專利名稱：一種煨木香乙酸乙酯提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種煨木香乙酸乙酯提取物。屬藥物領域。
背景技術：
川木香為菊科植物川木香Vladimiria souliei (Franch.)Ling.及灰毛川木香 Vladimiria soul iei (Franch.) Ling var. cinerea Ling 的干燥根，為中醫(yī)禾口藏醫(yī)等民族醫(yī) 交叉用藥品種，中藥用川木香為菊科川木香屬植物川木香及灰毛川木香的干燥根，藏藥用 川木香為川木香干燥根。川木香臨床應用廣泛，具有行氣止痛的功效，是治療胃腸疾病的常 用藥。川木香亦為常用川產(chǎn)道地中藥材，主要分布于四川西北部民族地區(qū)，該地區(qū)居民受當 地飲食條件等影響，胃腸道疾病常見?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版一部規(guī)定川木香 具有行氣止痛的功效，用于胸脅、脘腹脹痛，腸鳴腹瀉，里急后重。其炮制項下分列“川木香” 和“煨川木香”兩個品種，“川木香”經(jīng)“除去雜質(zhì)及‘油頭’，洗凈，潤透，切厚片，干燥”所得， “煨川木香”則“取凈川木香片，在鐵絲匾中，用一層草紙，一層川木香片，間隔平鋪數(shù)層，置 爐火旁或烘干室內(nèi)，烘煨至川木香中所含的揮發(fā)油滲至紙上，取出，放涼”而成。飲片入藥，生熟異治是中藥的鮮明特色，中醫(yī)臨床用藥的一大特點是使用經(jīng)炮制 所得的飲片，但炮制經(jīng)驗多數(shù)是“師徒相傳，口傳心受”繼承下來，各地遵循不一。通過前期 川木香相關文獻的整理與研究，發(fā)現(xiàn)川木香各地炮制方法不一致，多屬于手工作坊生產(chǎn)，尚 難適應現(xiàn)今工業(yè)化的生產(chǎn)，因此研究川木香的煨制技術，建立質(zhì)量控制標準，改進工藝是當 務之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術方案是提供了一種煨木香乙酸乙酯提取物。本發(fā)明還提供了該煨木 香的制備方法和用途。本發(fā)明提供了一種煨木香乙酸乙酯提取物，該提取物的指紋圖譜如圖1所示，具 有16個特征峰，它們的平均相對保留時間和平均相對峰面積如下表所示煨木香乙酸乙酯提取物的平均相對保留時間和平均相對峰面積
6 其指紋圖譜的色譜條件為色譜柱DiamonsilC18 (250 X 4. 6mm, 5 μ m)流動相A:水，B:甲醇梯度0-20min，40% -50% B ；20-60min, 50% -100% B檢測波長230nm柱溫30°C流速1· Oml/min。它是由如下方法制備而成稱取煨木香，加入95%乙醇提取，過濾；濾渣加入水煎煮，將醇提液減壓濃縮至無 醇味后與水煎液合并，濃縮，將濃縮液置于分液漏斗中采用系統(tǒng)溶劑法，依次加入石油醚 (沸程60 90 )、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇萃取至無色，取乙酸乙酯萃取液濃縮成干 膏，即得本發(fā)明煨木香乙酸乙酯提取物。本發(fā)明提取物中包含如下化合物 化合物I 化合物II 化合物III 化合物IV 化合物V 化合物VI
化合物VDI
化合物VDI
化合物IX
化合物X
化合物XI。
其中，所述的煨木香來源于菊科多年生草本植物木香Aucklandia IappaDecne.川木香 Vladimiria souliei (Franch. )Ling、灰毛川木香 Vladimiria souliei (Franch.) Ling var. cinerea Ling 的根的煨制品。其中，所述的煨制品為面裹煨、紙煨、麥麩煨。本發(fā)明還提供了該煨木香乙酸乙酯提取物的制備方法，它包括如下步驟稱取煨木香，加入95%乙醇提取，過濾；濾渣加入水煎煮，將醇提液減壓濃縮至無 醇味后與水煎液合并，濃縮，將濃縮液置于分液漏斗中采用系統(tǒng)溶劑法，依次加入石油醚 (沸程60 90°C )、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇萃取至無色，取乙酸乙酯萃取液濃縮成干 膏，即得本發(fā)明煨木香乙酸乙酯提取物。本發(fā)明還提供了所述的煨木香乙酸乙酯提取物在制備具有止瀉作用的藥物中的 用途。本發(fā)明還提供了一種具有止瀉作用的藥物組合物，它是由有效量的煨木香乙酸乙 酯提取物為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學上常用的藥劑。其中，所述的藥劑是口服制劑、注射制劑。所述的口服制劑是口服液、膠囊劑、丸 劑、顆粒劑或片劑。本發(fā)明以川木香及其煨制法為研究對象，對川木香炮制工藝、藥理作用和作用機 制、藥效物質(zhì)基礎的變化及其與藥理作用的相關性進行了深入系統(tǒng)的研究，以明確其藥效 物質(zhì)基礎及變化規(guī)律，制備得到的煨木香乙酸乙酯提取物用于止瀉作用，藥效最強，藥效明 確，且質(zhì)量穩(wěn)定，可控性強，為臨床提供了 一種新的用藥選擇。


圖1本發(fā)明煨木香乙酸乙酯提取物指紋圖譜圖2提取分離流程3川木香生品指紋圖譜圖4川木香煨品指紋圖譜圖5川木香生品與煨品共有模式對比6煨川木香各部位作用正常離體腸肌的量效曲線
具體實施例方式實施例1本發(fā)明煨木香乙酸乙酯提取物的制備川木香藥材1.4Kg，粉碎，加入八倍量95%乙醇回流提取兩次，每次1小時，過濾， 濾渣加入10倍量水煎煮兩次，每次lh，將醇提液減壓濃縮至無醇味后與水煎液合并，濃縮 至3 1(即每毫升藥液中相當于含原生藥Ig))，將濃縮液置于分液漏斗中采用系統(tǒng)溶劑 法，依次加入石油醚(沸程60 90°C )、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇，少量多次萃取至無 色，將乙酸乙酯萃取液濃縮成干膏。實施例2本發(fā)明藥物的制備取實施例1制備的煨木香乙酸乙酯提取物，加入藥學上常用的輔料，如淀粉，制 粒，整粒，裝膠囊，得膠囊劑。實施例3本發(fā)明藥物的制備取實施例1制備的煨木香乙酸乙酯提取物，加入藥學上常用的輔料，如淀粉，制粒，整粒，加入硬脂酸鎂，壓片，得片劑。實施例4本發(fā)明藥物的制備取實施例1制備的煨木香乙酸乙酯提取物，加入藥學上丸劑用輔料，制備成丸劑。實施例5本發(fā)明煨川木香止瀉作用有效部位的成分分離與結(jié)構(gòu)鑒定1.樣品的提取分離川木香藥材1.4Kg，粉碎，加入八倍量95%乙醇回流提取兩次，每次1小時，過濾， 濾渣加入10倍量水煎煮兩次，每次lh，將醇提液減壓濃縮至無醇味后與水煎液合并，濃縮 至3 1(即每毫升藥液中相當于含原生藥Ig))，將濃縮液置于分液漏斗中采用系統(tǒng)溶劑 法，依次加入石油醚(沸程60 90°C )、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇，少量多次萃取至無 色，將乙酸乙酯萃取液濃縮成干膏。得到147g浸膏。乙酸乙酯萃取物與100-200目硅膠(1 1)拌勻后通過100-200目硅膠柱層析，用 不同比例的石油醚-氯仿(90 10,80 20,70 30,60 40)和石油醚-丙酮(70 30) 梯度洗脫，并結(jié)合TLC反復分離純化，先后得到11個化合物I (800mg)、II (36mg)、 III (80mg)、IV (7mg)、V (Illmg)、VI (4mg)、ΥΠ (89mg)、VDI (48mg)、IX (IOmg)、X (120mg)、 XI (4mg)。提取分離流程見圖2。2.結(jié)構(gòu)鑒定化合物I 淡黃色油狀物，TLC鑒定石油醚-氯仿(80 20)展開，Rf值約為0. 5， 噴10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱2min，顯紫紅色斑點，置365nm紫外燈下檢視，顯綠色熒光。1H-WR(CDCL3), δ 1. 06 禾口 1.63(1H，m，1—Η)，1. 27 (1Η，m，2—H)，4. 50 (1H，dd, J =7,6. 9Hz，3-H)，0. 82 (1H, m，5-H)，1. 30 (1H, m，6_H)，1. 63 (1H, m，7_H)，1. 62 (1H, m，9_H)， 1. 89 (1H, m. 11-H) ,5. 12 (1H, t, J = 4. 8Hz，12-H)，1. 31 (1H，m，15-H)，1. 30 (1H，m，16-H)， 1. 31 (1H, m, 18-H)，0. 97(1H, m, 19-H)，1. 24(1H, m，20_H)，1. 31 (1H, m，22_H)，0. 82(1H, s，23-H)，0. 96 (1H, s，24-H)，0. 92 (1H，s，25-H)，0. 90 (1H，s，26-H)，1. 06 (1H，s，27_H)， 0. 86 (1H, s, 28-H)，0. 82 (1H, dd, J = 6. 6Hz，29-H)，0. 89 (1H, d, J = 6. 9Hz，30-H)，2. 28 (1H, t, J = 6. 6Hz,2' -H),1.63(1H, m,3' -H), 1. 28(12H, brs,4' -16' -H) ,0. 87 (1H, t, J = 7Hz, 17' -H)。13C-NMR (CDCL3) :39. 6 (C-I)，28. 0 (C-2)，80. 5 (C-3)，39. 6 (C-4)，55. 2 (C-5)， 16. 8(C-6)，31. 9(C-7)，41. 5(C_8)，47. 5 (C_9)，34. 8 (C—10)，22. 6 (C_l 1)，124. 2(C_12)， 139. 5(C-13) ,41. 5(C_14),28.0 (C_15),25. 1(C_16) , 34. 8(C_17),59.0 (C_18)， 29. 6 (C-19)，39. 6 (C—20) ,31. 9 (C—21)，41. 5 (C—22)，28. 0 (C—23)，16. 8 (C—24)，16. 8 (C—25)， 16. 8 (C-26) , 22. 6 (C_27) , 28. 0 (C_28) , 16. 8 (C_29) ,21. 3 (C_30) , 173. 6 (C_l ')， 34. 8 (C-2 ' )，25.1 (C-3 ' ), 29. 1-29. 6 (C-4 ' -13 ' ) ,29. 6(C-14 ' ) ,31. 9(C-15 ')， 22. 6(C-16' )，14.1(C-17')。以上數(shù)據(jù)與 α-amyrin margarate 基本一致，所以推斷化 ^^ I 為 a -amyrin margarate
Ri=CO(CHg) 15CH3 R2=CH3化合物I的化學結(jié)構(gòu)化合物II 白色羽毛狀結(jié)晶，TLC鑒定石油醚-氯仿(80 20)展開，Rf值約為 0. 4，噴10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱2min，顯紫紅色斑點，置365nm紫外燈下檢視，顯綠色熒光。IH-NMR(CDCL3)，δ 0. 83 (3Η, s, CH3), 0. 87 (3H, s, CH3) ,0. 88 (3H, s, CH3)， 0. 90 (3H, d, CH3) ,0. 97 (6H, s，2XCH3)，1. 04 (3H, d, J = 6. OHz, CH3)，1. 06 (3H, s, CH3)。13C-WR(CDCL3) 24. 1 (C-Ia)，23. 1 (C_2a)，23. 1 (C_3a)，25. 2 (C_4a) ,21. 3 (C_5a)， 23. 1 (C-6a)，24. 1 (C-Ib)，24. 1 (C_2b)，24. 1 (C_3b)，22. 2 (C_4b) ,21. 3 (C_5b)，24. 1 (C_6b)， 23. 1 (C-7)，22. 2 (C—8) ,41. 0 (C—9)，23. 1 (C-10)，23. 1 (C—15)，25. 2 (C—16)，33. 1 (C—18)， 34. 7 (C-19)，37. 3 (C—20)，35. 9 (C—21)，25. 2 (C—22)。以上數(shù)據(jù)與Isobauerenyl acetate (異降香萜烯酸乙酸酯)(劉文粢，何風 雷，阮子鏞等.狼毒大戟的化學成分研究[J].中國中藥雜志2001，26(3) :180-182.； A. K.Chakravarty et al.Peracid oxidation products of swertanone[J]. Tetraledron. 1991,47(1213) 2337 2350.)報道基本一致，所以推斷化合物II為 Isobauerenyl acetate (異降香萜烯酸乙酸酉旨)。化合物II的化學結(jié)構(gòu)化合物III 白色針狀結(jié)晶，TLC鑒定氯仿-異丙醇(90 10)展開，Rf值約為0. 5， 噴10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱2min，顯深綠色斑點，置365nm紫外燈下檢視，顯綠色熒光。1H-WR(CDCL3), δ :6· 19 (1Η, d, J = 3. 3Hz, H_13a)，5· 46 (1H，d, J = 3. 3Hz, H-13b)，5. 23 (1H, br. s, H-15a)，5. 03 (1H, br. s, H_15b)，4. 87 (1H, br. s, H-14a)，4. 78 (1H, br. s，H-14b)，3. 95(lH，t，J = 9. 2Hz，H_5)。13C-WR(CDCL3) :170. 16(C_12)，151. 18 (C-Il)， 149. 10(C-3)，139. 58(C_9)，120. 10(C-13)，112. 46(C-15)，109. 41(C-14)，85.16 (C_5)， 51. 87(C-4) , 47. 42 (C_6),44.95 (C-10),36. 18(C_2) , 32. 47 (C_8),30.80 (C-I), 30. 16 (C-7) 0以上數(shù)據(jù)與去氫木香內(nèi)酯(楊輝，謝金輪，孫漢董.云木香化學成分研究[J].
云南植物研究.1997，19(1) 85 91.)基本一致，所以推斷化合物III為去氫木香內(nèi)酯。 化合物III的化學結(jié)構(gòu)化合物IV 白色針狀結(jié)晶，TLC鑒定氯仿-乙酸乙酯(96 4)展開，Rf值約為 0. 4，噴10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱2min，置365nm紫外燈下檢視，顯綠藍色熒光。1H-NMR(CDCL3) , δ :0. 82 (s)，0. 84 (d，J = 6. 5Hz, ) ,0. 96 (d, J = 5. 1Hz), 0. 96 (s)，0. 97 (s)，1. 01 (s)，1. 02 (s). 3. 20 (1H, dd, Jaa = 10. 6andJae = 5. 5Hz,，3—H)， 3. 27 (1H, d, Jgem = 10. 7Hz,28b-H) ,3. 57 (1H, d, Jgem = 10. 7Hz，28a_H)，5. 16 (1H，t, J = 3. 42Hz, 12-H)。13C-NMR(CDCL3) :138· 6(C_13)，125. 0(C_12)，79· 0 (C_3)，69. 9 (C—28)， 55. 1 (C-5)，54. 0 (C-18)，47. 6 (C_9)，42. 0 (C-14)，38. 7 (C-I)，39. 4 (C-20)，39. 3 (C-8)， 38. 7 (C-19)，38. 7 (C—4)，37. 9 (C-10)，35. 1 (C—17)，32. 7 (C—21)，30. 6 (C—22)，28. 1 (C—23)， 28. 1 (C-15) ,27. 1 (C—2)，32. 8 (C—7)，25. 9 (C—11)，23. 3 (C—27)，23. 2(C_16) ,21. 3 (C—30)， 18. 3 (C-6)，17. 3 (C-26)，16. 7 (C-29)，15. 7 (C-25)，15. 6 (C-24)。以上數(shù)據(jù)與 Uvaol (熊果 酉享)(S. Siddiqui et al. Kaneric acid, a new triterpene from the leaves of Nerium Oleander [J], Journal of Natural Products. 1986,49 (6) :1086 1090.)基本一致，所以 推斷化合物IV為熊果醇。 化合物IV的化學結(jié)構(gòu)化合物V 白色針狀結(jié)晶，TLC鑒定氯仿-乙酸乙酯(98 2)展開，Rf值約為 0. 4，噴10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱2min，顯綠色斑點，置365nm紫外燈下檢視，顯綠色熒光。1H-NMR (CDCL3), δ :6·26(1Η，d, J = 3. 5Hz，13—H)，5· 53 (1H，d, J = 3. OHz, 13' -H)，4. 93(lH，br，dd，J = 11. 0Hz, 5-H), 4. 90 (1H, br, dd, J =，1_H)，4. 61 (1H，dd，J = 13. OHz, 15-H)，4. 60(lH，dd，J = 11. 0Hz，6_H)，4. 57(lH，d，J = 13. OHz, 15' -H)，2. 56 (1H, m, J = 3. 5Hz，7-H)，2. 53 和 2. 07 (1H, m, J = 12. 5Hz，3_H)，2· 20 (1H, m，2_H)，2. 10 (1H, s, OAc), 1. 35 (2H, br, s，14_H，14' -H)。以上數(shù)據(jù)與 15-Acetoxycostunolide (15-乙酰氧基 木香烯內(nèi)酉旨)(S. Siddiqui et al. Kaneric acid,a new triterpene from the leaves of Nerium Oleander [J]. Journal of Natural Products. 1986,49 (6) : 1086 1090.)基本一 致，所以推斷化合物V為15-Acetoxycostunolide (15-乙酰氧基木香烯內(nèi)酯)。
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化合物V的化學結(jié)構(gòu)化合物VI:白色針狀結(jié)晶，TLC鑒定石油醚-丙酮(80 20)展開，Rf值約為0.4， 噴10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱2min，置365nm紫外燈下檢視，顯綠色熒光。1HNMR(CDCl3), δ :d6. 08 (1Η，d，J = 3. 2Hz，H_13a)，5. 41 (1Η，d，J = 3. 2Hz，H_13b)， 5. 35(lH,br. s，H_3)，3· 93(lH，t，J = 11. 0Ηζ，Η_6β )，3· 66(lH，dd，J = 9. 9,6. 6Hz，H_la)， 1. 84 (3H, br. s, H-15)，0· 88 (3H，s, H-14)。13C-NMR(CDCL3) 138. 92 (C-ll)，133. 44 (C_4)， 121. 22 (C-3) , 116. 85 (C-13) , 75. 22 (C-I) , 32. 75 (C_2) , 51. 10 (C_5) ,81. 467 (C_6)， 51. 00(C-7)，40. 84 (C-IO)，34. 20 (C_9)，23. 35(C_15)，21. 15(C_8)，11. 03(C_14)。以上數(shù)據(jù) 與珊塔瑪內(nèi)酯(Santamarine)(楊輝，謝金輪，孫漢董.云木香化學成分研究[J].云南植物 研究.1997，19(1) :85 91.)基本一致，所以推斷化合物VI為珊塔瑪內(nèi)酯。 化合物VI的化學結(jié)構(gòu)化合物ΥΠ:白色針狀結(jié)晶，TLC鑒定氯仿-異丙醇(92 8)展開，Rf值約為0.5， 噴10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱2min，置365nm紫外燈下檢視，顯綠色熒光。1H-WR(CH3OH)jS :d7. 07 (1H，d，J = 1. 5Hz，2-H)，7. 07 (1H，d，J = 1. 5Hz，2 ‘ -H)， 6. 88 (1H, dd, J=L 5,8. 0Hz，6_H)，6. 88 (1H, dd, J=L 5,8. 0Hz，6 ' -H)，6. 85 (1H, d, J =8. 0Hz，5-H)，6. 85 (1H, d, J = 8. 0Hz，5 ' -H)，4. 98 (1H, S，7_H)，4. 98 (1H, s，7 ' -H)， 4. 13 (1H, d, J = 9. 4Hz，9b-H)，4. 10 (1H, d, J = 9. 4Hz,9' b_H)，4. 00 (1H, d, J = 9. 4Hz, 9a-H), 3. 97 (1H, d, J = 9. 4Hz，9' a_H)，3. 33 (3H, s，3_0CH3)，3. 33 (1H, s，3' -OCH3)。13C-WR(CH3OH) :148. 6,148. 6 (C-3, C-3 ' )，147. 4、147. 4(C_4，C_4 ' )，129. 5、 129. 5 (C-1 ‘，C-l)，121. 6、121. 6(C-6，C-6 ' )，115. 6、115. 6 (C_5，C_5 ' ) ,112.8、 12. 8(C-2, C-2 ' )，89· 1、89· 1、89· 1、89. l(C-7，C-8，C-7 ' , C-8 ' )，76. 7、76. 7 (C_9， C-9 ' )，56. 3、56. 3(3-0CH3，3 ' -0CH3)。以上數(shù)據(jù)與青刺尖木脂醇(Prins印iol) (Piccinelli et al. New Lignans from the Roots of Valeriana prionophylla with Antioxidative and Vasorelaxant Activities[J]. Journal of Natural Products. 2004, 67(7) :1134 1137.)基本一致，所以推斷化合物ΥΠ為青刺尖木脂醇。 化合物ΥΠ的化學結(jié)構(gòu)化合物VDI 白色針狀結(jié)晶，TLC鑒定氯仿-乙酸乙酯(85 15)展開，Rf值約為 0. 5，噴10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱2min，置365nm紫外燈下檢視，顯綠色熒光。1H-NMR (CDCl3), δ 6. 58 (4Η, s, H—2，6，2，6)，5. 51 (2H，s, 2 XArOH) ,4. 73 (2H, d, J-4. 2z, H-7,7) ,4. 28 (2H, m, H_9a，9a)，3· 93 (2Η, m, H_9b，9' b)，3· 92(12H, s，4X0CH3)， 3. 11 (2H, m, H-8,8')。13C-WR(CDCL3) 147. l(C-3，3 ‘ ,5,5 ‘ )，134. 2 (C—4，4 ‘ )，132. O (C_l，1 ‘)， 102.6(C-2，2' ,6,6 ‘ )，86. O (C—7，7 ‘ )，71. 8 (C—8，8 ‘ )，56. 3 (C—9，9 ‘ )，54. 3 (-OMe)。 上數(shù)據(jù)與文獻 艮道(Zuo G Y, He H P, Hong X, el al. Chemical constituents ofSpiraea japonica var. ovalifoh' a [J], Acta Bot Yunnan(云南植物研究)，2005，27 :101-106· Fumiko Abe and Tatsuo Yamauchi. 9 α -Hydroxypinoresinol,9 α -Hydroxymedioresinol and related lignans from Allamanda Neriifolia J]. Phytochemisty. 1988,27 (2) 575 577.)基本一致，鑒定化合物VDI為Syringaresinol ( 丁香脂素)。 化合物VDI的化學結(jié)構(gòu)化合物IX 白色針狀結(jié)晶，TLC鑒定氯仿-異丙醇(95 5)展開，Rf值約為0.5， 噴10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱2min，顯黃色斑點。1H-WR(CDCL3), δ :7. 61 (1Η，d，J = 1. 9Hz，2 ‘ -H)，7. 05 (1Η，d，J = 1. 7Hz，2_Η)， 7. 01 (1Η, d, J = 7. 4Ηζ,6' -H)，6. 96 (1Η, d, J = 8. 4Ηζ,5' -H)，6. 90 (1Η, dd, J = 8. IHz, 6-Η)，6. 19 (1Η, d, J = 8. 0Ηζ，2_Η)，4. 69 (1Η, d, J = 8. 5Ηζ,7' -H)，4. 22 (1Η, m,8' -H)， 4. 19(1Η, t, J = 8. 4Ηζ,9' b_H)，4. 18(lH，dd，J = 8. 3,5. 5Ηζ,9' a-Η)，3. 93 (3Η, s，0Me)， 3. 81 (3Η, s, OMe)，3. 78 (1H, m, 8-H)，3. 68 (1H, dd, J = 10. 3,5. 3Hz，9a_H)，2. 93 (1H, m, 8_H)。13C-NMR(CDCL3) 197. 9 (C-7)，150. 8 (C-4)，146. 8 (C-3)，145. 6 (C-4 ‘)， 145. 6 (C-3 ‘ ), 132. 4 (C-1 ‘ )，129. 5 (C_l)，123. 8 (C_6)，120. 1 (C_6 ‘ )，114. 1 (C_5)， 114. 0(C-5 ‘ )，110. 4(C-2)，109. 0(C-2 ‘ )，83.9(C_7' ), 77. O (C-9 ‘ )，61.5(C_9)，56. 1 (-OMe)，56. 0 (-OMe)，52. 2 (C-8 ‘ ), 49. 7 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與川木香醇 D (VladinolD) ([92]付朝暉，張玉梅，譚寧華等.云南油杉的化學成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開 發(fā)· 2008,20 257 261.)基本一致，所以推斷化合物IX為川木香醇D。
化合物IX的化學結(jié)構(gòu)化合物X 白色針狀結(jié)晶，TLC鑒定石油醚-丙酮(90 10)展開，Rf值約為0.3， 噴10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱2min，顯紫紅色斑點，置365nm紫外燈下檢視，顯綠色熒光。1H-NMR(CDCl3), δ :d6. 09 (1H, d, J = 3. 5Hz, H_13a)，5· 59 (1H，d, J = 3. 5Hz, H-13b)，4. 87 (1H, dd, J= 10. 5,4. 3Hz, H_l)，4. 69 (1H, br. d, J = 9. 9Hz, H_5)，4. 66 (1H, t, J = 9. 3Hz. H-6)，1. 70(3H，s, H-15)，1. 45 (3H，s, H-14)。13C-WR(CDCL3) : 170. 44 (C-12)， 141. 83 (C-Il)，141. 44 (C_4)，137. 93 (C-IO)，128. 66 (C_5)，127. 38 (C-I) ,119. 00(C_13)， 82. 13 (C-6) , 50. 90 (C_7) ,41. 59 (C_3) , 39. 87 (C_9) , 28. 45 (C_2) , 26. 72 (C-8)， 17.32(C-15)，16.24(C-14)。以上數(shù)據(jù)與木香烴內(nèi)酯([86]楊輝，謝金輪，孫漢董.云木香 化學成分研究[J].云南植物研究.1997，19(1) :85 91.)基本一致，所以推斷化合物X為 木香烴內(nèi)酯。 化合物X的化學結(jié)構(gòu)化合物XI 白色針狀結(jié)晶，TLC鑒定氯仿-異丙醇(95 5)展開，Rf值約為0.5， 噴10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱2min,顯紫紅色斑點。13C-NMR(CDCL3) 168. 95(C_12)， 165. 26(C-16)，152. 20(C-4)，141. 72(C-17)，139. 25(C-Il)，137. 27 (C-10)，126.67 (C-19)， 122. 64(C-13) ,118. 18(C_14) ,113. 57(C_15)，78· 42 (C-6) , 74. 31 (C-8) , 73. 75 (C—3)， 62. 27 (C-18)，51. 39 (C-5)，47. 60 (C-7)，45. 32 (C-I)，39. 07 (C-2)，37. 08 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與 Cynaropicrin (菜I^j苦素； 羊I^j 內(nèi)酉旨)([93] I. Muhammad et al. Cytotoxic Sesquiterpene Lactones from Centaurothamnus maximus and Vicoa pentanema[J].Phytotherapy Research, 2003，17 (2)，168-173.)基本一致，所以推斷化合物XI為 Cynaropicrin (菜薊苦 素；洋薊內(nèi)酯)。
化合物XI的化學結(jié)構(gòu)3.小結(jié)首次對煨川木香的乙酸乙酯萃取部位進行了深入的化學成分分析，成功分離出 11個化合物單體，其中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯及川木香想醇D為川木香已知成分，另 外8個成分均為首次從川木香藥材獲得，分別為α-amyrin margarate、Isobauerenyl acetate (異降香萜烯酸乙酸酯)、Uvaol (熊果醇)、15-Acetoxycostunolide (15-乙 酰氧基木香烯內(nèi)酯)、Santamarine(珊塔瑪內(nèi)酯)、PrinS印iol(青刺尖木脂醇)、 (+) -Syringaresinol ( 丁香脂素)、VladinolD (川木香醇 D)、Cynaropicrin (菜薊苦素；洋 薊內(nèi)酯)。實施例6本發(fā)明煨川木香止瀉作用有效部位的含量測定1.木香烴內(nèi)酯與去氫木香內(nèi)酯的含量測定1.1色譜條件色譜柱=Diamonsil-C18ODS (150*4. 6mm，5 μ m)；流動相甲醇-水(65 35)等度 洗脫25min ；流速=ImL · mirT1 ；檢測波長:225nm ；柱溫:30°C。1.2對照液的制備分別取木香烴內(nèi)酯與去氫木香內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含 Img的溶液，精密吸取1ml，置IOml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。1.3供試液的制備各取川木香及煨川木香乙酸乙酯萃取物約0.5g，精密稱定，加甲醇溶解，置50ml 容量瓶中，再加甲醇稀釋至刻度，精密量取1ml，置IOml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖 勻，即得。1.4檢測波長的確定通過全波長掃描并結(jié)合參考文獻，選用225nm為木香烴內(nèi)酯與去氫木香內(nèi)酯含量 的檢測波長。1.5線性關系的考察分別精密吸取2. 2項下對照品溶液1、2、5、10、20μ 1進樣，按上述色譜條件，測定 峰面積。以峰面積(A)為縱坐標，對照品進樣量(yg)為橫坐標，繪制標準曲線并進行線性 回歸，回歸方程見表1。表1木香烴內(nèi)酯與去氫木香內(nèi)酯回歸方程表 1.6精密度試驗精密吸取2. 2項下對照品溶液5 μ 1，連續(xù)進樣5次，測定色譜峰峰面積，計算峰面 積積分平均值，見表2，結(jié)果表明儀器精密度良好。表2精密度實驗結(jié)果 1.7穩(wěn)定性試驗精密吸取2. 3項下供試品溶液10 μ 1，分別于0、2、4、6、8、12h進樣，測定色譜峰峰 面積，計算峰面積積分平均值，見表3，結(jié)果表明木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在12h內(nèi)穩(wěn)定。表3穩(wěn)定性實驗結(jié)果 1.8重復性試驗精密稱取同批樣品5份，按照2. 3項下方法制備供試品溶液，各進樣10 μ 1，測定色 譜峰峰面積，計算峰面積積分平均值，見表4，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好。表4重復性實驗結(jié)果
1.9加樣回收率試驗精密稱取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對照品適量，加甲醇分別制成每Iml含木香 烴內(nèi)酯1. 16mg、去氫木香內(nèi)酯1. IOmg的溶液備用。取已知含量的川木香乙酸乙酯萃取物5 份，每份25mg，精密稱定，分別精密加入上述對照品溶液各5ml，按“2. 3”項下方法制備供試 品溶液，按上述色譜條件測定，計算回收率，見表5。結(jié)果表明各化合物回收率良好。表5加樣回收率實驗結(jié)果 1.10樣品的含量測定分別精密稱取10批藥材生品及煨品，按照2. 3項下操作制備樣品液，按照2. 1項 下條件進行測定。表6含量測定結(jié)果
2.三種化合物的含量測定2.1色譜條件色譜柱=Diamonsil-C18 ODS (250*4. 6mm, 5 μ m)；流動相甲醇-水梯度洗脫；流速 ImL · miiT1 ；檢測波長:230nm ；柱溫30°C。表7流動相程序 2. 2對照液的制備分別取化合物II、通、XI，精密稱定，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，精密吸取 Iml，置IOOml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。2. 3供試液的制備(同上)2. 4檢測波長的確定根據(jù)光譜掃描圖數(shù)據(jù)結(jié)果，化合物11、通、刃在23011111左右各化合物均有較強吸 收，故選擇230nm為檢測波長。2. 5線性關系的考察分別精密吸取3. 2. 2項下對照品溶液1、2、5、10、20μ 1進樣，各對照品按以峰面積 (A)為縱坐標，相應的進樣量(yg)為橫坐標進行回歸分析，所得回歸方程見表8。表8各化合物的回歸方程 2. 6精密度試驗精密吸取2. 2項下對照品溶液5ul，連續(xù)進樣5次，測定色譜峰峰面積，計算峰面積 積分平均值，見表9，結(jié)果表明儀器精密度良好。表9精密度實驗結(jié)果 2. 7穩(wěn)定性試驗精密吸取2. 3項下供試品溶液10μ 1，分別于0、2、4、6、8、12h進樣，測定色譜峰峰 面積，計算峰面積積分平均值，見表10，結(jié)果表明化合物11、通、)(1在12h內(nèi)穩(wěn)定。表10穩(wěn)定性實驗結(jié)果 2. 8重復性試驗精密稱取同批樣品5份，按照2. 3項下方法制備供試品溶液，各進樣10 μ 1，測定色 譜峰峰面積，計算峰面積積分平均值，見表10，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好。表10重復性實驗結(jié)果 2. 9加樣回收率試驗取已知含量的川木香藥材0. 5g，共5份，精密稱定，分別加入化合物II、通、XI適 量，按照2. 3項下方法制備供試品溶液。照上述方法測定，記錄峰面積，計算得結(jié)果見表11。表11加樣回收率實驗結(jié)果 2. 10樣品的含量測定分別精密稱取10批藥材生品及煨品，按照2. 3項下操作制備樣品液，按照2. 1項 下條件進行測定，用外標法計算含量，測定結(jié)果見表12。表12含量測定結(jié)果 實施例本發(fā)明煨川木香止瀉作用有效部位的指紋圖譜研究1.分析條件研究1. 1指紋圖譜研究方法的確定川木香乙酸乙酯部位主要含倍半萜類成分，具有 紫外吸收，可選擇操作簡便的高效液相色譜法作為指紋圖譜的研究方法。1. 2色譜柱的選擇參照《中藥注射劑色譜指紋圖譜研究指導原則》有關要求 進行了色譜柱的比較試驗，分別試驗了五種不同廠家的色譜柱=Scienhome公司Kromasil0DS-1 (250 X 4. 6mm，5um)，迪馬公司 Diamonsil C18 (250 X 4. 6mm，5um)，迪馬公司 Diamonsil C18 (150 X 4. 6mm, 5um), Schimadzu 公司 VP-ODS (150 X 4. 6mm, 5um)和 AKZ0N0BEL 公司 Kromasil-5C18(250X4. 6mm, 5um)。從中選擇了迪馬公司 Diamonsil C18 (250 X 4. 6mm, 5um)， 該色譜柱對該品種的分離效果最好。1.3測定波長的選擇選擇了 230nm、254nm和280nm處的指紋圖進行比較，結(jié)果在230nm處指紋圖譜所 反映的信息較多，主峰在230nm下的響應值較大，因此選擇230nm作為指紋圖譜的測定波長。1.4流動相的選擇采用梯度洗脫，比較了甲醇-水系統(tǒng)、乙腈_水系統(tǒng)(甲醇或乙腈比例在1小時內(nèi) 由5%線性增加到100% )，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)可以使樣品得到較好的分離，且色譜峰峰 形較好，故選用該系統(tǒng)為流動相。1.5梯度考察根據(jù)色譜柱的性能和實驗條件，選擇了 5種不同的梯度條件，如表13所示。表13梯度考察表 比較不同梯度色譜圖可以看出，各梯度條件下的色譜圖在0 20min差異較大，通 過比較，選擇分離度較好的梯度5作為最終分析樣品用的梯度條件。1. 6柱溫的考察考察了 20°C、25°C、30°C、35°C不同柱溫條件下的指紋圖譜。結(jié)果表明在不同柱溫條件下，指紋圖譜在局部存在一定差異，30°C時的色譜圖中 各峰分離度最好，故進行指紋圖譜的分析色譜柱溫為30°C。綜上，確定指紋圖譜分析條件為色譜柱Diamonsil C18 (250 X 4. 6mm, 5um)流動相A:水，B:甲醇梯度0-20min，40%-50% B ；20_60min，50% -100% B檢測波長230nm柱溫30°C流速1.0ml/min1.7陰性對照試驗以甲醇為陰性對照溶液，按上述確定的色譜條件進行測定，表明陰性無干擾。2.樣品溶液的制備2. 1供試品溶液的制備
2. 2參照物木香烴內(nèi)酯溶液的制備精密稱取以五氧化二磷干燥至恒重的木香烴內(nèi)酯對照品適量，加甲醇分別制成每 Iml含木香烴內(nèi)酯50 μ g的溶液，即得。3.色譜指紋圖譜試驗的方法學驗證3.1儀器精密度試驗取同一份供試品溶液，連續(xù)進樣5次，每次10 μ 1，以木香烴內(nèi)酯色譜峰的保留時 間和積分面積為參照，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，考察精密度，計算相 對保留時間和相對峰面積的RSD值，結(jié)果相對保留時間RSD值小于1 %，相對峰面積RSD值 小于3%，見表14和15，結(jié)果表明精密度良好。表14川木香指紋圖譜精密度(相對保留時間)考察結(jié)果 表15川木香指紋圖譜精密度(相對峰面積)考察結(jié)果 3. 2穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12h進樣，以木香烴內(nèi)酯色譜峰的保留 時間和積分面積為參照，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，考察穩(wěn)定性，計算 相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結(jié)果相對保留時間RSD值小于1 %，相對峰面積RSD 值小于3%，見表16和17，結(jié)果表明穩(wěn)定性良好。
表16川木香指紋圖譜穩(wěn)定性(相對保留時間)考察結(jié)果 表17川木香指紋圖譜穩(wěn)定性(相對峰面積)考察結(jié)果 3. 3重復性試驗取同一批川木香藥材5份，每份0.5g，按照“供試品制備”項下方法制備供試液，用 上述色譜條件進行分析，記錄各共有色譜峰的保留時間和峰面積。以木香烴內(nèi)酯的保留時 間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，考察重復性，計算出各共 有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結(jié)果相對保留時間RSD值小于1%，相對峰面 積RSD值小于3%，見表18和19，結(jié)果表明重復性良好。表18川木香指紋圖譜重復性(相對保留時間)考察結(jié)果 表19川木香指紋圖譜重復性(相對峰面積)考察結(jié)果 4色譜指紋圖譜的建立和辨認4. 1色譜峰的定位和參照物的選擇通過對照品實驗，鑒別了川木香乙酸乙酯部位HPLC指紋圖譜中的11個色譜峰，其 中15號色譜峰為木香烴內(nèi)酯，該峰為指紋圖譜中峰面積積分值最大且穩(wěn)定的一個峰，故選 擇木香烴內(nèi)酯為參照物。4. 2共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積從10批川木香生品和煨品乙酸乙酯部位的HPLC圖譜中，選擇17個峰作為共有色譜峰，共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積結(jié)果見表20。 表20川木香生品與煨品的平均相對保留時間和平均相對峰面積 4. 3相似度評價以國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件計算10批 川木香生品與煨品指紋圖譜的相似度，結(jié)果見圖3、圖4。10批川木香生品與煨品分別與其共有模式相比，相似度均大于0. 900，結(jié)果見表 21。表2110批川木香生品及煨品與其共有模式的相似度 經(jīng)軟件處理，得到共有模式如圖5所示。5.小結(jié)(1)本發(fā)明通過對川木香生品和煨品的指紋圖譜研究，建立了川木香生品和煨品 的指紋圖譜，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定、可靠，符合指紋圖譜要求。(2)川木香生品和煨品乙酸乙酯部位的指紋圖譜反映其化學成分具有一定差異， 共有模式中生品有17個共有峰，煨品有16個共有峰(與生品相比缺4號峰)，各成分的含量不同。(3)通過相似度對比發(fā)現(xiàn)，五個產(chǎn)地中的三個產(chǎn)地六批藥材差異較小，相似度均在 0.9以上，而產(chǎn)自會理和天全兩個產(chǎn)地四個批次的藥材之間具有一定的差異。以下通過藥效學試驗證明本發(fā)明的有益效果。實驗例1本發(fā)明川木香煨制前后抗腹瀉作用對比試驗川木香為菊科植物川木香Vladimiria soul iei (Franch.) Ling或灰毛川木 香 Vladimiria soul iei (Franch.) Ling var. cinaerea Ling 的干燥根，與菊禾斗植物木香 Aucklandia lappa Decne親緣，均具有行氣止痛的功效?！吨袊幍洹?010年版木香功能與 主治項下規(guī)定煨木香實腸止瀉，用于泄瀉腹痛，但對煨制川木香的功能主治并未作闡述。本 實驗根據(jù)其適應癥“腸鳴腹瀉”，對川木香炮制前后的抗腹瀉作用進行對比研究，同時揭示 其炮制前后的藥效差異。1.材料1. 1動物KM小鼠，雌雄各半(20士2g)。2. 1藥品及試劑川木香生品及紙煨制品提取液高、中、低劑量組，5%番瀉葉提取 液，生理鹽水，顛茄磺芐啶片(哈藥集團制藥六廠，批號080921)。2.方法2. 1對番瀉葉所致小鼠腹瀉的影響選取體重20士2g小鼠，雌雄各半，隨機分為7組，每組10只，單籠飼養(yǎng)于墊板上， 墊板下墊濾紙。各組均按0. 2ml/10g規(guī)格給予相應藥液(水)，其中空白組、模型組按灌胃 給予生理鹽水，陽性組灌胃給予0. 05g/ml顛茄磺芐啶混懸液，各實驗劑量組均灌胃給予川 木香炮制前后提取液，每天一次，連續(xù)給藥7天后，禁食不禁水16h，各組末次給藥0. 5h后， 除模型組外均以5%番瀉葉濃縮液按0. 2ml/10g灌胃，造模后0. 5h開始計時。實驗1_6小 時內(nèi)每小時換濾紙一次，采用稀便率作為評價指標。2. 2對蓖麻油所致小鼠腹瀉模型的影響選取體重20士2g小鼠，雌雄各半，隨機分為7組，每組10只，單籠飼養(yǎng)于墊板上， 墊板下墊濾紙。其中空白組、模型組按灌胃給予生理鹽水，陽性組灌胃給予0.05g/ml顛 茄磺芐啶混懸液，各實驗劑量組均灌胃給予川木香及煨品提取液，給藥量均為0. 2ml/10g, 每天一次，連續(xù)給藥7天后，禁食不禁水16h，各組末次給藥0. 5h后，除空白組外均按 0. 2ml/10g灌胃給予蓖麻油，造模后0. 5h開始計時。實驗1_6小時內(nèi)每小時換濾紙一次，觀 察并計算稀便率。3.結(jié)果利用SPSS13. 0對各組數(shù)據(jù)進行One Way-ANOVA方差分析，比較各組差異性。數(shù)據(jù) 均采用I <$s表示，結(jié)果見表22、23。表22川木香煨制前后對番瀉葉所致小鼠腹瀉的影響(I S，η = 10) 注□ P < 0. 05VS模型組；▲ P < 0. 05煨品組VS生品組從表22結(jié)果可知，煨品高劑量組與空白組比較，在實驗l_2h期間具有顯著性差異 (P < 0. 05)，說明該時間段為川木香煨制后發(fā)揮止瀉作用的時間段；而生品不同劑量組與 空白組比較均不具有顯著性差異，說明川木香生品不具有對抗番瀉葉所致腹瀉的作用；川 木香煨品高劑量組與生品高劑量組在實驗2h及5h時具有顯著性差異(P < 0. 05)，說明了 J11木香煨制前后抗番瀉葉所致腹瀉作用不同。表23川木香煨制前后對蓖麻油所致小鼠腹瀉的影響(I <Ss，n = 10) 注dP < 0. 05VS模型組；aP < 0. 05煨品組VS生品組從表23結(jié)果可知，煨品高劑量組在實驗2_3h期間與模型組比較具有顯著性差異 (P < 0. 05)，說明川木香煨品對蓖麻油所致小鼠腹瀉具有一定的抑制作用；而生品各劑量 組在各時間段與模型組相較均無顯著性差異；但生品高劑量組與煨品高劑量組比較，在實 驗l_3h期間的止瀉作用具有顯著性差異(P < 0. 05)。4.小結(jié)川木香煨制后對番瀉葉所致大腸刺激性腹瀉具有抑制作用，而煨制前不具有此種 作用，證明川木香煨制“止瀉”的作用，同時揭示了川木香煨制后可對抗大腸刺激性腹瀉。川 木香煨制后對蓖麻油所致小鼠小腸性腹瀉具有抑制作用，蓖麻油致瀉作用于小鼠小腸端， 故推測川木香的止瀉作用發(fā)揮部位也可能在動物小腸，同時因蓖麻油也具有“潤腸通便”的 功效，也進一步揭示了川木香煨制“實腸止瀉”作用機制。實驗例2本發(fā)明煨川木香“實腸止瀉”有效部位篩選試驗
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研究川木香煨制“實腸止瀉”的作用機理，探索川木香煨制后對抗引起動物腹瀉的 多種因素的影響，從煨制川木香對正常動物胃腸道運動的影響、拮抗模型藥所致動物腸道 平滑肌的運動異常及抗小鼠腹腔炎性反應等方面，從多個因素來考察川木香煨制止瀉的作 用機制。1.材料1. 1動物日本大耳兔(2 3kg)，成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號 SCXK (川)2004-14。KM小鼠，雌雄各半或雄性(20士2g)。1. 2藥品和試劑1.2. 1工具藥及試劑顛茄磺芐啶片(哈藥集團六廠，批號080325)，硫酸阿托 品(杭州民生藥業(yè)集團有限公司，批號T08C204)，蓖麻油(湖北科田藥業(yè)有限公司，批 號 Z42020991)，臺氏液(配方=NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g, MgSO4 · 7Η200· 29g, NaH2P04 · 2H20 0. 065g, NaHCO3 1. Og, CaCl2 0. 2g，葡萄糖1. Og)[78]，甲硫酸新斯的明注射液(上海信誼金朱 藥業(yè)有限公司，批號20050701)，地塞米松(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號080182)。1. 2. 2受試藥物稱取川木香煨品50g，8倍95%乙醇提取兩次，每次Ih后，濾渣加 入10倍量水煎煮兩次，每次lh，將醇提液減壓濃縮至無醇味后與水煎液合并，濃縮至3 1 濃度(即每3毫升藥液中相當于含原生藥Ig)，將濃縮液置于分液漏斗中采用系統(tǒng)溶劑法， 依次加入石油醚(沸程60 90°C )、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇，少量多次萃取至無色， 將各萃取液濃縮成干膏，加入10%吐溫-80，置于磁力攪拌器上使之溶解。1. 3儀器HW-400S恒溫平滑肌槽(成都泰盟科技有限公司)、BL_420生物機能實 驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)、壓力換能器、手術器械、200 μ 1可調(diào)式移液槍、眼科剪， 彎嘴鑷，灌胃針，天平等。2.方法2. 1煨川木香“實腸止瀉”有效部位的篩選取日本大耳兔猛擊頭部致死，迅速剖腹， 取近幽門端十二指腸約10cm，置于盛有冷臺氏液之器皿中，沿腸壁剪去腸系膜，將腸管剪成 1.5 2cm的小段備用。調(diào)節(jié)恒溫平滑肌槽，使水溫保持在(37士0.5) °C。將壓力換能器與 BL-420生物機能實驗系統(tǒng)連接。取兔腸一段，兩端各穿一線，其中一線固定于L型通氣管 上，放入有50ml臺氏液的浴漕內(nèi)，固定L型通氣管，并調(diào)節(jié)恒溫平滑肌槽，緩慢通入95% O2 和5% CO2 (2個氣泡/s)。腸管另一端與壓力換能器相連，加Ig負荷，打開BL-420生物機 能實驗系統(tǒng)，待腸管運動恢復正常后，記錄腸管正常情況下2min活動曲線，采用累積給藥 的方式滴加藥液，每次50ul，記錄各給藥量下腸管2min的活動曲線，抑制率(％ )=(給藥 前平均張力-給藥后平均張力)/給藥前平均張力X 100%。2. 2煨川木香對正常小鼠小腸推進的影響將50只小鼠隨機均分為5組，其中煨 品高、中、低劑量組(15、9、3g. kg-1)各組灌胃(ig)相應藥液，空白組和新斯的明組灌胃(ig) 等容積生理鹽水，給藥量均為0. 2mL · lOg—1，每天灌胃1次，連續(xù)7天。末次給藥前禁食不 禁水12h，新斯的明組末次給藥為皮下注射甲硫酸新斯的明0. lSmg'kg—1。給藥或生理鹽水 45min后灌胃給予每只小鼠0. 2mL新鮮配制的炭末混懸液(其中活性炭和阿拉伯樹膠各含 10% )，20min后脫頸椎處死。開腹分離腸系膜，剪取上端至幽門，下端至回盲部的腸管，置 于托盤上，輕輕將腸管拉直，測量總長度，測量幽門至活性炭前沿的距離作為其在小腸內(nèi)推 進距離，采用推進率作為指標。活性炭推進率(％ )=小腸推進距離/腸總長度X100%。
2. 3煨川木香對新斯的明負荷下小鼠小腸推進的影響將60只小鼠隨機均分6 組，其中煨品高、中、低劑量組(lSjdg.kg—1)各組灌胃(ig)相應藥液，空白組和新斯的明 組灌胃(ig)等容積生理鹽水，給藥量均為0. Zml^lOg—1，每天灌胃1次，連續(xù)6天；陽性組皮 下注射硫酸阿托品6X 10_3g. kg—1。末次給藥前禁食不禁水12h，給藥或生理鹽水45min后，除 空白對照組外，每只小鼠均皮下注射甲硫酸新斯的明0. 15mg. kg"1 ；空白組皮下注射同體積 生理鹽水。給藥或生理鹽水45min后灌胃給予每只小鼠0.2mL新鮮配制的炭末混懸液(其 中活性炭和阿拉伯樹膠各含10% )，20min后脫頸椎處死(其余同第二節(jié)“方法”項下)，計 算小腸推進率。2. 4煨川木香對家兔離體腸肌解痙機制的研究2.4. 1對家兔正常離體腸平滑肌的影響猛擊家兔頭部致昏，快速取出十二指腸， 用克氏液漂洗干凈，置于盛有低溫克氏液的培養(yǎng)皿中。剪取2cm腸段，置于盛有50ml、 (37士0. 5) °C克氏液的平滑肌槽中，持續(xù)通以氧氣。腸段的一端固定在肌槽底部的不銹鋼彎 鉤上，另一端與肌張力傳感器連接，后者接生物機能實驗系統(tǒng)記錄腸段的等長收縮活動。腸 段負荷Ig張力，溫育30min，待腸段自發(fā)活動平穩(wěn)，記錄2min正常收縮曲線，采用累積給藥 的方式滴加川木香煨品乙酸乙酯部位的吐溫-80溶液及空白吐溫-80溶液，分別作為實驗 組和對照組，記錄各給藥量下腸管2min的活動曲線，以給藥前后腸肌收縮的平均張力計算 抑制率。2. 4. 2對Ach負荷下家兔離體腸肌的影響腸肌制取同上，待腸段自發(fā)活動平穩(wěn) 后，在浴槽中加入1. OX 10_5mol/L(浴槽內(nèi)終濃度)的氯化乙酰膽堿，使腸肌出現(xiàn)持續(xù)性 收縮，處于痙攣狀態(tài)，記錄2min收縮曲線，再分別累積給予川木香煨品乙酸乙酯部位的吐 溫-80藥液及空白吐溫-80溶液，分別作為實驗組和對照組，操作同前，以給藥前后腸肌收 縮的平均張力計算抑制率。2. 4. 3對磷酸組胺負荷下家兔離體腸肌的影響腸肌制取同上，待腸段自發(fā)活動平 穩(wěn)后，在浴槽中加入1.0X10_5mOl/L(浴槽內(nèi)終濃度)的磷酸組胺，使腸肌收縮增強，記錄 2min收縮曲線，再分別累積給予川木香煨品乙酸乙酯部位的吐溫-80藥液及空白吐溫_80 溶液，分別作為實驗組和對照組，操作同前，以給藥前后腸肌收縮的平均張力計算抑制率。2. 4. 4對Bacl2負荷下家兔離體腸肌的影響腸肌制取同上，待腸段自發(fā)活動平穩(wěn) 后，在浴槽中加入0. Sg -Γ1 (浴槽內(nèi)終濃度)的氯化鋇溶液，使腸肌收縮增強，記錄2min收 縮曲線，再分別累積給予川木香煨品乙酸乙酯部位的吐溫-80藥液及空白吐溫-80溶液，分 別作為實驗組和對照組，操作同前，以給藥前后腸肌收縮的平均張力計算抑制率。2. 5煨川木香對小鼠毛細血管通透性的影響將50只小鼠隨機均分5組，其中 煨品高、中、低劑量組(15.L3g.kg_1)各組灌胃(ig)相應藥液，模型組灌胃等容積生理鹽 水，陽性組灌胃給予地塞米松混懸液(2. 5mg/kg)，給藥量均為0. 2mL· lOg—1，每天灌胃1 次，連續(xù)7天。末次給藥前禁食16h，給藥Ih后，每只尾靜脈注射0. 5%伊文思藍生理鹽水 0. lml/10g (體重)，腹腔注射0. 7%冰醋酸致炎0. 2ml/只。20分鐘后脫頸處死動物，剪開 腹部皮膚，分離肌肉，暴露腹腔，用5ml生理鹽水分數(shù)次洗滌腹腔，3000rpm離心5min，移液 槍移取上清液用分光光度計于590nm處測定吸光度。3.結(jié)果3. 1煨川木香“實腸止瀉”有效部位的篩選數(shù)據(jù)均采用I ±S表示，利用SPSS13. 0對各組數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析，見圖6。結(jié)果表明各部位在藥槽終濃度為1. 2X 10_5 1. 08X 10_4g · ml—1范圍9個劑量 組內(nèi)，均可抑制離體腸運動，其抑制作用呈一定的量效關系，量效曲線如圖4. 1所示。其中 乙酸乙酯部位作用最強，與乙醇部位作用相比具有顯著性差異(P <0.05)，與正丁醇部位 作用相比具有極顯著性差異(P < 0. 01)。從L2X10-5 1. 08X 10_4g · ml—1濃度范圍內(nèi)9個劑量組中選取高、中、低三個給 藥劑量，各部位作用結(jié)果比較如表24、25、26。表24煨川木香各部位低劑量對家兔離體腸肌的作用(7 土 S, η = 10) 注與乙酸乙酯部位相比，aP < 0.05，aaP < 0.01表25煨川木香各部位中劑量對家兔離體腸肌的作用(i±s，n = 10) 注與乙酸乙酯部位相比，aP < 0. 05, aaP < 0.01表26煨川木香各部位高劑量對家兔離體腸肌的作用(I±S，n = 10) 注與乙酸乙酯部位相比，aP < 0. 05, aaP < 0.013. 2煨川木香對正常小鼠小腸推進的影響利用SPSS13. 0對各組數(shù)據(jù)進行ANOVA 方差分析，數(shù)據(jù)均采用I 士 S形式表示，結(jié)果見表27表27煨川木香對小鼠正常狀況下小腸推動的影響(I 士S，n = 10)
乙酸乙酯部位 正丁醇部位 乙醇部位
注▲P < 0. 05VS 空白組實驗結(jié)果表明，陽性組、煨品低劑量組與空白組比較均有顯著性差異(P < 0. 05)， 均具有促進正常情況下小鼠小腸推進的作用，而煨品高劑量組與空白組比較沒有統(tǒng)計學差 異，故推測川木香煨制后止瀉作用與其對正常情況小鼠小腸推動作用不存在明顯聯(lián)系，其 “實腸”作用與正常小鼠小腸運動情況關系不明顯。3. 3煨川木香對新斯的明負荷下小鼠小腸推進的影響利用SPSS13. 0對各組數(shù) 據(jù)進行ANOVA方差分析，數(shù)據(jù)均采用I 士 S形式表示，結(jié)果見表28表28煨川木香對新斯的明負荷下小鼠小腸推進的影響(I±S，n = 10) 注aP< 0. 05VS 模型組表28結(jié)果表明，煨品高劑量組與模型組比較具有顯著性差異(P < 0. 05)，說明川 木香煨制后對胃腸平滑肌運動異常的小鼠具有抑制其小腸推進的作用。3. 4煨川木香對家兔離體腸肌解痙機制的研究利用SPSS13. 0對各組數(shù)據(jù)進行 ANOVA方差分析，數(shù)據(jù)均采用I ± s的形式，結(jié)果如下表29煨川木香乙酸乙酯部位對正常家兔離體腸平滑肌的影響(I±s，n = 8) 注aP< 0. 05，aaP < 0. OlVS 對照組由表29結(jié)果可知煨川木香乙酸乙酯部位可明顯抑制家兔離體腸肌運動，且抑制 作用呈現(xiàn)量效關系。表30煨川木香乙酸乙酯部位對工具藥負荷下離體腸肌的影響(7 土S,η = 8)
注aP< 0. 05，▲▲ P < 0. OlVS 對照組由表30結(jié)果可知，煨川木香乙酸乙酯部位可明顯拮抗乙酰膽堿、組胺、Bacl2弓丨起 的離體腸肌興奮狀態(tài)，并隨劑量增加而作用增加。3. 5煨川木香對小鼠毛細血管通透性的影響利用SPSS13. 0對各組數(shù)據(jù)進行 ANOVA方差分析，數(shù)據(jù)均采用I ± s的形式，結(jié)果見31。表31煨川木香乙酸乙酯部位對小鼠腹腔毛細血管通透性影響(I±S，n= 12) 注▲P < 0. 05VS 模型組表31結(jié)果表明煨川木香乙酸乙酯部位高劑量組與模型組比較有顯著性差異，說 明川木香煨制后具有抗小鼠腹腔毛細血管通透性作用，為揭示川木香抗腹瀉與抗炎作用的 相關性奠定了基礎。4.小結(jié)綜上所述，川木香煨制品中乙酸乙酯部位的止瀉作用最強。隨著給藥部位的極性 增加或減少，其作用強度都不同程度地減小。
權利要求
一種煨木香乙酸乙酯提取物，其特征在于該提取物的指紋圖譜如圖1所示，具有16個特征峰，它們的平均相對保留時間和平均相對峰面積如下表所示煨木香乙酸乙酯提取物的平均相對保留時間和平均相對峰面積其指紋圖譜的色譜條件為色譜柱Diamonsil C18(250×4.6mm，5μm)流動相A水，B甲醇梯度0 20min，40％ 50％B；20 60min，50％ 100％B檢測波長230nm柱溫30℃流速1.0ml/min。
2.根據(jù)權利要求1所述的煨木香乙酸乙酯提取物，其特征在于它是由如下方法制備 而成稱取煨木香，加入95%乙醇提取，過濾；濾渣加入水煎煮，將醇提液減壓濃縮至無醇味 后與水煎液合并，濃縮，將濃縮液置于分液漏斗中采用系統(tǒng)溶劑法，依次加入石油醚沸程 60 90°C、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇萃取至無色，取乙酸乙酯萃取液濃縮成干膏，即得 本發(fā)明煨木香乙酸乙酯提取物。
3.根據(jù)權利要求1所述的煨木香乙酸乙酯提取物，其特征在于它包含如下化合物
4.根據(jù)權利要求1-3任意一項所述的煨木香乙酸乙酯提取物，其特征在于所述的 煨木香來源于菊科多年生草本植物木香Aucklandia lappa Decne.、川木香Vladimiria souliei (Franch.) Ling、灰毛川木香 Vladimiria souliei (Franch.) Ling var. cinerea Ling的根的煨制品。
5.根據(jù)權利要求4所述的煨木香乙酸乙酯提取物，其特征在于所述的煨制品為面裹 煨、紙煨、麥麩煨。
6.一種制備權利要求1-5任意一項所述的煨木香乙酸乙酯提取物的方法，它包括如下 步驟稱取煨木香，加入95%乙醇提取，過濾；濾渣加入水煎煮，將醇提液減壓濃縮至無醇味 后與水煎液合并，濃縮，將濃縮液置于分液漏斗中采用系統(tǒng)溶劑法，依次加入石油醚沸程 60 90°C、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇萃取至無色，取乙酸乙酯萃取液濃縮成干膏，即得 本發(fā)明煨木香乙酸乙酯提取物。
7.權利要求1-5任意一項所述的煨木香乙酸乙酯提取物在制備具有止瀉作用的藥物 中的用途。
8.一種具有止瀉作用的藥物組合物，其特征在于它是由有效量的權利要求1-5任意 一項所述的煨木香乙酸乙酯提取物為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制 備成藥學上常用的藥劑。
9.根據(jù)權利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑是口服制劑、注射制劑。
10.根據(jù)權利要求9所述的藥物組合物，其特征在于所述的口服制劑是口服液、膠囊 劑、丸劑、顆粒劑或片劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種煨木香乙酸乙酯提取物，該提取物的指紋圖譜如圖1所示，具有16個特征峰。本發(fā)明還提供了該提取物的制備方法和用途。本發(fā)明以川木香及其煨制法為研究對象，對川木香炮制工藝、藥理作用和作用機制、藥效物質(zhì)基礎的變化及其與藥理作用的相關性進行了深入系統(tǒng)的研究，以明確其藥效物質(zhì)基礎及變化規(guī)律，制備得到的煨木香乙酸乙酯提取物用于止瀉作用，藥效最強，藥效明確，且質(zhì)量穩(wěn)定，可控性強，為臨床提供了一種新的用藥選擇。
文檔編號A61K36/285GK101904888SQ20101023877
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權日2010年7月28日
發(fā)明者傅超美, 王戰(zhàn)國, 瞿燕, 章津銘, 胡慧玲, 許麗佳 申請人:成都中醫(yī)藥大學