一種發(fā)形霞水母多肽生長因子及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于海洋生物【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明提供了一種發(fā)形霞水母多肽生長因子，命名為Cc-GRN-1，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。本發(fā)明還提供了上述發(fā)形霞水母多肽生長因子的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)形霞水母多肽生長因子具有顯著的促細(xì)胞增殖作用，在研制損傷修復(fù)藥物方面有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種發(fā)形霞水母多肽生長因子及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種發(fā)形霞水母多肽生長因子及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水母(jellyfish)是一類膠質(zhì)狀的浮游動(dòng)物，種類繁多，數(shù)量巨大，分布廣泛，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位。水母的基本結(jié)構(gòu)是由傘體、緣膜、口腕、觸手、附屬器等組成，傘體呈扁平圓盤形或球形，傘體腹面有口，口下懸垂口腕，傘體邊緣和口腕上長有許多觸手，長者達(dá)數(shù)十米，其上密布刺絲囊。刺絲囊是觸手上一種特化細(xì)胞——刺細(xì)胞的特化細(xì)胞器，狀如小囊，內(nèi)含毒液，是刺胞動(dòng)物的防御與進(jìn)攻武器。當(dāng)觸手觸及其他動(dòng)物時(shí)，立即纏繞受害者，刺絲囊發(fā)射刺絲穿入人體皮膚或小動(dòng)物體內(nèi)，同時(shí)釋放出毒液。
[0003]水母生殖腺發(fā)達(dá)，繁殖能力強(qiáng)，生長發(fā)育速度極快，同時(shí)也具有非常強(qiáng)的再生能力。水母捕食或防御天敵進(jìn)攻的過程中，一方面，細(xì)長絲狀的觸手容易出現(xiàn)斷裂、脫落或者被天敵咬去許多，但受損部位很快可長出新的觸手，以維持水母?jìng)€(gè)體的正?；顒?dòng)與功能，水母觸手表現(xiàn)出了超強(qiáng)的損傷修復(fù)能力；另一方面，水母觸手上刺絲囊數(shù)量巨大，需經(jīng)細(xì)胞快速、大量增殖產(chǎn)生，而且捕食、防御過程會(huì)消耗大量刺絲囊，損耗的刺絲囊也需要及時(shí)補(bǔ)充，因此推測(cè)觸手中存在著刺細(xì)胞快速增殖和刺絲囊補(bǔ)充的動(dòng)態(tài)過程。水母觸手的超強(qiáng)損傷修復(fù)能力和刺細(xì)胞的快速增殖能力提示，水母觸手，特別是刺細(xì)胞中，可能存在高活性生長因子。
[0004]顆粒體蛋白前體(Progranulin, PGRN)是一種參與發(fā)育調(diào)節(jié)、傷口愈合、血管發(fā)生、神經(jīng)元細(xì)胞生長和維持以及炎癥反應(yīng)等多種生理病理過程的分泌型生長因子，亦稱為顆粒體蛋白/上皮肽前體(GEP)、PC細(xì)胞衍生的生長因子(PCDGF)、acrogranin或G80。它首先作為生長因子從條件組織培養(yǎng)基中純化得到，是一種含593個(gè)氨基酸殘基的分泌性糖蛋白，表觀分子量88kDa。PGRN包括I個(gè)信號(hào)肽序列和7.5個(gè)顆粒體蛋白(granulin，GRN)模序(X2_3CX5_6CX5CCX8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5_6CX2)，每個(gè)模序都含有 12 個(gè)半胱氨酸并形成6對(duì)二硫鍵，在空間結(jié)構(gòu)上，4個(gè)β_折疊的“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)依次呈梯狀折疊。共有序列的C末端包含保守序列CCXDX2HCCP，被認(rèn)為具有金屬酶結(jié)合位點(diǎn)以及參與調(diào)節(jié)功能。PGRN可以被細(xì)胞外的蛋白酶如嗜中性粒細(xì)胞分泌的彈性蛋白酶水解成小的多肽片段GRN，這些多肽片段的分子量從6kDa到25kDa大小不等，均保留生物學(xué)活性:可促進(jìn)細(xì)胞生長，并可能與炎癥有關(guān)(參見文獻(xiàn):Lu R, G Serrero, et al.1nhibition of PC cell-derived growthfactor(PCDGF, epthelin/granulin precursor)expression by antisense PCDGF cDNAtransfection inhibits tumorigenictiy of the human breast carcinoma cell lineMDA-MB-468.Proc Natl Acad Sci USA,2000，97(8):3993-3998)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種來源于發(fā)形霞水母，新的多肽生長因子；本發(fā)明的另一目的在于提供該多肽生長因子的制備方法，以及在制備損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007]本發(fā)明從發(fā)形霞水母刺絲囊毒素中分離得到的一種促進(jìn)細(xì)胞增殖的單鏈多肽Cc-GRN-1，生物信息學(xué)分析提示其屬于顆粒體蛋白(GRN)家族，查詢蛋白質(zhì)/多肽公共數(shù)據(jù)庫無該多肽序列，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。
[0008]本發(fā)明的第一方面，是提供了一種發(fā)形霞水母多肽生長因子，命名為Cc-GRN-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]本發(fā)明的多肽生長因子是從發(fā)形霞水母刺絲囊毒素中分離得到的一種單鏈多肽，58個(gè)氨基酸，分子量5782.9Da，多肽氨基酸全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)如下:Asn -Val - He - Cys -Pro - Asp - Gly - Thr - Ser - Phe - Cys - Ala - Ser - Gly - Gln - Thr - Cys - Cys - Lys -Leu - Ser - Ser - Gly - Ser - Tyr - Gly - Cys - Cys - Pro - Leu - Pro - Asn - Ala - Val -Cys - Cys - Ser - Asp - Gly - Val - His - Cys - Cys - Pro - Ser - Gly - Thr - Thr - Cys -Asp - Val - Ser - Gln - Gly - Thr - Cys - Leu - Arg (SEQ ID NO:1)
[0010]本發(fā)明的第二方面，是提供了上述的發(fā)形霞水母多肽生長因子的制備方法。
[0011]本發(fā)明將活體發(fā)形霞水母觸手剪下，-70°C凍存，采用自溶法制備發(fā)形霞水母刺絲囊，利用組織研磨器破碎提取得到水母粗毒素，再經(jīng)凝膠過濾層析和兩次反相高效液相層析(RP-HPLC)分離純化后即得到。
[0012]本發(fā)明的發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1的制備方法，具體步驟如下:A、準(zhǔn)備水母刺絲囊毒素
[0013]取凍存的發(fā)形霞水母觸手解凍，加入2-6倍體積預(yù)冷的蒸餾水，用攪拌器緩慢連續(xù)攪拌5h以上；混懸液用孔徑為450μπι的40目分樣篩過濾，收集濾液，3000 X g離心5min，移去上清液，沉淀用無菌人工海水洗滌2-3次，即得刺絲囊；向洗干凈的刺絲囊加入50mmol/L、pH3.0的乙酸,轉(zhuǎn)移至破碎管中，然后利用組織研磨器Min1-Beadbeater在轉(zhuǎn)速為4600rpm條件下破碎3_6min，每破碎30s，將破碎管取出置于冰水中冷卻lmin，破碎完畢后10000 Xg離心IOmin,收集上清即為水母刺絲囊毒素；
[0014]上述操作都在0-4°C (如冰水混合物)條件下進(jìn)行。
[0015]所述的無菌人工海水，是用以下方法配制得到的:稱取NaC128g，MgCl2.6H205g,KC10.8g, CaCl2L 033g,加蒸懼水至1L,混勻后用孔徑為0.20 μ m的微孔濾膜過濾。
[0016]B、Superdex30柱凝膠過濾層析
[0017]將上述水母刺絲囊毒素用孔徑為0.45 μ m的微孔濾膜過濾，濾液上Superdex30柱進(jìn)行分離純化，采用50mmol/L、pH3.0的乙酸洗脫,流速為lmL/min, 280nm波長的紫外檢測(cè)器同步檢測(cè)并收集洗脫體積110-115mL組分的洗脫峰SE2。
[0018]我們用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)分析得知，其中流出體積110-115mL內(nèi)的組分(參見圖1洗脫峰SE2)含有多肽生長因子Cc-GRN-1。
[0019]C、C8柱反相高效液相層析(RP-HPLC)
[0020]將上述流出體積110_115mL組分以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的乙腈構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行線性梯度洗脫，收集HPLC反相CS柱層析峰(參見圖2洗脫峰RP2)，即得到多肽生長因子Cc-GRN-1組分。
[0021]本發(fā)明的發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1的制備方法，還包括以下步驟:[0022]D、C18柱反相高效液相層析(RP-HPLC)
[0023]將步驟C含多肽生長因子Cc-GRN-1組分用反相C18柱進(jìn)行二次純化，以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的乙腈構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行線性梯度洗脫，收集HPLC反相C18柱層析峰(參見圖3洗脫峰Cc-GRN-1)，即得到多肽生長因子Cc-GRN-1單體。
[0024]本發(fā)明采用MALD1-T0F質(zhì)譜測(cè)定分子量，用全自動(dòng)蛋白質(zhì)多肽測(cè)序儀測(cè)定多肽氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0025]本發(fā)明也可通過人工方法合成如SEQ ID NO:1所示的多肽。
[0026]本發(fā)明的第三方面，是提供了上述的發(fā)形霞水母多肽生長因子在制備損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。
[0027]所述的損傷，指外力作用于身體使某部組織或器官發(fā)生結(jié)構(gòu)破壞或功能障礙，如機(jī)械性、物理性或化學(xué)性損傷。
[0028]所述的修復(fù)，指受損害或缺損的組織由周圍健康組織來再生、修補(bǔ)恢復(fù)的過程。它是機(jī)體的一種適應(yīng)能力和抗損害的防御機(jī)能。組織修復(fù)主要通過血管、結(jié)締組織、上皮組織等的再生而完成。
[0029]用本發(fā)明的發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果來證明本發(fā)明的促細(xì)胞增殖作用。本發(fā)明的Cc-GRN-1有顯著的促細(xì)胞增殖作用，可作為研制損傷修復(fù)藥物的應(yīng)用。
[0030]采用CCK-8法來檢測(cè)樣品的促細(xì)胞增殖作用。A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)在37°C，5%C02條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，將濃度分別為I μ g/mL、2 μ g/mL、3 μ g/mL和4 μ g/mL多肽生長因子Cc-GRN-1加入預(yù)培養(yǎng)的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育48h，向每孔加入10 μ L CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育1.5h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖率。同樣，HUVEC細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)在37°C，5%C02條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，將濃度分別為0.125 μ g/mL,0.25 μ g/mL,0.5 μ g/mL和I μ g/mL多肽生長因子Cc-GRN-1加入預(yù)培養(yǎng)的96孔培養(yǎng)板中,每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育72h,向每孔加入10 μ L CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育1.5h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖率。結(jié)果表明，發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1具有顯著的促細(xì)胞增殖作用，而且促細(xì)胞增殖作用隨著劑量的遞增而增強(qiáng)。
[0031]本發(fā)明的發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1是一種首次從刺胞動(dòng)物發(fā)形霞水母中得到的具有顯著促細(xì)胞增殖作用的新的多肽。本發(fā)明的發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1具有顯著的促細(xì)胞增殖作用，在研制損傷修復(fù)藥物方面有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的多肽也具有序列高度保守性、促細(xì)胞增殖作用顯著等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為海洋藥物的研發(fā)提供了新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】`
[0032]圖1為本發(fā)明發(fā)形霞水母顆粒體蛋白Cc-GRN-1的Superdex30柱凝膠過濾層析圖。
[0033]圖2為本發(fā)明發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1的C8柱反相高效液相層析圖。
[0034]圖3為本發(fā)明發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1的C18柱反相高效液相層析圖。
[0035]圖4為本發(fā)明發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1的MALD1-T0F質(zhì)譜圖。[0036]圖5為本發(fā)明發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性檢測(cè)。
[0037]圖6為本發(fā)明發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1對(duì)HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但下列實(shí)施例不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
[0039]本發(fā)明選擇的發(fā)形霞水母(Cyanea Capi I lata)采集自浙江省三門灣海域，并經(jīng)集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院洪惠馨教授鑒定(Xiao L, He Q, et al.Cyanea capillatatentacle-only extract as a potential alternative of nematocyst venom:1tscardiovascular toxicity and tolerance to isolation and purification procedures.Toxiconj2009，53(I):146-152)。
[0040]A549細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞購自中科院細(xì)胞所。
[0041 ] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042]實(shí)施例1:制備水母刺絲囊毒素
[0043]取200g凍存的水母觸手置于燒杯中解凍，加入5倍體積預(yù)冷的蒸餾水，用攪拌器緩慢連續(xù)攪拌IOh ;混懸液用孔徑為450μπι的40目分樣篩過濾，收集濾液，3000Xg離心5min，移去上清液，沉淀用無菌人工海水洗滌3次，即得刺絲囊；向洗干凈的刺絲囊加入少量50mmol/L、pH3.0的乙酸，轉(zhuǎn)移至含有破碎用鋼珠的破碎管中，然后利用組織研磨器Min1-Beadbeater在轉(zhuǎn)速為4600rpm條件下破碎6min,每破碎30s,將破碎管取出置于冰水中冷卻lmin,破碎完畢后10000 Xg離心IOmin,收集上清即為水母刺絲囊毒素。上述操作都在4°C條件下進(jìn)行。
[0044]實(shí)施例2:水母刺絲囊毒素的分離純化
[0045](1) Superdex30柱凝膠過濾層析
[0046]將水母刺絲囊毒素用孔徑為0.45 μ m的微孔濾膜過濾，濾液上Superdex30柱進(jìn)行分離純化，采用50mmol/L、pH3.0乙酸洗脫，流速為lmL/min,按固定體積收集洗脫峰，MALD1-T0F質(zhì)譜分析得知，其中流出體積110-115mL內(nèi)的組分(參見圖1洗脫峰SE2)含有多肽生長因子Cc-GRN-1。
[0047](2) C8柱反相高效液相層析(RP-HPLC)
[0048]將上述流出體積110_115mL組分以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的乙腈構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行線性梯度洗脫，收集HPLC反相CS柱層析峰(參見圖2洗脫峰RP2)，即得到多肽生長因子Cc-GRN-1組分。
[0049](3) C18柱反相高效液相層析(RP-HPLC)
[0050]將上述顆粒體蛋白Cc-GRN-1組分用反相C18柱進(jìn)行二次純化，以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的乙腈構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行線性梯度洗脫，收集HPLC反相C18柱層析峰(參見圖3洗脫峰Cc-GRN-1)，即得到多肽生長因子Cc-GRN-1單體。
[0051]實(shí)施例3:發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1測(cè)序
[0052]用高效液相色譜(HPLC)方法鑒定發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1的純度，MALD1-TOF質(zhì)譜測(cè)定其分子量(參見圖4)，用全自動(dòng)蛋白質(zhì)多肽測(cè)序儀測(cè)定其氨基酸序列。
[0053]通過上述方法制備的發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1，是我們從發(fā)形霞水母刺絲囊毒素中分離得到的一種單鏈多肽，分子量5782.9Da，多肽氨基酸全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為:天冬酰胺-纈氨酸-異亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-絲氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-蘇氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-亮氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-纈氨酸-組氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-絲氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-絲氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-精氨酸(SEQ ID NO:1)。
[0054]實(shí)施例4:發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1的細(xì)胞增殖活性檢測(cè)
[0055](I)在96孔板中接種100 μ L Α549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)和HUVEC細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中于37°C，5% CO2的條件下預(yù)培養(yǎng)24h。
[0056](2)移去原培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板加入100 μ L含不同濃度Cc-GRN-1的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱分別孵育48h和72h。
[0057](3)向每孔加入10 μ L CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育1.5h。
[0058](4)用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=[(處理組A值一空白組A值) /空白組A值]X100%。
[0059]實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖5、圖6，隨著多肽生長因子Cc-GRN-1濃度的增加，細(xì)胞增殖率逐漸增大，且與空白對(duì)照相比有顯著性差異。
[0060]可見，發(fā)形霞水母多肽生長因子Cc-GRN-1具有顯著的促細(xì)胞增殖作用，可作為研制損傷修復(fù)藥物的應(yīng)用。
[0061]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)形霞水母多肽生長因子，其特征在于，該多肽生長因子的氨基酸序列如SEQID NO:1 所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的發(fā)形霞水母多肽生長因子的制備方法，其特征在于，該方法是將活體發(fā)形霞水母觸手剪下，-70°C凍存，采用自溶法制備發(fā)形霞水母刺絲囊，利用組織研磨器破碎提取得到水母粗毒素，再經(jīng)凝膠過濾層析和兩次反相高效液相層析分離純化后即得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)形霞水母多肽生長因子的制備方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下: A、準(zhǔn)備水母刺絲囊毒素 取凍存的發(fā)形霞水母觸手解凍，加入2-6倍體積預(yù)冷的蒸餾水，用攪拌器緩慢連續(xù)攪拌5小時(shí)以上；混懸液用孔徑為450μπι的40目分樣篩過濾，收集濾液,3000 Xg離心5min，移去上清液，沉淀用無菌人工海水洗滌2-3次，即得刺絲囊；向洗干凈的刺絲囊加入50mmol/L、pH3.0的乙酸,轉(zhuǎn)移至破碎管中，然后利用組織研磨器Min1-Beadbeater在轉(zhuǎn)速為4600rpm條件下破碎3_6min，每破碎30s，將破碎管取出置于冰水中冷卻lmin，破碎完畢后10000 Xg離心IOmin,收集上清即為水母刺絲囊毒素； 上述操作都在0_4°C條件下進(jìn)行。 所述的無菌人工海水，是用以下方法配制得到的:稱取NaC128g，MgCl2.6H205g,KC10.8g, CaCl2L 033g,加蒸懼水至1L,混勻后用孔徑為0.20 μ m的微孔濾膜過濾； B、Superdex30柱凝膠過濾層析 將上述水母刺絲囊毒素用孔徑為0.45 μ m的微孔濾膜過濾，濾液上Superdex30柱進(jìn)行分離純化，采用50mmol/L、pH3.0的乙酸洗脫,流速為lmL/min, 280nm波長的紫外檢測(cè)器同步檢測(cè)并收集洗脫體積110-115mL組分的洗脫峰SE2 ； C、C8柱反相高效液相層析 將上述流出體積110-115mL組分以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的乙腈構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行線性梯度洗脫，收集HPLC反相CS柱層析峰，即得到多肽生長因子Cc-GRN-1 組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)形霞水母多肽生長因子的制備方法，其特征在于，該方法還包括以下步驟: D、C18柱反相高效液相層析 將步驟C含多肽生長因子Cc-GRN-1組分用反相C18柱進(jìn)行二次純化，以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的 乙腈構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行線性梯度洗脫，收集HPLC反相C18柱層析峰，即得到多肽生長因子Cc-GRN-1單體。
5.一種如權(quán)利要求1所述的發(fā)形霞水母多肽生長因子在制備損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/475GK103819552SQ201410052489
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】張黎明, 常銀龍, 肖良, 鄭杰民, 王蓓蕾, 王倩倩, 尹慢慢, 周永紅, 劉丹 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)