流體相關(guān)的特征例如粘度。但是，其中提及的方法無論用任何方式都不能夠再現(xiàn)微生物的行為例如細(xì)菌在粘滯流體中的生長。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠模擬生物膜在非均質(zhì)、渾濁和不透明的介質(zhì)(對應(yīng)于微生物在其中生長以形成這樣的生物膜的培養(yǎng)基)中生長的方法和裝置。
本發(fā)明的另一目的在于可以模擬微生物在表面定植的過程。
本發(fā)明的又一目的在于允許證明在非均質(zhì)介質(zhì)中粘度的不同，從而允許根據(jù)生物膜在每一區(qū)域的生長，模擬不同區(qū)域的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的目的還在于提供一種實(shí)施簡單、不很繁瑣并且能夠自動(dòng)化檢測生物膜生長的方法和裝置。
為此，本發(fā)明屬于上述類型，并且在其最廣泛的意義上是值得注意的。
由此，本發(fā)明的目的在于一種能夠測量微生物5的培養(yǎng)基粘度的方法，依次包括以下步驟a)將至少一種帶電、磁性的或可磁化顆粒或者覆蓋至少一層磁性層或可磁化層的顆粒浸沒在前述的培養(yǎng)介質(zhì)中，b)將前述的培養(yǎng)介質(zhì)置于電場、磁場或電磁場中，優(yōu)選磁場，以便使顆粒運(yùn)動(dòng)，c)光學(xué)檢測前述顆粒在前述培養(yǎng)介質(zhì)中運(yùn)動(dòng)的自由度，優(yōu)選通過光學(xué)測量，前述方法不使用掃描顯微鏡。
步驟b)包括將前述培養(yǎng)介質(zhì)置于電場或磁場或電磁場中，可選地通過脈沖施加，或者置于逐漸增加的電磁場或變化更加復(fù)雜的電磁場或不同場的組合中。
根據(jù)本發(fā)明的特殊結(jié)構(gòu)，通過沿直線或者正弦曲線的軌跡接近磁體或者根據(jù)具有或者不具有可變振蕩幅度和可變頻率的振蕩運(yùn)動(dòng)，獲得電磁場的逐漸增強(qiáng)。電磁場更復(fù)雜的變化通過前述培養(yǎng)介質(zhì)附近磁棒的旋轉(zhuǎn)或不同運(yùn)動(dòng)的組合來獲得。
電場、磁場或電磁場有利地由產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)的場的裝置來產(chǎn)生。
有利地，該培養(yǎng)介質(zhì)以恒流(flux constant)或者在給定時(shí)間間隔以不連續(xù)流流過開放的反應(yīng)器。而后者的構(gòu)造優(yōu)選在其可以具有與生物膜生長的自然條件相適合的范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，其中涉及的顆粒可以是帶電顆粒，或者磁性顆粒，或者覆蓋至少一層磁性層的顆粒，或者可磁化顆?；蚋采w一層可磁化層的顆粒。
有利地，前述磁性顆?？梢跃哂信c產(chǎn)生生物膜的微生物的大小基本上一致的大小。
同樣有利地，可以使用不同大小和/或(同樣有利地)不同顏色的顆粒。在生物膜生長過程中，較小顆粒在較大顆粒之前固定。因此可以更精確地將生物膜的生長或其降解特征化。
同樣，根據(jù)本發(fā)明的有利構(gòu)造，前述顆粒產(chǎn)生前述光學(xué)檢測運(yùn)動(dòng)的設(shè)備可檢測到的信號。前述信號可以以自動(dòng)的方式(有利地通過放射)檢測，或者通過以連續(xù)或不連續(xù)流傳輸?shù)哪芰康脑侔l(fā)射(有利地通過激光束的光能傳輸和熒光再發(fā)射)來檢測。
有利地，前述顆粒是熒光型、磷光型、放射性或者化學(xué)發(fā)光型。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方式，步驟c)包括用光源照亮該顆粒以及檢測前述顆粒在前述培養(yǎng)介質(zhì)中的運(yùn)動(dòng)。
為此，有利地，前述顆粒可以是熒光的。
根據(jù)優(yōu)選的構(gòu)造，前述顆粒3構(gòu)造成使得其在該反應(yīng)器1中靜止(無場)時(shí)處于穩(wěn)定狀態(tài)。有利地，該顆粒可以是例如冰球形狀、平面不對稱的幾何形狀，(...)的顆粒。
另外，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，前述方法還包括在對應(yīng)于給前述培養(yǎng)介質(zhì)接種的時(shí)間t＝0時(shí)根據(jù)前述方法測定前述培養(yǎng)介質(zhì)的粘度以及在時(shí)間t時(shí)根據(jù)前述方法進(jìn)行至少一次對前述培養(yǎng)介質(zhì)粘度的測定，以及比較t0和t時(shí)的前述測定值。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以測量均質(zhì)或非均質(zhì)、優(yōu)選非均質(zhì)微生物培養(yǎng)介質(zhì)的粘度。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明的目的在于提供可以實(shí)施如前述本發(fā)明方法的裝置。
由此，本發(fā)明的目的在于提供可以測量均質(zhì)或非均質(zhì)微生物培養(yǎng)介質(zhì)粘度的裝置，包括-至少一個(gè)培養(yǎng)介質(zhì)反應(yīng)器，用于容納前述培養(yǎng)介質(zhì)，以便檢測生物膜的形成與生長，-浸沒在培養(yǎng)介質(zhì)中的至少一種帶電、磁性或可磁化或者覆蓋至少一層磁性層或可磁化層的顆粒，-用于產(chǎn)生電場、磁場或電磁場，優(yōu)選為磁場的裝置，前述場施加給前述顆粒，以便使其運(yùn)動(dòng)，-用于光學(xué)檢測前述顆粒運(yùn)動(dòng)的設(shè)備，掃描顯微鏡除外。
術(shù)語“培養(yǎng)介質(zhì)反應(yīng)器”指至少一端封閉的容器如管子型、小孔(puit)，(...)(封閉反應(yīng)器)，或者可以使前述培養(yǎng)介質(zhì)流經(jīng)的、兩端開放的反應(yīng)器(開放反應(yīng)器)。
根據(jù)本發(fā)明的第一構(gòu)造，前述反應(yīng)器具有一個(gè)封閉的端部以形成平底。
為了在顆粒靜止時(shí)，即不加任何場時(shí)，在管子底部具有穩(wěn)定狀態(tài)，前述反應(yīng)器的底部可以具有一個(gè)或者多個(gè)孔穴或槽，用于容納前述顆粒。
根據(jù)本發(fā)明的第二構(gòu)造，前述反應(yīng)器具有一個(gè)封閉的端部以便形成半球形的底部。
根據(jù)本發(fā)明的另一構(gòu)造，反應(yīng)器可以具有兩個(gè)開放的端部。在該構(gòu)造中，前述反應(yīng)器可以構(gòu)造成使得前述培養(yǎng)介質(zhì)以穩(wěn)定流或者在給定時(shí)間間隔的不連續(xù)流流動(dòng)。
有利地，其中涉及的該顆粒是帶電顆粒(由于陰離子和/或陽離子的存在)，或者磁性顆粒，或者覆蓋至少一層磁性層的顆粒，或者可磁化顆粒，或者覆蓋至少一層可磁化層的顆粒。
有利地，前述磁性顆粒的小大與產(chǎn)生生物膜的微生物的大小基本一致。
有利地，可以使用不同大小和(同樣有利地)不同顏色的顆粒。在生物膜生長過程中較小的顆粒在較大的顆粒之前固定不動(dòng)。由此顆粒更準(zhǔn)確地表征前述生物膜的生長或者其降解。
同樣，根據(jù)本發(fā)明的有利構(gòu)造，前述顆粒產(chǎn)生由前述用于光學(xué)檢測運(yùn)動(dòng)的設(shè)備可檢測到的信號。有利地，前述顆粒是熒光型或磷光型或放射性或化學(xué)發(fā)光型的。
關(guān)于前述用于光學(xué)檢測運(yùn)動(dòng)的設(shè)備，其包括在前述顆粒的方向上發(fā)射的光源，以及可以檢測前述顆粒在培養(yǎng)介質(zhì)中的運(yùn)動(dòng)的光學(xué)檢測裝置。術(shù)語“光學(xué)檢測裝置”指任何可使用的檢測裝置。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，其為宏觀(macroscopiques)光學(xué)裝置。根據(jù)本發(fā)明的具體方式，所述顆粒的運(yùn)動(dòng)可以直接用肉眼看到。
在這個(gè)檢測范圍，被照亮的顆?？梢园晒忸w?；蛘吆谏蛑辽俨煌腹獾念w粒。
有利地，可以使用不同顏色、不同大小、不同密度、不同形狀/幾何狀態(tài)、不同物理-化學(xué)構(gòu)成、不同表面狀態(tài)的顆粒，用于增加使生物膜生長表征的標(biāo)準(zhǔn)。
有利地，待測試的化學(xué)基團(tuán)(groupements)可以連接到顆粒表面，并且對前述化學(xué)基團(tuán)(可移動(dòng)顆粒)的抗附著性進(jìn)行測試。
有利地，允許表征某些種類微生物的分子能夠連接到顆粒表面，并對前述種類的微生物(固定的顆粒)的附著性進(jìn)行測試。
前述顆?？梢灾苯訕?gòu)造成使其靜止時(shí)在前述反應(yīng)器的平底部保持在穩(wěn)定的狀態(tài)。有利地，所述顆?？梢允抢绫驙畹?、平面幾何不對稱、(...)的顆粒。
有利地，前述裝置還包括用于在給定時(shí)間間隔測量前述培養(yǎng)介質(zhì)的裝置以及可以將獲得的測量值進(jìn)行比較的裝置。
如此，可以測試由于定植的微生物或者在不同時(shí)間將微生物包圍起來的胞外多糖或微生物分泌的基質(zhì)的存在對該顆粒位移的阻礙。


通過以下結(jié)合附圖對本發(fā)明實(shí)施例的純粹解釋性的說明，將更好地理解本發(fā)明，在附圖中圖1示出對在具有半球形底部的管中生物膜的形成與生長進(jìn)行檢測的原理；圖2表現(xiàn)對在具有半球形底部的管(或非平底管)中生物膜的形成與生長進(jìn)行檢測的原理(頂視圖)。
圖3示出對平底管中生物膜的形成與生長進(jìn)行檢測的原理；圖4示出對端部開放的管中生物膜的形成與生長進(jìn)行檢測的原理；
圖5表現(xiàn)對平底2管1型反應(yīng)器1中的生物膜的形成與生長進(jìn)行檢測的原理的另一圖例。
圖6表現(xiàn)圖5中示出的本發(fā)明的一個(gè)變化例。
圖7表現(xiàn)如同圖5所述的本發(fā)明的一個(gè)具體應(yīng)用。
圖8表現(xiàn)在監(jiān)視管道污染方面，尤其在監(jiān)視閥污染方面本發(fā)明的一個(gè)具體應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
用于檢測生物膜在含有微生物的培養(yǎng)介質(zhì)中形成與生長的一般原理如下。
一種或多種帶電、磁性、可磁化或者覆蓋一層磁性層或可磁化層的顆粒或小珠置于培養(yǎng)介質(zhì)中。顆粒的組成可以變化，只要其與電場、磁場或電磁場中的反應(yīng)性相容。為了簡化以下的描述，這些顆粒將僅被描述為小珠。
可以發(fā)現(xiàn)，前述小珠逐漸結(jié)合到微生物分泌的基質(zhì)中直到完全固定不動(dòng)。
在生物膜形成的生物過程中，微生物被固定和包圍在該基質(zhì)中。由此它們被隱藏、保護(hù)以免受外界介質(zhì)侵襲，所觀察到的對抗生素的抗性(醫(yī)院內(nèi)病理)來源于此。前述小珠可以模擬該固定過程。
為了模擬該固定過程，將場發(fā)生器靠近前述小珠。由此，在生物膜未形成的介質(zhì)中，小珠在前述發(fā)生器靠近時(shí)起反應(yīng)并移動(dòng)，通常朝場發(fā)生器移動(dòng)，可選地根據(jù)前述發(fā)生器的運(yùn)動(dòng)來移動(dòng)。另一方面，如果顆粒被包圍在生物膜的基質(zhì)中，它們的運(yùn)動(dòng)將根據(jù)生物膜形成的程度被抑制甚至阻止。
因此，本發(fā)明的方法在于對小珠行為的利用，該小珠能夠在電場、磁場、電磁場的作用下運(yùn)動(dòng)。如果這些小珠的行為被構(gòu)成生物膜的基質(zhì)的存在而阻礙，這樣就有可能檢測它們的活動(dòng)程度(活動(dòng)的、半活動(dòng)的、固定的)并使之可視化，由此可以使生物膜的生長可視化。
前述的方法還可以區(qū)分能夠在場作用下運(yùn)動(dòng)的小珠以及因存在微生物分泌的基質(zhì)而運(yùn)動(dòng)受阻的小珠。
通過由直接照亮或者間接照亮的光學(xué)測量對小珠在生物膜中的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行檢測，在后一情況中，所使用的小珠有利地是熒光的。
根據(jù)所選小珠的形式(幾何形狀、大小、密度)，細(xì)菌體將被或多或少準(zhǔn)確地模擬，并且用新的標(biāo)準(zhǔn)可表征生物膜的發(fā)展(l’évolution)。
作為場發(fā)生器的表現(xiàn)頻率的函數(shù)和作為場力的函數(shù)，構(gòu)成生物膜的基質(zhì)的動(dòng)態(tài)生長可以進(jìn)行追蹤。同樣，生物膜一旦構(gòu)成，其降解可以在特殊處理作用下進(jìn)行追蹤。
由此有可能通過生化試驗(yàn)分析前述基質(zhì)的構(gòu)成。
同樣，用類推的方法，通過構(gòu)成生物膜的基質(zhì)追蹤小珠的固定過程，也可以追蹤細(xì)菌包埋在其分泌的基質(zhì)中的過程。
為了測試生物膜在管底的生長，使用密度足夠大的顆粒進(jìn)行檢測以便在管底形成沉淀。相反，使用密度不很大的顆粒以便漂浮在培養(yǎng)基的表面來進(jìn)行檢測，從而可以研究生物膜在表面(氣/液界面)的生長。
此外，通過利用顆粒密度，可以在固/液、液/液、液/氣界面上進(jìn)行一系列檢測。
檢測可以使用不同大小的顆粒，這些顆粒還可以用例如不同顏色加以區(qū)分。
現(xiàn)將該方法的一些具體實(shí)施例描述如下。在這些實(shí)施例中，所描述的微生物是細(xì)菌。應(yīng)該理解，對于其生物膜的生長待研究的任何微生物，以下說明均可適用。然而，如果希望模擬微生物在形成的生物膜中的行為，有利地使小珠的大小適合于所研究微生物的大小。
圖1至8示出檢測在不同幾何形狀的管中生物膜生長的原理，該管容納含有待研究細(xì)菌的培養(yǎng)介質(zhì)。
圖1和2具體示出檢測在具有半球形底部2的管1型反應(yīng)器1中生物膜形成與生長的原理。圖1是剖視圖，圖2是頂視圖。
舉例而言，實(shí)驗(yàn)可以在具有96個(gè)200μl容量管(或孔)的板上進(jìn)行。在本實(shí)施例中，小珠3置于每管1的底部。應(yīng)該理解，該方法不是必須限于單一小珠。然后將培養(yǎng)基4加入到每一管1中，接著在標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)條件(溫度、給氧、pH)下對該培養(yǎng)基接種能夠形成生物膜6的細(xì)菌菌株5。
置于在管1之下、更具體地置于小珠3之下的磁體7以規(guī)則的時(shí)間間隔移動(dòng)，以便沿著前述管1的壁規(guī)則地上升。
當(dāng)小珠3在其運(yùn)動(dòng)中未遇到障礙或者在細(xì)菌5分泌的構(gòu)成生物膜6的基質(zhì)中未被充分阻礙時(shí)，小珠跟隨前述磁體7的運(yùn)動(dòng)(圖1b和1c或圖2b和2c)。當(dāng)磁體遠(yuǎn)離，小珠不再受到其磁場作用而能夠回到其最初的位置。相反，當(dāng)生物膜的形成使得小珠3的運(yùn)動(dòng)受阻礙甚至被阻止，該小珠3在管1的底部保持不動(dòng)(圖1d或2d)。由此這個(gè)狀態(tài)可以表示在管1中構(gòu)成生物膜6的細(xì)胞外基質(zhì)的發(fā)展(或生長)，使得該基質(zhì)以其包圍細(xì)菌5的相同的方式包圍小珠1。
在本實(shí)施例中，操作磁體以便沿著前述管1的壁移動(dòng)小珠3。然而，有利地可以在小珠3的方向上操作磁體或者相反地，朝磁體操作管，以便根據(jù)除前述管1的壁之外的另一軌跡移動(dòng)小珠3。
有利地，光學(xué)設(shè)備能夠自動(dòng)將前述小珠的自由度可視化(未示出)。前述設(shè)備包括沿前述小珠3的方向發(fā)射的光源以及能夠檢測小珠3在培養(yǎng)介質(zhì)4中的運(yùn)動(dòng)的檢測裝置。
當(dāng)管3是透明時(shí)，光源置于前述管1之下以便直接向磁珠3發(fā)出光束。然后將檢測裝置置于前述管3的上面。于是，跟隨對應(yīng)于小珠3的黑點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)對小珠3的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行檢測。
當(dāng)管1為不透明材料，例如由金屬制成，光源置于前述管的上面，以便透過培養(yǎng)介質(zhì)4朝磁珠3發(fā)射光束。與前面相同，前述檢測裝置置于前述管的上面。在這個(gè)構(gòu)造中，前述小珠3有利地由熒光材料制成。由此，當(dāng)前述小珠3經(jīng)光源照亮，跟隨對應(yīng)于小珠3的熒光點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)，通過前述檢測裝置檢測它們的運(yùn)動(dòng)。
圖3示出本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施例的變化例檢測在具有平底2的管1型反應(yīng)器1中生物膜6的生長。
有利地，管1的底部2設(shè)置有兩個(gè)相鄰的孔穴8，9。最初，將小珠3置于孔穴8的其中一個(gè)內(nèi)。然后將磁體7設(shè)置成與另一個(gè)孔穴9接觸。當(dāng)小珠3在其運(yùn)動(dòng)中未被生物膜6阻礙時(shí)，它從孔穴8滑到相鄰的孔穴9(圖3b)。接著將磁體7移到第一個(gè)孔穴8的下面(圖3c)。當(dāng)其運(yùn)動(dòng)尚未被阻止或者至少尚未被充分阻礙時(shí)，在磁體7的吸引作用下，小珠3滑向前述第一個(gè)孔穴8。在固定的時(shí)間間隔重復(fù)試驗(yàn)直到觀察到如圖3d示出的小珠完全或者部分固定當(dāng)磁體7移動(dòng)到第二個(gè)孔穴9下面時(shí)，粘滯在生物膜中的小珠3由于其運(yùn)動(dòng)在生物膜6中被阻礙，對磁體7的吸引作用不再起反應(yīng)，不再能夠穿入第二個(gè)孔穴9內(nèi)。
在一個(gè)變化例中，管底不具有用于容納磁珠的孔穴。為此，前述磁珠構(gòu)造成使其自身能夠在所述管1的底部保持穩(wěn)定狀態(tài)。
圖4示出本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
，使用具有開放端部10，11的管1型反應(yīng)器。于是將管1構(gòu)造成使得允許培養(yǎng)基5連續(xù)流動(dòng)。
正如在平底管的實(shí)施例中，前述管1的壁13的內(nèi)表面12有利地具有孔穴8，9，以便容納前述小珠3。根據(jù)前述相同的原理，磁體7表現(xiàn)為使小珠3運(yùn)動(dòng)使其從一個(gè)孔穴運(yùn)動(dòng)到另一個(gè)孔穴。
在所述管1的壁13的內(nèi)表面12沒有形成任何孔穴的情況下，其原理類似于半球形底部管的原理，磁體7被呈現(xiàn)并移動(dòng)，使所述小珠3在管1壁13的內(nèi)表面12上升高。
根據(jù)本發(fā)明的具體構(gòu)造，包在生物膜6中的小珠隨后可以通過浸沒到培養(yǎng)介質(zhì)中的磁體回收。這樣，提取生物膜的一部分用于物理表征(基質(zhì)的粘度等)、化學(xué)和生化表征(基質(zhì)的構(gòu)成成分等)和生物表征(在潛伏、活動(dòng)、死體等狀態(tài)下構(gòu)成基質(zhì)的微生物)的試驗(yàn)。
圖5是檢測生物膜在具有平底2的管1型反應(yīng)器1中生物膜形成與生長原理的另一圖解。該圖解是從管的頂部(看)的平面視圖。
將小珠3置于在每一管1的底部。然后將培養(yǎng)基4加入到每一管中(圖5a)，接著在標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)條件下(溫度、給氧、pH...)用能形成生物膜6的細(xì)菌菌株5對該培養(yǎng)基接種。
在固定的時(shí)間間隔，磁體7置于在管1下面(圖5b和5e)。當(dāng)小珠在其運(yùn)動(dòng)中未遇到障礙或者未被細(xì)菌5分泌并構(gòu)成生物膜6的基質(zhì)充分阻礙時(shí)，它們在磁體7的方向受吸引(圖5b)。圍繞磁體7受吸引的小珠3游離出“無小珠”區(qū)或者“空曠區(qū)”，該區(qū)容易檢測、尤其是易于可視化檢測。當(dāng)生物膜6的形成使得小珠3的運(yùn)動(dòng)被阻礙甚至被阻止時(shí)，這些小珠3在管1的底部保持不動(dòng)(圖5d和5e)。于是這個(gè)狀態(tài)表示在管1中構(gòu)成生物膜6的細(xì)胞外基質(zhì)的發(fā)展，使得該基質(zhì)以與包圍細(xì)菌5的相同的方式包圍磁珠。
圖6示出圖5中示出的本發(fā)明的變化例。
對含有液體培養(yǎng)基4的培養(yǎng)皿1接種細(xì)菌5，不同大小的磁珠3和3′置于每一培養(yǎng)皿1中(圖7)。培養(yǎng)條件標(biāo)準(zhǔn)化(溫度、給氧、pH...)以便允許細(xì)菌的生長以及由此的生物膜6的生長。
在固定的時(shí)間間隔將磁珠置于培養(yǎng)皿1之下。當(dāng)小珠3在其運(yùn)動(dòng)中未遇到障礙或者在細(xì)菌5分泌的構(gòu)成生物膜6的基質(zhì)中未被充分阻礙，磁珠3在磁體7的方向上被吸引。在磁場線9影響區(qū)的外界和小珠聚集體15之間形成空曠區(qū)14。當(dāng)生物膜的形成使得小珠3的運(yùn)動(dòng)被阻礙甚至被阻止，這些小珠在培養(yǎng)皿1中保持不動(dòng)。然而，由于小珠大小不同，小珠的移動(dòng)是其大小和生物膜密度的函數(shù)。隨著生物膜的生長，較小小珠的移動(dòng)首先被生物膜抑制，隨著生物膜的補(bǔ)充性生長，較大的小珠也停止移動(dòng)。
圖7示出如在圖5或圖6中所述的本發(fā)明的具體應(yīng)用，小珠放置在覆蓋含抗微生物制劑(例如去污劑)的制品表面上。該表面可以由任何材料制成，特別是由金屬制成。當(dāng)磁體靠近該表面時(shí)，小珠被磁體的磁力線吸引，于是構(gòu)成一個(gè)比該表面的其余部分更密集的小珠密集區(qū)。當(dāng)希望測定應(yīng)用于金屬表面的防污制品的有效性時(shí)，這一應(yīng)用是有利的。
在本具體實(shí)施例中，例如通過在待測試的表面之下旋轉(zhuǎn)磁棒而使磁場強(qiáng)度發(fā)生改變可能更有意義。
圖8示出本發(fā)明在監(jiān)測管道污染特別是在監(jiān)測閥污染中的具體應(yīng)用。
為了模擬生物膜在置于液流的載體(管道1)上的生長，有可能使用具有束縛在管17凸出部分的環(huán)16的裝置?？纱呕念w粒4裝入環(huán)2的一處。該環(huán)在磁場作用下可以轉(zhuǎn)動(dòng)(圖8b或8c)。
如果生物膜在該裝置中生長，環(huán)的運(yùn)動(dòng)將受阻礙。
前述裝置對閥，即管道中生物膜最易形成的位置進(jìn)行模擬。
本發(fā)明通過實(shí)施例的方式描述如上。應(yīng)該理解，在不背離本發(fā)明的保護(hù)范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的不同變化例。
權(quán)利要求
1.用于測量微生物(5)培養(yǎng)基粘度的方法，其特征在于，依次包括以下步驟a)將至少一種帶電、磁性或可磁化的或者覆蓋至少一層磁性層或可磁化層的顆粒(3)浸沒在該培養(yǎng)介質(zhì)(4)中，b)將所述培養(yǎng)介質(zhì)置于電場、磁場或電磁場中，優(yōu)選磁場中，以便使所述顆粒(3)運(yùn)動(dòng)，c)光學(xué)檢測所述顆粒在所述培養(yǎng)介質(zhì)中運(yùn)動(dòng)的自由度，所述方法不使用掃描顯微鏡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟b)包括將所述培養(yǎng)介質(zhì)(4)置于電磁場，可選地通過脈沖來施加。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟b)包括將所述培養(yǎng)介質(zhì)(4)置于逐漸增強(qiáng)的電磁場。
4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述電場、磁場或電磁場由產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)的場的裝置來產(chǎn)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述微生物培養(yǎng)介質(zhì)以恒流流過開放的反應(yīng)器(1)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該培養(yǎng)介質(zhì)(4)在給定的時(shí)間間隔以不連續(xù)流流過開放的反應(yīng)器(1)。
7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述步驟c)包括用光源照亮所述顆粒(3)并檢測所述顆粒(3)在所述培養(yǎng)介質(zhì)(4)中的運(yùn)動(dòng)。
8.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述顆粒(3)產(chǎn)生一種信號。
9.根據(jù)前一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述顆粒(3)是熒光型、磷光型、放射性或化學(xué)發(fā)光型的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法能夠檢測生物膜(6)在所述培養(yǎng)介質(zhì)(4)中的形成與生長，其特征在于，包括根據(jù)如在權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，在對應(yīng)于給所述培養(yǎng)介質(zhì)(4)接種的時(shí)間為t＝0時(shí)測定所述培養(yǎng)介質(zhì)的粘度，根據(jù)如在權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，在時(shí)間t對前述培養(yǎng)介質(zhì)粘度進(jìn)行至少一次測定，以及比較t0和t時(shí)所述測定值的步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)介質(zhì)(4)是均質(zhì)或非均質(zhì)的，優(yōu)選為非均質(zhì)的。
12.用于測定微生物培養(yǎng)介質(zhì)粘度的裝置，其特征在于，包括至少一個(gè)培養(yǎng)介質(zhì)反應(yīng)器(1)，用于容納所述培養(yǎng)介質(zhì)(4)以便檢測生物膜(6)的形成與生長，浸沒在所述培養(yǎng)介質(zhì)(4)中的至少一種帶電或者磁性或可磁化或者覆蓋至少一層磁性層或可磁化層的顆粒，用于產(chǎn)生施加給所述顆粒(3)的電場、磁場或電磁場的裝置，除掃描顯微鏡之外用于光學(xué)檢測所述顆粒運(yùn)動(dòng)的設(shè)備。
13.根據(jù)前一權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于，所述反應(yīng)器(1)具有一個(gè)封閉的端部以便形成平的底部(2)。
14.根據(jù)前一權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于，所述反應(yīng)器(1)的底部(1)具有一個(gè)或者多個(gè)孔穴(8，9)或槽，用于容納所述顆粒。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于，所述反應(yīng)器(1)具有一個(gè)封閉的端部以便形成半球形底部(2)。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于，所述反應(yīng)器(1)具有兩個(gè)開放的端部。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的裝置，其特征在于，所述反應(yīng)器(1)構(gòu)造成使得所述培養(yǎng)介質(zhì)以恒流流動(dòng)或者在給定時(shí)間間隔的不連續(xù)流流動(dòng)。
18.根據(jù)權(quán)利要求12至17中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述顆粒(3)產(chǎn)生由所述用于檢測運(yùn)動(dòng)的設(shè)備可檢測到的信號。
19.根據(jù)前一權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于，所述顆粒(3)是熒光型、磷光型或放射性或化學(xué)發(fā)光型的。
20.根據(jù)權(quán)利要求12至19中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述顆粒(3)構(gòu)造成使得靜止時(shí)在所述反應(yīng)器(1)中處于穩(wěn)定的狀態(tài)。
21.根據(jù)權(quán)利要求12至20中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述顆粒(3)的大小與微生物(5)的大小基本一致。
22.根據(jù)權(quán)利要求1 2至21中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述光學(xué)檢測設(shè)備包括在所述顆粒(3)的方向上發(fā)射的光源，以及可以檢測所述顆粒(3)在培養(yǎng)基(4)中運(yùn)動(dòng)的檢測裝置。
23.根據(jù)權(quán)利要求12至22中任一項(xiàng)所述的裝置，所述裝置能夠檢測生物膜(6)在所述培養(yǎng)基(4)中的形成與生長，其特征在于，包括-測量裝置，用于在給定的時(shí)間間隔測定所述培養(yǎng)基的粘度，以及-比較裝置，可以比較所獲得的測定值。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于測量微生物(5)的培養(yǎng)基(4)粘度的方法，其特征在于，依次包括以下步驟a)將至少一種帶電、磁性或可磁化或者覆蓋至少一層磁性層或可磁化層(3)的顆粒浸沒在該培養(yǎng)介質(zhì)(4)中，b)將該培養(yǎng)介質(zhì)置于電場、磁場或電磁場中，以便使該顆粒(3)運(yùn)動(dòng)，以及c)檢測該顆粒(3)在該培養(yǎng)基中運(yùn)動(dòng)的自由度。更具體地，本發(fā)明涉及檢測生物膜在微生物培養(yǎng)基中形成與生長的方法和裝置。
文檔編號G01N11/10GK1934435SQ200580009085
公開日2007年3月21日 申請日期2005年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月23日
發(fā)明者蒂埃里·貝爾納迪, 尼古拉·巴拉 申請人:蒂埃里·貝爾納迪