專利名稱：Exendin-4類似物的定位聚乙二醇化修飾物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Exendin-4類似物的定位聚乙二醇化修飾物，其制備方法、含它們的藥物組合物、其修飾前體及其在治療II型糖尿病等疾病中的用途。
背景技術(shù)：
Exendin-4 是一種從南美產(chǎn)毒蜥(Gila monster ；Heloderma suspectum)的唾液分泌物中分離和鑒定出的天然產(chǎn)物。其序列為Hisl-Gly-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leuio-Ser-Lys-Gln-Met-Glui5-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp25-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly3o-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala35-Pro-Pro-Pro-Ser39-NH2 的三十九肽，Exendin-4 是胰高血糖素樣肽-Kglucagon-like ρ印tide-1，GLP-1)的類似物。是GLP-1受體激動(dòng)劑， 能激活GLP-I受體，具有控制甘油酯、促進(jìn)胰島素分泌、降低循環(huán)胰高血糖素、提高胰β _細(xì)胞質(zhì)量、抑制胃的排空、減少營養(yǎng)的攝入、增加胰島素敏感性等生物活性。Exendin-4可模擬體內(nèi)自然分泌的激素，從而幫助人體調(diào)節(jié)血糖水平，而且在患者不需要的時(shí)候，就會停止該作用。Exendin-4的另一特點(diǎn)是可以恢復(fù)制造胰島素的β細(xì)胞的第1時(shí)相分泌。第1時(shí)相分泌指的是由攝取食物而引發(fā)的胰島素分泌，而對于II-型糖尿病患者而言，在患病初期就已經(jīng)喪失了該反應(yīng)能力。Exendin-4不但能夠降低血糖，而且還能加強(qiáng)正在喪失功能的細(xì)胞機(jī)能，對II-型糖尿病治療而言是一項(xiàng)重大進(jìn)步。Exendin-4于2005年4月獲美國FDA批準(zhǔn)，用于改善使用二甲雙胍和磺酰脲類藥物不理想的II型糖尿病患者的血糖控制。臨床結(jié)果顯示，Exendin-4用于糖尿病治療效果明顯，且副反應(yīng)較小，但是每天兩次的皮下給藥給病人帶來很多不便。Exendin-4的效能及其內(nèi)在獨(dú)特的血糖依賴性作用機(jī)制使其更適宜制成緩釋制劑，Amylin公司于2000年5月又和Alkermes公司簽約合作開發(fā)品緩釋型注射劑 Exendin-4LAR,目前已完成II期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示，15周后該藥物的兩種劑量水平都能很好耐受，并且Exendin-4的血藥濃度均達(dá)到了預(yù)期的治療范圍。同時(shí)由于Exendin-4在 II-糖尿病治療機(jī)理方面具有明顯優(yōu)勢，開發(fā)其長效類似物也是很多國外制藥公司研發(fā)熱
；ο研究表明，多肽類藥物經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾后仍能保持好的生物活性，并能顯著延長生物體內(nèi)的半衰期。目前，已有對Exendin-4進(jìn)行PEG修飾的研究報(bào)道，分別得到的三個(gè)位點(diǎn)His1、Lys12, Lys27的氨基PEG修飾產(chǎn)物，在大鼠的代謝研究中發(fā)現(xiàn)，代謝半衰期遠(yuǎn)長于 Exendin-4 (Jin Zhou 等，Eur. J Pharma. Biopharm.，2009，72 :412_417)。此外，還報(bào)道了對Exendin-4中Lys12和Lys27的ε -氨基進(jìn)行脂肪酸或石膽酸或透明質(zhì)酸修飾，分別得到單修飾和雙修飾的修飾物(Su Young Chae 等，J Control. Release, 2010,144 (1) :10_16 ； JControl. Release, 2010,142 :206_213 ；Biomaterials, 2010, 31 :4121_4128)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，不論是用PEG對Exendin-4進(jìn)行修飾，還是用脂肪酸、 石膽酸或透明質(zhì)酸對Exendin-4進(jìn)行修飾，均存在修飾位點(diǎn)專一性較差的問題，從而可能造成產(chǎn)物呈不同單位點(diǎn)修飾物共存的混合物形式，或者可能造成產(chǎn)物呈不同多位點(diǎn)修飾物共存的混合物形式，這對于后續(xù)的制藥應(yīng)用是不利的。因此，仍然期望提供一種可以對Exendin-4定位修飾并仍然保持Exendin-4生物學(xué)活性的方法以及Exendin-4修飾物例如PEG修飾物，以克服目前對Exendin-4進(jìn)行修飾例如PEG化修飾時(shí)專一性差的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是以克服目前對Exendin-4進(jìn)行修飾例如PEG化修飾時(shí)專一性差的缺點(diǎn)，提供一種可以對Exendin-4定位修飾并仍然保持Exendin-4生物學(xué)活性的方法以及Exendin-4修飾物例如PEG修飾物。本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，對Exendin-4肽鏈中的個(gè)別氨基酸替換為其它氨基酸，得到Exendin-4類似物，這些類似物在進(jìn)行PEG的化學(xué)修飾時(shí)具有優(yōu)良的反應(yīng)專一性。而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明Exendin-4類似物經(jīng)PEG修飾后，其PEG修飾產(chǎn)物可具有GLP-I受體激動(dòng)活性。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)而得以完成。發(fā)明概述本發(fā)明第一方面提供了具有以下式(I)所示的Exendin-4類似物的聚乙二醇修飾物PEG-M-X- (Ex-4)(I)或其可藥用鹽，其中各符號如本文所述。本發(fā)明第二方面提供了以下式(II)所示的Exendin-4類似物[Aap] Exendin-4(II)其中各符號如本文所述。本發(fā)明第三方面提供制備本發(fā)明第一方面所述聚乙二醇修飾物的方法。本發(fā)明第四方面提供了制備本發(fā)明第二方面所述Exendin-4類似物的方法。本發(fā)明第五方面提供本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)所述聚乙二醇修飾物在制備藥物中的用途。本發(fā)明第六方面提供一種組合物，其包括預(yù)防和/或治療有效量的本發(fā)明第一方面所述聚乙二醇修飾物以及任選的藥學(xué)可接受的載體。本發(fā)明第七方面提供本發(fā)明第二方面所述Exendin-4類似物在制備本發(fā)明第一方面所述聚乙二醇修飾物中的用途。本發(fā)明第八方面提供了在有需要的受試者中激活GLP-I受體的方法以及治療相關(guān)疾病或癥狀的方法。本發(fā)明第九方面提供作為GLP-I受體激動(dòng)劑等或者疾病或癥狀的預(yù)防和/或治療劑的本發(fā)明第一方面所述聚乙二醇修飾物。本發(fā)明第十方面提供了用于在有需要的受試者中激活GLP-I受體的組合物，或者用于預(yù)防和/或治療與GLP-I受體活性低下相關(guān)的疾病和/或癥狀的組合物，其包含本發(fā)明第一方面所述聚乙二醇修飾物。發(fā)明詳述本發(fā)明第一方面提供了具有以下式(I)所示的Exendin-4類似物的聚乙二醇修飾物PEG-M-X-(Ex-4)(I)
或其可藥用鹽，其中，PEG 表示 RO (CH2CH2O)n_CH2CH2-，其中 R 為 H 或 CH3, η 為 25-2500 的整數(shù)；M表示一N:O或 O 各自的氮或硫原子一側(cè)與
權(quán)利要求
1.式(I)所示的Exendin-4類似物的聚乙二醇修飾物 PEG-M-X-(Ex-4)(I) 或其可藥用鹽，其中，PEG 表示 RO (CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中 R 為 H 或 CH3, η 為 25-2500 的整數(shù)； OM或 O 各自的氮或硫一S-CH2-CH2-HO-NH,原子一側(cè)與PEG部分連接，另一側(cè)與X部分的巰基連接； X-(Ex-4)表示具有如下結(jié)構(gòu)的Exendin-4類似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Al a-Val-Arg-Aa21-Aa22-Aa23-Glu-Trp-Leu-Aa27-Asn-Gly-Gly-Aa31-Ser-Ser-Gly-Ala-Aa36-Aa37-Aa38-Ser-NH2,其中Aa21、Aa22、Aa23、Aa27、Aa31、Aa36、Aa37 和 Aa38 各自獨(dú)立地是選自下列的氨基酸Cys、Thp、 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp> Tyr> Val，并且 Aa21、A3-22 Λ A&23、A&27、 Aa31^Aa36, Aa37 和 Aa38 中只有一個(gè)為 Cys 或 Thp ； X表示在X- (Ex-4)所示的Exendin-4類似物中，位于21、22、23、27、31、36、37或38位HS的任一個(gè)位點(diǎn)并且為半胱氨酸或4-巰基脯氨酸(Thp，)的氨基酸，該氨基酸的巰I O基與M基團(tuán)連接。
2.式(I)所示的Exendin-4類似物的聚乙二醇修飾物 PEG-M-X-(Ex-4)(I)或其可藥用鹽，其中，PEG表示分子量為1，000至100，000的聚乙二醇； O各自的氮或硫I原子一側(cè)與PEG部分連接，另一側(cè)與X部分的巰基連接； X- (Ex-4)表示His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Al a-Val-Arg-Leu21-Phe22-Ile23-Glu-Trp-Leu-Lys27-Asn-Gly-Gly-Pro31-Ser-Ser-Gly-Al B-Pro36-Pro37-Pro38-Ser-NH2 中第 21、22、23、27、31、36、37 或 38 位氨基酸中的任一個(gè)被半胱氨酸或4-巰基脯氨酸(Thp，V^Y.)取代的三十九肽；ι οX表示在Χ-(Εχ-4)所示的三十九肽中，位于21、22、23、27、31、36、37或38位的任一個(gè)位點(diǎn)并且為半胱氨酸或4-巰基脯氨酸(Thp，""ζ^γ)的氨基酸，該氨基酸的巰基與M基I O團(tuán)連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的聚乙二醇修飾物，其中η為50-2000的整數(shù)、50-1500的整數(shù)、 50-1000的整數(shù)、75-1500的整數(shù)、75-1000的整數(shù)、75-500的整數(shù)、或100-500的整數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的聚乙二醇修飾物，其中所述PEG表示分子量為1，000至100，000、 2，000 至 80，000,3, 000 至 60，000,4, 000 至 60，000,5, 000 至 60，000,3, 000 至 50，000、 4，000 至 40，000,4, 000 至 30，000、或 5，000 至 20，000 的聚乙二醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的聚乙二醇修飾物，其中所述X-(Ex-4)表示具有如下結(jié)構(gòu)的 Exendin-4 類似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln_Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Aa21-Aa22-Aa23-Glu-Trp-Leu-Aa27-Asn-Gly-Gly-Aa31-Ser-Ser-Gly-Ala-Aa36-Aa37-Aa38-Ser-NH2, ^ψ Aa21 > Aa22> Aa23> Aa27> Aa31 > Aa36> Aa37 禾口 Aa38 各自獨(dú)立地是選自下列的氨基酸Cys、Thp、Leu、Phe、lie、Lys、Pro,并且 Aa21、Aa22、Aa23, Aa27、Aa31、 Aa36, Aa37和Aa38中只有一個(gè)為Cys或Thp。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的聚乙二醇修飾物，其中所述Aa21可選自Cys、Thp、Leu，所述Aa22 可選自Cys、Thp、Phe，所述Aa23可選自Cys、Thp、IIe，所述Aa27可選自Cys、Thp、Lys，所述 Aa31 可選自 Cys、Thp、Pro，所述 Aa36 可選自 Cys、Thp、Pro，所述 Aa37 可選自 Cys、Thp、Pro, 所述 Aa38 可選自 Cys、Thp、Pro ；前提條件是,Aa21 > Aa22> Aa23> Aa27> Aa31 > Aa36> Aa37 禾口 Aa38 中只有一個(gè)為Cys或Thp。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的聚乙二醇修飾物，其中所述X表示在X-(Ex-4)所示的 Exendin-4類似物中，位于21、22、23、31、36、37或38位的任一個(gè)位點(diǎn)并且為半胱氨酸或 4_巰基脯氨酸的氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的聚乙二醇修飾物，其中所述X表示在X-(Ex-4)所示的Exendin-4 類似物中，位于21、22、23、31、36、37或38位的任一個(gè)位點(diǎn)并且為半胱氨酸的氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的聚乙二醇修飾物，其中所述X表示在X-(Ex-4)所示的Exendin-4 類似物中，位于31、36、37或38位的任一個(gè)位點(diǎn)并且為4-巰基脯氨酸的氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的聚乙二醇修飾物，其是Exendin-4類似物的定位聚乙二醇化修飾物或其可藥用鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的聚乙二醇修飾物，其是Exendin-4類似物的定位聚乙二醇化修飾物或其可藥用鹽，并且其中所述的聚乙二醇修飾為單聚乙二醇修飾。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的聚乙二醇修飾物，其選自 [Cys21 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4,[Cys22 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Cys23 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Cys31 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Cys36 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Cys37 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Cys38 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Thp31 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Thp36 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Thp37 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Thp38 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4,禾口[Cys31 (mPEG20000-MAL) ] Exendin-4， 或其藥學(xué)可接受的鹽。
13.式(II)所示的Exendin-4類似物 [Aap] Exendin-4 (II)其中，Exendin-4 表不His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Al a-Val-Arg-Leu21-Phe22-Ile23-Glu-Trp-Leu-Lys27-Asn-Gly-Gly-Pro31-Ser-Ser-Gly-Al B-Pro36-Pro37-Pro38-Ser-NH2 的三十九肽；Aap表示取代Exendin-4所示三十九肽ρ位的氨基酸，其選自半胱氨酸(S卩，Cys)或4-巰基脯氨酸(即，Thp、
14.根據(jù)權(quán)利要求13的Exendin-4類似物，其中Aap表示取代Exendin-4所示三十九肽ρ位的半胱氨酸； ρ表示Exendin-4所示三十九肽的21、22、23、31、36、37或38位。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的Exendin-4類似物，其中Aap表示取代Exendin-4所示三十九肽ρ位的4-巰基脯氨酸； P表示Exendin-4所示三十九肽的31、36、37或38位。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15任一項(xiàng)的Exendin-4類似物，其選自 [Cys21] Exendin-4,[Cys22] Exendin-4, [Cys23] Exendin-4, [Cys31] Exendin-4, [Cys36] Exendin-4, [Cys37] Exendin-4, [Cys38] Exendin-4, [Thp31] Exendin-4, [Thp36] Exendin-4, [Thp37] Exendin-4，和 [Thp38] Exendin-4 ο
17.制備權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述聚乙二醇修飾物的方法，其包括使發(fā)明第二方面任一項(xiàng)所述Exendin-4類似物與PEG-M反應(yīng)的步驟。
18.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述聚乙二醇修飾物的用途，其為 在制備作為GLP-I受體激動(dòng)劑的藥物中的用途；在制備用于預(yù)防和/或治療與GLP-I受體活性低下相關(guān)的疾病和/或癥狀的藥物中的用途；在制備用于控制甘油酯、促進(jìn)胰島素分泌、降低循環(huán)胰高血糖素、提高胰β-細(xì)胞質(zhì)量、抑制胃的排空、減少營養(yǎng)的攝入、增加胰島素敏感性的藥物中的用途；在制備用于預(yù)防和/或治療與糖代謝相關(guān)的疾病和/或癥狀的藥物中的用途； 在制備用于預(yù)防和/或治療II型糖尿病、肥胖和/或肥胖癥、β細(xì)胞功能低下等糖代謝疾病的藥物中的用途；和/或在制備用于控制II型糖尿病患者體內(nèi)血糖的藥物中的用途。
19.一種組合物，其包括預(yù)防和/或治療有效量的權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述聚乙二醇修飾物以及任選的藥學(xué)可接受的載體。
20.權(quán)利要求13-16任一項(xiàng)所述Exendin-4類似物在制備權(quán)利要求1_12任一項(xiàng)所述聚乙二醇修飾物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及Exendin-4類似物的定位聚乙二醇化修飾物及其用途。特別地，本發(fā)明涉及式(I)所示的Exendin-4類似物的聚乙二醇修飾物或其可藥用鹽，其中各符號如說明書所述。本發(fā)明還涉及式(II)所示的Exendin-4類似物其中各符號如說明書所述。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述聚乙二醇修飾物的制備方法、其用途、包含其的組合物、以及所述Exendin-4類似物用于制備所述聚乙二醇修飾物的用途。通過本發(fā)明可以使聚乙二醇專一性地定位修飾于Exendin-4類似物的肽鏈中并且修飾物具有有益的生物學(xué)活性。PEG-M-X-(Ex-4) (I)[Aap]Exendin-4 (II)。
文檔編號A61P3/10GK102397558SQ201010276918
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者劉克良, 梁遠(yuǎn)軍, 許笑宇 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所