專利名稱：一種低溫木聚糖酶xyngr40及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種低溫木聚糖酶XYNGR40及其 基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
半纖維素作為植物細(xì)胞壁的主要組分，是陸生植物中繼纖維素之后含量最豐富的 碳水化合物，約占植物干重的35%。其中木聚糖是半纖維素中的代表性組分，是自然界中含 量?jī)H次于纖維素的第二豐富的多聚糖，幾乎占地球可更新有機(jī)碳含量的三分之一(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews. 2005，29 :3_23·)。瘤胃是反芻動(dòng)物復(fù)胃的組成部分之一，而瘤胃微生物則是指棲息在瘤胃中的微 生物，主要包括細(xì)菌，真菌和原生動(dòng)物，經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化，瘤胃細(xì)菌能分泌多種糖苷水解酶， 對(duì)各種多聚糖有較強(qiáng)的降解能力，以提高食物中營(yíng)養(yǎng)成分的利用效率(Flintand Bayer. Annals ofthe New York Academy of Sciences. 2008，1125 :280_288.)。故瘤胃微生物 纖維素酶在降解纖維素、半纖維素、開發(fā)新飼料，食品加工等方面有廣闊的應(yīng)用前景。對(duì)植 物細(xì)胞壁的降解是微生物獲取營(yíng)養(yǎng)的第一步，需要多種纖維素酶和半纖維素酶的共同作 用。飼料中含有多種多聚糖，在飼料中添加木聚糖酶，可顯著降低消化道中的食糜粘度，提 高動(dòng)物內(nèi)源性消化酶活性地發(fā)揮，其酶解產(chǎn)物還具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境、降低動(dòng)物 結(jié)腸炎的發(fā)生率和減少抗生素等獸藥用量的功效(Beg et al. Applied Microbiology and Biotechnology. 2001,56 :326_338)。低溫木聚糖酶由于其在低溫環(huán)境中具有較高的酶活，相對(duì)于中溫或高溫木聚糖酶 有其特有的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)(Gerday et al. Trends Biotechnology. 2000，18 103-107)。比如水 產(chǎn)動(dòng)物由于水體環(huán)境影響其腸道溫度偏低，因此低溫木聚糖酶更適合作為水產(chǎn)飼料添加劑 使用以提高養(yǎng)殖魚類對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收。同時(shí)，在食品工業(yè)中，低溫木聚糖酶與果膠 酶及纖維素酶同時(shí)在低溫作用可有效降低果汁黏度，有效提高果汁口味。因此開發(fā)新型的 低溫木聚糖酶將對(duì)推動(dòng)木聚糖酶在各種工業(yè)中應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的低溫木聚糖酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述低溫木聚糖酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述低溫木聚糖酶的基因工程方法。本發(fā)明的另一目的提供上述低溫木聚糖酶的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種低溫木聚糖酶XYNGR40，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。Mkkrilsvltvplsmcaamsaqglkdaykdyfkigvavnnrnvadpdqikvvlrefnsitaeriamkpqp tepkkgefnwedadkiadfcrangikmrghtlmwhsqigswmyqdekgnlIskeefyanmkhhiqaivnrykdvvyc
3wdvvneavadspvypgrpelrnspmyqiageefiykafeyaheadpdalIfyndyndaepaksqriynlvkrmkdag vpidgigmqahynvygptmkevddaiklystvvdhihlteldirinedmggglrfnqgqatvsdwertlqqdqyvql fkvlrkhkdvidcvtfwnvsdkdswlgvrnypllfdenykpkqaynavknfdpkmdnaviledfkpselnqpgqeyp mvnsqgyarfkvnapkatsvivslglggsggtvlhkaedgswmgttdgpmdegfhyyhltidggvfndpgtnnyygs trwesgieipahdadfyamknvphgnv該酶包括481個(gè)氨基酸，N端21個(gè)氨基酸預(yù)測(cè)為信號(hào)肽序列。因此，成熟的木聚糖酶XYNGR40的序列如SEQ ID NO. 2所示。qglkdaykdyfkigvavnnrnvadpdqikvvlrefnsitaenamkpqptepkkgefnwedadkiadfc rangikmrghtlmwhsqigswmyqdekgnlIskeefyanmkhhiqaivnrykdvvycwdvvneavadspvypgrpe Irnspmyqiageefiykafeyaheadpdallfyndyndaepaksqriynlvkrmkdagvpidgigmqahynvygp tmkevddaiklystvvdhihlteldirinedmggglrfnqgqatvsdwertIqqdqyvqlfvlrkhkdvidcvtf wnvsdkdswlgvrnypllfdenykpkqaynavknfdpkmdnaviledfkpselnqpgqeypmvnsqgyarfkvna pkatsvivslglggsggtvlhkaedgswmgttdgpmdegfhyyhltidggvfndpgtnnyygstrwesgieipah dadfyamknvphgnv信號(hào)肽序列為Mkkrilsvltvplsmcaamsa (SEQ ID NO. 3).本發(fā)明提供了編碼上述低溫木聚糖酶的基因XynGR40，具體地，該基因的基因組序 列如SEQ ID NO. 4所示。ATGAAAAAAAGAATTCTTAGTGTATTGACAGTACCGCTGTCAATGTGTGCAGCAATGTCCGCGCAGGGT CTGAAGGATGCCTACAAGGACTACTTCAAGATCGGTGTCGCCGTCAACAACCGCAACGTCGCGGATCCTGACCAGAT CAAGGTCGTCCTCCGCGAGTTCAACAGCATCACCGCCGAGAACGCGATGAAGCCCCAGCCGACCGAGCCCAAGAAGG GCGAGTTCAACTGGGAGGACGCCGACAAGATCGCGGACTTCTGCCGCGCCAACGGCATCAAGATGCGTGGCCACACC CTGATGTGGCACAGCCAGATCGGCTCCTGGATGTACCAGGACGAGAAGGGCAACCTCCTCTCCAAGGAGGAGTTCTA CGCCAACATGAAGCACCACATCCAGGCCATCGTGAACCGCTACAAGGATGTCGTGTACTGCTGGGACGTGGTCAATG AGGCCGTCGCCGACAGCCCCGTGTACCCGGGC CGTCCGGAGCTCCGCAACTCCCCGATGTACCAAATCGCCGGTGA GGAGTTCATCTACAAGGCTTTCGAGTACGCCCACGAGGCCGACCCGGACGCCCTCCTCTTCTACAACGACTACAATG ACGCCGAGCCCGCCAAGAGCCAGCGCATCTACAACCTCGTCAAGCGCATGAAGGACGCCGGCGTGCCTATCGACGGT ATCGGCATGCAGGCCCACTACAACGTGTACGGCCCGACGATGAAGGAAGTGGACGACGCCATCAAGCTCTACTCCAC GGTCGTGGACCACATCCACCTCACCGAGCTGGATATCCGCATCAACGAGGACATGGGCGGCGGTCTCCGCTTCAACC AGGGCCAGGCCACGGTCTCCGACTGGGAGCGCACCCTGCAGCAGGACCAGTATGTCCAGCTCTTCAAGGTGCTCCGC AAGCACAAGGACGTGATCGACTGCGTCACCTTCTGGAATGTCTCCGACAAGGATTCCTGGCTGGGCGTGCGCAACTA CCCGCTCCTCTTCGACGAGAACTACAAGCCCAAGCAGGCCTACAACGCCGTCAAGAATTTCGATCCCAAGATGGACA ACGCCGTGATCCTCGAGGACTTCAAGCCGTCTGAGCTCAACCAGCCCGGCCAGGAGTACCCGATGGTCAACTCCCAG GGCTACGCCCGCTTCAAGGTCAACGCCCCCAAGGCTACGTCCGTGATCGTCAGCCTCGGTCTCGGCGGTTCCGGCGG CACCGTCCTCCACAAAGCCGAAGACGGCTCCTGGATGGGCACCACCGACGGACCGATGGACGAGGGCTTCCACTACT ATCACCTCACCATCGACGGCGGCGTGTTCAACGACCCCGGCACCAACAACTACTACGGCTCCACCCGTTGGGAGAGC GGTATCGAGATCCCGGCCCACGACGCCGACTTCTATGCTATGAAGAACGTTCCTCACGGCAATGTGTGA其中，信號(hào)肽的基因序列如SEQ IDN0. 5所示。atgaaaaaaa gaattcttag tgtattgaca gtaccgctgt caatgtgtgc agcaatgtccgcg本發(fā)明還提供了包含上述低溫木聚糖酶xynGR40的重組載體，優(yōu)選為pET22b-xynGR40o本發(fā)明還提供了包含上述低溫木聚糖酶xynGR40的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大 腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。本發(fā)明還提供了一種制備低溫木聚糖酶XYNGR40的方法，包括以下步驟1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木聚糖酶表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的木聚糖酶XYNGR40。本發(fā)明還提供了上述低溫木聚糖酶XYNGR40的應(yīng)用。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良 的、適合于在水產(chǎn)飼料、食品工業(yè)中應(yīng)用新的木聚糖酶。本發(fā)明獲得一種低溫木聚糖酶 XYNGR40，最適pH6.5。這些性質(zhì)符合水產(chǎn)動(dòng)物消化生理特點(diǎn)，能提高飼料消化能和代謝能， 降低配方成本，減少環(huán)境污染。此低溫木聚糖酶的理論分子量為52. 4kDa。該木聚糖酶XYNGR40的最適pH為 6. 5，在pH5. 0 7. 5的范圍內(nèi)，酶活性均維持在最大酶活性的60%以上。木聚糖酶在pH 4. 0-8. 0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在50%以上，這說明此酶 具有較好的PH穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供了編碼上述低溫木聚糖酶XYNGR40的基因xynGR40。 本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這一木聚糖酶基因xynGR40，DNA全序列分析結(jié) 果表明，木聚糖酶XYNGR40結(jié)構(gòu)基因xynGR40全長(zhǎng)1446bp編碼481aa和一個(gè)終止密碼子， N端21個(gè)氨基酸預(yù)測(cè)為信號(hào)肽序列。蛋白理論分子量為52. 4kDa，等電點(diǎn)為5. 24，中間為 一個(gè)第十家族的催化結(jié)構(gòu)域，末端為E set超家族結(jié)構(gòu)域。在GenBank中的比對(duì)結(jié)果表明 它與做過功能驗(yàn)證的來自于Prevotella ruminicola 23的低溫木聚糖酶的最高一致性為 57%，表明XYNGR40是一個(gè)新的木聚糖酶。通過進(jìn)化樹的構(gòu)建，利用臨位相接法構(gòu)建的進(jìn)化 樹(MEGA 4.0)，選取得序列包括XynGR40的蛋白序列以及它的相似性比較高的木聚糖酶蛋 白序列和六個(gè)低溫木聚糖酶序列。來自于Thermotoga lettingae TMO的極端嗜熱酶序列 作為進(jìn)化樹的根。發(fā)現(xiàn)直接從瘤胃微生物宏基因組DNA克隆得到的與瘤胃和人腸道來源的 細(xì)菌處在一個(gè)分枝上，表明該基因?yàn)橐粋€(gè)細(xì)菌來源的木聚糖酶基因。本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶基因的重組載體，優(yōu)選為pET22b-xynGR40。將 本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可 操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將木聚糖酶 基因插入到質(zhì)粒pET22b(+)上的NcoI和NotI限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒 pET22b-xynGR40o本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株BL21/ xynGR40，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4023。本發(fā)明還提供了一種制備低溫木聚糖酶的方法，包括以下步驟1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木聚糖酶的表達(dá)；3)回收并純化所表達(dá)的木聚糖酶。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21/xynGR40。本發(fā)明還提供了上述低溫木聚糖酶的應(yīng)用。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、 適合于在飼料、食品工業(yè)中應(yīng)用新的木聚糖酶。低溫木聚糖酶在室溫有非常高的活性，因其 不需要外加能量供酶促反應(yīng)，所以在工業(yè)和農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用可以節(jié)省大量的能源。本發(fā)明的 木聚糖酶最適pH為6. 5，在pH4 10都有較高的酶活性；在低溫下有很高的催化活性，催 化效率要比其它的低溫木聚糖酶高；比活高比已知的細(xì)菌來源的其它低溫木聚糖高2-7 倍；同時(shí)在中溫條件下的熱穩(wěn)定性要好30°C放置一個(gè)月酶活幾乎不變，而其它的低溫酶 在30°C的熱穩(wěn)定性很差，限制了其應(yīng)用。因此本發(fā)明的低溫木聚糖酶可作為水產(chǎn)飼料添加 劑使用，降低飼料的黏度，增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。同時(shí)此酶可與果膠酶、纖維素酶在低溫下 共同用于果汁的澄清。在面包的發(fā)酵過程中添加低溫木聚糖酶(面包發(fā)酵一般在20°C度左 右)可以改善面包的品質(zhì)，增加面包的口感。此酶的對(duì)各種來源的木聚糖的降解產(chǎn)物主要 是木糖和木二糖，木糖和木寡聚糖在食品行業(yè)中廣泛地作為增稠劑、脂肪代替物和抗凍食 品添加劑，同時(shí)在制藥工業(yè)中與其它物質(zhì)結(jié)合使用，可以延緩藥物成分的釋放。


圖1 在大腸桿菌中表達(dá)的重組木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白 質(zhì)Marker ；1 誘導(dǎo)的含有空載體的大腸桿菌培養(yǎng)上清液；2 未誘導(dǎo)的含有木聚糖酶基因載 體的大腸桿菌培養(yǎng)上清液；3 誘導(dǎo)的含有木聚糖酶基因的大腸桿菌培養(yǎng)上清液濃縮液；3 通過鎳柱純化的達(dá)到電泳純的XynGR40蛋白。圖2 重組木聚糖酶的最適pH。圖3 重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性。圖4 重組木聚糖酶的最適溫度。圖5 重組木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。重組大腸桿菌菌株大腸埃希氏菌XynGR40 (Escherichia coli)(保藏編號(hào) CGMCCNo. 4023，保藏日期2010年7月20日，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)， 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑1、菌株及載體大腸桿菌表達(dá)載體pET22b(+)及菌株Escherichia coli BL21 (DE3)購(gòu)自于 Novagen 公司。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，連接酶購(gòu)自Invitrogen公 司。燕麥木聚糖、樺木木聚糖、山毛櫸木聚，PNPC(鄰硝基苯基-beta-D-纖維二糖)， pNP-xyloside (鄰硝基苯基-beta-D-木糖)，大麥β -葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維 素購(gòu)自Sigma公司，其它都為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?均可從普通生化試劑公司購(gòu)買得到)。3、培養(yǎng)基(I)LB 培養(yǎng)基(g/Ι)酵母粉 5.0，蛋白胨 10.0，NaCl 10. 0，ρΗ7· 0。(2)平板篩選培養(yǎng)基(g/1)酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10. 0，瓊脂15. 0， ρΗ7· 0。
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4、瘤胃液瘤胃液取自三歲雄性的內(nèi)蒙古波爾山羊。說明以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進(jìn)行。實(shí)施例1瘤胃微生物宏基因組DNA的提取瘤胃液取自三歲雄性的內(nèi)蒙古波爾山羊，首先將采取的瘤胃液在4 °C下 17，OOOXg高速離心30分鐘以收集瘤胃微生物菌體。然后將離心得到的沉淀(含有微生 物)在研缽中液氮研磨成粉末，按照Brady (2007)提供的方法進(jìn)行宏基因組DNA的提取。將 提取得粗D N A進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，把含有D N A的膠塊切下用試劑盒純化備用。實(shí)施例2山羊瘤胃來源的木聚糖酶編碼基因xynGR40的克隆根據(jù)第十家族木聚糖酶基因的保守(YDWDVVNE和DGIGMQSH)序列設(shè)計(jì)合成了簡(jiǎn)并 引物 XlO-F 禾口 XlO-R XlO-F 5' -CTACGACTGGGAYGTNIBSAAYGA-3‘；XlO-R 5' -GTGACTCTGGAWRCCIABNCCRT-3‘ (Wang et al. ,2010)以上述的瘤胃微生物宏基因組總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。降落PCR反應(yīng)參數(shù)為 94°C變性5min ；94°C變性30sec，56-50°C退火30sec, 72°C延伸lmin，10個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán) 降落0. 5°C )，然后94 V變性30sec，50 V退火30sec，72 V延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72 V保溫 IOmin0得到一約260bp片段，將該片段回收后與pEASY_T3載體相連送三博生物技術(shù)有限 公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序得到的核甘酸序列，設(shè)計(jì)上游和下游各四條mTAIL-PCR特異性引物設(shè) 計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計(jì)在spl的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)， sp4位于sp3的內(nèi)側(cè)。每?jī)蓚€(gè)引物之間的距離沒有嚴(yán)格規(guī)定，引物長(zhǎng)度一般22 30nt，退 火溫度在 63°C。并將它們分別命名為 GR40-uSPl，GR40_uSP2，GR40_uSP3，GR40_uSP4，(上 游特異性引物)；GR40-dSPl，GR40-dSP2，GR40-dSP3，GR40-dSP4(下游特異性引物)見表1。 按照改進(jìn)的TAIL-PCR(Huang et al. ,2010)中的程序?qū)啥藗?cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增。表1.木聚糖酶XynGR40mTAIL_PCR特異性引物 通過改進(jìn)的TAIL-PCR (Huang et al.，2010)得到已知基因序列的側(cè)翼序列，擴(kuò)增 得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術(shù)有限公司測(cè)序。通過序列拼接獲得該片段的上下游側(cè)翼序 列，全序列共長(zhǎng)1. 8kb，找到一個(gè)完整的開放閱讀框(ORF)。木聚糖酶基因xynGR40 (GenBank accession no. HM156498)由1446個(gè)堿基組成，編碼481個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，在 GenBank中的比對(duì)結(jié)果表明它與來源于Bacteroides eggerthiiDSM 20697的假想木聚糖 酶基因全序列相似性為72%，其次是來源于Bacteroidesintestinalis DSM 17393的木聚 糖酶基因，相似性為69%，與做過功能驗(yàn)證的來自于Prevotella ruminicola 23的低溫木 聚糖酶的最高一致性為57%。xynGR40編碼蛋白預(yù)計(jì)分子量為52. 4kDa，等電點(diǎn)為5. 24。 經(jīng)預(yù)測(cè)，XYNGR40前21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，中間為一個(gè)第十家族的催化結(jié)構(gòu)域，末端為 E set超家族結(jié)構(gòu)域。通過進(jìn)化樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)直接從瘤胃微生物宏基因組DNA克隆得到的與瘤胃和人 腸道來源的細(xì)菌處在一個(gè)分枝上，表明該基因?yàn)橐粋€(gè)細(xì)菌來源的木聚糖酶基因。實(shí)施例3重組木聚糖酶的制備。將表達(dá)載體pET22b(+)進(jìn)行雙酶切(NcoI+NotI)，同時(shí)將編碼木聚糖酶的基因 xynGR40雙酶切(NcoI+NotI)，切好的編碼成熟木聚糖酶的基因片段與表達(dá)載體pET22b (+)連接，獲得含有木聚糖酶基因xynGR40的重組質(zhì)粒pET22b-XynGR40并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，獲得重組大腸桿菌菌株BL21/xynGR40(保藏編號(hào)CGMCCNo. 4023，日期2010年 7月20日，保藏地址中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC)。取含有重組質(zhì)粒的BL21菌株，接種于3mL LB (100 μ g/mL的氨芐青霉素)培養(yǎng)液 中，37°C培養(yǎng)過夜。接菌于20mL LB (加有100 μ g/mL的氨芐青霉素)，37°C振蕩培養(yǎng)約 2 3h (OD600達(dá)到0. 6)后加入終濃度0. 8mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，30°C 180rpm震蕩培養(yǎng)12h。 12000rpm離心5min，收集培養(yǎng)基上清。DNS法測(cè)定木聚糖酶的活力。重組木聚糖酶的表達(dá) 量為45. 6U/mL。SDS-PAGE結(jié)果(圖1)表明，重組木聚糖酶在大腸桿菌中得到了表達(dá)。所 表達(dá)的木聚糖酶經(jīng)過純化之后，其蛋白質(zhì)的含量達(dá)到總蛋白的95%以上。實(shí)施例4重組木聚糖酶的活性分析DNS法具體方法如下在pH6. 5，60°C條件下，ImL的反應(yīng)體系包括100 μ L適當(dāng)?shù)?稀釋酶液，900 μ L底物，反應(yīng)lOmin，加入1. 5mL DNS終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后540nm 測(cè)定OD值。1個(gè)酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出Iymol還原糖的酶量。實(shí)施例5重組木聚糖酶XYNGR40的性質(zhì)測(cè)定1、重組木聚糖酶XYNGR40的最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定方法如下將實(shí)施例3純化的重組木聚糖酶在不同的pH下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。 底物木聚糖用不同PH的0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中30°C下進(jìn)行木聚糖酶活力 測(cè)定。結(jié)果(圖2)表明，XYNGR40的最適pH為6. 5，在pH5. 0 7. 5的范圍內(nèi)，酶活性均維 持在最大酶活性的60%以上。木聚糖酶于上述各種不同pH的緩沖液中37°C處理60min，再 在PH6.5緩沖液體系中30°C下測(cè)定酶活性，以研究酶的pH耐性。結(jié)果(圖3)表明，木聚糖 酶在pH 4.0-8.0之間均很穩(wěn)定，在此？!1范圍內(nèi)處理601^11后剩余酶活性在50%以上，這 說明此酶具有較好的PH穩(wěn)定性。2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定方法如下木聚糖酶的最適溫度的測(cè)定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6. 5)緩沖液體 系及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。耐溫性測(cè)定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時(shí)間，再在 30°C下進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果(圖4)表明，其最適溫度為30°C。酶的 熱穩(wěn)定性性試驗(yàn)表明(圖5)，重組酶在45°C時(shí)穩(wěn)定性非常好。50°C下保溫60min，剩余酶活 性為25%，551處理51^11酶活全部喪失。3、木聚糖酶的Km值測(cè)定方法如下用不同濃度的三種木聚糖為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6. 5)緩沖液 體系中，分別在4和30°C下測(cè)定酶活性，計(jì)算出km值。經(jīng)測(cè)定，XYNGR40對(duì)三種木聚糖底物 在4和30°C的動(dòng)力學(xué)常數(shù)如表2.表2.木聚糖酶XYNGR40對(duì)三種底物的動(dòng)力學(xué)常數(shù)
9SubstrateTemperature「maxKmkcat眾cat/Km(0C)(μηιο mirfi mg_1)(mg mL_1)(S-1)(mL S-1 mg"1)山毛櫸木聚糖30674.11.8584324.64141.92.212354.9樺木木聚糖30647.93.2562175.44128.33.611130.8燕麥木聚糖30884.74.6767163.74173.84.715132.14、不同金屬離子化學(xué)試劑對(duì)XYNGR40酶活的影響測(cè)定如下在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對(duì)酶活性 的影響，各種物質(zhì)終濃度為l，5mmol/L。在30°C、pH6. 5條件下測(cè)定酶活性。結(jié)果(表3) 表明，Zn2+、Na+、Ca2+在高濃度和低濃度時(shí)對(duì)酶活都有輕微的促進(jìn)作用，濃度高時(shí)促進(jìn)作用稍 有升高；Cr3+、Cu2+、Mn2+在低濃度時(shí)對(duì)酶活抑制不強(qiáng)，但隨著濃度的升高，其作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇蠓?度的抑制；SDS對(duì)酶活的抑制隨濃度增加而加強(qiáng)；EDTA在高濃度下都會(huì)輕微的抑制酶活；而 Co2+和β -Met的促進(jìn)作用在高濃度時(shí)得到更好的體現(xiàn)；重金屬離子Hg2+、Ag+和pb2+在低濃 度時(shí)即可強(qiáng)烈抑制酶活，高濃度時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)沉淀現(xiàn)象。其它離子對(duì)該酶的作用不明顯。表3.各種化學(xué)試劑對(duì)木聚糖酶XYNGR40活力的影響離子和化學(xué)試相對(duì)剩余活力(％)° 離子和化學(xué)試劑相對(duì)剩余活力(％廣 注“_”代表無法檢測(cè)。5、重組木聚糖酶XYNGR40的底物特異性。該酶除了可作用于不同來源的木聚糖，對(duì)pNPC(鄰硝基苯基-beta-D-纖維二糖) 也具有微弱的活性，但對(duì)于大麥葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素等由葡萄糖聚合 而成的底物沒有活性(表3)。此外，該酶對(duì)pNP-xyloside (鄰硝基苯基-beta-D-木糖)也 沒有活性，說明該酶不具有木糖苷酶的活性。表3.木聚糖酶XYNGR40底物特異性分析 6、木聚糖酶XYNGR40降解燕麥木聚糖、樺木木聚糖、山毛櫸木聚糖產(chǎn)物的分析如 下在500 μ L 0.2%的木聚糖底物(燕麥木聚糖、樺木木聚糖、山毛櫸木聚糖)中加 入6. 5U(IOOyL)純化的酶液，最適溫度30°C下保溫12h。用3kD的超濾管去掉酶蛋白，上 清液用2500色譜儀，利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培(HPAEC-PAD)檢測(cè)方法，進(jìn)行產(chǎn) 物中糖種類的分析。分析結(jié)果表明木聚糖酶XYNGR40降解的三種底物的產(chǎn)物主要是木糖， 木二糖，降解燕麥木聚糖產(chǎn)物中木糖含量為31. 6%，木二糖含量為57. 2%;降解樺木木聚糖 的產(chǎn)物中木糖含量為28. 8%，木二糖含量為61. 3% ；降解山毛櫸木聚糖的產(chǎn)物中木糖含量 為28. 9，木二糖含量為62. %。
權(quán)利要求
一種低溫木聚糖酶XYNGR40，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的低溫木聚糖酶XYNGR40，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.—種低溫木聚糖酶基因xynGR40，其特征在于，其編碼權(quán)利要求1或2所述的低溫木 聚糖酶XYNGR40。
4.如權(quán)利要求3所述的低溫木聚糖酶基因xynGR40，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4。
5.如權(quán)利要求3所述的低溫木聚糖酶基因XynGR40，其特征在于，所述低溫木聚糖酶基 因xynGR40的信號(hào)序列如SEQ ID NO. 5所示。
6.包含權(quán)利要求3或4所述低溫木聚糖酶基因xynGR40的重組載體。
7.包含權(quán)利要求3或4所述低溫木聚糖酶基因xynGR40的重組菌株。
8.如權(quán)利要求7的重組菌株，其特征在于，其所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌 或乳酸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為重組大腸桿菌菌株 BL21/xynGR40，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4023。
10.權(quán)利要求1或2所述低溫木聚糖酶XYNGR40的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種低溫木聚糖酶XYNGR40及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種來源于瘤胃的低溫木聚糖酶XYNGR40，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述木聚糖酶的基因組編碼基因xynGR40。本發(fā)明的木聚糖酶的具有以下性質(zhì)最適pH6.5，最適溫度30℃，較好的pH穩(wěn)定性和在低溫下具有較高活性。做為一種新型的酶制劑，可廣泛用于水產(chǎn)飼料、食品工業(yè)等。
文檔編號(hào)A61K47/42GK101921739SQ20101023856
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者史秀云, 姚斌, 孟昆, 楊培龍, 柏映國(guó), 王亞茹, 王國(guó)增, 石鵬君, 羅會(huì)穎, 袁鐵錚, 黃火清 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所