專利名稱：高效細(xì)胞核靶向藥物載體及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有高效穿透細(xì)胞膜作用和細(xì)胞核 靶向作用的高效細(xì)胞核靶向藥物載體及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前臨床上使用的抗腫瘤藥物主要的作用機(jī)理是針對(duì)核酸合成過程中的不同環(huán) 節(jié)，因此希望抗腫瘤藥物能夠穿過腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜并能迅速進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮藥物作 用。所以提高抗腫瘤藥物的穿越細(xì)胞膜的能力和核靶向性，快速到達(dá)作用部位，這是當(dāng)今迫 切需要解決的科學(xué)問題?；熢谝欢ǔ潭壬涎娱L(zhǎng)了患者的生存期，但同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的損傷也很大，尤其 是在全身使用化療藥物時(shí)，藥物通過血液循環(huán)達(dá)到人體的各個(gè)組織并對(duì)正常細(xì)胞也產(chǎn)生了 殺傷作用，引起全身的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響治療的最終效果。因此，治療腫瘤藥物的細(xì)胞靶 向和進(jìn)一步的細(xì)胞核靶向一直是生物醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)問題，其中尤其是新型抗腫瘤藥物的核 靶向載體的研發(fā)顯得尤為重要，也是一直以來研究者不懈努力的目標(biāo)。從抗腫瘤藥物靶向治療的角度看，把藥物定向地輸入到腫瘤發(fā)生的部位，臨床上 已采用的介入治療，就是將抗癌藥物直接注入腫瘤發(fā)生的靶器官，以消除癌塊，這是器官水 平的靶向治療。然而，由于目前臨床上使用的抗腫瘤藥物主要的作用機(jī)理是針對(duì)核酸合成 過程中的不同環(huán)節(jié)，輸入到腫瘤發(fā)生的部位的抗腫瘤藥物必須要迅速進(jìn)入腫瘤細(xì)胞以及細(xì) 胞核，才能達(dá)到迅速殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。例如阿霉素(Adriamycin/Doxorubicin，ADM)通 過抑制細(xì)胞核內(nèi)DNA及RNA的合成達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的作用。因此，抗腫瘤藥物載體應(yīng)該 不僅能快速運(yùn)載治療性藥物穿過腫瘤細(xì)胞膜，而且能使治療藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞發(fā)揮藥效的 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這樣才能既不影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低藥物的毒副作用，又能充分發(fā)揮抗腫 瘤藥物的藥效。因此，抗腫瘤細(xì)胞藥物載體的核靶向功能至關(guān)重要，是長(zhǎng)期以來影響抗腫瘤 藥物藥效性的關(guān)鍵。1988年著名的科學(xué)雜志“Cell”報(bào)道的人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白及隨后 報(bào)道的單純皰疹病毒的VP22蛋白，它們的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高于目前所有的基因治療載體。進(jìn)一步 研究表明HIV-TAT、VP22蛋白等能夠穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞是因?yàn)樵谶@些蛋白質(zhì)分子中包 含了由幾個(gè)或幾十個(gè)氨基酸殘基組成的并且富含精氨酸(Arginine，Arg)的肽鏈，稱為穿 膜序列。隨后對(duì)穿膜序列的研究證實(shí)它與各種大分子或生物活性治療藥物偶聯(lián)后能攜帶 原先不能進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)揮其細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。 穿膜序列的發(fā)現(xiàn)為我們尋找高效抗腫瘤藥物載體提供了思路，也為我們尋找抗腫瘤藥物的 穿膜運(yùn)載載體奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型抗腫瘤藥物的載體，它能攜帶抗腫瘤藥物快速穿過 腫瘤細(xì)胞膜屏障并能靶向性地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的高效性殺傷，降低抗腫瘤藥物的使用劑量，降低對(duì)正常細(xì)胞毒副作用。本發(fā)明提供的這種新型高 效抗腫瘤藥物的載體是一種具有細(xì)胞核靶向性的蛋白質(zhì)，可以在制備抗腫瘤藥物中得到廣 泛的應(yīng)用。本發(fā)明從運(yùn)載抗腫瘤藥物穿膜和抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的亞細(xì)胞位點(diǎn)這兩個(gè)方面 入手，開發(fā)出雙重功效性藥物載體。這種藥物載體既能使攜帶的藥物快速穿過細(xì)胞膜屏障， 使藥物快速進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，又能迅速介導(dǎo)抗腫瘤藥物的入核轉(zhuǎn)運(yùn)，使藥物有效進(jìn)入細(xì)胞核 從而發(fā)揮殺滅腫瘤細(xì)胞的作用。使用本發(fā)明的藥物載體能減少抗腫瘤藥物的使用劑量，并 顯著降低了藥物的毒副作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的高效殺滅。迄今為止國內(nèi)外尚未報(bào)道過本發(fā)明的高效細(xì)胞核靶向藥物載體。尚未見用這種藥 物載體提高抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細(xì)胞能力的報(bào)道。本發(fā)明所述的一種高效細(xì)胞核靶向藥物載體，該藥物載體蛋白包含至少一個(gè)核定 位序列、至少一個(gè)穿膜序列和至少一個(gè)多聚組氨酸肽序列，核定位序列通過至少一個(gè)共價(jià) 鍵與所述的穿膜序列相偶聯(lián)，所述的多聚組氨酸肽序列通過至少一個(gè)共價(jià)鍵與所述的核定 位序列或穿膜序列相偶聯(lián)，形成三者的線性重組蛋白。其中所述的核定位序列是來自人體蛋白的多肽序列，具有單一的核靶向功能，其 具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，所述的穿膜序列具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序 列，所述的多聚組氨酸肽序列具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。進(jìn)一步，前面所述的一種高效細(xì)胞核靶向藥物載體的多聚組氨酸肽序列位于該藥 物載體蛋白的N末端或者C末端。共價(jià)鍵是肽鍵。進(jìn)一步，該藥物載體蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。前面所述的一種高效細(xì)胞核靶向藥物載體在制備抗腫瘤藥物中的具有廣泛應(yīng)用。 該藥物載體通過至少一個(gè)共價(jià)鍵與抗腫瘤藥物相偶聯(lián)，形成高效核靶向載體-抗腫瘤藥物 的共價(jià)偶聯(lián)物?？鼓[瘤藥物為阿霉素ADM、阿糖胞苷CPT、雷替曲塞Raltitrexed或順鉬 Cisplatin Injection0進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及一種編碼前面所述的高效細(xì)胞核靶向藥物載體蛋白的基 因，其具有SEQ ID NO :5所示的DNA序列。本發(fā)明還涉及一種重組表達(dá)載體，其是SEQ ID NO 5所示DNA序列的基因與表達(dá)載體pEI^8a、pMA5或pGT22重組構(gòu)建的重組表達(dá)載體。本發(fā)明實(shí)施例1中的高效細(xì)胞核靶向藥物載體的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所 示，它是SEQ ID NO :1序列與SEQ ID NO :2序列和SEQ ID NO :3序列順次重組而成，實(shí)施例 2中所制備的“細(xì)胞核靶向載體-抗腫瘤藥物”的共價(jià)偶聯(lián)物中，載體的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示，抗腫瘤藥物是阿霉素(AdriamyCin，ADM)，實(shí)施例3中“細(xì)胞核靶向載體-抗 腫瘤藥物”的共價(jià)偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞有效性殺傷作用中，所應(yīng)用的靶細(xì)胞是Hela細(xì)胞。本發(fā)明的特點(diǎn)是以來自人體蛋白的核定位序列為藥物載體蛋白的核心序列，同時(shí) 重組了穿膜序列，充分體現(xiàn)出載體蛋白的穿膜功能和核靶向性，使本發(fā)明的抗腫瘤藥物載 體具有雙重功效。


圖1 實(shí)施例1制備的pMA5-PP107H重組表達(dá)載體的測(cè)序譜圖；圖2 實(shí)施例1制備的重組表達(dá)載體pMA5-PP107H構(gòu)建示意圖3 純化得到的重組藥物載體蛋白PP107H的SDS-PAGE圖譜；其中M:蛋白質(zhì) Marker ；A :PP107H ；圖 4 :PP107H-ADM 純度分析圖；圖5 :PP107H-His載體與ADM的偶聯(lián)的熒光分光光度法分析圖；圖6 藥物載體PP107H增強(qiáng)抗腫瘤藥物ADM對(duì)HeLa細(xì)胞殺傷作用分析圖；其中， 以對(duì)照細(xì)胞為100% ；圖7 藥物載體PP107H加速ADM進(jìn)入腫瘤細(xì)胞核并使ADM在腫瘤細(xì)胞中聚集分析 圖。其中，ADM的免疫熒光顯示出ADM的存在部位，DAPI染色的部位顯示出細(xì)胞核的區(qū)域。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H，包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)本發(fā)明的藥物載體蛋白序列本發(fā)明的高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H的設(shè)計(jì)使得其完整氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示，它包含了 1個(gè)SEQ ID NO 1(核靶向)序列，1個(gè)SEQ ID NO 2 (穿膜)序列 和1個(gè)SEQ ID NO 3 (組氨酸標(biāo)簽)序列；1個(gè)穿膜序列SEQ ID NO 2順次與1個(gè)核靶向序 列SEQ ID NO :1和1個(gè)組氨酸標(biāo)簽序列SEQ ID NO :3重組形成高效細(xì)胞核靶向藥物載體序 列SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO :3 (組氨酸標(biāo)簽)序列既是該藥物載體序列的一部分，又是該 藥物載體蛋白的純化標(biāo)簽。(2)合成編碼PP107H的基因及構(gòu)建其表達(dá)載體依據(jù)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并利 用DNA合成儀人工合成了編碼PP107H的基因片段，其序列如下ggaattcca^tatgggtcgtaaaaagcgtcgtcaacgtcgtcgtcatatggacctcttcggggacctgcc ggagcccgagcgctcgccgcgcccggctgccgggaaagaagctcagaaaggacccctgctctttgatgacctc cctccggccagcagtactgactcaggatcagggggacctttgctttttgatgatctcccacccgctagcagtgg cgattcaggttctcttgccacatcaatatcccagatggtaaagactgaagggaaaggagcaaagagaaaaacctccga ggaagagaagaatggcagtgaagagcttgtggaaaagaaagtttgtaaagcctcttcggtgatctttggtctgc accaccaccaccaccactRaRRatcctaa其中5’端有下劃線的Catatg序列是內(nèi)切酶Nde 1識(shí)別位點(diǎn)，3’端有下劃線的 序列是內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn)，所設(shè)計(jì)的此二酶切位點(diǎn)與本發(fā)明所用的原核表達(dá)載體pMA5(通用的枯草桿菌表達(dá)載體，含有硫酸卡那霉素抗性基因，Novagen等公司有售)的 Ndel和Biol相匹配，適合于在枯草桿菌中高效表達(dá)。利用Ndel和BamHI切割位點(diǎn)將此人 工合成的編碼PP107H的基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體pMA5中Ndel和BamHI酶切位點(diǎn)之間，連 接便得到完整的編碼PP107H的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。上述表達(dá)載體的構(gòu)建步驟具體如下
雙酶切反應(yīng)將l.Oyg pMA5載體和上述用DNA合成儀人工合成的編碼PP107H的 基因片段5. Oug分別與適量去離子水混勻，使其總體積分別為16 μ 1，各加入2單位限制性 內(nèi)切酶Ndel和BamHI及2 μ 1相應(yīng)的IOX K緩沖液，混勻，置于37°C水浴保溫2小時(shí)后。分 別采用常規(guī)瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海生工公司有售，貨號(hào)BS413)回收目的DNA，分別 獲得載體PMA5片段和編碼PP107H的基因片段。編碼PP107H的基因片段與載體pMA5的連接取0. 5 μ g上述步驟回收的載體pMA5 片段，加入4ug編碼PP107H的基因片段、2μ 1 IOX T4DNA連接酶緩沖液，加去離子水定容 至20 μ 1，最后加入1單位的T4DNA連接酶，混勻并瞬間離心以使液滴聚集管底，置于16°C 水浴過夜，得到連接好的重組表達(dá)載體PMA5-PP107H。重組表達(dá)載體pMA5-P P107H轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α 取10 μ 1重組表達(dá)載體 ΡΜΑ5-ΡΡ107Η加入100 μ 1 Ε. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(Ε. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制備方 法參照“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”第二版，科學(xué)出版社，49頁)中，冰浴30分鐘后置于42°C水浴 中保溫1分鐘，立即取出并置于冰浴中冷卻2分鐘。加入200μ1 37 °C預(yù)熱的SOC液體培養(yǎng) 基，37°C 150rpm振搖培養(yǎng)60分鐘后，取出100 μ 1培養(yǎng)液涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂培 養(yǎng)平板上，37 °C培養(yǎng)16小時(shí)后，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。重組表達(dá)載體pMA5-PP107H的克隆與基因序列分析挑取上述轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行核酸 序列分析，結(jié)果如圖1 (重組表達(dá)載體PMA5-PP107H測(cè)序譜圖，其中編碼PP107H的基因號(hào)為 168-545號(hào))所示，證明獲得了編碼完整PP107H的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所 示，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。重組表達(dá)載體pMA5-PP107H的構(gòu)建過程如圖2 所示，利用Ndel和BamHI切割位點(diǎn)將合成的編碼PP107H的基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體pMA5 中Ndel和BamHI酶切位點(diǎn)之間，獲得重組表達(dá)載體pMA5_PP 107H。(3)高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H的表達(dá)與制備在本實(shí)施例中使用BS168為宿主菌細(xì)胞，重組表達(dá)載體pMA5_PP107H可轉(zhuǎn)化BS168 細(xì)胞，并使用硫酸卡那霉素篩選出能高效穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株，獲得表達(dá)的高效細(xì)胞 核靶向藥物載體PP107H。具體操作將3-4μ g的重組表達(dá)載體pMA5-PP107H加入到0. 5ml BS168感受態(tài)細(xì)胞中，37°C， 250r/min培養(yǎng)90min，取菌液涂布篩選平板。37°C培養(yǎng)16小時(shí)后，獲得轉(zhuǎn)化的單菌落。挑取轉(zhuǎn)化的單菌落，接種于aiil LB培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜。以1 100(體 積比)的比例接種IOml LB培養(yǎng)基(50 μ g/ml Kana)，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后， 40C 5000rpm離心5分鐘收集菌體。用1/10培養(yǎng)液體積的IOmM Tris-cl (pH8. 0)重懸菌 體，置于冰浴中超聲波破碎菌體。破碎菌體于4°C，5000rpm離心15分鐘，獲得上清液。最 后，使用Ni2+親和層析柱(上海生工有售，貨號(hào)BSP079)純化得到本發(fā)明的高效細(xì)胞核靶 向藥物載體PP107H。圖3A示出了所制備的高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H的SDS-PAGE鑒定結(jié)果，純 化得到的高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H的分子量為14. IkDa0實(shí)施例2抗腫瘤細(xì)胞核靶向藥物PP107H-ADM的制備，包括以下步驟(1)高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H與抗腫瘤藥物阿霉素(Adriamycin，ADM)偶 聯(lián)將IOmg阿霉素鹽酸鹽(ADM · HCl)和MOmg高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H置于IOml終濃度為InM的1-乙基-3-(3- 二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽[l-Ethyl-3-(3-dimethylIaminopropy 1) carbodiimide hydrochloride, EDC. HCl]及 InM 的 N-輕基琥拍酉先 亞胺(Hydroxysuccinimide，NHS)的水溶液中，置于37°C避光溫和攪拌10小時(shí)，完成高效 細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H與抗腫瘤藥物ADM的偶聯(lián)，得到偶聯(lián)產(chǎn)物。偶聯(lián)產(chǎn)物PP107H-ADM以G50分子篩層析柱分離純化，再經(jīng)過透析、凍干，獲得抗腫 瘤細(xì)胞核靶向藥物PP107H-ADM。(2)抗腫瘤細(xì)胞核靶向藥物PP107H-ADM的檢測(cè)分子篩層析法檢測(cè)抗腫瘤細(xì)胞核靶向藥物PP107H-ADM 將制備的抗腫瘤細(xì)胞核 靶向藥物PP107H-ADM配制2ml、2mg/ml的溶液，使用G50分子篩層析柱檢測(cè)目的產(chǎn)物的純 度，結(jié)果如圖4所示。目的產(chǎn)物峰為單一峰，分子量與理論值相符，表明制備的產(chǎn)物純度較 高，達(dá)到了應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)抗腫瘤細(xì)胞核靶向藥物PP107H-ADM 分別將2%ig/ml的高效 細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H和抗腫瘤細(xì)胞核靶向藥物PP107H-ADM以及l(fā)mg/ml的抗腫瘤 藥物ADM置于EX470nm、Em585nm的波長(zhǎng)處測(cè)定熒光強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的抗腫瘤細(xì)胞核靶 向藥物PP107H-ADM與相同當(dāng)量的單體抗腫瘤藥物ADM均在Ex470nm、Em585nm處檢測(cè)到熒 光強(qiáng)度，而高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H卻未檢測(cè)到熒光強(qiáng)度，如圖5所示。這證明了 高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H與抗腫瘤藥物ADM偶聯(lián)成功。實(shí)施例3高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H增強(qiáng)抗腫瘤藥物ADM的抗腫瘤作用(1)高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H增強(qiáng)了抗腫瘤藥物ADM對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作 用將生長(zhǎng)良好的IXlO4HeLa細(xì)胞分為三組，使細(xì)胞均勻貼壁生長(zhǎng)于96孔板底部后， 三組細(xì)胞中分別加入終濃度為20、40、80nmol/ml的單純抗腫瘤藥物ADM，抗腫瘤細(xì)胞核靶 向藥物PP107H-ADM，單純的高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H ；上述三組細(xì)胞孵育24h后以 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，結(jié)構(gòu)如圖6所示，單純的高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H對(duì)HeLa 細(xì)胞沒有殺傷作用(細(xì)胞存活率達(dá)100%)，而單純的抗腫瘤藥物ADM和抗腫瘤細(xì)胞核靶向 藥物PP107H-ADM均對(duì)HeLa細(xì)胞有殺傷作用，其中抗腫瘤細(xì)胞核靶向藥物PP107H-ADM的殺 傷作用較單純的抗腫瘤藥物ADM明顯增強(qiáng)，表明高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H顯著增強(qiáng) 了抗腫瘤藥物ADM對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，顯示出高效細(xì)胞核靶向藥物載體的功效。(2)高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H增強(qiáng)了抗腫瘤藥物ADM在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)的聚 集。將生長(zhǎng)良好的IXlO4HeLa細(xì)胞分為二組，使細(xì)胞均勻貼壁生長(zhǎng)于M孔板底部的玻 璃片上后，分別加入終濃度為20nmol/ml的抗腫瘤細(xì)胞核靶向藥物PP107H-ADM和單純的 抗腫瘤藥物ADM，并于5min、10min、30min時(shí)在熒光顯微鏡下觀察ADM的亞細(xì)胞定位，并與 DAPI染色的細(xì)胞核區(qū)域相比較，結(jié)果如圖7所示，相比之下，在加入單純抗腫瘤藥物ADM的 細(xì)胞中，ADM進(jìn)入細(xì)胞核的速度較慢，IOmin時(shí)仍有部分ADM存在于細(xì)胞質(zhì)中，直到30min 時(shí)，ADM的存在部位才與DAPI染色的細(xì)胞核區(qū)域基本吻合；而在加入抗腫瘤細(xì)胞核靶向藥 物PP107H-ADM的細(xì)胞中，5min時(shí)ADM的存在部位與DAPI染色的細(xì)胞核區(qū)域就已基本上一 致，到IOmin時(shí)，ADM的存在部位與DAPI染色的細(xì)胞核區(qū)域已完全吻合，而到30min時(shí)，ADM 在細(xì)胞核中的聚集進(jìn)一步加強(qiáng)了。上述結(jié)果說明高效細(xì)胞核靶向藥物載體PP107H明顯增強(qiáng)了抗腫瘤藥物ADM進(jìn)入HeLa細(xì)胞核中的速度和數(shù)量，表明高效細(xì)胞核靶向藥物載體 PP107H能快速引導(dǎo)偶聯(lián)的抗腫瘤藥物ADM進(jìn)入腫瘤細(xì)胞核并在核中聚集，顯示出了 PP107H 的高效細(xì)胞核靶向藥物載體的作用。
權(quán)利要求
1.一種高效細(xì)胞核靶向藥物載體，其特征在于該藥物載體蛋白包含至少一個(gè)核定位 序列、至少一個(gè)穿膜序列和至少一個(gè)多聚組氨酸肽序列，核定位序列通過至少一個(gè)共價(jià)鍵 與所述的穿膜序列相偶聯(lián)，而所述的多聚組氨酸肽序列通過至少一個(gè)共價(jià)鍵與所述的核定 位序列或穿膜序列相偶聯(lián)，形成三者的線性重組蛋白序列，其中所述的核定位序列具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，所述的穿膜序列具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，所述的 多聚組氨酸肽序列具有SEQ IDNO 3所示的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種高效細(xì)胞核靶向藥物載體，其特征在于多聚組氨酸肽序 列位于該藥物載體蛋白的N末端或者C末端。
3.如權(quán)利要求1所述的一種高效細(xì)胞核靶向藥物載體，其特征在于共價(jià)鍵是肽鍵。
4.如權(quán)利要求2或3所述的一種高效細(xì)胞核靶向藥物載體，其特征在于該藥物載體 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
5.權(quán)利要求1所述的一種高效細(xì)胞核靶向藥物載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的一種高效細(xì)胞核靶向藥物載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其 特征在于該載體蛋白通過共價(jià)鍵與抗腫瘤藥物相偶聯(lián)，形成高效核靶向載體-抗腫瘤藥 物的共價(jià)偶聯(lián)物。
7.如權(quán)利要求6所述的一種高效細(xì)胞核靶向藥物載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng) 用，其特征在于抗腫瘤藥物為阿霉素ADM、阿糖胞苷CPT、雷替曲塞Raltitrexed或順鉬 Cisplatin Injection。
8.一種編碼權(quán)利要求4所述的高效細(xì)胞核靶向藥物載體的基因，其特征在于它具有 SEQ ID NO 5所示的DNA序列。
9.一種重組表達(dá)載體，其特征在于是SEQ ID NO :5所示DNA序列的基因與表達(dá)載體 pET28a, pMA5或pGT22重組，構(gòu)建的重組表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速運(yùn)載抗腫瘤藥物進(jìn)入細(xì)胞核、有效殺滅腫瘤細(xì)胞的高效細(xì)胞核靶向藥物載體蛋白以及編碼這種高效細(xì)胞核靶向藥物載體蛋白的基因。本發(fā)明的高效細(xì)胞核靶向藥物載體包含至少一個(gè)細(xì)胞核定位序列、至少一個(gè)穿膜序列、至少一個(gè)多聚組氨酸序列。本發(fā)明的高效細(xì)胞核靶向藥物載體既可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)該載體偶聯(lián)的抗腫瘤藥物的敏感性，又可以靶向性地運(yùn)載抗腫瘤藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞核酸合成的功效，本發(fā)明的高效細(xì)胞核靶向藥物載體具有快速、靶向的雙重作用，大幅降低了抗腫瘤藥物的用藥劑量，從而降低了抗腫瘤藥物的毒副作用。
文檔編號(hào)A61K33/24GK102038957SQ20101060537
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者周旺, 張應(yīng)玖, 鄒雪 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)