專利名稱：一種具有高效殺菌活力的抗菌蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有高效殺菌活力的抗菌蛋白，及其在制備抑菌劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
國(guó)際上赫赫有名的醫(yī)學(xué)權(quán)威期刊《柳葉刀》刊登了一篇關(guān)于“超級(jí)細(xì)菌”的研究報(bào)告，報(bào)告稱發(fā)現(xiàn)了一種具有多重抗藥性、幾乎能抵抗所有抗生素的危險(xiǎn)基因突變產(chǎn)物—— 含有新德里金屬蛋白酶-I(NDM-I)的“超級(jí)細(xì)菌”。目前，研究人員在印度和巴基斯坦確認(rèn)病例逾百人，在英國(guó)確認(rèn)了 37名患者，類似的“超級(jí)細(xì)菌”感染也出現(xiàn)在美國(guó)、加拿大、澳大利亞和荷蘭等國(guó)。濫用抗生素是出現(xiàn)超級(jí)細(xì)菌的原因?？股卣Q生之初曾是殺菌的神奇武器，但細(xì)菌也逐漸進(jìn)化出抗藥性。由于新型抗生素的研發(fā)速度相對(duì)較慢，研制一種抗生素大約需要10年時(shí)間，而產(chǎn)生耐藥菌素卻在2年之內(nèi)，抗生素的研制速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上耐藥菌的繁殖速度。對(duì)付超級(jí)細(xì)菌已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的一個(gè)難題。超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，一方面告訴我們要合理使用抗生素，一方面要加快抗菌藥物研發(fā)的步伐。一種新的、有效的、安全的抗病原微生物的武器。其獨(dú)特的作用方式使其有望解決傳統(tǒng)抗生素長(zhǎng)期使用帶來(lái)的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品工業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。如上所述，抗菌藥物的研發(fā)周期比較長(zhǎng)，如何縮短耐藥菌產(chǎn)生抗性時(shí)間的差距，最簡(jiǎn)便的方法就是在已有的抗菌藥物的基礎(chǔ)上進(jìn)行分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)改造，提高殺菌效價(jià)。這樣的做的好處就是“短平快”——投資少、周期短、見(jiàn)效快、效益高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種具有顯著抑菌效果的抗菌蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種具有顯著抑菌效果的抗菌蛋白，具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。經(jīng)序列結(jié)構(gòu)分析和序列比較分析，顯示該蛋白酶為噬菌體中內(nèi)溶素，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，該序列全部具有較好的殺菌活性。所述抗菌蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，命名為蛋白，其編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明還涉及所述的抗菌蛋白在制備抑菌劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明抗菌蛋白，高效、低毒、應(yīng)用廣泛，通過(guò)市場(chǎng)上已有的合適表達(dá)載體表達(dá)、純化后，體外對(duì)一系列病原菌表現(xiàn)出顯著的殺菌效果，可用于抑菌劑的制備。


圖1為電鏡圖片LL37、E蛋白和&17(；蛋白對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響；A為空載體在E. coli T0P10對(duì)照；B為L(zhǎng)L37在E. coli T0P10中誘導(dǎo)；C為E蛋白在E. coli T0P10中誘導(dǎo)；D為 Ee17g 在 Ecoli T0P10 中誘導(dǎo)；E 為 Ee17g 在 P. aeruginosa 中誘導(dǎo)。
圖2為L(zhǎng)L37 (A)、E(B)、^17e(C)體內(nèi)表達(dá)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響；圖3為L(zhǎng)L37(A)、E蛋白⑶和蛋白(C)體內(nèi)表達(dá)對(duì)銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)影響。圖4為對(duì)內(nèi)溶素E和進(jìn)行結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)分析預(yù)測(cè)比較；A為內(nèi)溶素E蛋白的三維結(jié)構(gòu)，B為E蛋白的結(jié)合位點(diǎn)分析；C為本發(fā)明蛋白的三維結(jié)構(gòu)，D為本發(fā)明蛋白的結(jié)合位點(diǎn)分析；圖B、D中透明球狀圖表示蛋白與配體的結(jié)合位點(diǎn)；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 以大腸桿菌和銅綠假單胞為靶細(xì)菌體內(nèi)LL37抗菌肽，內(nèi)溶素為對(duì)照，進(jìn)行&17(；對(duì)細(xì)胞形態(tài)電鏡比較LL37是含有37個(gè)氨基酸在人體內(nèi)唯一產(chǎn)生的抗菌肽，目前已經(jīng)證明對(duì)多種病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等有廣泛的抑菌效果。本發(fā)明中，首先根據(jù)已經(jīng)發(fā)發(fā)現(xiàn)的LL37核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)238(^6)，通過(guò)上海生工合成了 LL37基因。把 LL37基因連接到pHERD30t載體(美國(guó)馬歇爾大學(xué)于宏偉教授惠贈(zèng))，構(gòu)成pHERD30t_1137 重組子。通過(guò)電激法把重組子導(dǎo)入大腸桿菌中。在含有慶大霉素的LB平板上篩選出重組子。重組子在生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)加入0. 的阿拉伯糖誘導(dǎo)物，同樣，克隆出了內(nèi)溶素E基因 (SEQ ID NO :4)，按著同樣的方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進(jìn)行內(nèi)溶素蛋白的表達(dá)。隨后對(duì)內(nèi)溶素E 基因進(jìn)行易錯(cuò)PCR，通過(guò)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，篩選出了活力最強(qiáng)的內(nèi)溶素蛋白&17e。以空載體誘導(dǎo)、LL37和E蛋白誘導(dǎo)與&17(；誘導(dǎo)后的電鏡比較觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空載體誘導(dǎo)后，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整無(wú)缺。而LL37、E蛋白(SEQ ID NO 3)和^7g蛋白(SEQ ID NO 1)誘導(dǎo)后對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜造成了很大的影響，使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生了不規(guī)則變化。結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)施例2 以大腸桿菌為靶細(xì)菌測(cè)試內(nèi)溶素蛋白抑菌效果從雞新鮮糞便中分離出一株大腸桿菌的烈性噬菌體WL08。經(jīng)分子鑒定，該噬菌體和已發(fā)表的大腸桿菌噬菌體RB69有較高的相似性，根據(jù)已公布的RB69的基因預(yù)測(cè)，克隆出該噬菌體的內(nèi)溶素蛋白(E蛋白)。利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)內(nèi)溶素蛋白進(jìn)行隨機(jī)突變。通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)曲線的觀察，選取殺菌最強(qiáng)的蛋白，隨后對(duì)其核苷酸和氨基酸進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與內(nèi)溶素E蛋白相比，發(fā)生一個(gè)點(diǎn)突變，由氨基酸序列中的17位Glu突變成Gly，命名為^7e。 以其為基礎(chǔ)，測(cè)試本發(fā)明所述的抗菌蛋白。選取抗菌肽基因1137與原始內(nèi)溶素e基因作為對(duì)照，將所得克隆的編碼序列與PHERD30T載體進(jìn)行連接，電激法對(duì)構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中。重組子在生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)加入0. 1 %的阿拉伯糖誘導(dǎo)物，每個(gè)小時(shí)取樣在0D_ 下測(cè)吸光度，結(jié)果如圖2所示。&17(；基因表達(dá)的蛋白在體內(nèi)對(duì)大腸桿菌抑制效果最強(qiáng)，比已知抗菌效果好的抗菌肽還要強(qiáng)。實(shí)施例3 以銅綠假單胞菌為靶細(xì)菌測(cè)試內(nèi)溶素&17(；蛋白抗菌效果為了進(jìn)一步尋找出對(duì)銅綠假單胞菌有明顯殺菌效果的抗菌蛋白序列，將上述實(shí)施例 2 中的三段基因，1137 和 e(SEQ ID NO 4)禾口 eE17G(SEQID NO 2)連接至Ij pHERD30t 載體上，通過(guò)電激法導(dǎo)入銅綠假單胞菌PAOl中。重組子在生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)加入1.8%的阿拉伯糖誘導(dǎo)物，每個(gè)小時(shí)取樣在0D_下測(cè)吸光度。和對(duì)照重組子相比，在銅綠假單胞菌PAOl體內(nèi)表達(dá)^17e基因?qū)Π屑?xì)菌有很好的抑制作用(見(jiàn)圖3)。其余的蛋白和多肽對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果不明顯。實(shí)施例4 對(duì)噬菌體的內(nèi)溶素和E蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)和配體結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。由于內(nèi)溶素蛋白和E蛋白之間相差一個(gè)氨基酸，但是其蛋白具有更高的抑菌能力，甚至高于人源性陽(yáng)性離子抗菌肽LL37，所以利用分子模擬技術(shù)對(duì)內(nèi)溶素的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，找出它們之間的差異。其模擬的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)溶素&17(；蛋白與 E蛋白結(jié)構(gòu)略有不同、結(jié)合位點(diǎn)也全部發(fā)生變化，說(shuō)明其空間結(jié)構(gòu)對(duì)其活性的影響很大。Ee17g蛋白配體的結(jié)合位點(diǎn)有13個(gè)，分別如下=ILE :73、LEU :79、VAL :82、TYR :83、 LEU 86, LEU 94, MET 97, VAL 98, VAL 106, PHE 109, LEU 113, LEU 116, PHE :148。而內(nèi)溶素E蛋白配體的結(jié)合位點(diǎn)有13個(gè)，分別如下GLU :6、ASP 15,GLU 17,GLY 25, HIS :26, LEU 27, ASP :65、VAL 98, PHE :99、GLN 100、MET =IOUGLY :102, TRP :133。
權(quán)利要求
1.一種具有高效殺菌活性的抗菌蛋白，具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白，其特征在于所述抗菌蛋白氨基酸序列如SEQID NO 1所示。
3.編碼權(quán)利要求2所述抗菌蛋白的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQID NO 2所示。
4.如權(quán)利要求1或2所述的抗菌蛋白在制備抑菌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有高效殺菌活力的抗菌蛋白，及其在制備抑菌劑中的應(yīng)用。該抗菌肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，經(jīng)序列結(jié)構(gòu)分析和序列比較分析，顯示該蛋白酶為噬菌體中內(nèi)溶素，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，該蛋白具有較好的殺菌活性。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明抗菌蛋白，高效、低毒、應(yīng)用廣泛，通過(guò)市場(chǎng)上已有的合適表達(dá)載體表達(dá)、純化后，體外對(duì)一系列病原菌表現(xiàn)出顯著的殺菌效果，可用于抑菌劑的制備。
文檔編號(hào)A61K38/16GK102153631SQ20101060566
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月25日
發(fā)明者劉偉, 王欣, 董世雷 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院