專利名稱：力生長因子多肽及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生長因子，具體屬于力生長因子多肽(MGF41)及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
力生長因子(Mechano growth factor，MGF)是Goldspink等發(fā)現(xiàn)的一種機械牽 張導(dǎo)致肌肉局部增長的調(diào)控因子。肌肉在力的刺激下，胰島素樣生長因子I (Insulin-like growth factor, IGF-I)基因通過選擇性剪切產(chǎn)生兩種異構(gòu)體，一種與肝臟型IGF-I相類 似，命名為肌肉型IGF-KIGF-I Ea)；另一種因?qū)αW(xué)刺激十分敏感，故命名為力生長因子 (MGF)。研究發(fā)現(xiàn)，MGF不僅是一種生長因子，而且還是一種修復(fù)因子。MGF的功能，主要與 其C端結(jié)構(gòu)域有關(guān)。MGF在正常生理狀態(tài)下不太常見，但當(dāng)骨骼肌或心肌在機械負荷加大的 狀態(tài)下表達增加，參與肌肉損傷后修復(fù)的過程。MGF不僅存在于骨骼肌、心肌中，在神經(jīng)系統(tǒng) 和造骨細胞中也發(fā)現(xiàn)其具有修復(fù)損傷的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)MGF能夠明顯提高營養(yǎng)不良 肌肉和肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)肌肉中干細胞的數(shù)量，并起到修復(fù)作用；MGF的導(dǎo)入能使?fàn)I養(yǎng) 不良的肌肉強度提高35%且具有明顯的保護神經(jīng)的作用。因此，MGF作為肌肉萎縮和肌肉 /神經(jīng)損傷修復(fù)的治療藥物具有廣泛的應(yīng)用前景。為了獲得MGF，國內(nèi)外專家已經(jīng)開展了一些研究工作，但是結(jié)果并不理想，由于 MGF不穩(wěn)定，在工程菌中的表達易形成包涵體，較難拿到純品。因此尋求一種可替代MGF，并 容易操作獲得的產(chǎn)品十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種力生長因子多肽及其制備方法和用途。本發(fā)明提供的一種力生長因子多肽(MGF41)是力生長因子C端41個氨基酸的多 肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO=I0本發(fā)明提供的編碼力生長因子多肽(MGF41)的核苷酸序列由126個核苷酸組成，包 括一個閱讀框和終止密碼子TAA。其核苷酸序列SEQ ID NO :2?！N含有編碼MGF41的核苷酸序列的載體，它是將編碼MGF41的核苷酸序列克隆進 表達載體后獲得的重組質(zhì)粒pRSETc-MGF41。一種MGF41工程菌，為原核表達系統(tǒng)，它含有如前所述的載體。是將所述的 PRSETc-MGF41重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至一種菌中，例如大腸桿菌BL21 (DE3)，構(gòu)建成工程菌株，例如 pRSETc-MGF41/BL21。MGF41的制備方法，包括如下步驟A)構(gòu)建 pRSETc_MGF41 表達載體； B)按照標(biāo)準(zhǔn)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，構(gòu)建大腸桿菌工程菌株pRSETc-MGF41/BL21，將 工程菌接種在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C，150r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5-0. 7， 加入IPTG使終濃度為0. 5mmol/L，誘導(dǎo)表達5小時； C)收集菌體，破碎細胞，離心，將上清經(jīng)陽離子交換層析獲得目的蛋白，冷凍干燥。
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采用CCK-8法對純化的MGF41的生物學(xué)活性進行研究。實驗證明，MGF41具有促成 肌細胞C2C12增殖的活性，該多肽可用于制備促細胞增殖的藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點和效果本發(fā)明MGF41多肽的制備方法簡單，一步純 化即可得到目的蛋白，且該蛋白穩(wěn)定性較好，并具有很好的促細胞增殖的生物學(xué)活性。


圖 IMGF41 的 Tricine-SDS-PAGE 圖。圖2MGF41促細胞增殖活性。
具體實施例方式實施例1:MGF41表達載體的構(gòu)建以實驗室保存的pExSecI-MGF為模板，利用特異性引物Forward primer :gat at gga tcc gctagc get cgc tct gtc cgt gcc cag和Reverse primer :cgc gc ctc gag tta ctt gtg ttc ttc aaa tgt ac進行PCR擴增，所得擴增產(chǎn)物經(jīng)OMEGA膠回收試劑盒回收目的 基因，然后用Nhe I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)同樣雙酶切的載體pRSETc通過T4 DNA 連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，進行菌落PCR及酶切鑒定。經(jīng) DNA測序分析表明，MGF41已克隆至pRSETc，將此重組質(zhì)粒命名為pRSETc_MGF41。MGF41的表達，純化及活性測定 將重組質(zhì)粒pRSETc-MGF41轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，構(gòu)建大腸桿菌工程菌株 pRSETc-MGF41/BL21，將工程菌接種在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，分別選用不同的誘導(dǎo)劑 濃度(0. 1-l.Ommol/L)，誘導(dǎo)時間(l_6h)和誘導(dǎo)溫度(37°C，30°C，16°C )對目的蛋白進行 表達。通過優(yōu)化，最終選定在37°C，150r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5-0. 7，加入IPTG使終 濃度為0. 5mmol/L，誘導(dǎo)表達5小時，進行目的蛋白的表達。最終收集菌體，破碎細胞，將全 菌和上清進行Tricine-SDS-PAGE分析，結(jié)果表明在約5KD處有表達條帶，與預(yù)計的MGF41的 蛋白分子量大小相同(如圖1，泳道3和4)。且目的蛋白大部分以可溶的方式表達。將上述獲得的含有可溶表達蛋白上清通過SP Sepharose FF陽離子交換層析柱， PB緩沖液平衡后用含有IOmM-IM NaCl的PB緩沖液洗脫，收集目的蛋白，冷凍干燥即為MGF41 產(chǎn)品。該產(chǎn)品經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析，為單一條帶(如圖1，泳道5)，這表明已獲得了純 度較高的MGF41產(chǎn)品。采用CCK-8法對純化的MGF41的生物學(xué)活性進行檢測，具體過程如下用DMEM高 糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)C2C12細胞，使其貼壁 生長，取對數(shù)生長期C2C12細胞，進行血清饑餓24h。用0. 25%胰酶消化貼壁生長的C2C12 細胞，再用不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，制成細胞懸液，并用血細胞計數(shù)板對細胞進 行計數(shù)，調(diào)整細胞個數(shù)為5X IO4個/mL。向96孔板中每孔加入上述細胞懸液100 μ L。在 37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育直到細胞完全貼壁。以不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋 MGF41樣品，加入96孔板中，樣品濃度分別為0，5，10，50，500，10000ng/mL，每個濃度重復(fù)5 個孔，每孔加50 μ LMGF樣品，以同濃度的BSA做對照。37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)12h。每孔 加人10 μ LCCK-8溶液，370C ,5% CO2條件下繼續(xù)孵育2h。用酶標(biāo)儀測定波長450nm處的吸光度值。檢測結(jié)果如圖2，表明MGF41具有促細胞增殖的活性，可用于制備促細胞增殖的藥 物。
權(quán)利要求
一種力生長因子多肽，其特征在于氨基酸序列為SEQ ID NO1。
2.編碼權(quán)利要求1的力生長因子多肽的核苷酸序列為SEQID NO :2。
3.一種載體，它含有權(quán)利要求2所述的核苷酸序列。
4.一種工程菌，其特征在于含有權(quán)利要求3所述的載體。
5.權(quán)利要求4所述工程菌為原核表達系統(tǒng)。
6.權(quán)利要求1所述的力生長因子多肽的制備方法，其特征在于，步驟如下A)構(gòu)建pRSETc-MGF41表達載體；B)按照標(biāo)準(zhǔn)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，構(gòu)建大腸桿菌工程菌株pRSETc-MGF41/BL21，將工程 菌接種在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C，150r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5-0. 7，加入 IPTG使終濃度為0. 5mmol/L，誘導(dǎo)表達5小時；C)收集菌體，破碎細胞，離心，將上清經(jīng)陽離子交換層析獲得目的蛋白，冷凍干燥。
7.權(quán)利要求1所述的力生長因子多肽在制備促細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種力生長因子多肽及其制備方法，以及該多肽的用途。本發(fā)明中的力生長因子多肽是力生長因子C端41個氨基酸的多肽，此多肽是力生長因子的活性區(qū)域。將這種多肽的核苷酸序列克隆到表達載體pRSETc中獲得重組表達質(zhì)粒pRSETc-MGF41，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌后得到表達力生長因子多肽的工程菌株，然后經(jīng)過培養(yǎng)，純化得到力生長因子多肽，該多肽具有促細胞增殖的功能，可用于制備促細胞增殖的藥物。
文檔編號A61P21/00GK101891812SQ20101022443
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者劉曉輝, 宋莉, 李卓玉, 祝文思, 董俊麗 申請人:山西大學(xué)