一種分離自發(fā)形霞水母的微生物來源的抗菌蛋白及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離自發(fā)形霞水母的微生物來源的 抗菌蛋白及其制備方法與其在抗海洋微生物感染藥物和海水浸泡后損傷修復(fù)藥物方面的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水母（jellyfish)屬于刺胞動(dòng)物口，是一類常見的大型海洋浮游生物，種類繁多， 分布廣泛，生物總量龐大。我國(guó)所在的東亞海域是水母的主要暴發(fā)區(qū)之一，常見的有海月水 母、霞水母、海藝、口冠海藝等。水母的體腔開放浸泡于海水之中，口腕及傘部外沿生有細(xì) 長(zhǎng)觸手，與海水接觸面積大，體表及機(jī)體組織共附生多種微生物，送些微生物具有獨(dú)特的代 謝系統(tǒng)和防御體系，可W阻止其他微生物對(duì)宿主的侵襲，起到保護(hù)宿主的作用?？咕鞍?(Antimicrobialprotein)是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種防御分子，共附生微生物也可產(chǎn) 生送種具有保護(hù)功能的活性蛋白?？咕鞍淄ǔＷ饔糜诩?xì)菌細(xì)胞膜，在膜上形成孔道，破壞 細(xì)胞膜的完整性，最終導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物外泄而使細(xì)菌死亡。因此，抗菌蛋白具有廣譜抗菌活 性，且不易產(chǎn)生耐藥性，在醫(yī)學(xué)上有良好的應(yīng)用前景。
[0003] 海水浸泡傷是人員落海后，海水的溫度、鹽分和海水中微生物等因素對(duì)落水人員 共同造成的一系列損傷。海洋微生物豐富，不僅有大量陸地常見的病原微生物，也有海水 中特有的病原微生物，如各種弧菌（創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等），其中創(chuàng)傷弧菌 (Vi虹iovulnificus)被認(rèn)為是海水中主要的致病菌。接觸海水的皮膚和軟組織創(chuàng)面極易出 現(xiàn)弧菌感染，短時(shí)間內(nèi)即可致嚴(yán)重?fù)p傷?，F(xiàn)有抗生素對(duì)海洋弧菌感染療效欠佳，亟需尋找新 的抗菌活性物質(zhì)。
[0004] 水母是一類高度適應(yīng)海洋環(huán)境的重要海洋生物資源，有可能從其共附生微生物中 分離獲得特異性針對(duì)海洋致病菌的抗菌蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種分離自發(fā)形霞水母的微生物來源的抗菌蛋白；
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供該分離自發(fā)形霞水母的微生物來源的抗菌蛋白的制 備方法；
[0007] 本發(fā)明的第H目的在于提供該分離自發(fā)形霞水母的微生物來源的抗菌蛋白在制 備抗菌藥物或抗感染藥物中的應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] 本發(fā)明從發(fā)形霞水母?jìng)悴考∪夥蛛x得到微生物菌株CMF-2,16SrDNA序列分析提 示其屬于假單胞菌屬（Pseudomonas)。
[0010] 本發(fā)明所用的菌種是假單胞菌屬CMF-2(Pseudomonassp.CMF-2)，于2014年5月 16日保藏于中國(guó)武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中必（簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC M2014207。
[0011] 進(jìn)一步地，本發(fā)明制備CMF-2菌株發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白，綜合采用多種分離純化方法 獲得單一組分抗菌蛋白CAP-1，并對(duì)其抗菌活性及相關(guān)生物學(xué)活性進(jìn)行研究。該蛋白未見相 關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。
[0012] 本發(fā)明的第一方面，是提供了一種分離自發(fā)形霞水母的微生物來源的抗菌蛋白， 命名為CAP-1。本發(fā)明的抗菌蛋白是分離自發(fā)形霞水母?jìng)悴考∪獾奈⑸飦碓吹囊环N活性 蛋白。
[0013] 本發(fā)明的第二方面，是提供了上述的分離自發(fā)形霞水母的微生物來源的抗菌蛋白 的制備方法，該方法包括W下步驟：
[0014]將保藏編號(hào)為CCTCCM2014207 的假單胞菌屬CMF-2(Pseudomonassp.CMF-2)， 接種于液體牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基，37C震蕩培養(yǎng)6天，得菌株發(fā)酵液，采用硫酸倭沉淀法制 備發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白，分離純化。進(jìn)一步地，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白的分離純化是通過凝膠過濾層析 (Gel円Itrationchromatography)和離子交換層析（Ionexchangechromatography)。
[0015] 所述的牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基，是用W下方法配制得到的；稱取牛肉膏3g，蛋白腺 lOg，化C15g，瓊脂15-20g，加蒸傭水至1L，12rC高壓滅菌20min，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。
[0016] 所述的菌株發(fā)酵液的制備，較佳的，37C，150巧m恒溫震蕩培養(yǎng)6天。
[0017] 所述的硫酸倭沉淀法，參見教科書：蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)，北京科學(xué)出版社，2000年第 1版。
[0018] 較佳的，菌株發(fā)酵液，SOOOXg離必10-30min，取上清液加入66%的硫酸倭沉淀， 4°C過夜，過濾收集沉淀，PBS緩沖液透析2-3天，得到發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白。
[0019] 本發(fā)明的分離自發(fā)形霞水母的微生物來源的抗菌蛋白的制備方法，包括如下具體 步驟：
[0020] A、制備微生物發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白
[0021]將菌株CMF-2接種于液體牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基，37°C，150巧m恒溫震蕩培養(yǎng)6d，得 菌株發(fā)酵液，8000Xg離必20min，取上清液加入66 %的硫酸倭沉淀，4°C過夜，過濾收集沉 淀，PBS緩沖液透析2-3d。將上述粗蛋白組分凍干保存?zhèn)溆谩?br>[002引所述的PBS緩沖液是用W下方法配制得到的：稱取化C18g，KC10. 2邑， 胞2冊(cè)041. 15g，KH2PO4O. 2g，加蒸傭水至 1L，pH7. 4。
[0023]B、Superdex75 柱凝膠過濾層析（Gelfiltrationchromatography)
[0024] 將上述粗蛋白用等滲溶液PBS復(fù)溶，lOOOXg離必lOmin，取上清，用孔徑為 0. 22ym的針頭濾器過濾，濾液上Superdex75柱凝膠過濾層析進(jìn)行分離純化，采用pH7. 6的 PBS進(jìn)行洗脫，流速為ImL/min，280nm波長(zhǎng)的紫外檢測(cè)器同步檢測(cè)并收集洗脫峰，收集體積 為12mL。抗菌活性檢測(cè)得知，peakl組分具有明顯抗菌活性，即含有抗菌活性蛋白CAP-1 (參 見圖1洗脫峰peakl)。
[00巧] C、離子交換層析（Ionexchangechromatography)
[0026] 將上述peakl活性組分上離子交換柱W抑7. 6的20mM己酸鋼和IM氯化鋼構(gòu)成的 洗脫系統(tǒng)進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0. 25mL/min，同樣280nm波長(zhǎng)的紫外檢測(cè)器同步檢測(cè) 并收集層析峰，收集體積為2mL?；钚詸z測(cè)顯示peak2(參見圖2洗脫峰peak2)為活性組 分，SDS-PAGE電泳檢測(cè)peak2為單一蛋白組分（參見圖3)，即抗菌活性蛋白CAP-1單體。
[0027] 本發(fā)明的第H方面，是提供該分離自發(fā)形霞水母的微生物來源的抗菌蛋白CAP-1 在制備抗菌藥物或抗感染藥物中的應(yīng)用。
[0028] 進(jìn)一步的，該應(yīng)用是指CAP-1在制備抗海洋微生物感染藥物中的應(yīng)用，或在制備 海水浸泡后損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。
[0029] 通過本發(fā)明的分離自發(fā)形霞水母的微生物來源的抗菌蛋白CAP-1的抗菌活性實(shí) 驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和溶血活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果來證明本發(fā)明的抗菌蛋白CAP-1的特異性抗菌活 性。
[0030]采用濾紙片擴(kuò)散法檢測(cè)樣品的抗菌活性，W金黃色葡萄球菌（ATCC27217)、大腸 桿菌（ATCC8739)、枯草芽抱桿菌（ATCC6633)、白色念珠菌（ATCC10231)W及來源于海洋 的創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562)、溶藻弧菌（ATCC17749)、副溶血弧菌（ATCC17802)為指示菌。 配制牛肉膏蛋白腺固體培養(yǎng)基，采用涂布平板法接種指示菌，75%酒精為陽性對(duì)照，PBS為 陰性對(duì)照，抑菌圈直徑的大小反映抑菌活性的強(qiáng)弱。結(jié)果表明，CAP-1蛋白具有顯著的抗菌 活性，尤其是對(duì)海洋來源的微生物也有明顯的抗菌活性（參見表1和圖4)。
[0031] 采用M1T法測(cè)定細(xì)胞存活率，檢測(cè)抗菌蛋白的細(xì)胞毒性作用。CH0細(xì)胞（人卵巢 癌細(xì)胞）、K562細(xì)胞（白血病細(xì)胞）、化CaT細(xì)胞（人正常皮膚細(xì)胞）接種于96孔板中，在 37°C，5%C〇2培養(yǎng)2地，將不同濃度的CAP-1加入培養(yǎng)好的96孔培養(yǎng)板中，對(duì)照組細(xì)胞只 加純培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱賠育化，每孔加入10yLM1T液，