專利名稱：吡咯啉-5-羧酸還原酶1的突變蛋白的制作方法
吡咯啉-5-羧酸還原酶1的突變蛋白發(fā)明領(lǐng)域
此申請要求在2009年5月沈日申請的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/180，937的優(yōu)先權(quán)利益，為了所有目的將其內(nèi)容在此以其整體引入作為參考。本發(fā)明涉及吡咯啉-5-羧酸還原酶I(PYCRl)的突變蛋白。本發(fā)明也涉及測定在受試者中患上與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的傾向的方法，鑒定能夠修飾PYCRl的表達(dá)的化合物的方法，和治療患有與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的受試者的方法。本發(fā)明還涉及基因改造的動(dòng)物和修飾PYCRl基因在動(dòng)物中的表達(dá)的方法。
發(fā)明背景
皺皮和骨丟失是與衰老有關(guān)的典型特征。在一些單成因疾病中，這些變化的過早發(fā)生導(dǎo)致患病個(gè)體的早衰樣外觀。作為臨床特征，皺皮或皮膚松弛被用作一些有重疊的綜合征性疾病的共同特征，這些疾病包括常染色體顯性皮膚松弛(ADCL;MIM 123700)、 常染色體隱性I型皮膚松弛(ARCL1 ；MIM 219100)、常染色體隱性II型皮膚松弛(ARCL2 ； MIM219200，又稱皺皮綜合征(WSS ；MIM 278250))、De Barsy 綜合征(DBS ；MIM 219150)和骨發(fā)育異常性老年?duì)钇つw(G0，MIM 231070)。在這些情況下由于廣泛的臨床重疊經(jīng)常難以診斷。
發(fā)明_既述
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 PYCRl的突變蛋白，其中在如Swiss-Prot檢索號 P32322所述的PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第4至220位和第222至266位中的至少 1個(gè)氨基酸殘基被突變。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了 PYCRl的突變蛋白。突變蛋白包括如Swiss-Prot檢索號P32322所述的PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第4至266位中的至少1個(gè)氨基酸殘基的突變，其中所述突變導(dǎo)致突變蛋白與野生型蛋白相比降低的功能或功能的喪失。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了核酸分子。核酸分子包括編碼如上所述的突變蛋白的核苷酸序列。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了測定在受試者中患上與吡咯啉-5-羧酸還原酶 1 (PYCRl)有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的傾向的方法。所述方法包括分析從受試者中得到的核酸樣品中編碼如上所述的突變蛋白的核苷酸序列的存在，其中所述核酸序列的存在指示受試者患上或有風(fēng)險(xiǎn)患上年齡相關(guān)疾病的傾向。
在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含編碼如上所述的突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子在診斷或測定患上與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的傾向中的用途。
在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定能夠修飾PYCRl基因的表達(dá)的化合物的方法。 所述方法包括使目的化合物接觸包含編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶I(PYCRl)或其功能片段或突變體的核苷酸序列的核酸分子，并測量編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶1 (PYCRl)或其功能片段或突變體的核苷酸序列的表達(dá)。
在第七個(gè)方面，本發(fā)明提供了修飾PYCRl基因在細(xì)胞中的表達(dá)的方法。所述方法包括將包含編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶1 (PYCRl)或其功能片段或功能突變體的核苷酸序列的核酸分子引入細(xì)胞。
在第八個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療患有與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的或具有患上與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法。所述方法包括將包含編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶I(PYCRl)或其功能片段或功能突變體的核苷酸序列的核酸分子引入受試者。
在第九個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療患有與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的或具有患上與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法。所述方法包括對受試者施用能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物。
在第十個(gè)方面，本發(fā)明提供了基因改造的動(dòng)物。所述基因改造的動(dòng)物包含編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶1 (PYCRl)的核酸，其中所述核酸是失活的。
在第十一個(gè)方面，本發(fā)明提供了修飾PYCRl基因在動(dòng)物中的表達(dá)的方法。所述方法包括對動(dòng)物施用能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物。
在第十二個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物的方法。 所述方法包括對如上所述的基因改造的動(dòng)物施用目的化合物；并測定所述化合物是否能夠修飾PYCRl基因的表達(dá)。
在第十三個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物的方法。 所述方法包括提供包含至少一層活動(dòng)物皮的分離的皮瓣，所述皮瓣被附著在試驗(yàn)動(dòng)物上； 并應(yīng)用目的化合物使其接觸活動(dòng)物皮。
發(fā)明詳述
本文描述了與以皺皮、骨質(zhì)疏松和早衰樣外觀為特征的多種疾病有關(guān)的PYCRl中的突變。在此背景下，發(fā)明人檢測了在PYCRl基因中導(dǎo)致疾病的突變。PYCRl基因的這些突變是PYCRl的突變蛋白，其中在如Swiss-Prot檢索號P32322所述的PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第4至220位和第222至266位中的至少1個(gè)氨基酸殘基被突變(見圖6)。 在一些實(shí)施方案中，突變蛋白可包含如Swiss-Prot檢索號P32322所述的PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第4至266位中的至少1個(gè)氨基酸殘基的突變，其中所述突變導(dǎo)致突變蛋白相比于野生型蛋白降低的功能或功能的喪失。
根據(jù)本發(fā)明描述的突變蛋白可通過任意標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定或測定，例如通過純合性作圖，使用從大家族的成員中得到的匯合的DNA樣品以鑒定目的染色體基因座或其候選區(qū)域。一旦鑒定了染色體基因座的候選區(qū)域，可使用常規(guī)測序和基因組基因座捕獲然后通過高通量測序方法篩選區(qū)域中導(dǎo)致疾病的突變。
在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明描述的突變蛋白也可來源于單核苷酸多態(tài)性 (SNP)。術(shù)語“SNP”指在個(gè)體群中變化的人基因組中特定位置上的單核苷酸多態(tài)性。此單核苷酸多態(tài)性可為例如在DNA序列中的單個(gè)堿基改變，在給定位置上通常具有2個(gè)可能的核苷酸之一。如本文使用的，SNP可通過其名稱或通過其在特定序列中的位置鑒定?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法產(chǎn)生SNP。根據(jù)本發(fā)明的SNP可例如來源于表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)生成項(xiàng)目中的序列數(shù)據(jù)的比較，特別是如果使用的文庫是使用來自不同個(gè)體的 ^1^ (Picoult-Newberg L. ,^A, Mining SNPs from EST databases, Genome Res. 9 (1999) 167-174)。根據(jù)本發(fā)明的SNP也可來源于如在Altshuler D.等人，An SNP map of human genome generated by reduced representation shotgun sequencing, Nature407(2000)513-516中描述的降低表現(xiàn)度的鳥槍(RRS)法的使用。
只要能達(dá)到預(yù)期的目的，也可能將突變引入PYCRl的野生型氨基酸序列，例如以得到相比于各自野生型蛋白質(zhì)，本發(fā)明的突變蛋白的降低的或丟失的功能。這些突變可包括例如PYCRl的野生型氨基酸序列的取代、缺失和插入?？赡艿母淖兊膶?shí)例包括保守修飾變化，其中改變是用化學(xué)上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能相似的氨基酸的表是本領(lǐng)域熟知的。保守取代的實(shí)例是在1)丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和賴氨酸力)異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸之間的取代。在其他實(shí)施方案中，也可通過非保守改變修飾PYCRl 的氨基酸序列。
在某些實(shí)施方案中，PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第4，119，179，189，206， 251，257和266位上的至少1個(gè)氨基酸殘基被突變。在此背景下，PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第4位上的氨基酸殘基的突變可通過移碼突變被突變，所述移碼突變導(dǎo)致編碼 PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第50位的密碼子變?yōu)榉g終止密碼子。
在其他實(shí)施方案中，PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第19位的氨基酸殘基可被甘氨酸或組氨酸替換。
在一些實(shí)施方案中，PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第179位的氨基酸殘基可被親水性氨基酸替換。親水性氨基酸可為例如含有羥基的氨基酸。這些含有羥基的氨基酸的實(shí)例包括絲氨酸或蘇氨酸。
在一些實(shí)施方案中，PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第189位的氨基酸殘基可被疏水性氨基酸替換。疏水性氨基酸可為例如脂肪族氨基酸。這些脂肪族氨基酸的實(shí)例可包括異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸。
在一些實(shí)施方案中，PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第206位的氨基酸殘基可被芳香族氨基酸或正電荷氨基酸替換。芳香族氨基酸的實(shí)例可包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。正電荷氨基酸的實(shí)例可包括精氨酸或賴氨酸。
在一些實(shí)施方案中，PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第251位的氨基酸殘基可被組氨酸替換。在其他實(shí)施方案中，PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第257位的氨基酸殘基可被親水性氨基酸替換。此親水性氨基酸可為例如含有羥基的氨基酸。這些含有羥基的氨基酸的實(shí)例可為絲氨酸或蘇氨酸。
在一些實(shí)施方案中，PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第266位的氨基酸殘基可被谷氨酰胺或天冬酰胺替換。
為了改進(jìn)的穩(wěn)定性、產(chǎn)量、純化或適用性的目的，根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白的序列也可被修飾。例如，如果希望，可為了這些目的去除對折疊為有功能的三維結(jié)構(gòu)不關(guān)鍵的肽區(qū)段?？赏ㄟ^取代半胱氨酸殘基去除二硫鍵或可在另一個(gè)位點(diǎn)引入新的二硫鍵。任選地，也可新引入半胱氨酸殘基以通過與其他成分的化學(xué)偶聯(lián)制備，例如，對應(yīng)的蛋白質(zhì)綴合物。也可在突變蛋白中構(gòu)建用于其他配體，例如金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)。
如本文使用的術(shù)語“氨基酸殘基”指D或L型的氨基酸或指可通過酰胺鍵摻入多肽的氨基酸模擬物。因此，第89位的正電荷氨基酸殘基可為例如在生理?xiàng)l件下為正電荷的天然存在的氨基酸殘基，例如精氨酸或賴氨酸或非天然模擬物，例如這樣的賴氨酸殘基，其 α-氨基被烷基化以得到具有永久正電荷的(季)銨鹽。
如本文使用的涉及動(dòng)物或氨基酸序列的術(shù)語“野生型”指相對在天然或人工環(huán)境中遺傳改變的形式在生物或生物品系的天然群體中占優(yōu)勢的表型、基因型或基因。
在本發(fā)明的說明性實(shí)施方案中，研究了來自22個(gè)家族的35位患病個(gè)體的臨床特征并總結(jié)在表1中。這些特征包括先天的皮膚起皺，在手和腳的背部最顯著，全身的結(jié)締組織薄弱，手指攣縮，疝氣，骨質(zhì)疏松和由于皮膚松垂和頌發(fā)育不全(經(jīng)常導(dǎo)致下頌前突)而具有早衰樣外觀的三角形臉(圖la-d)。皮膚的超微結(jié)構(gòu)研究顯示與在常染色體隱性皮膚松弛(ARCL)中描述的變化類似的彈性纖維的稀疏和破碎(圖le-h)。通過標(biāo)準(zhǔn)診斷未檢測出糖基化異常。在除一例以外的所有案例中觀察到不同程度的智力遲鈍。在大量患者中有明顯的胼胝體發(fā)育不全。盡管大部分患病的個(gè)體被歸為骨發(fā)育異常性老年?duì)钇つw(GO)或皺皮綜合征，患病較嚴(yán)重的個(gè)體也顯示兒童期白內(nèi)障或張力障礙性運(yùn)動(dòng)并因此被診斷為De Barsy 綜合征(DBS) (Al-Gazali, L. I.,等人，Gerodermia osteodysplastica and wrinkly skin syndrome are they the same ？ Am J Med Genet 101,213-20 (2001) ；Hamamy, H. A, Wrinkly skin syndrome. Clin Exp Dermatol 30,590-2(2005) ；Nanda, Α.等)κ Gerodermia osteodysplastica/wrinkly skin syndrome :report of three patients and brief review of the literature. Pediatr Dermatol 25,66-71(2008)；禾口Kunze,J.等人 De Barsy syndrome-an autosomal recessive,progeroid syndrome. Eur J Pediatr 144, 348-54(1985))ο
在5個(gè)有血緣的家族中的純合性作圖顯示在染色體17q25上在rs806M31和 rsl046896標(biāo)記之間的2. 8Mb的最小候選區(qū)域(圖Ii)。除了通過測序被排除的P4HB之外， 在此區(qū)域中的59個(gè)基因無一是明顯的候選者。因此，在組合了常規(guī)測序和基因組基因座捕獲之后進(jìn)行了高通量測序(圖Ij)。后者鑒定出552個(gè)基因組錯(cuò)配，其中8個(gè)是導(dǎo)致非同義突變的新SNP (表1)。這樣發(fā)明人鑒定出PYCRl (編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶1酶(PYCRl) 的基因)的突變蛋白。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含編碼根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子。如本文使用的術(shù)語“核酸”指任意可能構(gòu)型的任意核酸分子，例如線性化的單鏈、雙鏈或其組合。這樣的核酸實(shí)例可包括但不限于DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)， RNA分子(例如mRNA)，反義RNA，短干擾(siRNA)，微小RNA(miRNA)，使用核苷酸類似物或使用核酸化學(xué)生成的DNA或RNA的類似物，cDNA合成DNA，DNA和RNA的共聚物，寡核苷酸， PNA(蛋白質(zhì)核酸)，或其組合。DNA或RNA可為基因組或合成來源并可為單或雙鏈。各個(gè)核酸可進(jìn)一步包含非天然核苷酸類似物和/或與親和標(biāo)簽或標(biāo)記連接。
術(shù)語“核苷酸”包括天然(天然存在)的核苷酸，其包括選自腺嘌呤、胸腺嘧啶、 胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶的含氮堿基，選自核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖，和脫氧核糖的糖 (堿基和糖的組合一般被稱為“核苷”)，和1至3個(gè)磷酸基，且其可形成核苷間的磷酸二酯鍵?！昂塑账帷币仓负塑账犷愃莆铩＿@樣的類似物可具有糖類似物、堿基類似物和/或核苷間鍵類似物。另外，也包括展示非標(biāo)準(zhǔn)堿基配對的類似物(見例如美國專利號5，432，272)。 這樣的核苷酸類似物包括在天然的堿基中化學(xué)修飾的核苷酸(“堿基類似物”)，在天然的糖中化學(xué)修飾的核苷酸(“糖類似物”)和/或在天然的磷酸二酯鍵或任意其他核苷間鍵中化學(xué)修飾的(“核苷間鍵類似物”)。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)包含至少一個(gè)氮原子。在某些實(shí)施方案中，核苷酸堿基能夠與合適的互補(bǔ)核苷酸堿基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氫鍵。示例性核苷酸堿基及其類似物包括但不限于天然存在的核苷酸堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，和天然存在的核苷酸堿基的類似物， 例如7-脫氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜-8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜-8-氮雜腺嘌呤、N6 δ 2-異戊烯基腺嘌呤、Ν2- 二甲基鳥嘌呤(dmG)、7_甲基鳥嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6_ 二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、2-巰基嘧啶、6-巰基鳥嘌呤、4-巰基胸腺嘧啶、4-巰基尿嘧啶、O6-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、 5，6-二氫胸腺嘧啶、5，6-二氫尿嘧啶、吡唑并[3,4-D]嘧啶(見例如美國專利號6，143,877 和6，127，121)、亞乙烯基腺嘌呤、吲哚例如硝基吲哚和4-甲基吲哚和吡咯例如硝基吡咯。
術(shù)語“互補(bǔ)”旨在指在2條不同的DNA或RNA鏈上的核苷酸/堿基的關(guān)系，其中堿基是配對的(鳥嘌呤和胞嘧啶，腺嘌呤和胸腺嘧啶(DNA)或尿嘧啶(RNA))。
在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的核酸分子可包含編碼本發(fā)明的突變蛋白的核苷酸序列，在其他實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的核酸可包含吡咯啉-5-羧酸還原酶 1 (PYCRl)或其功能片段或突變體的核苷酸序列。本文使用的術(shù)語PYCRl的“功能突變體” 指本發(fā)明的突變蛋白以外的變體蛋白，其中基本上保留功能。例如，與所述功能無關(guān)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸已被交換。如本文使用的術(shù)語“功能片段”指PYCRl的片段，其具有足夠的長度以提供其希望的功能。
在此背景下，如本文使用的核酸分子例如DNA可被視為例如“能夠表達(dá)核酸分子或編碼核苷酸序列”或能夠“允許核苷酸序列的表達(dá)”，如果其包含含有轉(zhuǎn)錄和翻譯信息的調(diào)控核苷酸序列且這樣的序列與編碼本發(fā)明的突變蛋白的核苷酸序列“有效連接”。有效連接是這樣的連接，其中調(diào)控DNA序列和尋求被表達(dá)的DNA序列以允許基因序列表達(dá)的方式相連。用于基因序列表達(dá)所需要的調(diào)控區(qū)的精確性質(zhì)在生物和生物之間可有不同，但大體上應(yīng)當(dāng)包括啟動(dòng)子區(qū)，在原核生物中其僅包含啟動(dòng)子或包含引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子以及下述DNA序列，即當(dāng)其被轉(zhuǎn)錄為RNA時(shí)將發(fā)出合成起始的信號。這樣的區(qū)域通常將包括位于待表達(dá)的核苷酸序列的5’和3’的非編碼區(qū)且所述非編碼區(qū)涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始， 例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列。
在一些實(shí)施方案中，可通過插入或從核苷酸序列中缺失至少一個(gè)核苷酸改變本發(fā)明的或根據(jù)本發(fā)明使用的核酸分子。在其他實(shí)施方案中，可突變核酸分子的核苷酸序列的至少一個(gè)剪接位點(diǎn)。術(shù)語“剪接位點(diǎn)”指特定的核酸序列，其能夠被真核細(xì)胞的剪接機(jī)器識(shí)別為適合被切割和/或連接至對應(yīng)的剪接位點(diǎn)。剪接位點(diǎn)允許在前體mRNA轉(zhuǎn)錄物中存在的內(nèi)含子的切除。一般將內(nèi)含子的5’部分稱為供體剪接位點(diǎn)和將對應(yīng)的3’剪接位點(diǎn)稱為受體剪接位點(diǎn)。術(shù)語剪接位點(diǎn)包括，例如天然存在的剪接位點(diǎn)、改造的剪接位點(diǎn)。改造的剪接位點(diǎn)可為例如被突變的位點(diǎn)。剪接位點(diǎn)的突變能夠控制從不同轉(zhuǎn)錄物群中翻譯的多肽之間的比例。剪接位點(diǎn)是本領(lǐng)域熟知的且在本發(fā)明中可利用任意剪接位點(diǎn)。
在一些實(shí)施方案中，核酸分子可被包含在載體例如表達(dá)載體中。這樣的載體能夠整合如上所述的核酸并可包含編碼限制性切割位點(diǎn)的序列，該序列以5’或/和3’方向連接編碼本發(fā)明的突變蛋白或PYCRl或其功能片段或突變體的核酸。所述載體也可包含來源于與用于表達(dá)的載體相容的物種的復(fù)制位點(diǎn)和控制序列。在此背景下，術(shù)語“載體”涉及可被引入，例如轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞和在細(xì)胞基因組內(nèi)或獨(dú)立復(fù)制的單或雙鏈環(huán)狀核酸分子。在用限制酶處理下，環(huán)狀雙鏈核酸分子可被切割和因此被線性化。各種核酸載體、限制酶和限制酶切割的核苷酸序列的知識(shí)是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的。
通過用限制酶切割載體并將2個(gè)片段連接在一起可將編碼本發(fā)明的突變蛋白或 PYCRl或其功能片段或突變體的核酸分子插入載體。在本發(fā)明中可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適用于基因克隆的任意載體。這些載體的實(shí)例可包括但不限于PUC18，pUC19，BR322, PBR325，pBR327和pBR3^。編碼本發(fā)明的突變蛋白或PYCRl或其功能片段或突變體的核酸和/或各自的載體可被包含在能夠表達(dá)所述核酸的宿主細(xì)胞中。本文公開的宿主細(xì)胞也可包含如上定義的核酸。如本文使用的宿主細(xì)胞包括可用作表達(dá)系統(tǒng)以產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)特別是如上所述的突變蛋白或PYCR或其功能片段或突變體的任意宿主細(xì)胞。示例性宿主細(xì)胞為原核宿主細(xì)胞，例如但不限于大腸桿菌(E. coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)；和真核宿主細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物、鳥類、真菌和昆蟲細(xì)胞。將載體引入宿主細(xì)胞的多種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔和生物射彈法。
本發(fā)明也提供了包含編碼本發(fā)明的突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子，其用于診斷或測定患上與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的傾向。年齡相關(guān)疾病可為(但不限于)皮膚松弛(皺皮綜合征)、De Barsy綜合征和骨發(fā)育異常性老年?duì)钇つw。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了測定在受試者中患上與吡咯啉-5-羧酸還原酶 1 (PYCRl)有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的傾向的方法。所述方法包括分析從受試者中得到的核酸樣品中編碼本發(fā)明的突變蛋白的核苷酸序列的存在，其中所述核酸序列的存在指示受試者患上或有風(fēng)險(xiǎn)患上年齡相關(guān)疾病的傾向。
本發(fā)明也提供了鑒定能夠修飾PYCRl基因的表達(dá)的化合物的方法。所述方法包括使目的化合物接觸包含編碼PYCRl或其功能片段或突變體的核苷酸序列的核酸分子。所述方法還包括測量編碼PYCRl或其功能片段或功能突變體的核苷酸序列的表達(dá)。之后，可將測量結(jié)果與未加入目的化合物的對照測量的結(jié)果相比較。
本發(fā)明也提供了基因改造的動(dòng)物?；蚋脑斓膭?dòng)物包括編碼PYCRl基因的核酸， 其中所述核酸是失活的。在一些實(shí)施方案中，核酸導(dǎo)致PYCRl基因的功能喪失。可通過本領(lǐng)域熟知的遺傳方法失活編碼PYCRl基因的核酸。例如可通過使用基因敲除或基因敲低方法、嗎啉代反義寡聚物或其他已知的可導(dǎo)致PYCRl基因的功能喪失的方法失活所述核酸。 術(shù)語“動(dòng)物”可包括所有脊椎動(dòng)物，包括人。其可也包括在所有發(fā)育階段中的個(gè)體動(dòng)物，包括胚胎和胎兒階段的動(dòng)物。為了得到根據(jù)本發(fā)明的基因改造的動(dòng)物，可使用基因工程技術(shù)例如重組DNA技術(shù)改造動(dòng)物的遺傳物質(zhì)?？赏ㄟ^例如將相關(guān)DNA加入現(xiàn)有的生物基因組， 例如質(zhì)粒，產(chǎn)生重組DNA，以為了特定目的編碼或改變不同的性狀。這樣的動(dòng)物的實(shí)例可包括但不限于爪蟾、魚、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物和鳥。在本發(fā)明中使用的基因改造的動(dòng)物也可為哺乳動(dòng)物，在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物可包括人、嚙齒動(dòng)物、犬類、有蹄類、貓科動(dòng)物、兔科和獼猴。嚙齒動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于小鼠、大鼠、松鼠、花栗鼠、囊地鼠、箭豬、海貍、倉鼠、 沙鼠、豚鼠、南美栗鼠、草原土撥鼠和土撥鼠。犬類的實(shí)例包括但不限于狗、狼、北美小狼和豺。有蹄類的實(shí)例包括但不限于馬、驢、斑馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、長頸鹿和駝鹿。貓科動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于貓、獰貓、美洲獅、獵豹和豹。兔科的實(shí)例包括但不限于兔、野兔和長耳大野兔。獼猴的實(shí)例包括恒河猴。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物的方法。所述方法包括對如本文描述的動(dòng)物或基因改造的動(dòng)物施用目的化合物。所述方法還包括測定目的化合物是否能夠修飾PYCRl基因的表達(dá)。
只要根據(jù)本發(fā)明使用的目的化合物能夠修飾PYCRl基因的表達(dá)，可將所述化合物配制成任意形式。例如可將化合物配制成藥物組合物或化妝品組合物的形式?；瘖y品組合物的實(shí)例包括凝膠、軟膏、乳膏、洗劑、精華素(serum)、糊劑、肥皂、氣溶膠、可溶性片劑、粉末、棒狀物(sticks)、水基或油基懸浮劑和乳劑。
在此背景下，可在基因或蛋白質(zhì)水平修飾PYCRl的表達(dá)。當(dāng)各個(gè)蛋白質(zhì)的基因表達(dá)/活性/量相比對照水平提高或降低例如約10%、約25%、約50%、約75%、約100%或更高時(shí)，認(rèn)為基因表達(dá)水平或蛋白質(zhì)水平的量是被“修飾的”或“調(diào)節(jié)的”。備選地，當(dāng)基因表達(dá)/或活性/蛋白質(zhì)水平相比對照水平提高或降低例如至少約0. 1，至少約0. 2，至少約 1，至少約2，至少約5、或至少約10或更多倍時(shí)，認(rèn)為表達(dá)水平或活性水平或蛋白質(zhì)水平/ 量被“提高”或“降低”。因此，在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的目的化合物可例如提高或降低PYCRl基因的表達(dá)。
因此本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供修飾PYCRl基因在細(xì)胞中表達(dá)的方法。所述方法包括將包含編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶I(PYCRl)或其功能片段或功能突變體的核苷酸序列的核酸分子引入細(xì)胞。在本發(fā)明的本方法中可使用任意細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞從宿主生物中獲得或來源于宿主生物，宿主生物可為任意生物。細(xì)胞可以例如活組織或血樣的樣品形式從各個(gè)宿主生物直接采集，例如分離。其也可為已經(jīng)從宿主生物獲得的，例如分離的，和然后被培養(yǎng)、生長、轉(zhuǎn)化或暴露于選定的處理。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞可被包含在宿主生物中。其可例如在血液中或組織中，包括在宿主生物的器官中存在。宿主生物可為任意生物，例如微生物，動(dòng)物，例如魚、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥類、哺乳動(dòng)物，包括嚙齒動(dòng)物物種，無脊椎動(dòng)物物種，例如包括例如青蛙、蟾蜍、火蜥蜴或蠑螈的滑體亞綱，或植物，細(xì)胞來源于所述宿主生物的或從其獲得，包括分離、純化或富集，或細(xì)胞包含在宿主生物中。哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于大鼠、小鼠、兔、松鼠、田鼠、鴨嘴獸、雞、奶牛、 山羊、綿羊、豬、狗、歐洲盤羊、豚鼠、倉鼠、黑猩猩、恒河猴、獼猴或人。
本發(fā)明也提供了修飾PYCRl基因在動(dòng)物(包括上述動(dòng)物)中表達(dá)的方法。所述方法包括對動(dòng)物施用能夠修飾PYCRl基因的表達(dá)的化合物。所述化合物在一些實(shí)施方案中包括能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的核酸分子。這樣的核酸分子的實(shí)例如上所述并包括反義RNA、 短干擾(siRNA)、微小RNA(miRNA)、肽核酸(PNA)及其組合。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供治療患有與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的或有風(fēng)險(xiǎn)患上與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的受試者的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將包含編碼PYCRl或其功能片段或功能突變體的核苷酸序列的核酸分子引入受試者。在其他實(shí)施方案中，所述方法也可包括施用能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物。一個(gè)單獨(dú)的用途可為例如制造用于此目的的藥物或藥物組合物。因此，本發(fā)明的方法包括如上定義的核酸或化合物的用途，包括在制造藥物中的用途?？墒褂帽疚拿枋龅谋景l(fā)明的方法鑒定能夠修飾PYCRl表達(dá)的化合物。在此背景下，本發(fā)明的或根據(jù)本發(fā)明使用的方法可在體內(nèi)或體外進(jìn)行。
術(shù)語“施用”涉及將目的化合物、根據(jù)本發(fā)明的核酸或其各個(gè)藥物組合物摻入生物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組織。各個(gè)化合物、核酸或其藥物組合物的示例性施用途徑包括口服、 經(jīng)皮和胃腸外遞送。合適的施用途徑可包括例如貯庫制劑、口服、直腸、黏膜、靜脈內(nèi)、髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。
在說明性實(shí)施方案中，鑒定了 8個(gè)錯(cuò)義突變、1個(gè)移碼突變、5個(gè)剪接位點(diǎn)突變和包含外顯子5的外顯子-內(nèi)含子邊界的22bp的1個(gè)缺失(表1，圖6)。這些突變中的5個(gè)是經(jīng)常出現(xiàn)的，盡管患病個(gè)體沒有共同的種族背景。為了檢查PYCRl蛋白質(zhì)的表達(dá)，從淵源者和其未患病的兄弟姐妹中分離了皮膚成纖維細(xì)胞(圖幻。在具有純合剪接位點(diǎn)突變的患者(SJ)和具有錯(cuò)義和移碼突變的復(fù)合雜合患者(DI)的成纖維細(xì)胞中檢測到顯著降低的 PYCRl蛋白水平(圖加)。錯(cuò)義突變p. Gly206Trp和p. Arg251His導(dǎo)致相比對照細(xì)胞蛋白質(zhì)水平的降低(圖加)。PYCRl蛋白，經(jīng)常被描述為在細(xì)胞質(zhì)中與線粒體基質(zhì)蛋白Δ1-吡咯啉-5-羧酸合酶(P5CS)共定位，P5CS也屬于脯氨酸代謝途徑(圖2b-f)。因此可推斷 PYCRl是線粒體蛋白且本文描述的突變導(dǎo)致功能喪失。
在另一個(gè)說明性實(shí)施方案中，在小鼠組織中的PYCRl表達(dá)分析顯示在2個(gè)受影響最嚴(yán)重的組織骨和皮膚中mRNA水平最高(圖7b)。在人中存在PYCRl的2個(gè)旁系同源物， 高度相似的PYCR2和關(guān)系最遠(yuǎn)的PYCRl。在具有PYCRl突變的個(gè)體的成纖維細(xì)胞中未觀察到PYCR2或P5CS的顯著表達(dá)變化(圖7a)。由于PYCRl在脯氨酸的從頭合成中催化必需和最終步驟，研究了患病個(gè)體是否展示脯氨酸不足的問題。在患病個(gè)體中血清脯氨酸水平輕微降低，但在正常范圍內(nèi)(圖8a)。同樣地，培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞未顯示降低的脯氨酸水平(圖8b)或在不合脯氨酸的培養(yǎng)基中降低的增殖率(圖8c)的跡象，反駁了脯氨酸營養(yǎng)缺陷型的存在。
在另一個(gè)說明性實(shí)施方案中，基于PYCRl的線粒體定位更詳細(xì)檢查了線粒體網(wǎng)絡(luò)。超微結(jié)構(gòu)分析顯示線粒體及其嵴的異常形態(tài)學(xué)(圖3a，b)。這些差異在氧化脅迫下加劇(圖3c_e)。對細(xì)胞培養(yǎng)基加入H2O2導(dǎo)致患病個(gè)體細(xì)胞中絲狀線粒體網(wǎng)絡(luò)的塌陷，而在對照細(xì)胞的線粒體中觀察到幾乎無變化(圖3f)。在正常培養(yǎng)條件下患者和對照成纖維細(xì)胞在其凋亡水平上顯示無差異。然而在短暫暴露于H2A后，檢測到當(dāng)與對照相比時(shí)患者的成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞死亡提高了 5倍。這暗示PYCRl涉及細(xì)胞對氧化脅迫的應(yīng)答。
在另一個(gè)說明性實(shí)施方案中，研究了 PYCRl在胚胎發(fā)生中的功能，因?yàn)樵赑YCRl中具有突變的患者在出生時(shí)就患病。PYCRl在進(jìn)化中始終保守，在細(xì)菌、植物、昆蟲和脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)PYCRl直系同源物(圖如)。為了在爪蟾胚胎中建立疾病模型，設(shè)計(jì)了針對根據(jù)本發(fā)明的Pycrl的嗎啉代(MO)。Pycrl耗盡的胚胎未顯示明顯的發(fā)育缺陷，直到早期蝌蚪階段。 到階段30，Pycrl嗎啉突變體(morphant)胚胎不能發(fā)育出眼睛和尾芽(圖如，d)。據(jù)顯示此表型為細(xì)胞自主的，因?yàn)閮H在腹部或背部卵裂球中注射分別阻止眼睛和尾巴的發(fā)育(圖 4e_i)。皮膚改變變得明顯并且后來在游泳蝌蚪階段發(fā)育為外胚層水腫(圖4j，i)。組織學(xué)皮膚切片顯示上皮的解體和增大的細(xì)胞和核(圖4k，m)。顯微注射人PYCRl mRNA部分挽救了在Pycrl嗎啉突變體中觀察到的表型而模擬K215-D319Ddel突變的人PYCRl mRNA沒有效果(圖9)。同樣地，在斑馬魚中Pycrl和Pycr2的嗎啉代介導(dǎo)的敲除導(dǎo)致類似的皮膚表型(

圖11a，b)，其可被人野生型PYCRl mRNA的注射挽救(圖lld，e)。Pycrl嗎啉突變體沒有可見的循環(huán)的紅血球(圖10a，b)。此貧血可追溯到在階段25時(shí)原始造血作用的標(biāo)記物Scl表達(dá)的喪失(圖5e，f)。
在階段25-30，皮膚發(fā)育不全伴隨凋亡細(xì)胞數(shù)目的顯著增加(圖fe-d，g)。由于在 PYCRl嗎啉突變體中觀察到的皮膚缺陷可能是由貧血導(dǎo)致，在野生型和注射Pycrl-MO的胚胎中進(jìn)行了聯(lián)體生活(圖IOc)。在聯(lián)體生活后由于共享的血液循環(huán)Pycrl嗎啉突變體中外胚層水腫的程度有所降低，但皮膚發(fā)育不全、凋亡和生長障礙沒有被挽救(圖5g-i)。可以推斷Pycrl在爪蟾的血液形成和皮膚發(fā)育中發(fā)揮獨(dú)立的作用。在青蛙中觀察到的貧血可能反映了 Pycrl在此缺乏Pycr2基因的物種中發(fā)揮的雙重作用。在人中，Pycr2在血細(xì)胞中的作用已被詳細(xì)記載24_25?？傊鲜鼋Y(jié)果表明PYCRl中的功能喪失突變危害線粒體功能，這導(dǎo)致在胚胎形成中的凋亡和在成人期中一般不能活躍。
PYCRl屬于催化1-吡咯啉-5-羧酸(P5C)轉(zhuǎn)化為L-脯氨酸的NAD (P)結(jié)合 Rossmarm-折疊結(jié)構(gòu)域超家族。若干遺傳疾病已與脯氨酸代謝途徑相聯(lián)系1(1。更值得注意地是，在P5CS中的突變導(dǎo)致智力低下、關(guān)節(jié)活動(dòng)過度和皮膚松弛(0ΜΙΜ 612652)的狀況"_13。 如在本文描述的患者中的情況，P5CS缺陷不是由降低的血清脯氨酸水平所一致表征的"’12。 此外，來自這些患者的成纖維細(xì)胞未展示用于描述P5CS缺陷的增殖缺陷13。PYCRl相關(guān)疾病的表型和皮膚松弛的其他形式有重疊，以前曾在診斷WSS、G0或DBS中描述過此組群患病患者的事實(shí)反映了這一點(diǎn)5’6’8’9’14’15。盡管GO不導(dǎo)致智力損傷，但是ARCL2經(jīng)常包括輕度或中度智力遲鈍和大腦異常16。在ARCL2中已鑒定出編碼定位至內(nèi)體和高爾基體的V-ATP酶復(fù)合體的a2亞基的ATP6V0A2中的突變。在GO中鑒定出在另一個(gè)囊泡高爾基體蛋白GORAB 中的突變。表型的相似性暗示了在這些病癥中共同的但尚未確定的致病機(jī)理。有趣的是， 在具有ATP6V0A2缺陷的ARCL2患者的成纖維細(xì)胞中也觀察到凋亡的增加。
在有氧代謝中可能有害的活性氧類別(ROS)的產(chǎn)生已變成衰老研究的主要焦點(diǎn) 18O ROS最初被視為氧化磷酸化的有害副產(chǎn)物，但最近發(fā)現(xiàn)其對氧化還原依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的重要性w’19。實(shí)際上，脯氨酸已經(jīng)涉及ROS水平的調(diào)節(jié)2°’21。此外，PYCRl和-2可能涉及在細(xì)胞質(zhì)中和線粒體中調(diào)節(jié)NAD(P)H/NAD(P)+比例。在神經(jīng)退化疾病中已描述線粒體的破裂損害細(xì)胞功能23。此外，線粒體融合中的變化可觸發(fā)衰老24。盡管PYCRl對線粒體功能和完整性的精確作用仍有待確定，其在其他物種例如酵母、擬南芥和果蠅中的直向同源物與脅迫抵抗有關(guān)聯(lián)的事實(shí)暗示人PYCRl也可能通過維持可快速代謝的脯氨酸儲(chǔ)備和減少進(jìn)入線粒體的當(dāng)量提供對抗脅迫的適應(yīng)性保護(hù)25。
總之，導(dǎo)致PYCRl功能的喪失的PYCRl中的突變是常染色體隱性皮膚松弛的主要原因，引起與骨發(fā)育異常性老年?duì)钇つw、2型ARCL和3型ARCL有重疊的表型。病理生理學(xué)基礎(chǔ)是損傷的線粒體功能，通過凋亡的增加導(dǎo)致發(fā)育缺陷。本發(fā)明人強(qiáng)調(diào)的線粒體功能在衰老過程中的重要性可幫助發(fā)展新的用于一般年齡相關(guān)疾病的治療策略27。這些治療策略可包括新的藥物或化妝品應(yīng)用以治療年齡相關(guān)疾病或防止衰老的影響，例如皮膚起皺。作為說明性實(shí)例，可生成使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的篩選測定以篩選新的化妝品化合物或藥物組合物。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)例可包括裸小鼠，其中將攜帶PYCRl基因突變的活人皮膚移植物移植到裸小鼠上。
在一個(gè)方面，本發(fā)明也提供了鑒定能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物的方法。所述方法包括提供包含至少一層活動(dòng)物皮的分離的皮瓣，將所述皮瓣附著在試驗(yàn)動(dòng)物上，如例如在美國專利號4，677，968中描述的。所述方法還包括對活動(dòng)物皮應(yīng)用目的化合物。
在此背景下，為了篩選能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物，可將目的化合物直接應(yīng)用在移植在裸小鼠上的活人皮上。根據(jù)此方法使用的化合物可為任意形式，包括如上所述的藥物或化妝品組合物。
在一些實(shí)施方案中，皮瓣可包括表達(dá)本發(fā)明的突變蛋白的細(xì)胞。所述細(xì)胞可包括例如成纖維細(xì)胞。皮瓣可在一個(gè)表面上包含一層活人皮和在另一個(gè)表面上包含活動(dòng)物皮。 皮瓣可由可附著在試驗(yàn)動(dòng)物上的分離的脈管系統(tǒng)供給?；顒?dòng)物皮可為和試驗(yàn)動(dòng)物相同或不同的物種。動(dòng)物可為人或嚙齒動(dòng)物，包括例如無胸腺的嚙齒動(dòng)物。
總之，上述篩選測定可提供鑒定和分析化妝品或藥物組合物接觸活人皮的效果。 可通過直接表面應(yīng)用在皮膚上檢測目的化合物?？裳芯炕钊似?yīng)答不同化合物的行為和效^ ο實(shí)施例
以下非限制性實(shí)施例也說明了上述方法且不應(yīng)被視為限制本發(fā)明的范圍。
基因分型和連鎖分析。在參與者知情同意和當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)(Ethikkommission der Charite)同意之后，從22個(gè)家族獲得DNA樣品。使用Affymetrix GeneChip Human Mapping 250K Arrays (Affymetrix, Santa Clara，CA)，我們在 8 個(gè)家族中進(jìn)行了基因組范圍的連鎖分析。通過GeneChip DNA分析軟件(GDAS v2. 0, Affymetrix)調(diào)入基因型。通過對X染色體上的雜合SNP的計(jì)數(shù)，我們驗(yàn)證了樣品的性別。在Graphical Relationship R印resentation程序的幫助下評估了關(guān)系錯(cuò)誤。應(yīng)用PedCheck程序檢測孟德爾誤差并從數(shù)據(jù)集中去除具有這些誤差的SNP數(shù)據(jù)。通過使用MERLIN程序鑒定了非孟德爾誤差并刪除相關(guān)樣品的不太可能的表型％。使用MERLIN進(jìn)行了同時(shí)使用所有染色體基因型的非參數(shù)連鎖分析。通過GENEHUNTER 2. 1程序的修改版本，通過逐步使用具有110或200個(gè) SNP的集合的滑動(dòng)窗口，進(jìn)行了參數(shù)連鎖分析。使用GENEHUNTER 2. 1重建了單元型并使用 HaploPainter用圖表顯示ffl。
突變分析。 從 GenBank (http: "www. ncbi. nlm. nih. gov/mapview/)禾口 EnsembKhttp://www. ensembl. org)數(shù)據(jù)庫獲得位置候選基因。通過使用每個(gè)外顯子兩側(cè)的引物直接測序DNA分析基因。引物序列是基于每個(gè)基因的參考序列。用于PYCRl突變篩選的引物序列在補(bǔ)充的表1中提供。使用BigDye Terminator循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems,Foster City, CA)進(jìn)行序列分析,并在 3730DNA 分析儀(Applied Biosystems, Foster City, CA)上電泳產(chǎn)物。
基因組基因座捕獲。簡單地說，設(shè)計(jì)了定制的陣列(Agilent 244K)以靶向基因座 17q25中72，048，357和78，774，742之間(排除高度重復(fù)區(qū))存在的基因的每個(gè)外顯子序列。遵照Illumina文庫生成實(shí)驗(yàn)方案版本2. 3制備了 DNA文庫并根據(jù)Agilent CGH 244K 陣列實(shí)驗(yàn)方案將其與定制的陣列雜交，然后洗滌、洗脫和擴(kuò)增。每個(gè)樣品通過Illumina 流動(dòng)池的一個(gè)通道并通過Illumina基因組分析儀(GA)使用標(biāo)準(zhǔn)的制造商的實(shí)驗(yàn)方案測序。通過制造商提供的GA Pipeline版本1.0處理圖像數(shù)據(jù)并將所有序列與人參考基因組 (UCSC build 18，http://genome.ucsc.edu)通過類似 Blat 的快速精確搜索工具(BFAST， https://secure, genome, ucla. edu/index. php/BFAST, N. Homer 等人，在準(zhǔn)備中)比對。
過濾了出現(xiàn)2次或更多次的錯(cuò)配，其中在100%的時(shí)間中觀察到突變(純合的)， 且其不與已知的dbSNPU9條目錯(cuò)配有重復(fù)。在此工作中使用開源kqWare項(xiàng)目，其提用于跟蹤樣品的LIMS工具(SeqWare LIMS)和用于序列分析的流程(pipeline) (Seqffare Pipeline)(http//seqware. sourceforge. net)。
細(xì)胞培養(yǎng)。在補(bǔ)充10 %的胎牛血清(FCS) (Lonza)U %的超谷氨酰胺 (Ultraglutamine) (Lonza)和的青霉素 / 鏈霉素(Lonza)的 DMEM(Lonza)中在 5% CO2 和37°C下培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞。
定量PCR。使用Trizol (Invitrogen)法從P4小鼠的器官中分離RNA。使用 Revert Aid試劑盒(Fermentas)和隨機(jī)六聚物逆轉(zhuǎn)錄Iyg RNA0使用STOR綠(Applied Biosystems)進(jìn)行定量PCR。在補(bǔ)充的表1中提供了引物。
蛋白質(zhì)印跡分析。使用用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的線粒體分離試劑盒(Thermo Scientific)得到原代皮膚成纖維細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液的線粒體和細(xì)胞質(zhì)級分，并通過在SDS聚丙烯酰胺凝膠中的電泳解析。對于蛋白質(zhì)印跡分析，使用以下抗體標(biāo)記PVDF膜 1 1000 的抗肌動(dòng)蛋白 A5060 (Sigma)和 1 500 的兔抗 PYCRl (Proteintech)。
免疫熒光分析。對于免疫熒光，在磷酸緩沖鹽水(PBS)中洗滌細(xì)胞3次。在4% (重量/體積)的溶于IxPBS中的多聚甲醛中固定細(xì)胞10分鐘并用0.4% (體積/體積)的 Triton-XlOO (在3%的溶于IxPBS的BSA中)在4°C滲透10分鐘。在3% BSA中在4°C下過夜孵育1 500的針對PYCRl的特異性抗體(兔抗PYCRl (ftOteintech))和1 300的 P5CS (小鼠抗 P5CS (Abnova))。為了顯色，應(yīng)用抗小鼠 IgG Alexa Fluor 555 (Invitrogen, Molecular Probes)禾口抗兔 IgG Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Molecular Probes)綴合物。用 DAPI 染色 DNA 并用 Fluoromount (Scientific Services)封片細(xì)胞。使用 LSM 5IOmeta(Carl Zeiss, Gottingen, Germany)用 63 倍的 Plan Apochromat 油浸物鏡收集圖像。
線粒體形態(tài)學(xué)。在用過氧化氫(neoLab)處理后研究了線粒體網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)學(xué)。將細(xì)胞培養(yǎng)至50%匯合。在正常培養(yǎng)基中用每種物質(zhì)進(jìn)行了處理。對細(xì)胞加載IOOnM Mito Tracker Red CM_H2XRos(Invitrogen)。
將細(xì)胞與500 μ M H2O2孵育5分鐘。在4% (重量/體積)的溶于IxPBS中的多聚甲醛中在4°C固定細(xì)胞10分鐘。用DAPI染色DNA并用Fluoromount (Scientific Services) 封片細(xì)胞。使用BX60 Olympus顯微鏡隨機(jī)收集每個(gè)樣品的圖像并測定線粒體形態(tài)學(xué)。
凋亡測定。對于在過氧化氫(neoLab)處理后的凋亡測量，將細(xì)胞與200 μ M H2O2 在不存在FCS下孵育1小時(shí)。在脅迫期之后將培養(yǎng)基更換為具有0. 4% FCS的正常培養(yǎng)基并在正常條件下另外培養(yǎng)細(xì)胞M小時(shí)。使用補(bǔ)充5mM L-脯氨酸(Sigma-Adrich)的培養(yǎng)基進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)。在4% (重量/體積)的溶于IxPBS中的多聚甲醛中固定細(xì)胞10 分鐘并用0. 1 % (體積/體積)的"Triton-XlOO (在溶于IxPBS的3%的BSA中)在冰上滲透2分鐘。對于凋亡測定，根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行了 TUNEL測定(Roche)。在4% (重量/體積)的溶于IxPBS中的多聚甲醛中在4°C固定細(xì)胞10分鐘。用DAPI染色DNA并用 Fluoromount (Scientific Services)封片細(xì)胞。隨機(jī)收集圖片。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。每次測定分析了超過2000個(gè)細(xì)胞。
增殖測定。為了評估增殖率，將2.切104個(gè)細(xì)胞接種在蓋玻片上。將細(xì)胞在含有 10 μ M溴脫氧尿嘧啶(BrdU) (Roche)的培養(yǎng)基中孵育8小時(shí)。在M、48和72小時(shí)后在4% (重量/體積)的溶于IxPBS中的多聚甲醛中固定細(xì)胞10分鐘，并然后在3N HCL中在室溫16孵育10分鐘。用0. 1 % (體積/體積)的Triton-XlOO (在3%的溶于IxPBS的BSA中) 在4°C滲透細(xì)胞30分鐘。在室溫孵育1 500的針對BrdU的特異性抗體(G3G4) 1小時(shí)。 為了顯色，應(yīng)用抗小鼠 IgG Alexa Fluor 488 (Invitrogen，Molecular Probes)綴合物。用 DAPI染色DNA并用Fluoromount (Scientific Services)封片細(xì)胞。在含有10%透析過的 FCS的培養(yǎng)基中和在補(bǔ)充5mM L-脯氨酸(Sigma-Adrich)的培養(yǎng)基中也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
嗎啉代寡聚物和RNA注射。用于爪蟾Pycrl的25_bp嗎啉代(MO)反義寡聚物從 Gene Tools處獲得并由以下序列組成5' -AGCTCCTATGAAGCCCACACTCATG-3‘。根據(jù)制造商的說明在無菌水中重懸MO至ImM的濃度。在二至四細(xì)胞階段用如l(33ng MO/注射) 以放射狀注射胚胎4次。在四細(xì)胞階段以每個(gè)卵裂球200pg使用合成的人PYCRl cDNA的加帽mRNA用于挽救實(shí)驗(yàn)。對于斑馬魚實(shí)驗(yàn)，針對斑馬魚Pycrl和斑馬魚Pycr2的MO從 Gene Tools 處獲得DrPycrl_M0 5 ‘ -CAGCTCCGATAAATCCCACACTCAT-3 ‘和 DrPycr2_M0 5 ‘ -CCGCTCCAATGAAGCCCACACTCAT-3 ‘。在單細(xì)胞階段用 4nl (33ng MO/ 注射)或每種 MO (當(dāng)共同注射時(shí))注射胚胎。通過共同注射20pg或200pg人PYCRl加帽mRNA進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)，人PYCRl加帽mRNA使用SP6試劑盒(Ambion)體外轉(zhuǎn)錄得到。
胚胎學(xué)方法。受精、注射、整體原位雜交和TUNEL的實(shí)驗(yàn)方案可在http://WWW. reversade. com—a. googlepages. com/protocols 3°處找到。通過在黑暗中用溶于0. IX Barth 的吖啶橙O μ g/ml)孵育蝌蚪30分鐘進(jìn)行活胚胎上的細(xì)胞死亡分析。在用0. IX Barth多次洗滌后，用Leica DFC 300FX照相機(jī)在熒光GSOnm)下捕獲胚胎圖像。在階段22時(shí)，在切開小切口后通過腹部外胚層加入去絨毛膜胚胎上進(jìn)行聯(lián)體生活。在IX Barth中培養(yǎng)聯(lián)體生活胚胎直到痊愈并轉(zhuǎn)移至IX Steinberg溶液。使用配備來自Leica的I⑶照相機(jī)的立體顯微鏡M205FA在連續(xù)的焦平面上捕獲胚胎圖像。然后使用Wiotoshop CS3 將圖像合并為單張圖片。
產(chǎn)生用于皮膚移植的試驗(yàn)動(dòng)物。為了在試驗(yàn)動(dòng)物上得到分離的皮瓣，在裸小鼠的主題區(qū)的三側(cè)切開切口。在切割前，通過腹膜內(nèi)氯胺酮麻醉裸小鼠。從表1中提及的家族患者處得到人皮用于移植至裸小鼠。人皮移植物與在裸小鼠上產(chǎn)生的皮瓣具有大約相同的大小和結(jié)構(gòu)。人皮移植物或者立即使用，或在含10%牛血清的RPMI-1640中于4°C儲(chǔ)存至多約72小時(shí)或直到用于移植。為了將人皮移植物移植到裸小鼠上，用外科手術(shù)將人皮移植物附著在裸小鼠的分離的皮瓣區(qū)的皮下表面。在適當(dāng)?shù)牡胤娇p合皮瓣和人皮移植物，產(chǎn)生在皮層之間夾有脈管系統(tǒng)的夾層結(jié)構(gòu)，從而使基本上所有離開皮瓣的血液流經(jīng)分離的脈管系統(tǒng)。一旦人皮和裸小鼠的患病皮膚區(qū)長在一起形成整合的皮瓣，形成血管的皮瓣通過皮下通道移動(dòng)到小鼠背側(cè)，并在適當(dāng)?shù)牡胤娇p合用于檢測。為了防止對人皮移植物的排斥，為小鼠提供25mg/kg/天劑量的環(huán)孢霉素皮下注射。
檢索碼。GenbankRefseq DNA 智人(Homo sapiens)PYCRl 同種型A NM_006907. 2， 智人 PYCRl 同種型 B NM_153824. 1，光滑爪蟾(Xenopus laevis) PYCRl NM_001091619，斑馬魚(Danio rerio) PYCR1BC095;354 ；斑馬魚 PYCR2 BC060905。
描述本發(fā)明的說明性實(shí)施例
圖1具有PYCRl相關(guān)常染色體隱性早衰樣de Barsy綜合征的患者的表型特征。 (a)具有典型的三角形臉的來自家族DI的患病的9個(gè)月齡女嬰，(b)在來自家族DT的6 歲患病男童中的類似的臉部外觀。(c)來自家族TP的最初被診斷為皺皮綜合征的7歲患病女童。注意典型的臉部完全形態(tài)，包括凸頌，(d)在來自家族HB的患病個(gè)體中手背處的皮膚起皺和典型的內(nèi)收的拇指。(e_h)來自家族DI的患病個(gè)體的皮膚活檢中發(fā)現(xiàn)的情況。 (e, f)Weigert染色顯示，和對照相比在網(wǎng)狀真皮中稀疏、變薄和破碎的彈性纖維，比例尺 IOOym0 (g，h)超微結(jié)構(gòu)分析證實(shí)，和對照相比在來自家族DI的患病個(gè)體中顯著減少的彈性纖維(箭頭)大小和纖維狀和無定形成分二者的減少，比例尺500nm。(i)純合性作圖得到在染色體17q25上在rs8065431和rsl046896標(biāo)記物之間的2. 8Mb的最小候選區(qū)。僅顯示了 4個(gè)信息量最多的系譜。(j)基因組捕獲然后是最小候選區(qū)(從72. 05擴(kuò)展至78. 77Mb) 的下一代測序。在來自家族GO的患者中7次測序出胞嘧啶至胸腺嘧啶的序列變化。此堿基變化導(dǎo)致在PYCRl基因編碼的蛋白質(zhì)中的單個(gè)p.Argll9His突變。
圖2PYCR1突變的效果，(a)在來自對照和患者的原代皮膚成纖維細(xì)胞中的PYCRl 蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。ACTIN用作上樣對照。注意PYCRl表達(dá)在患病個(gè)體DI和SJ 中的缺乏，而EU和TP顯示了顯著的降低，(b-f)在皮膚成纖維細(xì)胞中PYCRl和P5CS的免疫熒光檢測，(b)在對照成纖維細(xì)胞中PYCRl和線粒體基質(zhì)蛋白P5CS共定位。在來自患者 DI(e)和SJ(d)的成纖維細(xì)胞中檢測不到PYCRl的免疫染色信號。相比之下，在來自TP(c) 和EU(d)的成纖維細(xì)胞中，在線粒體中的PYCRl染色和對照相比強(qiáng)度減少。注意在DI、W 和TP中異常的線粒體網(wǎng)絡(luò)。比例尺20 μ m。
圖3PYCR1的喪失導(dǎo)致對氧化脅迫的提高的敏感性。(a，b)線粒體形態(tài)學(xué)的超微結(jié)構(gòu)分析。盡管(a)在對照成纖維細(xì)胞中線粒體具有正常排列的嵴，但是(b)在來自患病個(gè)體DI的成纖維細(xì)胞中線粒體顯示了劇烈改變的嵴和減少的直徑，比例尺1 μ m。(c，d)在氧化脅迫下線粒體形態(tài)的改變。加入500 μ M H2O2至細(xì)胞培養(yǎng)基10分鐘導(dǎo)致來自家族SJ 的患病個(gè)體的成纖維細(xì)胞中線粒體網(wǎng)絡(luò)的坍塌(d)，在對照細(xì)胞中管狀線粒體網(wǎng)絡(luò)大部分保持完整(c)，比例尺20μπι。(e)在氧化脅迫下對線粒體形態(tài)學(xué)改變的定量。在沒有氧化脅迫時(shí)(灰色條)大多數(shù)對照(n = 2)和患者(n = 4)細(xì)胞展示管狀線粒體。觀察到僅少數(shù)具有破碎的或中間形態(tài)的細(xì)胞。相比之下，在氧化脅迫下(黑色條)，在患者細(xì)胞中具有破碎的線粒體的細(xì)胞數(shù)比在對照中的增加得更多。將來自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)平均。(f) 在氧化脅迫后M小時(shí)通過TUNEL定量凋亡細(xì)胞死亡。來自對照(n = 2)和患病個(gè)體(n = 4)的成纖維細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下(對照)在凋亡率中沒有差異。與200 μ M H2O2孵育10 分鐘后M小時(shí)在來自患病個(gè)體的細(xì)胞中觀察到凋亡的5倍增加(ρ = 0. 026)。將數(shù)字相對對照實(shí)驗(yàn)中的對照細(xì)胞歸一化(n = 1)。
圖4Pycrl爪蟾嗎啉突變體的表型。(a)從細(xì)菌、植物、昆蟲到脊椎動(dòng)物，PYCRl在進(jìn)化上是保守的。(b)用于爪蟾Pycrl的翻譯阻斷嗎啉代寡聚物的設(shè)計(jì)。(c)在階段30時(shí)的對照胚胎。(d)在四細(xì)胞階段在每個(gè)卵裂球中注射的Pycrl嗎啉突變體不能長出尾巴并具有發(fā)育不全的眼睛，(e)背部MO注射損傷眼睛但不損傷尾巴的發(fā)育，(f)腹部MO注射損害尾巴但不損傷眼睛的發(fā)育，提示Pycrl是細(xì)胞自主所必須的。白色箭頭指向皮膚皺紋，其在階段40時(shí)發(fā)育為外胚層水腫。(g)用前腦/中腦標(biāo)記物0tx2和體節(jié)標(biāo)記物MyoD染色的階段23的對照蝌蚪。(h)Pycrl的背部耗盡影響0tx2標(biāo)記的背前部結(jié)構(gòu)但不影響MyoD標(biāo)記的腹后部結(jié)構(gòu)。(i) Pycrl的腹部耗盡影響MyoD標(biāo)記的腹后部結(jié)構(gòu)但不影響0tx2標(biāo)記的背前部結(jié)構(gòu)。(j)在游泳蝌蚪階段的對照胚胎。(I)PycrlMO注射的胚胎經(jīng)歷嚴(yán)重的生長遲緩并在整個(gè)身體上展示大的外胚層水腫，(k)在階段45時(shí)的對照胚胎的組織學(xué)皮膚切片顯示由外側(cè)周皮和內(nèi)側(cè)知覺層組成的雙層表皮，(m)具有增大的細(xì)胞、核和細(xì)胞突出的表皮的瓦解的構(gòu)造。
圖5在Pycrl嗎啉突變體中的皮膚發(fā)育不全伴隨自發(fā)的凋亡并且不依賴于貧血， (a)在階段30時(shí)的對照胚胎。(a' ) (a)中顯示的胚胎的吖啶橙背景染色，(b)僅由腹部 MO注射造成的Pycrl嗎啉突變體。(b’ ) (b)中顯示的胚胎中垂死細(xì)胞的吖啶橙標(biāo)記(深綠)。注意僅胚胎的腹后部一半(來源于注射的腹部卵裂球)正經(jīng)歷凋亡。(c)在階段33 時(shí)的蝌蚪中的TUNEL染色指示少量凋亡細(xì)胞(插圖在階段25時(shí)的對照)。(d)Pycrl嗎啉突變體在階段33時(shí)相比對照具有顯著增加的垂死細(xì)胞數(shù)(插圖階段2 。(e)在階段 25時(shí)的Scl表達(dá)標(biāo)記了對照胚胎的腹部外胚層中原始造血作用的位點(diǎn)。(f)在遭受貧血的 Pycrl嗎啉突變體中缺乏Scl表達(dá)(補(bǔ)充圖5)。(g)在階段22時(shí)在Pycrl耗盡的蝌蚪(頂部)和對照(底部)之間進(jìn)行的聯(lián)體生活不能挽救凋亡(插圖階段33)、生長遲緩和皮膚缺陷，盡管共享血液循環(huán)(補(bǔ)充圖幻。(h)組織學(xué)染色顯示Pycrl聯(lián)體生活嗎啉突變體胚胎的表皮相比對照依然是無組織的，(i)在階段45時(shí)的聯(lián)體生活的對照蝌蚪表皮的組織學(xué)切片顯示正常的皮膚構(gòu)造。
圖9通過過表達(dá)人野生型Pycrl mRNA而不是突變體PycrlK215_D319del mRNA部分挽救Pycrl嗎啉突變體表型。(a)在階段42時(shí)的對照蝌蚪。(b)Pycrl耗盡的蝌蚪，(c) 注射了 800pg野生型人Pycrl的合成的mRNA的蝌蚪。(d)注射了 800pg野生型人Pycrl 的合成的mRNA的Pycrl耗盡的蝌蚪，注意相對b被挽救的生長遲緩。(e)注射SOOpg突變體K215-D319del人PYCRl合成的mRNA沒有效果，(f)注射800pg突變體K215_D319del人 PYCRl的合成的mRNA沒有挽救Pycrl耗盡的蝌蚪的生長遲緩。
圖10聯(lián)體生活減輕了在Pycrl嗎啉突變體中的血液缺陷，(a)在階段30時(shí)在對照蝌蚪中循環(huán)的紅血球和搏動(dòng)的心臟的動(dòng)畫。(b)在階段30時(shí)在Pycrl嗎啉突變體中搏動(dòng)的心臟的動(dòng)畫，盡管缺乏循環(huán)的紅血球，(c)在階段45時(shí)在聯(lián)體生活胚胎中Pycrl嗎啉突變體(頂部)和對照蝌蚪(底部)之間的共享的血液循環(huán)的動(dòng)畫。
圖11在斑馬魚中敲低Pycrl和Pycr2導(dǎo)致畸形、表皮萎縮和增加的凋亡。(a_h) 在階段24h時(shí)注射了 20pg人PYCRl mRNA的對照、Pycrl嗎啉突變體、Pycr2嗎啉突變體、 Pycrl+2嗎啉突變體和Pycrl+2嗎啉突變體斑馬魚。(f_h)在階段48h時(shí)注射了 20pg人 PYCRl mRNA的對照、Pycrl+2嗎啉突變體和Pycrl+2嗎啉突變體斑馬魚。注意嗎啉突變體魚的減少的長度、異常彎曲的尾巴和卵黃囊周圍的表皮的松散。當(dāng)Pycrl和Pycr2同時(shí)被敲低時(shí)表型的嚴(yán)重程度增加。在用20pg人PYCRl mRNA挽救嗎啉突變體表型后僅觀察到輕微的變化。(i，j)在Pycrl+2嗎啉突變體中的真皮萎縮。在48小時(shí)大的對照魚中(i)雙層表皮圍繞卵黃囊。在Pycrl+2嗎啉突變體中此表皮是萎縮的。Goldner三色染色，(k_m) 在階段24h時(shí)凋亡細(xì)胞的吖啶橙染色。注意在嗎啉突變體中凋亡細(xì)胞數(shù)的顯著增加和共注射人PYCRl mRNA后表型的幾乎完全逆轉(zhuǎn)。(n_p)尾巴中凋亡細(xì)胞的吖啶染色，較高的放大倍數(shù)。
圖12顯示了 PYCRl基因的氨基酸序列(Swiss Prot檢索號P32322)。
在此說明書中對以前出版的文獻(xiàn)的列表或討論沒有必要被視為承認(rèn)所述文獻(xiàn)是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或是一般的普通知識(shí)。所有列出的文獻(xiàn)以其整體引入本文作為參考。
已在本文中寬泛地和一般地描述了本發(fā)明。在所述一般公開范圍內(nèi)的每個(gè)較狹義的種類和亞屬組也構(gòu)成本發(fā)明的部分。這包括本發(fā)明的一般性描述以及從屬中去除任一主題的條件或否定性限制，不管去除的內(nèi)容是否在本文中特別引用。
其他實(shí)施方案在以下權(quán)利要求范圍內(nèi)。另外，當(dāng)依照馬庫什組描述本發(fā)明的特征或方面時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將承認(rèn)因此也依照馬庫什組的任意單個(gè)成員或成員的亞組描述本發(fā)明。
在本說明書中引用了以下參考文獻(xiàn)
1. Kielty,CM. Elastic fibres in health and disease. Expert Rev Mol Med 8， 1-23(2006).
2. Zhang,M. C. et al· Cutis Iaxa arising from frameshift mutations in exon 30 of the elastin gene (ELN). J Biol Chem 274,981-6(1999).
3. Megarbane, H. et al. An Autosomal-Recessive Form of Cutis Laxa Is Due to Homozygous Elastin Mutations， and the Phenotype May Be Modified by a Heterozygous Fibulin 5 Polymorphism. J Invest Dermatol(2009).
4. Hucthagowder，V. et al. Fibulin-4 :a novel gene for an autosomal recessive cutis Iaxa syndrome. Am J Hum Genet 78，1075-80 (2006) ·
5. Loey s, B. et al. Homozygosity for a mi ssense mutation in fibulin-5 (FBLN5)results in a severe form of cutis laxa. Hum Mol Genet 11， 2113-8(2002).
6. Hennies,H. C. et al. Gerodermia osteodysplastica is caused by mutations in SCYL1BP1,a Rab-6 interacting golgin. Nat Genet 40,1410-2(2008).
7. Kornak, U. et al. Impaired glycosylation and cutis laxa caused by mutations in the vesicular H+-ATPase subunit ATP6V0A2. Nat Genet 40,32-4(2008).
8. de Barsy, A. M.，Moens，E. & Dierckx, L. Dwarfism, oligophrenia and degeneration of the elastic tissue in skin and cornea. A new syndrome ？ HelvPaediatr Acta 23，305-13 (1968).
9. Van Maldergem，Let al. Cobblestone-like brain dysgenesis and altered glycosylation in congenital cutis laxa, Debre type. Neurology 71，1602-8 (2008) ·
10. Kivuva, E. C.，Parker，M. J.，Cohen，M. C.，Wagner, B. E. & Sobey, G. De Barsy syndrome :a review of the phenotype. Clin Dysmorphol 17，99-107(2008) ·
11. Al-Gazal i , L. I.，Sztriha，L.，Skaff，F(xiàn). & Haas，D. Gerodermia osteodysplastica and wrinkly skin syndrome :are they the same ？ Am J Med Genet 101,213-20(2001).
12. Hamamy, H.，Masri, Α. & Ajlouni，K. Wrinkly skin syndrome. Clin Exp Dermatol 30,590-2(2005).
13. Nanda, A. et al. Gerodermia osteodysp1astica/wrinkly skin syndrome report of three patients and brief review of the literature.Pediatr Dermatol 25,66-71(2008).
14. Kunze, J. et al. De Barsy syndrome—an autosomal recessive, progeroid syndrome. Eur J Pediatr 144，348—54 (1985).20
15. Rajab,A. et al. Geroderma Osteodysplasticum and Wrinkly Skin Syndrome in 22patients from Oman. Am J Med Genet (in press) (2008).
16. Guerra，D. et al. The De Barsy syndrome. J Cutan Pathol 31， 616-24(2004).
17. Martin，G. M. Genetic modulation of senescent phenotypes in Homo sapiens. Cell 120，523-32 (2005).
18. Mitsubuchi, H.，Nakamura, K.，Matsumoto, S. & Endo, F. Inborn errors of proline metabolism. J Nutr 138,2016S-2020S (2008).
19. Baumgartner, M.R.et al. Deltal-pyrroline-5-carboxylate synthase deficiency :neurodegeneration, cataracts and connective tissue manifestations combined with hyperammonaemia and reduced ornithine， citrulline， arginine and proline.Eur J Pediatr 164,31-6(2005).
20. Bicknell, L.S.et al. A missense mutation in ALDH18A1，encoding Deltal-pyrroline-5-carboxylate synthase (P5CS)，causes an autosomal recessive neurocutaneous syndrome. Eur J Hum Genet 16，1176-86 (2008) ·
21. Baumgartner，M. R. et al. Hypera mmonemia with reduced ornithine， citrulline, arginine and proline :a new inborn error caused by a mutation in the gene encoding delta(1) -pyrroline-5-carboxylate synthase. Hum Mol Genet 9， 2853-8(2000).
22. Hucthagowder, V. et al. Loss-of-Function Mutations in ATP6V0A2 Impair Vesicular Trafficking，Tropoelastin Secretion，and Cell Survival. Hum Mol Genet (2009).
23. Krishnan，N.，Dickman，M. B. & Becker，D. F. Proline modulates the intracellular redox environment and protects mammalian cells against oxidative stress. Free Radic Biol Med 44,671-81(2008).
24. Phang, J. M.，Pandhare, J. & Liu, Y. The metabolism of proline as microenvironmental stress substrate. J Nutr 138，2008S-2015S (2008) ·
25. Hagedorn，C. H. & Phang，J. M. Transfer of reducing equivalents into mitochondria by the interconversions of pro line and delta 1-pyrroline-5-carboxylate. Arch Biochem Biophys 225，95-101 (1983) ·
26. Meng, Z. et al. Crystal structure of human pyrroline-5-carboxylate reductase. J Mol Biol 359,1364-77(2006).
27. Balaban，R. S.，Nemoto, S. & Finkel，Τ. Mitochondria，oxidants, and aging. Cell 120,483-95(2005).
28. Abecasis，G. R.，Cherny, S. S.，Cookson，W. 0. & Cardon, L R. Merlin—rapid analysis of dense genetic maps using sparse gene flow trees. Nat Genet 30， 97-101 (2002)
29.Thiele，H. & Nurnberg，P. HaploPainter :a tool for drawing pedigrees with complex haplotypes. Bioinformatics 21，1730—2 (2005) ·
30. Hensey, C. & Gautier, J. Programmed cell death during Xenopus development :a spatio-temporal analysis. Dev Biol 203，36-48 (1998) ·
31. Picoult-Newberg L，et al，Mining SNPs from EST databases，Genome Res. 9(1999) 167-174
32. Altshuler D. et al.，An SNP map of human genome generated by reduced representation shotgun sequencing，Nature 407 (2000)513-516.
33.USPatentNo.5，432，272
34.USPatentNo.6，143，877
35.usPatentNo.6，127，121
36.usPatentNo.4，677，968
權(quán)利要求
1.吡咯啉-5-羧酸還原酶I(PYCRl)的突變蛋白，其中在如Swiss-Prot檢索號P32322 所示的PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第4至220位和第222至266位中的至少1個(gè)氨基酸殘基被突變。
2.PYCRl的突變蛋白，其包含如Swiss-Prot檢索號P32322所示的PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第4至266位中的至少1個(gè)氨基酸殘基的突變，其中所述突變導(dǎo)致該突變蛋白相比于野生型蛋白降低的功能或功能的喪失。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的突變蛋白，其中在序列第4、119、179、189、206、251、257和266 位的至少1個(gè)氨基酸殘基被突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的突變蛋白，其中在序列第4位的氨基酸殘基的突變是移碼突變，所述移碼突變導(dǎo)致編碼PYCRl的野生型氨基酸序列的序列第50位的密碼子為翻譯終止密碼子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的突變蛋白，其中在序列第119位的氨基酸殘基被甘氨酸或組氨酸替換。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的突變蛋白，其中在序列第179位的氨基酸殘基被親水性氨基酸替換。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的突變蛋白，其中所述親水性氨基酸是含有羥基的氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的突變蛋白，其中含有羥基的氨基酸是絲氨酸或蘇氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的突變蛋白，其中在序列第189位的氨基酸殘基被疏水性氨基酸替換。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的突變蛋白，其中所述疏水性氨基酸是脂肪族氨基酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的突變蛋白，其中所述脂肪族氨基酸選自異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求3的突變蛋白，其中在序列第206位的氨基酸殘基被芳香族氨基酸替換。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的突變蛋白，其中所述芳香族氨基酸選自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求3的突變蛋白，其中在序列第206位的氨基酸殘基被正電荷氨基酸替換。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的突變蛋白，其中所述正電荷氨基酸是精氨酸或賴氨酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求3的突變蛋白，其中在序列第251位的氨基酸殘基被組氨酸替換。
17.根據(jù)權(quán)利要求3的突變蛋白，其中在序列第257位的氨基酸殘基被親水性氨基酸替換。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的突變蛋白，其中所述親水性氨基酸是含有羥基的氨基酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的突變蛋白，其中所述含有羥基的氨基酸是絲氨酸或蘇氨酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求3的突變蛋白，其中在序列第266位的氨基酸殘基被谷氨酰胺或天冬酰胺替換。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中在如Swiss-Prot檢索號P32322 所示的PYCRl的野生型氨基酸序列的至少1個(gè)氨基酸殘基的突變是單核苷酸多態(tài)性(SNP) 或選自取代、缺失、插入及其組合。
22.包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的核酸分子，其中在所述核苷酸序列上插入或缺失至少一個(gè)核苷酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的核酸分子，其中所述核苷酸序列的至少一個(gè)剪接位點(diǎn)被突變。
25.測定受試者中具有與吡咯啉-5-羧酸還原酶I(PYCRl)有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的傾向的方法，所述方法包括分析從受試者得到的核酸樣品中編碼根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的突變蛋白的核苷酸序列的存在，其中所述核苷酸序列的存在指示受試者患上或有風(fēng)險(xiǎn)患上年齡相關(guān)疾病的傾向。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述年齡相關(guān)疾病選自皮膚松弛(皺皮綜合征)、De Barsy綜合征和骨發(fā)育異常性老年?duì)钇つw。
27.包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子在診斷或測定患上與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的傾向中的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述年齡相關(guān)疾病選自皮膚松弛(皺皮綜合征)、De Barsy綜合征和骨發(fā)育異常性老年?duì)钇つw。
29.鑒定能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物的方法，所述方法包括a.使目的化合物接觸包含編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶I(PYCRl)或其功能片段或突變體的核苷酸序列的核酸分子，和b.測量編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶I(PYCRl)或其功能片段或功能突變體的核苷酸序列的表達(dá)。
30.根據(jù)權(quán)利要求四的方法，其還包括將從步驟(b)得到的測量結(jié)果與未加入目的化合物的對照測量相比較。
31.根據(jù)權(quán)利要求四或30的方法，其中所述化合物增加PYCRl基因的表達(dá)。
32.修飾PYCRl基因在細(xì)胞中的表達(dá)的方法，所述方法包括將包含編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶I(PYCRl)或其功能片段或功能突變體的核苷酸序列的核酸分子引入細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述PYCRl基因的表達(dá)提高。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33的方法，其中所述細(xì)胞被包含在哺乳動(dòng)物中。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人或嚙齒動(dòng)物。
36.根據(jù)權(quán)利要求32至35中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸分子與調(diào)控序列有效連接以允許所述核酸分子表達(dá)。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述調(diào)控序列包含啟動(dòng)子序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37的方法，其中所述核酸分子被包含在載體中。
39.治療患有與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病或具有患上與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，所述方法包括將包含編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶1 (PYCRl)或其功能片段或功能突變體的核苷酸序列的核酸分子引入受試者。
40.治療患有與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病或具有患上與PYCRl有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，所述方法包括對受試者施用能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述化合物已通過權(quán)利要求四的方法鑒定。
42.基因改造的動(dòng)物，其中所述基因改造的動(dòng)物包含編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶·1 (PYCRl)的核酸，并且其中所述核酸是失活的。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的基因改造的動(dòng)物，其中所述失活的核酸導(dǎo)致PYCRl的功能喪失。
44.根據(jù)權(quán)利要求42或43的基因改造的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物是爪蟾或魚。
45.根據(jù)權(quán)利要求42至44中任一項(xiàng)的基因改造的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的基因改造的動(dòng)物，其中所述哺乳動(dòng)物是人或嚙齒動(dòng)物。
47.修飾PYCRl基因在動(dòng)物中表達(dá)的方法，所述方法包括對動(dòng)物施用能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述化合物包含能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的核酸分子。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述核酸分子選自反義RNA、短干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、肽核酸(PNA)及其組合。
50.鑒定能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物的方法，所述方法包括a.對根據(jù)權(quán)利要求42至46中任一項(xiàng)的動(dòng)物施用目的化合物；和b.測定所述化合物是否能夠修飾PYCRl基因的表達(dá)。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述化合物增加PYCRl基因的表達(dá)。
52.根據(jù)權(quán)利要求50或51的方法，其中將所述化合物以化妝品組合物的形式配制。
53.鑒定能夠修飾PYCRl基因表達(dá)的化合物的方法，所述方法包括a.提供包含至少一層活動(dòng)物皮的分離的皮瓣，所述皮瓣被附著在試驗(yàn)動(dòng)物上；和b.對該活動(dòng)物皮應(yīng)用目的化合物。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中所述皮瓣包括表達(dá)如權(quán)利要求1至21任一項(xiàng)中定義的突變蛋白的細(xì)胞。
55.根據(jù)權(quán)利要求M的方法，其中所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
56.根據(jù)權(quán)利要求53至55中任一項(xiàng)的方法，其中所述皮瓣還包含一層活動(dòng)物皮。
57.根據(jù)權(quán)利要求53至56中任一項(xiàng)的方法，其中所述皮瓣在一個(gè)表面包含活人皮并且在另一個(gè)表面包含活動(dòng)物皮。
58.根據(jù)權(quán)利要求53至57中任一項(xiàng)的方法，其中所述皮瓣由分離的脈管系統(tǒng)供給。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中所述分離的脈管系統(tǒng)附著在試驗(yàn)動(dòng)物上。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其進(jìn)一步包括從分離的脈管系統(tǒng)中取出至少一個(gè)血液樣品，其中分析取出的血液含量。
61.根據(jù)權(quán)利要求53至59任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括從所述皮瓣得到DNA樣品以測量PYCRl基因的表達(dá)。
62.根據(jù)權(quán)利要求53至61任一項(xiàng)的方法，其中所述活動(dòng)物皮與試驗(yàn)動(dòng)物是相同或不同的物種。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述試驗(yàn)動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人或嚙齒動(dòng)物。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠、大鼠、松鼠、花栗鼠、囊地鼠、箭豬、海貍、倉鼠、沙鼠、豚鼠、南美栗鼠、草原土撥鼠和土撥鼠。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物是無胸腺的。
67.根據(jù)權(quán)利要求53至66中任一項(xiàng)的方法，其中將所述目的化合物配制為化妝品組合物的形式。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中所述化妝品組合物選自凝膠、軟膏、乳膏、洗劑、精華素、糊劑、肥皂、氣溶膠、可溶性片劑、粉末、棒狀物、水基或油基懸浮劑和乳劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及吡咯啉-5-羧酸還原酶1(PYCR1)的突變蛋白，包含編碼這些突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子，測定在受試者中患上與PYCR1有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的傾向的方法，鑒定能夠修飾PYCR1的表達(dá)的化合物的方法，和治療患有與PYCR1有關(guān)的年齡相關(guān)疾病的受試者的方法。本發(fā)明還涉及基因改造的動(dòng)物和修飾PYCR1基因在動(dòng)物中的表達(dá)的方法。
文檔編號A61P43/00GK102482337SQ201080022686
公開日2012年5月30日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者B·勒韋薩德, S·蒙德勒斯 申請人:新加坡科技研究局