專利名稱：使用氣霧化的納米顆粒治療肺部細菌感染的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過給藥氣霧制劑或噴霧制劑治療由細菌感染引起的嚴重肺部疾病如肺炎(pneumonia)、VAP、支氣管炎(bronchitis)、支氣管擴張(bronchiectasis)或其它肺部疾病的方法，所述氣霧制劑或噴霧制劑含有負載有氨基糖苷類抗生素或肽類抗生素的生物可降解納米顆粒(biodegradablenanoparticle)。本發(fā)明涉及使用結合到生物可降解聚合物納米顆粒中并通過氣霧吸入遞送的氨基糖苷類抗生素來治療敏感性細菌肺部感染(susceptible bacterialpulmonary infection)的新穎且改善的方法。
背景技術：
氨基糖苷類是強效的殺菌劑，并且通常是對由革蘭氏陰性菌(gram-negative bacteria)引起的感染進行治療的一線藥物。呼吸系統(tǒng)感染中主要涉及的革蘭氏陰性菌包括流感桿菌(Hemophilus influenzae)、月市炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜月市性軍團病桿菌(Legionella pneumophila)禾口綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。 就多種嚴重的革蘭氏陰性菌感染而言，氨基糖苷類或氨基糖苷類與其它抗菌劑的組合是選用藥(drug of choice) 0它們就對抗一些革蘭氏陽性菌如分枝桿菌(Mycobacteria)而言也是有效的。盡管引入了新一代的強效抗生素和新穎的藥物遞送技術，但氨基糖苷類仍然用于一線治療。需要對這些抗生素進行給藥的更有效方法，這是因為氨基糖苷類的腎毒性和神經毒性會限制它們在治療細菌感染中的用途，尤其是當需要高的劑量時。由于在肺組織中氨基糖苷類與高度硫酸化的甘油氨基聚糖(glycoaminoglycan，GAG))發(fā)生顯著的結合，藥物在腸胃外給藥后從血液向肺組織的輸送可受到抑制，這降低了肺內的有效濃度。即使靜脈內注射或肌內注射高劑量的氨基糖苷類并且其提供了有效的血液水平，在肺組織中也只顯示出濃度可忽略的抗生素。根據目前的療法給藥的氨基糖苷類的最大安全全身水平不能提供這樣的劑量，所述劑量足以實現在氣道和肺組織中抑制細菌生長所需的藥物最小抑制濃度(MIC)。由于所述藥物進入痰(sputum)中以及穿過肺內皮的滲透性差，通常需要高的靜脈內劑量(IV dose)。氨基糖苷類的常規(guī)腸胃外給藥不能治愈肺感染，而同時增加了耐藥菌(resistant organism)發(fā)展的可能性和不良副作用的出現。仍然需要“患者友好的 (patient-friendly)”氨基糖苷類給藥方式，所述方式可在氣道、分泌物和鄰近的肺組織中提供較高的局部藥物濃度而沒有出現顯著全身副作用的危險。這種給藥必須經由可確?；颊唔槕缘倪m當方法進行。支氣管擴張是這樣的病癥，其特征在于氣道防御系統(tǒng)不能排出分泌物，由此不能維持下呼吸道和肺實質的無菌環(huán)境，這引起這些分泌物的感染和保留，因此氣道發(fā)生進行性破壞和膨脹。在感染開始時需要強力抗生素治療的被感染的大體積分泌物和對一般和常用抗生素的顯著細菌耐藥性的存在代表了針對有效治療的顯著障礙。對支氣管擴張的最有效治療仍然是抗生素治療，其一般通過口服或靜脈內注射來全身給藥。氨基糖苷類被認為是治療綠膿假單胞菌感染的最有用抗生素類別之一。然而，針對各種呼吸系統(tǒng)感染特別是支氣管擴張的有效抗生素治療繼續(xù)代表了主要的醫(yī)藥挑戰(zhàn)。同時，抗生素的低劑量和不完全過程是導致無效治療的部分問題。這種不適當治療的潛在后果包括病原體的不完全根除、抗生素耐藥性的發(fā)展和療程的延長以及由于增加的肺損傷而引起的持久臨床癥狀、支氣管擴張、瘢痕形成和有時引起早產兒死亡。抗生素在治療呼吸系統(tǒng)感染中的過多使用是主要的問題；抗生素的過多處方是抗生素耐藥性問題一直增長的主要原因之一。鑒于抗生素治療中的上述問題，研究已經主要集中于發(fā)現解決這些問題的新分子。已經對用通過新的藥物遞送技術如吸入氣霧劑給藥的氨基糖苷類治療呼吸道感染的潛在有效性進行了研究一具體為氣霧化的抗生素，將所述抗生素溶于液態(tài)水介質中并經由噴霧器給藥，或經由吸入藥用媒介物的含有微粉化抗生素的干燥粉末給藥。迄今為止，美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)僅批準了一種氣霧化的抗感染藥-TOBI (Chiron Corporation, Seattle, Wash.)。TOBI ⑧是噴霧吸入的妥布霉素 (Tobramycin)溶液。妥布霉素(0_3_氨基-3-去氧-α-D-吡喃葡萄糖基-(1_4) _0_[2， 6-二氨基_2，3，6-三去氧-a-D-吡喃核己糖基-(1-6)]-2-去氧-L-鏈霉胺(O-3-amin o-3-deoxy-alpha-D-glucopyranosyl-(1-4)-0-[2,6-diamino-2,3,6-trideoxy-alpha-D-ribo-hexopyranosyl- (1-6) ] -2-deoxy-L-streptamine))是水溶性氨基糖苷類抗生素(分子量為467. 5道爾頓)。妥布霉素以及慶大霉素就對抗革蘭氏陰性病原體(特別是綠膿假單胞菌)而言是有效的。所配制的TOBI 產品是對強光敏感的無菌無熱原水溶液(sterile non-pyrogenic aqueoussolution)。其以300mg妥布霉素游離堿溶于5ml氯化鈉中的溶液 (2. 25mg/ml) (pH為6. 0)的形式提供，并且在2_8°C穩(wěn)定至少2年。當pH為6. 0時，約五分之二的妥布霉素氨基被質子化。治療劑量為每日給藥兩次(相隔12個小時)的單一 300mg 安瓿。Τ0ΒΙ 適于治療與細菌感染相關的肺病(如囊性纖維化或支氣管擴張)并使用適當的噴霧器(例如PARI LC)給藥?；颊呓邮墀煶虨橛^天的吸入治療，接著經歷觀天的清除期(washout period)，從而降低發(fā)展出耐藥菌株的可能性。在所吸入的300mg中，所吸入的藥物中僅10%或30mg被遞送至肺。用TOBI 進行的臨床研究已經顯示所吸入的妥布霉素可導致耳鳴和變聲(voice alteration)的副作用。作為靜脈內注射、肌內注射和皮下注射的有吸引力的供選途徑利用干燥粉末氣霧吸入的肺遞送已受到了大量關注，這是因為這種途徑消除了對注射器和針頭的需要。已嘗試將氨基糖苷類的干燥粉末氣霧劑給藥至肺，但無效的遞送裝置和/或分散性差的乳糖制劑限制了結果(美國專利7，306，787描述了用于吸入的多孔顆粒的制備。美國專利 7，368，102和5，508，269涉及氨基糖苷類的肺遞送。美國專利6，890，907描述了吸入給藥妥布霉素的方法和單位劑量制劑。美國專利6，387，886描述了用氣霧化的抗生素治療嚴重慢性支氣管炎(支氣管擴張)。美國專利6，沈4，922顯示了含有水不溶性結晶留體納米顆粒分散體的霧化氣霧劑在治療肺功能障礙中的用途)。干燥粉末吸入器描述在美國專利5，458，135,5, 740, 794,5, 775，320和 155，785，049中。將所有引用的專利全文引入本申請作為參考。此外，美國專利5，875，776披露了干燥粉末吸入器，并披露了適于通過此專利披露的裝置給藥的抗生素如硫酸慶大霉素、硫酸阿米卡星和硫酸妥布霉素以及廣泛列舉的其它治療藥物。沒有披露制劑的實例。WO 00/3M61還披露了治療支氣管擴張的方法，其包括給藥氨基糖苷類的氣霧劑。在最近的臨床研究中，設計了中空的多孔妥布霉素干燥粉末制劑，并通過Turb0SpinTM(PH&T，Italy)干燥粉末吸入器遞送。在此臨床研究中，就負載到膠囊中的25mg粉末而言，僅4.6mg(18.4%)活性藥物被遞送至肺。當藥物負載和效力為這種
水平時，需要約6個膠囊(約27. 6mg)來遞送與霧化的TOBI 產品相等的肺劑量。對給藥至少6個膠囊的需要增加了患者對這種治療的順應性問題。盡管存在所有這些途徑，但由于氨基糖苷類與甘油氨基聚糖(GAG)的顯著結合以及口腔粘膜和氣管中的吸收，通過噴霧或吸入來肺內給藥游離的氨基糖苷類不能提供足以根除細菌感染所需的持續(xù)藥物濃度。將抗生素結合到膠體遞送系統(tǒng)如脂質體中，這可改善抗菌活性。若干文章和專利描述了氨基糖苷類的脂質體制劑在治療由分枝桿菌、綠膿假單胞菌、伯克霍爾德菌 (Burkholderia)和其它病原體引起的肺部感染中的用途。美國專利55，662，929提供了關于新穎的治療性脂質體制劑的信息一結合到噴霧干燥的脂囊泡中的妥布霉素肺氣霧劑。通過噴霧或氣霧化干燥粉末吸入器給藥的氨基糖苷類的脂質體制劑可增加肺組織中的藥物濃度，這增加了藥物保留和抗菌效力。限制所述脂質體氨基糖苷類的成功應用因素是抗生素填充的磷脂囊泡的穩(wěn)定性低。由于在室溫的穩(wěn)定性低，所結合的藥物從囊泡中的顯著滲漏，這使得它們不適于肺內遞送。生物可降解納米顆?；蚣{米膠囊改善了所結合的抗生素的抗菌作用，這提供了將它們遞送至肺組織的有效方法。已經顯示，通過對Fluidosomes (—種以液體形式給藥的具有低相變溫度(低 T(C))的脂質體妥布霉素制劑)進行氣管內給藥，在慢性肺部感染的動物模型中根除了類粘蛋白(mucoid)綠膿假單胞菌。就在治療囊性纖維化患者中的可能功效而言，已在慢性肺部感染的動物模型中以干燥粉末氣霧劑的形式給藥了相同的脂質體制劑。對呈干燥粉末制劑形式的脂質體妥布霉素進行氣霧化可能是治療由假單胞菌引起的慢性肺部感染的有效方法。然而，就生物可降解納米顆粒在給藥極端親水的水溶性氨基糖苷類抗生素中的用途而言，沒有任何公開的數據。申請人:已發(fā)現，盡管氨基糖苷類具有親水性和高水溶性，但可成功地將它們結合到疏水性生物可降解聚合物納米顆粒中。還已經顯示，含有包括在其中的抗生素的生物可降解納米顆?？山浻蓪{米顆粒的水混懸液進行噴霧或以干燥粉末吸入物的形式來有效地給藥至肺組織。所述給藥方法與以溶液形式給藥相等劑量的相同抗生素相比，在延長的時段中增加了肺內的藥物濃度，并在感染有綠膿假單胞菌的測試動物的存活率方面提供了顯著的改善。

發(fā)明內容
已發(fā)現患有肺部感染的患者可通過以下方式來有效地治療經由噴霧或吸入結合到生物可降解納米顆粒中的氨基糖苷類抗生素(如妥布霉素)來進行氣管內給藥?？晌虢M合物由氨基糖苷類抗生素(例如妥布霉素)構成，所述氨基糖苷類抗生素(例如妥布霉素)在用于噴霧的混懸液中的濃度為約5至50mg/ml，或在用于吸入的干燥粉末中的含量為約20至100mg/g。納米顆粒組合物可使用適當的噴霧器、干燥粉末吸入器、篩網噴霧器或超聲波噴霧器來氣霧化和給藥。也可在機械肺通氣(mechanical lung ventilation)下將氣霧化的納米顆粒組合物遞送至患者。單次給藥后氨基糖苷類抗生素的總給藥劑量包括約 20至300mg氨基糖苷類抗生素或更多，優(yōu)選為約50至約200mg所述氨基糖苷類抗生素。具體地，本發(fā)明涉及以下方面。在一個方面，本發(fā)明涉及通過向肺給藥氣霧化的納米顆粒藥物組合物治療由細菌感染引起的肺病的方法，所述納米顆粒藥物組合物包含生物可降解聚合物納米顆粒和與所述納米顆粒結合的氨基糖苷類抗生素。在另一個方面，本發(fā)明涉及氨基糖苷類抗生素在制備用于治療由細菌感染引起的肺病的、適于以氣霧化的形式向肺給藥的納米顆粒藥物組合物中的用途，其中所述納米顆粒藥物組合物包含生物可降解聚合物納米顆粒和與所述納米顆粒結合的氨基糖苷類抗生在另一個方面，本發(fā)明涉及適于以氣霧化的形式向肺給藥的納米顆粒藥物組合物，所述納米顆粒藥物組合物用于治療由細菌感染引起的肺病，其中所述納米顆粒藥物組合物包含生物可降解聚合物納米顆粒和與所述納米顆粒結合的氨基糖苷類抗生素。優(yōu)選地，使用噴霧器將所述納米顆粒藥物組合物以霧化的氣霧劑制劑的形式給藥，產生氣霧化的中值直徑為1至10微米的混懸液液滴，并且其中懸浮于上述氣霧化的液滴中的聚合物納米顆粒具有50至500nm的平均粒度。優(yōu)選地，使用干燥粉末吸入器以干燥粉末吸入性氣霧化制劑的形式給藥的所述納米顆粒藥物組合物主要遞送粉末中值粒徑為1至10微米的氣霧化混懸液，而結合到上述氣霧化的粉末顆粒中的聚合物納米顆粒具有50至500nm的平均粒度。優(yōu)選地，所述納米顆粒藥物組合物在給藥后提供了所結合的氨基糖苷類抗生素的延長釋放。優(yōu)選地，所述氨基糖苷類抗生素選自下組中的任何一種或其藥用鹽慶大霉素、妥布霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星和新霉素。優(yōu)選地，所述氨基糖苷類抗生素為妥布霉素。優(yōu)選地，對霧化的納米顆粒制劑進行單次給藥使妥布霉素在肺內的有效濃度維持至少12小時。優(yōu)選地，在給藥后，所述妥布霉素納米顆粒制劑的肺內濃度的曲線下面積(AUC) 比以溶液形式給藥的相等劑量的妥布霉素高至少2倍。優(yōu)選地，所述氨基糖苷類抗生素中的至少約2%與所述納米顆粒結合。優(yōu)選地，所述生物可降解納米顆粒包含生物可降解聚合物，所述生物可降解聚合物選自聚(丙交酯)、聚(乙交酯)或聚(丙交酯-共-乙交酯)聚合物。優(yōu)選地，所述生物可降解聚合物為乳酸和羥乙酸的共聚物。優(yōu)選地，單次給藥后氣霧化的納米顆粒藥物組合物中的妥布霉素的總給藥劑量包括20mg至300mg氨基糖苷類抗生素，優(yōu)選50mg至約200mg所述妥布霉素。


通過參考以下的詳細描述以及附圖可更容易地理解本發(fā)明的上述方面和多個附帶的優(yōu)點，其中圖1為說明水介質的霧化液滴的圖示，所述水介質含有負載有抗生素的懸浮納米顆粒。圖2為顯示在干燥粉末吸入器中使用的固體可吸入顆粒的圖示，所述固體可吸入顆粒含有負載有結合的抗生素的納米顆粒；所述顆粒主要由水溶性物質(糖(如乳糖、海藻糖或蔗糖)或多元醇(例如甘露醇))組成。圖3為顯示相等劑量的抗生素溶液和抗生素霧化納米顆粒進行肺內給藥后妥布霉素的比較性藥物動力學的圖示，其為以10mg/kg的劑量進行氣管內氣霧給藥后妥布霉素在肺實質中的濃度(大鼠，η = 4-6)，其中溶液形式的妥布霉素Cmax為5· 4μ g/g，AUC(Q_4M、 時)為75. 5 μ g*hr/g ；納米顆粒混懸液形式的妥布霉素(實施例10) =Cmax為19. 6 μ g/g ；就實施例10的NP制劑而言的AUC(0_48小時)為215. 4 μ g*hr/g。圖4為用綠膿假單胞菌感染并用妥布霉素溶液和妥布霉素霧化納米顆粒進行治療后的動物存活率的卡普蘭-邁耶圖(Kaplan-Meyer graph)，其為在綠膿假單胞菌肺炎模型中妥布霉素治療的存活率的卡普蘭-邁耶圖(小鼠，η = 10，IT給藥)，即在小鼠綠膿假單胞菌肺炎模型中以ang/kg的劑量進行吸入性妥布霉素治療(妥布霉素NP-A相應于實施例10)的存活率的卡普蘭-邁耶圖。圖5為用于肺內給藥的妥布霉素納米顆?；鞈乙涸趦龈汕昂驮趦龈僧a品復原 (reconstitution)后的粒度分布圖的圖示。
具體實施例方式當描述本發(fā)明時，詳細描述了通過對含有與生物可降解納米顆粒結合的藥理學活性量的氨基糖苷類抗生素的制劑進行吸入給藥來治療患有支氣管內感染(例如綠膿假單胞菌感染)的患者的方法。本發(fā)明特別適于強效氨基糖苷類如妥布霉素的以下制劑， 所述制劑使用噴霧器來對納米顆粒的水介質混懸液進行氣霧化，或使用呼吸驅動的高輸出率和高效率吸入器來吸入干燥粉末。為了治療敏感性微生物感染(如綠膿假單胞菌肺炎或其它類型的肺炎[尤其是醫(yī)院性肺炎(nosocomial pneumonia)或呼吸機相關肺炎 (ventilator-associated pneumonia, VAP)]以及其它肺感染(包括支氣管炎、細支氣管炎或支氣管擴張))，所產生的水滴或粉末顆粒(所述水滴或粉末顆粒包含帶有抗生素的納米顆粒)的粒度在1和5 μ m之間，從而確保氨基糖苷類向支氣管內空間的有效遞送。所述制劑含有由生物可降解聚合物制成的納米顆粒，所述生物可降解聚合物優(yōu)選為丙交酯、乙交酯或丙交酯-共-乙交酯聚酯。所述聚合物在體內降解，由此形成了不損害周圍組織的無毒分解產物。與納米顆粒結合或締合的藥物通過擴散以及利用聚合物降解機制來釋放。釋放的持續(xù)時間取決于聚合物和活性成分的性質、粒度和制備方法。在本發(fā)明的實施方案中，將所提出的遞送方法設計成在氣霧化的納米顆?？晌胫苿┲刑峁O小但有效量的氨基糖苷類以產生氨基糖苷類的氣霧顆粒，所述氣霧顆粒被患者良好耐受并且防止發(fā)展成不期望的副作用。本發(fā)明的另一個實施方案涉及氨基糖苷類向感染部位的改善遞送。對肺炎的現有治療包括腸胃外(靜脈內或肌內)給藥抗生素。這些方法在血液中提供了抗生素的有效濃度，但氨基糖苷類抗生素不能從毛細血管有效進入肺泡內空間以在肺泡內實現MIC水平。
7此外，帶正電的氨基糖苷類多胺分子個NH2基團)與多陰離子的甘油氨基聚糖(GAG) (其具有高密度的負電性羧基和磺基并存在于肺組織各處)結合成離子性顯著的聚電解質，這減少了游離的氨基糖苷類在間質液(interstitial fluid)中的存在。負載有氨基糖苷類抗生素的納米顆?？墒褂萌榛?勻化方法 (emulsification-homogenization method)來制備。將所選擇的生物可降解聚合物(例如來自Boehringer Ingelheim的PLGA共聚物Resomer)于與水不混溶的揮發(fā)性有機溶劑(二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯)中的溶液與氨基糖苷類抗生素如妥布霉素于少量水中的溶液混合，這形成了最初的油包水型(w/o)乳液。將得到的w/o乳液進一步分散在含有表面活性劑的水相中，并且將如此制備的w/o/w雙重乳液使用高壓勻化器或高剪切力勻化器來進一步勻化。除去有機溶劑后，形成含有結合的氨基糖苷類抗生素的納米顆粒的混懸液。得到的混懸液通過蒸發(fā)水或超濾而濃縮至所需的藥物量。當需要時，對PH和滲透性(osmolarity) 進行調整，并對混懸液進行霧化以形成適于經由吸入進行肺內給藥的氣霧，其中液滴大小的中值為1_10μπι(參見圖2)?？蛇x擇地，納米顆粒混懸液可與所加入的額外賦形劑(糖或多元醇)一起凍干或噴霧干燥，這形成了含有包括在其中的納米顆粒的固體顆粒(參見圖3)；凍干制劑用水復原后可使用噴霧器以氣霧形式分配，或對凍干制劑進行碾磨以形成粒度適于干燥粉末吸入器的可吸入干燥粉末(MMAD低于10 μ m且優(yōu)選1_5 μ m)。通過吸入給藥的、包含帶有結合的抗生素的納米顆粒的氣霧劑可深入地遞送到支氣管樹中以到達肺泡。這在緊密接近感染部位的位置處提供了抗生素的持續(xù)釋放；此外，因為所述感染與炎癥(例如肺炎或支氣管擴張)相關，所以納米顆粒被有效地攝入巨噬細胞內，而巨噬細胞在炎癥區(qū)域中的數量是顯著增加的。因為病原菌也位于巨噬細胞的細胞內并以其它方式免受氨基糖苷類的作用，所以負載有抗生素的納米顆粒向巨噬細胞內的輸送可顯著地增加所述制劑中的藥物的抗菌活性?；加蟹尾扛腥镜幕颊呖扇缦卤挥行У刂委熗ㄟ^對包含氨基糖苷類抗生素如妥布霉素的納米顆粒藥物組合物進行噴霧或吸入來進行氣管內給藥?？晌虢M合物包含結合到生物可降解納米顆粒中的氨基糖苷類抗生素(例如妥布霉素)，所述氨基糖苷類抗生素(例如妥布霉素)在用于噴霧的混懸液中的濃度為約5至50mg/ml，或在用于吸入的干燥粉末中的含量為約20至約100mg/g。所述組合物可經由適當的噴霧器、干燥粉末吸入器、篩網噴霧器或超聲波噴霧器來氣霧化和給藥。也可用在線噴霧器(in-line nebulizer)將氣霧化的組合物遞送至接受機械肺通氣的患者。單次給藥后氨基糖苷類抗生素的總給藥劑量可由 20至300mg氨基糖苷類抗生素，或優(yōu)選為約50至200mg所述氨基糖苷類抗生素構成。在動物模型中，與以溶液形式給藥相似劑量的妥布霉素相比，對上述負載有妥布霉素的納米顆粒制劑進行氣管內給藥使存活率增加了 1.5倍。藥物動力學結果顯示，在 0-48小時的時段內，氣管內(IT)給藥納米顆粒混懸液后肺實質中妥布霉素濃度的AUC比以溶液形式對藥物進行給藥幾乎高3倍(分別為75. 5和215. 4 μ g*hr/g)。就NP (納米顆粒)混懸液而言妥布霉素的Cmax也大大高于對溶液進行IT給藥后的CmaX(分別為19. 6 和 5. 4 μ g/g)。給藥于人類患者的氣霧制劑可包含5至約20mg/ml氨基糖苷類抗生素。在本發(fā)明的其它方面，當實施本發(fā)明時所給藥的氣霧制劑可包含約20至約約200mg氨基糖苷類抗生素。預計的給藥頻率為每日1-4次，優(yōu)選每日1-2次，并且治療的總持續(xù)時間為5-14天，這取決于疾病的嚴重程度和菌株的敏感性。妥布霉素甚至以高濃度通過氣霧化給藥至肺也不能實現抗生素在痰中的水平，并顯示出極低血清水平的妥布霉素。由此，通過氣霧化給藥妥布霉素的納米顆粒制劑降低了氨基糖苷類的全身毒性，同時在間質液和肺實質中提供了有效濃度得以擴大的藥物。支氣管屏障以及藥物與GAG的強力結合限制了游離妥布霉素的移動，并阻止其達到高的全身水平。結合以下非限制性實施例可更好地理解本發(fā)明構思的這些方面和其它方面。氣管內給藥步驟在測試動物中進行的氣管內給藥在氯胺酮(Ketamine) (80mg/kg，腹腔內注射 (i. P·))和賽拉嗪(Xylazine) (10mg/kg，腹腔內注射)麻醉下進行。將麻醉的大鼠置于仰臥位(supine position)。小動物喉鏡用于使喉可見，并使用MicroSprayer 霧化器將氣霧形式的測試品(test article)直接給藥至肺內。所述裝置由與手動高壓注射器相連的MicroSprayer (特別設計的薄的柔性不銹鋼管)組成。氣霧通過在管最末端的多孔霧化器產生。可使用來自同一制造商(www.penncentury.com)的DP-4 Dry Powder Insufflator 來遞送干燥制劑。以10mg/kg的劑量對妥布霉素溶液(對照組)或妥布霉素PLGA納米顆粒(實驗組)進行氣霧遞送后，立即將動物的頭相對于水平面抬高30°，并維持在此位置直到它們從麻醉中清醒。在預定的時間點收集血液樣品和全肺；使用固相萃取柱(Strata-X 33 μ m, ImL, Phenomenex, USA)對妥布霉素進行萃取，并通過HPLC方法分析。體內感染模型凍干制劑在使用前復原，其顯示復原后的粒度和藥物結合與初始值接近。小鼠 (每組10只)用綠膿假單胞菌(菌株ATCC 27853)的IO8個細胞(IOOLD5ci)于PBS中的溶液進行氣管內接種。接種后2小時開始處理，將妥布霉素的NP混懸液或妥布霉素的溶液 (陽性對照)或鹽水(未處理組)以M小時的間隔IT給藥3次，并繼續(xù)觀測7天。負載有氨基糖苷類的納米顆粒制劑的制備實施例1.將400mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503， Boehringer-Ingelheim,Germany)>20mg Phospholipon 80H(Lipoid AG, Germany)禾口 IOOmg 生育酚琥珀酸酯(tocopheryl succinate) USP (Sigma-Aldrich，St-Louis, Mo.，USA)溶于 IOml 二氯甲烷中。將117mg妥布霉素USP于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭(tipped indenter)超聲處理(sonicate) 30秒。將得到的w/o乳液倒入20ml 1 %聚乙烯醇(PVA，漏17，000，水解度88%，USP級 (美國藥典級)，Fluka，Germany)的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器(Avestin C-5 Emulsiflex, Ottawa, Canada)以9，OOOpsi (磅/平方英寸)勻化3次。使用旋轉蒸發(fā)儀除去二氯甲烷后，使用22%乳酸溶液將pH調節(jié)至6. O。使用旋轉蒸發(fā)儀將NP混懸液濃縮至10g，然后使其通過1.2 μ m濾器。藥物結合如下確定使用帶有再生纖維素膜(截留分子量為50kDa)的Microcon裝置實施超速離心方法，以10，OOOG離心30-60分鐘；通過HPLC 方法分析膜后離心物(post-membrane centrifugate)。使用Malvern Nano-S納米分選器 (nanosizer) (Malvern, UK)通過對混懸液進行光散射測量并且用水稀釋來評價粒度和粒度分布。所得到的納米顆粒具有約450nm的粒度和抗生素中約15%與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為8mg/ml (以堿計)。實施例2.含有妥布霉素的納米顆粒制劑以類似于實施例1的方式制備，但是使用7g乙酸乙酯代替二氯甲烷。所得到的納米顆粒具有約167nm的粒度和抗生素中約13% 與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為7. 2mg/ml (以堿計)。實施例3.將400mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 150mg 生育酷玻拍酸酉旨(Sigma—Aldrich, St—Louis, Mo.，USA)溶于IOml 二氯甲烷中。將117mg妥布霉素USP于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的w/o乳液倒入20ml 泰洛沙泊(tyloxapol)NF 級(Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA)的溶液中，超聲處理 30 秒， 然后使用高壓勻化器(AvestinC-5 Emulsiflex, Ottawa, Canada)以 12，OOOpsi 勻化 3 次。 使用旋轉蒸發(fā)儀除去二氯甲烷后，使用22%乳酸溶液將pH調節(jié)至6. 0并濃縮至10g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(1000G，10分鐘)，然后使其通過1. 2 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約250nm的粒度和抗生素中約19%與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為9. 9mg/ml (以堿計)。實施例4.將I2OOmg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503, Boehringer-Ingelheim, Germany)和 450mg 生育酚琥珀酸酯 USP(Sigma-Aldrich， St-Louis, Mo.，USA)溶于25ml 二氯甲烷中。將375mg妥布霉素USP于2ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的w/o乳液倒入60ml
聚乙烯醇(PVA，MW17，000，水解度88%，USP級，Fluka，Germany)的溶液中，超聲處理50 秒，然后使用高壓勻化器(Avestin C_5Emulsiflex，Ottawa, Canada)以 10，OOOpsi 勻化 3 次。使用旋轉蒸發(fā)儀除去二氯甲烷后，使用22%乳酸將pH調節(jié)至5. 5并濃縮至30g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G，10分鐘)，然后使其通過1. 2 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約MOnm的粒度和抗生素中18. 4%與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為9. 5mg/ml (以堿計)。實施例5.將800mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 300mg 生育酷玻拍酸酉旨(Sigma—Aldrich，St-Louis, Mo.，USA)溶于20ml 二氯甲烷中。將23%ig妥布霉素USP于Iml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的w/o乳液倒入40ml 1%PEG硬脂酸酯Mirj-52的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以9，OOOpsi勻化3次。除去二氯甲烷(旋轉蒸發(fā)儀，室溫)后，使用22%乳酸將產物的pH調節(jié)至6. 1并將混懸液濃縮至22g(旋轉蒸發(fā)儀，10毫巴，40°C)。對混懸液進行離心(600G，10分鐘)，然后使其通過 1. 2μπι 濾器。所得到的納米顆粒具有約M4nm的粒度和抗生素中13. 3%與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為7. 7mg/ml (以堿計)。使用蔗糖作為冷凍保護劑，將所制備的制劑凍干(來自Christ，Germany的Alpha 2-4 LSC)72小時。用蒸餾水復原后，混懸液具有231nm的平均粒度，妥布霉素濃度為 7. 73mg/mL,以及與納米顆粒結合的藥物為17. 7%。
實施例6·將200mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)、IOmg 氧化大豆卵憐月旨(Phospholipon 80H, American Lecithin Company)和 50mg 生育酚琥珀酸酯(Sigma-Aldrich，St-Louis, Mo.，USA)溶于 9ml乙酸乙酯中。將25mg妥布霉素USP于0. 3ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理15秒。將所形成的w/o乳液倒入20ml 0. 5% Mirj-52的溶液中， 超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以12，OOOpsi勻化3次。使用旋轉蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯后，用陽111 22%乳酸將？!1調節(jié)至5.2，并濃縮至118(10毫巴，40°0。對混懸液進行離心(600G, 10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約168nm的粒度，并且20. 1 %的抗生素與納米顆粒結合。 妥布霉素濃度為1. 61mg/ml (以堿計)。使用蔗糖作為冷凍保護劑，將所制備的制劑凍干(來自ChristGermany的Alpha 2-4 LSC) 72小時。用蒸餾水復原后，混懸液具有186nm的平均粒度，妥布霉素濃度為1. 7mg/ mL,以及與納米顆粒結合的藥物為15. 7%。實施例 .將400mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 150mg 生育酷玻拍酸酉旨(Sigma—Aldrich, St—Louis, Mo.，USA)溶于8ml乙酸乙酯中。將117mg妥布霉素USP于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理15秒。將所形成的w/o乳液倒入20ml 0.5% Pluronic F-127 (環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷嵌段共聚物)的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以12，OOOpsi勻化3次。使用旋轉蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯后，用22%乳酸將pH調節(jié)至6. 0，并濃縮至8g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G，10分鐘)，然后使其通過 0. 45 μ m 濾器。所得到的納米顆粒具有約120nm的粒度，并且15. 7%的妥布霉素與納米顆粒結合 (纖維素膜50kDa)。妥布霉素濃度為9. 5mg/ml (以堿計)。實施例8.將400mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 50mg 膽留酉享基硫酸鈉(cholesteryl sulfatesodium salt) (Sigma-Aldrich, St-Louis,Mo. ,USA)溶于 10ml 二氯甲烷中。將 117mg 妥布霉素 USP 于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理20秒。將所形成的w/o乳液倒入20ml 吐溫-80(聚山梨醇酯-80，乙氧基化脫水山梨醇單油酸酯)的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以9，OOOpsi勻化3次。將產物濃縮至10g(10 毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G，10分鐘)，然后使其通過1. 2 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約IOSnm的粒度，并且當pH為5. 9時，7. 2%的妥布霉素與納米顆粒結合(纖維素膜50kDa)。妥布霉素濃度為7. 5mg/ml (以堿計)。實施例9·將200mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)、20mg 氧化大豆卵憐月旨(Phospholipon 80H, American Lecithin Company)和 50mg 生育酚琥珀酸酯(Sigma-Aldrich，St-Louis, Mo.，USA)溶于 9ml乙酸乙酯中。將25mg妥布霉素USP于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理15秒。將所形成的w/o乳液倒入25ml 0. 4% Mirj-52的溶液中， 超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以15，OOOpsi勻化3次。使用旋轉蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯后，用65μ1 22%乳酸將pH調節(jié)至5.0，并濃縮至20g(10毫巴，40°C)。對混懸液進行離心(600G, 10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約114nm的粒度，并且7. 1 %的抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為0. 99mg/ml (以堿計)。使用蔗糖作為冷凍保護劑，將所制備的制劑凍干(來自Christ，Germany的Alpha 2-4 LSC)72小時。用蒸餾水復原后，混懸液具有126nm的平均粒度，妥布霉素濃度為 1. 08mg/mL,以及與納米顆粒結合的藥物為9. 5%。實施例10.將200mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 20mg 氧化大豆卵憐月旨(Phospholipon 80H, American Lecithin Company)溶于9ml乙酸乙酯中。將25mg妥布霉素USP于0.5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理20秒。將所形成的w/o乳液倒入25ml
0.4%Mirj-52的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以15，OOOpsi勻化3次。使用旋轉蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯后，使用65 μ 1 22%乳酸將ρΗ調節(jié)至5. 4，并濃縮至17. 9g(10 毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G，10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約259nm的粒度，并且沒有抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為1. 16mg/ml (以堿計)。使用蔗糖作為冷凍保護劑，將所制備的制劑凍干(來自Christ，Germany的Alpha 2-4 LSC)72小時。用蒸餾水復原后，混懸液具有126nm的平均粒度，妥布霉素濃度為
1.30mg/mL,以及沒有藥物與納米顆粒結合。實施例11.將350mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 35mg 氧化大豆卵憐月旨(Phospholipon 80H, American Lecithin Company)溶于Ilml乙酸乙酯中。將25mg妥布霉素USP于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理15秒。將所形成的w/o乳液倒入25ml 0.4% Mir j-52的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以15，OOOpsi勻化3次。使用旋轉蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯后，使用65 μ 1 22%乳酸將ρΗ調節(jié)至5. 0，并濃縮至17. 8g(10 毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G，10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約的平均粒度，并且13. 1 %的抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為1. 09mg/ml (以堿計)。使用蔗糖作為冷凍保護劑，將所制備的制劑凍干(來自Christ，Germany的Alpha 2-4 LSC) 72小時。用蒸餾水復原后，混懸液具有126nm的平均粒度，妥布霉素濃度為1. Img/ mL,以及與納米顆粒結合的藥物為7. 3%。實施例12.實施例12以與實施例11相似的方式制備，但使用0. 8% Cremophor EL-35 (聚乙氧基化蓖麻油，USP級，BASF, Germany)的溶液。所得到的納米顆粒具有約112nm的粒度，并且10. 9 %的抗生素與納米顆粒結合。 妥布霉素濃度為0. 89mg/ml (以堿計)。將所制備的制劑凍干(來自Christ，Germany的Alpha 2-4 LSC) 72小時，其中一部分不使用冷凍保護劑，而相等量的一部分使用蔗糖作為冷凍保護劑。用蒸餾水復原后，在沒有冷凍保護劑的情況下凍干的混懸液具有139nm的平均粒度，妥布霉素濃度為0. 78mg/mL, 以及與納米顆粒結合的藥物為2. 5 %，而含有蔗糖冷凍保護劑的樣品具有116nm的平均粒度，妥布霉素濃度為1. 02mg/mL，以及與納米顆粒結合的藥物為2. 9%。
實施例13.將300mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)、50mg 氧化大豆卵憐月旨(Phospholipon 80H, American Lecithin Company)和 150mg 生育酚琥珀酸酯(Sigma-Aldrich，St-Louis, Mo.，USA)溶于 12ml乙酸乙酯中。將75mg妥布霉素USP于0.5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的w/o乳液倒入25ml 0. 4% Mirj-52的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以15，OOOpsi勻化3次。使用旋轉蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯后，用130μ1 22%乳酸將ρΗ調節(jié)至5. 9，并濃縮至11.4g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G, 10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約212nm的粒度，并且21. 3%的抗生素與納米顆粒結合。 妥布霉素濃度為2. 70mg/ml (以堿計)。使用蔗糖作為冷凍保護劑，將所制備的制劑凍干(來自Christ，Germany的Alpha 2-4 LSC)72小時。用蒸餾水復原后，混懸液具有對611111的平均粒度，妥布霉素濃度為 2. 98mg/mL,以及與納米顆粒結合的藥物為27. 2%。實施例14.將300mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 35mg 氧化大豆卵憐月旨(Phospholipon 80H, American Lecithin Company)溶于IOml乙酸乙酯中。將30mg妥布霉素USP于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的w/o乳液倒入25ml 0. 8% PVA的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以15，OOOpsi勻化3次。使用旋轉蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯后，用130 μ 1 22%乳酸將PH調節(jié)至5.9，并濃縮至11.48(10毫巴， 40°C )。對混懸液進行離心(600G，10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約212nm的粒度，并且21. 3 %的抗生素與納米顆粒結合。 妥布霉素濃度為2. 70mg/ml (以堿計)。使用蔗糖作為冷凍保護劑，將所制備的制劑凍干(來自Christ，Germany的Alpha 2-4 LSC)72小時。用蒸餾水復原后，混懸液具有對611111的平均粒度，妥布霉素濃度為 2. 98mg/mL,以及與納米顆粒結合的藥物為27. 2%。實施例15.將300mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)、150mg 生育酷玻拍酸酉旨(Sigma-Aldrich, St-Louis, Mo. ,USA)禾口 50mg 氧化大豆卵憐月旨(Phospholipon 80H,AmericanLecithin Company)溶于 12ml乙酸乙酯中。將90mg妥布霉素USP于0.5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的w/o乳液倒入25ml 0. 8% Mirj-52的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以12，OOOpsi勻化3次。使用旋轉蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯后，用150μ1 22%乳酸將ρΗ調節(jié)至6. 2，并濃縮至20g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G, 10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約182nm的平均粒度，并且25. 8%的抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為3. 3mg/ml (以堿計)。實施例16.將360mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 504， Boehringer-Ingelheim, Germany)溶于 8ml 乙酸乙酉旨中。Mf 40mg 妥布霄素 USP 于 0. 5ml 蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的Wo乳液倒入 25ml 1. 5% TPGS((聚乙二醇 1000)生育酚琥珀酸酯(tocopherol acid succinatepolyethylene glycol 1000), Eastman, UK)的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以12，OOOpsi勻化3次。除去乙酸乙酯后，用乳酸將混懸液的pH調節(jié)至6. 1，并將產物濃縮至10g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G，10分鐘)，然后使其通過0.45μπι濾
ο所得到的納米顆粒具有約95nm的平均粒度，并且3. 4 %的抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為3. 9mg/ml (以堿計)。實施例17.將360mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 504H, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 45mg 甘油三硬月旨酸酉旨(Sigma—Aldrich，St-Louis, Mo.，USA)溶于IOml乙酸乙酯中。將40mg妥布霉素USP于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的w/o乳液倒入25ml 1.5%吐溫-80的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以12，OOOpsi勻化3次。除去乙酸乙酯后，用乳酸將混懸液的PH調節(jié)至6. 2，并將產物濃縮至15g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G, 10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約156nm的平均粒度，并且7. 4%的抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為3. Omg/ml (以堿計)。實施例18.將360mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 504H, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 40mg 甘油三硬月旨酸酉旨(Sigma—Aldrich, St-Louis, Mo.，USA)溶于IOml乙酸乙酯中。將45mg妥布霉素USP于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的w/o乳液倒入25ml 1.5%吐溫-80的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以12，OOOpsi勻化3次。除去乙酸乙酯后，用乳酸將混懸液的PH調節(jié)至6. 1，并將產物濃縮至15g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G, 10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約156nm的平均粒度，并且7. 4%的抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為3. 0mg/ml (以堿計)。實施例19.將360mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 504H, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 40mg 三硬月旨精(Precirol ATO 5, Gattefosse, France)溶于12ml乙酸乙酯中。將50mg妥布霉素USP于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的w/o乳液倒入25ml 0.5%伯洛沙姆188(P0l0Xamer 188)的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以12，OOOpsi 勻化3次。除去乙酸乙酯后，用乳酸將混懸液的pH調節(jié)至6. 0，并將產物濃縮至10g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G，10分鐘)，然后使其通過1. 2 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約227nm的平均粒度，并且7. 5%的抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為4. lmg/ml (以堿計)。實施例20.將360mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 504H, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 40mg 甘油單硬月旨酸酉旨(Myvaplex 600, Eastman, USA) 溶于12ml乙酸乙酯中。將50mg妥布霉素USP于100. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的w/o乳液倒入25ml 0.5%伯洛沙姆 188的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以12，OOOpsi勻化3次。除去乙酸乙酯后，用乳酸將混懸液的PH調節(jié)至6. 0，并將產物濃縮至10g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行
14離心(600G, 10分鐘)，然后使其通過1. 2 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約314nm的平均粒度，并且13. 5%的抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為4. 2mg/ml (以堿計)。實施例21.將360mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 504H, Boehringer-Ingelheim, Germany)禾口 40mg 甘油單硬月旨酸酉旨(Myvaplex 600, Eastman, USA) 溶于12ml乙酸乙酯中。將50mg妥布霉素USP于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30秒。將所形成的w/o乳液倒入25ml 3% TPGS和0. 5% 去氧膽酸鈉(Sigma-AldrichjtLouisMo.，USA)的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以12，OOOpsi勻化3次。除去乙酸乙酯后，將產物(pH*5.9)濃縮至15g(10毫巴， 40°C )。對混懸液進行離心(600G，10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約SOnm的平均粒度，并且60. 7%的抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為3. lmg/ml (以堿計)。實施例22.將420mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)、64mg 生育酷玻拍酸酉旨(Sigma—Aldrich, St—Louis, Mo., USA)、40mg 去氧膽酸鈉(Sigma-Aldrich，St Louis, Mo.，USA)和氫化大豆卵磷脂 (Phospholipon 80H, American Lecithin Company)溶于 12ml 乙酸乙酉旨中。Mf 150mg 妥布霉素USP于0. 5ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理30 秒。將所形成的w/o乳液倒入40ml 0. 375% Mirj-52的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以12，OOOpsi勻化3次。除去乙酸乙酯后，將產物(pH*5.9)濃縮至30g(10 毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(1000G，10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約94nm的平均粒度，并且39. 6 %的抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為4. 2mg/ml (以堿計)。實施例23.將200mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)、10mg 膽甾酉享基硫酸鈉(Sigma-Aldrich, St-Louis, Mo., USA)禾口 5mg 氧化大豆卵憐月旨(Phospholipon 80H, AmericanLecithin Company)溶于 7ml 乙酸乙酯中。將25mg妥布霉素USP于0.2ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理15秒。將所形成的w/o乳液倒入20ml 0. 5% Cremophor EL的溶液中，超聲處理30秒，然后使用高壓勻化器以11，OOOpsi勻化3次。除去乙酸乙酯后，將產物 (pH為5. 6)濃縮至10g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(600G，10分鐘)，然后使其通過0. 45 μ m濾器。所得到的納米顆粒具有約98nm的平均粒度，并且7. 4 %的抗生素與納米顆粒結合。妥布霉素濃度為2. 0mg/ml (以堿計)。實施例24.將200mg聚(丙交酯-共-乙交酯)(Resomer RG 503H, Boehringer-Ingelheim, Germany)溶于4ml乙酸乙酯中。將50mg硫酸慶大霉素USP于 0. 25ml蒸餾水中的溶液加到聚合物溶液中，然后使用鑲尖的壓頭超聲處理20秒。將所形成的w/o乳液倒入20ml濃度為0. 05M的磷酸鈉緩沖液(pH為7.0)(其在10%蔗糖中含有 0.5% Cremophor EL和0. 5 %芐醇)中?；旌衔锍曁幚?0秒，然后使用高壓勻化器以 11，OOOpsi勻化3次。除去乙酸乙酯后，將產物濃縮至10g(10毫巴，40°C )。對混懸液進行離心(1000G, 10分鐘)，然后使其通過0.22 um濾器。
所得到的納米顆粒具有約152nm的平均粒度，并且通過顆粒沉降(particle sedimentation) (16，000G, 1小時)確定6. 9%的抗生素與納米顆粒結合。慶大霉素濃度為 0. 4mg/ml (以堿計)。參考文獻美國專利1.美 |5 專禾Ij 7，306，787 :Engineered particles and methods of useTarara ； Thomas Ε. , Weers ； Jeffry G. , Kabalnov ；Alexey,Schutt ；Ernest G. ,Dellamary ；Luis Α.2·美國專禾Ij 5，508，269 :Aminoglycoside formulation for aerosolizationSmith ；Arnold L. , Ramsey ；Bonnie W. , Montgomery ；Alan B.3.美國專 ^lJ 7, 368, 102 :Pulmonary delivery of aminoglycosidesTarara ； Thomas E. , Weers ；Jeffry G. , Venthoye ；Geraldine.4. ^ H # 禾I」6,890,907 :Methods and unit dose formulations for theinhalation administration of tobramycinSpeirs ；Robert John, Schaeffler ；Barbara Ann, Challoner ；Peter Bruce5.美國專禾Ij 6，387，886 :Method for the treatment of severe chronicbronchitis (bronchietasis)with an aerosolized antibioticMontgomery ；Alan B. , Baker ；William R.6.美國專禾Ij 6，264，922 :Nebul ized aerosols containing nanoparticledispersionsWood ；Ray W. ，DeCastro ；Lan, Bosch ；H. William7.美國專禾Ij 5，458，135 :Method and device for delivering aerosolizedmedicamentsPatton John S. , Platz ；Robert M.8.美國專利 5, 740, 794 Apparatus and methods for dispersing dry powdermedicamentsSmith ；Adrian Ε. , Burr ；John D. ,Etter ；Jeffrey W,Axford ；George S. Anthony ； Jack M.9.美國專禾Ij 5, 775, 320 =Method and device for delivering aerosolizedmedicamentsPatton John S. , Platz ；Robert M.10.美國專禾[I 5，785，049 :Method and apparatus for dispersion of drypowder medicamentsSmith ；Adrian Ε. , Burr ；John D. ,Etter ；Jeffery W. ,Axford ；George S., Lyons ； Shirley W. , Platz ；Robert M.11.美國專利 5，662，929 :Therapeutic liposomal formulationLagace ； Jacqueline, Beaulac ；Christian, Clement-Major ；Sebastien文章1. Beaulac, C.，Clement-Major, S.，Hawari J. and Lagace J. "Eradication of mucoid Pseudomonas aeruginosa with fluid liposome—encapsulated tobramycin in ananimal model of chronic pulmonaryinfection"Antimicrob. Agents Chemother. ，1996 ；Vol. 40，pp. 665-669,2. Beaulac C，Sachetelli S，LagaceJ..Aerosolization of low phase transition temperature liposomal tobramycin asa dry powder in an animal model of chronic pulmonary infection caused byPseudomonas aeruginosa. J Drug Target. 1999 ；Vol.7(1)pp.33-41 ；3. Dhillon J，Fielding RjAdler-Moore J，Goodall RL，Mitchison D.“The activity of low-clearance liposomal amikacin in experimental murinetuberculosis.，，J Antimicrob Chemother. 2001 ；Vol. 48 (6) pp. 869-764. Halwani M，Mugabe C，Azghani AO，Lafrenie RM，Kumar A, Omri A."Bactericidal efficacy of 1 iposomal aminoglycosides against Burkholderiacenocepacia. ”J Antimicrob Chemother. 2007 ；Vol. 60(4) pp. 760-95. Rajesh Pandeyl，Anjali Sharmal，A. Zahoorl，Sadhna Sharmal，G. K. Khuller and B.Prasad "Poly (DL-lactide-co-glycolide) nanoparticle-based inhalablesustained drug delivery system for experimental tuberculosis，，Journal of Antimicrobial Chemotherapy(2003) ；Vol. 52, pp.981-9866. Dailey, L A.，Schmehl, Τ.，Gessler, Τ. et al." Nebulization of biodegradable nanoparticles，impact of nebulizertechnology and nanoparticle characteristics on aerosol features. ”Journal of Controlled Release (2003) Vol. 86, pp. 131-44.
權利要求
1.通過向肺給藥氣霧化的納米顆粒藥物組合物治療由細菌感染引起的肺病的方法，所述納米顆粒藥物組合物包含生物可降解聚合物納米顆粒和與所述納米顆粒結合的氨基糖苷類抗生素。
2.權利要求1中所述的方法，其中使用噴霧器將所述納米顆粒藥物組合物以霧化的氣霧劑制劑的形式給藥，產生氣霧化的中值直徑為1至10微米的混懸液液滴，并且其中懸浮于上述氣霧化的液滴中的聚合物納米顆粒具有50至500nm的平均粒度。
3.權利要求1中所述的方法，其中使用干燥粉末吸入器以干燥粉末吸入性氣霧化制劑的形式給藥的所述納米顆粒藥物組合物主要遞送粉末中值粒徑為1至10微米的氣霧化混懸液，而結合到上述氣霧化的粉末顆粒中的聚合物納米顆粒具有50至500nm的平均粒度。
4.權利要求1中所述的方法，其中所述納米顆粒藥物組合物在給藥后提供了所結合的氨基糖苷類抗生素的延長釋放。
5.權利要求1中所述的方法，其中所述氨基糖苷類抗生素選自下組中的任何一種或其藥用鹽慶大霉素、妥布霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星和新霉素。
6.權利要求5中所述的方法，其中所述氨基糖苷類抗生素為妥布霉素。
7.權利要求1中所述的方法，其中對霧化的納米顆粒制劑進行單次給藥使妥布霉素在肺內的有效濃度維持至少12小時。
8.權利要求7中所述的方法，其中在給藥后，所述妥布霉素納米顆粒制劑的肺內濃度的曲線下面積(AUC)比以溶液形式給藥的相等劑量的妥布霉素高至少2倍。
9.權利要求1中所述的方法，其中所述氨基糖苷類抗生素中的至少約2%與所述納米顆粒結合。
10.權利要求1中所述的方法，其中所述生物可降解納米顆粒包含生物可降解聚合物， 所述生物可降解聚合物選自聚(丙交酯)、聚(乙交酯)或聚(丙交酯-共-乙交酯)聚合物。
11.權利要求10中所述的方法，其中所述生物可降解聚合物為乳酸和羥乙酸的共聚物。
12.權利要求6中所述的方法，其中單次給藥后氣霧化的納米顆粒藥物組合物中的妥布霉素的總給藥劑量包括20mg至300mg氨基糖苷類抗生素，優(yōu)選50mg至約200mg所述妥布霉素。
13.氨基糖苷類抗生素在制備用于治療由細菌感染引起的肺病的適于以氣霧化的形式向肺給藥的納米顆粒藥物組合物中的用途，其中所述納米顆粒藥物組合物包含生物可降解聚合物納米顆粒和與所述納米顆粒結合的氨基糖苷類抗生素。
14.適于以氣霧化的形式向肺給藥的納米顆粒藥物組合物，所述納米顆粒藥物組合物用于治療由細菌感染引起的肺病，其中所述納米顆粒藥物組合物包含生物可降解聚合物納米顆粒和與所述納米顆粒結合的氨基糖苷類抗生素。
全文摘要
治療肺部感染和疾病的方法，其中藥物組合物經由噴霧或氣霧吸入給藥，所述藥物組合物含有結合到生物可降解納米顆粒中的氨基糖苷類抗生素。
文檔編號A61K47/34GK102188376SQ201010129348
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月3日 優(yōu)先權日2010年3月3日
發(fā)明者約瑟夫·施瓦茨, 邁克爾·韋斯帕皮爾 申請人:阿爾法里克斯公司