專利名稱：具有止血活性并能夠誘導(dǎo)血小板聚集的重組蛋白的制作方法
具有止血活性并能夠誘導(dǎo)血小板聚集的重組蛋白本發(fā)明涉及由描述用于與血小板膠原受體相互作用的肽序列的組件(assembly) 組成的重組蛋白。這些蛋白具有獨立于三螺旋形成的促聚集活性。其可在細(xì)菌和在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生。膠原是所有多細(xì)胞生物的胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)組分。其為由觀個在發(fā)育過程中和在組織穩(wěn)態(tài)(tissue homeostasis)中起作用的不同類型組成的蛋白家族。其能夠裝配成為纖維、微纖維和網(wǎng)絡(luò)形式的多種超分子結(jié)構(gòu)。膠原具有下述共同特征含有一個或多個具有由三個多肽鏈，或α鏈卷繞在一起而形成的三螺旋結(jié)構(gòu)的域。因為所有三個均為氨基酸，該特征通過螺旋基序中的甘氨酸的存在成為可能，所述基序由重復(fù)的G-X-Y序列組成，其中X通常為脯氨酸而Y通常為羥脯氨酸。此羥脯氨酸對于三螺旋的穩(wěn)定化是必需的并且是膠原的特征。脯氨酸殘基主要由脯氨酰-4-羥化酶(Ρ-4-Η)羥化成為4-羥脯氨酸。存在第二羥化酶，脯氨酰-3-羥化酶，其使得脯氨酸在位置X時能夠羥化，而在位置Y時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了由Ρ-4-Η羥化的脯氨酸。在膠原分子中，α鏈可為相同或不同的。膠原分子由側(cè)翼為非螺旋域(稱作N-和C-前肽)的螺旋域(或膠原域)形成。 形成分子的三個α鏈的識別及其裝配的起始在C-末端(C-前肽)的調(diào)控下進(jìn)行。該過程是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行的。隨后，N-和C-前肽在膠原成熟過程中切出，留下短的非螺旋序列，端肽。膠原在血管壁處通過維持其完整性和彈性起重要作用。該壁是由纖維狀的I型膠原和III型膠原，以及網(wǎng)絡(luò)形式的IV型膠原形成的，應(yīng)注意III型膠原也在動脈粥樣硬化斑塊(atheromatous plaque)處強(qiáng)烈表達(dá)。此外，膠原能夠通過直接與特定細(xì)胞受體相互作用來調(diào)節(jié)某些細(xì)胞的功能。因此，膠原，主要是I型和III型，是血小板功能的強(qiáng)力激活劑。III型膠原是由排列為三螺旋的三個α 1鏈組成的同三聚體。而兩個存在于所述 α 1鏈C-末端的G-P-P三聯(lián)體(可能經(jīng)羥化)對于三螺旋的核化和折疊是充分而必需的 (Bulleid等，EMBO J. 1997 Nov 17 ；16(22) :6694-701)。相反，這兩個三聯(lián)體不足以使得所述三個鏈能夠發(fā)生起始的組合。有趣的是，注意到Bulleid等(1997)在維持三個三聯(lián)體時觀察到更高效的三螺旋形成，且該效率甚至比野生型分子更高。幾種蛋白涉及單體鏈的裝配過程HSP47(熱休克蛋白)和PDI (蛋白二硫鍵異構(gòu)酶，protein disulfide isomerase)。 位于單體鏈的C-末端的C-前肽，表現(xiàn)為涉及α鏈的比對(alignment)和所述蛋白穩(wěn)定化所必需的二硫橋的形成(Bulleid 等，EMBO J. 1997 Nov 17 ；16(22) :6694-701)。因此該 C-前肽僅對確保單體鏈的組合是必需的。關(guān)于其應(yīng)記住以下幾點-其由確定α1鏈的特定標(biāo)準(zhǔn)裝配的15個氨基酸的不連續(xù)序列組成(Hulmes DJ, J Struct Biol. 2002 Jan-Feb ； 137 (1-2) :2-10)。-位于C-前肽起始處的卷曲螺旋域涉及膠原III的三聚化(Bulleid等， EMBO J. 1997 Nov 17 ；16(22) :6694-701)。該域由四個七肽組成(McAlinden 等，J Biol Chem. 2003 Oct 24 ；278 (43) :42200-7)。
-其含有使得鏈內(nèi)(intracatenary)和鏈間(intercatenary)二硫橋能夠形成的八個半胱氨酸殘基。在C-端肽或C-前肽中在鏈之間二硫橋聯(lián)的存在對于鏈的組合和三螺旋的形成并不是必需的(Bulleid 等，Biochem J. 1996 Jul 1 ；317 (Pt 1) =195-202) 應(yīng)注意該實驗是用N-前肽進(jìn)行的。三聚體和α三螺旋的概念似為悖論性的彼此獨立。在缺乏N-前肽時， 留下C前肽的半胱氨酸2或C-端肽的兩個半胱氨酸似為明智的。該后者基序，稱作結(jié)序列(knot sequence) (GPCCG)，僅由于α 1鏈的裝配和折疊的初步現(xiàn)象使得二硫橋能夠形成 (Boudko 和 Engel，J Mol Biol. 2004 Jan 30 ；335 (5) :1289-97)。無論是來源于創(chuàng)傷或動脈粥樣硬化的后果，對動脈壁的損傷伴隨著血管內(nèi)皮的破壞和血栓形成組分如膠原的暴露。在此之后血小板粘著于損傷位點，與富含膠原或膠原片段的表面相接觸，其激活并形成血栓。與該膠原相接觸的血小板的粘著和穩(wěn)定化是由于血小板表面存在的受體與所述膠原之間具有高親和力的多重相互作用而能夠發(fā)生的。該粘著可于von Willebrand因子(vffF)的Al域與由糖蛋白(Gp) GpIb-V-IX (其自身通過其A3域或通過血小板受體和膠原之間的直接相互作用結(jié)合于膠原)形成的血小板復(fù)合物的結(jié)合之后間接發(fā)生。幾種受體可在高度特異性的肽序列處結(jié)合膠原分子，所述序列即為整聯(lián)蛋白α 2β 1，其在與膠原相接觸的血小板的穩(wěn)定化中起重要作用，以及GpVI，被視為對于血小板激活為最重要的受體。另一種受體，TIIICBPdII型膠原結(jié)合蛋白)已描述為能夠直接結(jié)合膠原。血管流速是確定募集的血小板膠原受體的類型的主要決定因素。在升高的流速， 血小板與膠原通過vWF通過Gprt受體相互作用，然后其通過藉由GpVI結(jié)合而激活；整聯(lián)蛋白α 2β1僅作為血小板-膠原連接的穩(wěn)定劑而介入。在低流速，血小板通過整聯(lián)蛋白 α 2β1結(jié)合于膠原，然后結(jié)合于GpVI，從而導(dǎo)致其激活，其為引起血小板聚集的步驟。同樣，也涉及其它的血小板膠原受體如TIIICBP。在所有情況下，GpVI在血小板激活中起主要作用。血小板粘著現(xiàn)為與血小板激活無關(guān)的過程。事實上，許多肽，對應(yīng)于膠原的短肽基序，能夠誘導(dǎo)血小板的粘著而不導(dǎo)致其激活。無論如何，這些肽中的一些具有誘導(dǎo)血小板激活的能力，并顯示所謂促聚集活性。其三螺旋結(jié)構(gòu)似為該活性的必需先決條件。應(yīng)指出當(dāng)這些肽中的一些保持單體形式時，其通過仍待鑒定、但可為占據(jù)位點使天然膠原無法獲得的機(jī)理顯示抗聚集活性。大多數(shù)目標(biāo)為鑒定涉及血小板與III型膠原的粘著的肽序列的工作使用顯示最高聚集活性、對應(yīng)于CNBr消化片段的片段α 1 (III)CB4。在過去數(shù)年已描述了多種肽基序能夠結(jié)合并激活血小板。已以兩種可能性質(zhì)的肽形式對其進(jìn)行了測試-類似膠原，由保守GPO基序重復(fù)η次的重復(fù)形成，不存在于III型膠原的天然序列中；-或?qū)?yīng)于α1(III)CB4序列中存在的肽基序形成的肽，主要通過化學(xué)合成獲得 (Farndale 等，Biochem Soc Trans. 2008 Apr ；36 (Pt 2) :241-50)。整聯(lián)蛋白α 2β1針對在多種細(xì)胞類型(包括內(nèi)皮細(xì)胞和血小板)中膠原、層粘連蛋白和其它配體的受體。α 2β 1通過其域I在纖維狀膠原序列中存在的肽基序處結(jié)合膠原。已描述了多種針對I型膠原α 1鏈處存在的GFOGER具有最高親和力的基序。對于III型膠原，且與I型膠原相反，幾種GXYGER基序?qū)τ谧钸m結(jié)合似為必需的，其中GL0GER、GM0GER、 GROGER 和 GAOGER 為主要的基序(Kim 等，J Biol Chem. 2005 Sep 16 ；280 (37) :32512-20)。 已描述了其它的基序如GLOGEN和GLKGEN，但其對α2β 1顯示低親和力(Raynal等，J Biol Chem. 2006 Feb 17 ；281 (7) :3821-31)。應(yīng)注意所有從這些基序合成的肽在其組織為三螺旋形式時顯示粘著活性。糖蛋白VI(GPVI)為屬于免疫球蛋白(Ig)超家族的60_65kDa的I型跨膜糖蛋白。其在血小板表面以與對于Ig受體常見的Y鏈(FCRY)的非共價復(fù)合物的形式組成型表達(dá)。描述為與該受體相互作用的肽為類似于由4至10個GPO三聯(lián)體的重復(fù)形成的膠原的肽(Morton 等，Biochem J. 1995 Mar 1 ；306 (Pt 2) :337-44 和 Smethurst 等，J Biol Chem. 2007 Jan 12 ；282 (2) :1296-304)。盡管包含10% GPO基序，該三聯(lián)體的最大重復(fù)數(shù)在III型膠原的天然序列中不超過三。在此還應(yīng)注意在半胱氨酸或賴氨酸殘基的修飾之后化學(xué)方式獲得的三螺旋或聚合形式的形成對于賦予這些肽促聚集活性是必需的。而且，在3 位羥脯氨酸的存在對于該活性是必需的。相反，當(dāng)其為單體形式時，這些肽顯示抗聚集活性 (Asselin等，Biochem J. 1999 Apr 15 ；339 (Pt 2) :413-8)。最近，Jarvis 等鑒定了 III 型膠原序列中顯示最高粘著活性的肽基序。其由位于α I(III)CB4的氨基酸523至549的殘基 GA0GLRGGAGP0GPEGGKGAAGP0GP0 組成(Jarvis 等，Blood. 2008 May 15 ；111(10) :4986-96)。 該肽基序由三個GPO組成，其并非連續(xù)的，且似為與GpVI適當(dāng)相互作用所必需的最小數(shù)目。血小板受體Gprt與膠原之間的間接相互作用依賴于vWF，其為由內(nèi)皮細(xì)胞和血小板響應(yīng)血管損傷或在壁壓(parietal pressure)增加之后而分泌的血漿多聚蛋白。其在經(jīng)受升高流速的血管區(qū)域的損傷位點處血小板的募集中起主要作用。該因子由三個稱為Al、A2和A3的域組成。其通過其A3域結(jié)合膠原，并通過其Al域結(jié)合Gprt受體。III 型膠原似具有對于vWF的A3域具有高親和力的單一位點，其也存在于II型膠原中。該肽基序位于氨基酸403和413之間，且由GPRGQ0VMGF0組成，其中某些氨基酸對于結(jié)合 vWF 是至關(guān)重要的(Lisman T 等，Blood. 2006 Dec 1 ； 108 (12) :3753-6)。Verkleij 等將由GAAGP0GP0GSAGT0GLQ組成的氨基酸541至558鑒定為潛在結(jié)合位點(Verkleij等， Blood. 1998 May 15 ；91 (10) :3808-16)。該肽基序位于 Lisman 等描述的 vWF基序與 GMOGER 整聯(lián)蛋白α 1β 2結(jié)合基序之間。Fauvel-Lafeve團(tuán)隊描述了位于片段α I(III)CB4的氨基酸655和662之間的八肽K0GE0GPK的存在。已鑒定了由該八肽識別的血小板受體并稱為TIIICBPdII型膠原結(jié)合蛋白)(Monnet E 等，J Biol Chem. 2000 Apr 14 ；275 (15) 10912-7)。該八肽在靜止和流動條件下能夠抑制血小板與III型膠原、但非與I型膠原的相互作用。最近，Pires等顯示該八肽僅在當(dāng)其為同源三聚體形式時具有對聚集的抑制活性。相反，其在三螺旋形式中在這些末端添加半胱氨酸和GPP的結(jié)構(gòu)給予其促聚集活性(Pires等，Eur J Med Chem. 2007 May ；42 (5) :694-701)。膠原的生物學(xué)和超結(jié)構(gòu)特性，特別是其結(jié)合于膜受體的能力，開辟了廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域，因為其在組織中具有多種作用。然而，這些應(yīng)用僅在能夠以大量并以可重復(fù)的方式得到這些膠原的均質(zhì)制備物時方才有意義。為此目的使用了兩種產(chǎn)生方法。在這兩個區(qū)域進(jìn)行的工作和開發(fā)通常高度靶向給定的應(yīng)用。因此，化學(xué)合成可產(chǎn)生僅代表所述蛋白微小部分的短肽，通常為目標(biāo)肽基序。其主要應(yīng)用涉及止血，且更精確而言，涉及膠原與血小板之間連接的調(diào)節(jié)。然而，這些肽通常僅具有一種所尋求的活性，且這取決于所述肽的三維構(gòu)型，特別是三螺旋的形成。因此，對于開發(fā)可由提供高產(chǎn)量的生物系統(tǒng)產(chǎn)生的功能化的重組膠原蛋白有顯著的需要。主要的障礙是這些膠原衍生蛋白產(chǎn)生和純化的難度，因為其趨于聚集和粘著。迄今，短肽序列(少于50個氨基酸)均由化學(xué)合成而非通過細(xì)胞產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生 (Farndale 等，Biochem Soc Trans. 2008 Apr ；36 (Pt 2) :241-50)。而且，這些基序以分離的方式合成。相反，顯示血小板結(jié)合活性的重組III型膠原的合成已通過細(xì)胞產(chǎn)生系統(tǒng)進(jìn)行，且所用的是其完整序列，例如前α 1(111)。尋求的目標(biāo)是合成能夠組織成為三螺旋的完整前膠原(W0 9 307 889)。這些重組膠原原則上具有多種應(yīng)用，即完整膠原序列的應(yīng)用。因此，問題是如何合成具有較簡單結(jié)構(gòu)的較小蛋白(其因此在產(chǎn)生方面較為不困難)，但其仍然保留天然蛋白的目標(biāo)生物學(xué)活性。本發(fā)明因此涉及擁有獲得促聚集活性所需的基序的重組蛋白，其以無法構(gòu)造成三螺旋形式的單體形式合成。無法形成該三螺旋結(jié)構(gòu)是缺乏下述的結(jié)果1)其彼此之間的α 鏈識別基序，II)非螺旋膠原N-和C-末端域以及III)引發(fā)三螺旋所需的兩個GPO三聯(lián)體。 令人驚訝的是，在缺乏三螺旋形成的情況下獲得了促聚集活性。申請人:以令人意想不到的方式顯示可以將三種類型的肽序列組合在具有促聚集活性的單一單體蛋白之內(nèi)。本發(fā)明的重組蛋白因此組合了 -具有至少一個重復(fù)的四個GPO三聯(lián)體的肽基序，-描述為對存在于天然膠原序列中的多個血小板受體具有結(jié)合活性的肽序列，-這些由GXY三聯(lián)體的重復(fù)形成的基序之間的結(jié)合序列。由細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生這些蛋白使得能夠具有大量的這些新一代的重組抗原，其為類似于膠原的肽序列與存在于膠原天然形式的序列的組合的成果。這些類型的蛋白并不需要偏好不組成型產(chǎn)生膠原的細(xì)胞作為用于該生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。事實上，其序列并不允許多種天然膠原α鏈的識別。相反，必需偏好表達(dá)膠原成熟關(guān)鍵酶如脯氨酰-4-羥化酶(Ρ4Η)和HSP47的膠原產(chǎn)生細(xì)胞。現(xiàn)有的重組膠原產(chǎn)生系統(tǒng)相反使用并不天然產(chǎn)生膠原的細(xì)胞(Olsen 等，Adv Drug Deliv Rev. 2003 Nov 28 ；55(12) :1547-67 以及 Ruggiero 和 Koch, Methods. 2008 May ；45(1) :75-85)。這涉及共轉(zhuǎn)染編碼酶如P4H的基因。本發(fā)明的重組蛋白具有許多優(yōu)點，包括-將目標(biāo)基序組合在一個小蛋白之內(nèi)，其更容易使用細(xì)胞產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生，-在缺乏三螺旋結(jié)構(gòu)情況下的促聚集活性，-其序列中缺乏膠原酶識別位點，但存在HSP47識別位點，使其能夠由膠原產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生，-通過參照測試(血小板聚集測試)顯示的其生物學(xué)活性，其用于監(jiān)測現(xiàn)有的抗血小板治療并用于探索血小板功能。本發(fā)明的重組蛋白的生物學(xué)特性使其能夠預(yù)見許多應(yīng)用。第一個應(yīng)用涉及使用這些蛋白作為診斷工具探索血栓形成疾病血小板聚集測試，體外血栓形成模型和評價現(xiàn)有抗血小板治療(阿司匹林，氯吡格雷)和將來治療的有效性。產(chǎn)生的蛋白來源于人蛋白，且在其序列中具有針對就其在血小板粘著和激活中的作用而描述的某些血小板受體的結(jié)合位點。現(xiàn)有的測試使用動物來源的膠原，其序列與人序列并不具有完美的同源性。此外，在多種蛋白之間血小板受體相互反應(yīng)位點的數(shù)量和位置的變化使得能夠提出更多相關(guān)的靶驗證測試。存在使得能夠更加特異性地研究每個血小板受體的肽片段，但其產(chǎn)生方法與本發(fā)明的產(chǎn)生方法不同，即化學(xué)合成相對細(xì)胞的天然產(chǎn)生 (翻譯后修飾的重要性)。本發(fā)明可在止血繃帶(因此在血管損傷情況下強(qiáng)化了就地(on-site)血小板募集)或預(yù)防出血風(fēng)險的止血粘著劑(手術(shù)背景)的組成方面起作用。產(chǎn)品目前已上市，但使用動物來源的膠原。另一個應(yīng)用是使用這些蛋白以激活瘢痕形成。某些傷口的瘢痕形成需要某些細(xì)胞群體(包括血小板)的就地遷移、粘著和分化。這些過程依賴于這些細(xì)胞的表面整聯(lián)蛋白。 存在于本發(fā)明蛋白的結(jié)構(gòu)中的某些肽基序因此能夠通過促進(jìn)瘢痕形成與這些整聯(lián)蛋白相互作用。在非常接近的領(lǐng)域，可提出將這些重組蛋白用于某些皮膚病學(xué)乳劑的組成中。抑制血小板功能的蛋白的另一個應(yīng)用是治療動脈粥樣硬化。血小板受體是具有對抗動脈粥樣硬化疾病的并發(fā)癥前景的治療靶物。迄今，并無能夠在內(nèi)皮下膜 (subendothelium)中阻斷血小板粘著起始階段的分子。本發(fā)明蛋白的多種蛋白結(jié)構(gòu)使得其能夠與這些受體相互作用導(dǎo)致血小板的抗粘著作用(位點遮掩)和/或血小板促聚集作用。所述多種作用可用相同蛋白通過調(diào)節(jié)其物理化學(xué)特性來獲得。本發(fā)明因此提供了具有多種應(yīng)用的生物試劑，其可在試劑盒的組成中發(fā)揮作用以評價血小板功能，激活細(xì)胞分化以供診斷血液學(xué)功能障礙，通過對纖維化區(qū)域成像來進(jìn)行檢測。本發(fā)明還可進(jìn)入止血繃帶的組成以供血小板的就地募集(在血管損傷情況下)，預(yù)防出血風(fēng)險的止血粘著劑，或皮膚病學(xué)乳劑。序列描述SEQ ID No. 1 =Coll-III 樣重組蛋白SEQ ID No. 2 編碼Coll-III樣重組蛋白的多核苷酸SEQ ID No. 3-6 引物發(fā)明詳述本發(fā)明涉及分離的多肽，其具有SEQ ID NO 1的多肽或SEQ ID NO 1的位置25至位置152的多肽的序列。本發(fā)明還涉及分離的多肽，其在其全長與SEQ ID NO 1的多肽或SEQ IDNO :1的位置25至位置152的多肽具有至少70%同一性，并能夠在血小板聚集度計(aggregometer) 中在37°C以IOOOrpm攪拌下誘導(dǎo)超過30%的人血血小板的聚集。在一個優(yōu)選實施方案中，這些多肽包含下述肽基序-GX1X2GER,其中 X1 和 X2 獨立地代表選自 A、R、N、D、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、
Y、V和0的氨基酸；-(GPX3)n，其中 η 為 4 至 10，且)(3代表P 或0 ；-GPRGQX4GVMGra5，其中&和&獨立地代表P或0。
P為脯氨酸而0為羥脯氨酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，這些多肽包含下述肽基序-GAPGER,-KPGEPGPK,-(GPP) η 其中 η 為 4 至 10，-腳。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其特征在于其編碼本發(fā)明的多肽。在一個優(yōu)選實施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO 2的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合于SEQ ID NO=I的多肽的抗體。本發(fā)明還涉及在轉(zhuǎn)錄方向包含下述的表達(dá)盒-宿主生物中的功能性啟動子-本發(fā)明的多核苷酸，-相同宿主生物中的功能性終止序列。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸和/或本發(fā)明的表達(dá)盒的載體。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的表達(dá)盒和/或本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主生物。本發(fā)明還涉及用作藥物的組合物，其包含本發(fā)明的多肽，本發(fā)明的多核苷酸，本發(fā)明的表達(dá)盒，本發(fā)明的載體和/或本發(fā)明的宿主生物。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療血栓形成疾病的組合物。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療止血的病癥的組合物。本發(fā)明還涉及這些組合物作為瘢痕形成劑的用途。最后，本發(fā)明涉及包含如上所述的多肽的化妝品組合物。本發(fā)明涉及分離的多肽，其具有SEQ ID NO 1的多肽或SEQ ID NO 1的位置25至位置152的多肽的序列。SEQ ID NO :1位置1至位置M的肽對應(yīng)于使得所述重組蛋白能夠由宿主細(xì)胞分泌的信號肽。該信號肽可缺失或可由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的另一個信號肽代替。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選取適用于本發(fā)明多肽在多種原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和分泌的同源或異源的信號肽。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽在真核細(xì)胞或生物中，特別是在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生。 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含使得其能夠分泌至胞外介質(zhì)的信號肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及在切割所述信號肽之后獲得的成熟多肽。本發(fā)明的多肽具有生物活性，特別是使用血小板聚集度計(Regulest，F(xiàn)lorange, France)依照參考技術(shù)(Born，196 檢測的對人血血小板的促聚集活性。使富含血小板的血漿(PRP)與激動劑Ο90μ 1 PRP中10 μ 1)相接觸，并實時監(jiān)視介質(zhì)的清除(涉及落于管底部的聚集物的形成)(聚集曲線)。在缺乏血小板聚集時，信號保持水平(持續(xù)混濁的介質(zhì))。能夠通過在測量結(jié)束時檢查試管來驗證聚集物的存在與否。血小板聚集測試反應(yīng)的評價在37°C進(jìn)行，同時連續(xù)攪拌(IOOOrpm)。裝置如下所述進(jìn)行校準(zhǔn)0%聚集為富含血小板的血漿(通過緩慢離心和濃縮調(diào)整至300xl09/L獲得的制備物)，而100%聚集為貧血小板血漿(通過快速離心獲得的制備物)。血小板制備物的質(zhì)量通過驗證其對用于開發(fā)抗血小板治療的參照激動劑(5 μ M ADP和1 μ g/ml膠原)的反應(yīng)來確認(rèn)。當(dāng)?shù)鞍啄軌蛞圆豢赡娴姆绞秸T導(dǎo)超過30%的聚集時，認(rèn)為其為促聚集的。表達(dá)于許多細(xì)胞類型表面的受體識別肽基序賦予下述類型的多肽活性-細(xì)胞粘著，-細(xì)胞募集。多肽的促聚集作用，獨立于其三螺旋結(jié)構(gòu)，是血小板表面存在的一種或多種受體 (α 13 2、TIIICBP 和 GPVI)激活的結(jié)果。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO 1的多肽的片段，其保留SEQ ID NO=I的多肽的至少一種活性。術(shù)語多肽的“片段”指包含其來源的多肽的部分但非全部的多肽。因此，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO :1的多肽的至少100、110、120、130、140或150個氨基酸的片段的多肽。SEQ ID NO=I的多肽的這些片段保留SEQ ID NO 1的多肽的至少一種活性，特別是對人血血小板的促聚集活性。本發(fā)明因此涉及SEQ ID NO 1的多肽的生物活性片段。術(shù)語“生物活性片段”指保留其來源的多肽的功能的多肽的片段。SEQ ID NO :1的多肽的生物活性片段因此保留該多肽的至少一種功能，并優(yōu)選地保留SEQ ID NO :1的多肽的所有生物活性。用于制備多肽片段的方法以及用于測量本發(fā)明多肽的生物活性的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是周知的。本發(fā)明還涉及具有SEQ ID NO :1的多肽的至少一種活性、并與SEQ IDNO :1的多肽至少70%相同的多肽。優(yōu)選地，這些多肽與SEQ ID NO :1的多肽具有相同的特性和特別是相同的生物活性。本發(fā)明涉及與SEQ ID N0:1的多肽具有至少70^^80^^90^^95%, 98%且優(yōu)選至少99%的相同的氨基酸的多肽?！跋嗤陌被帷币庵竷蓚€序列之間不變或未變化的氨基酸。這些多肽可與SEQ ID NO :1的多肽相比具有至少一個氨基酸的缺失、添加或取代。本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO :1的多肽具有至少70%、80%、90%、95%、98%且優(yōu)選至少99%的同源性的多肽?！巴葱浴币庵傅鞍仔蛄兄g相似性的量度。這些多肽可與 SEQ ID NO :1的多肽相比具有至少一個氨基酸的缺失、添加或取代。兩個序列之間的同源性程度，通過分?jǐn)?shù)量化，是基于序列的保守取代(preserving substitution)和/或同一性的百分比。與SEQ ID NO 1的多肽具有一定程度的同源性或同一性的本發(fā)明的多肽包含至少 100或150個氨基酸。測量和鑒定多肽之間同一性程度和同源性程度的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如，可使用 Vector NTi 9. 1. 0 軟件包(Invitrogen INFORMAX, http://www. invitrogen.com)的AlignX比對工具(Clustal W算法)，優(yōu)選使用缺省設(shè)定。本發(fā)明的多肽是從其天然環(huán)境分離或純化的。所述多肽可借助多種方法制備。特別地，這些方法是通過合適的宿主細(xì)胞產(chǎn)生重組多肽及其后續(xù)純化，通過化學(xué)合成產(chǎn)生或， 最終地，這些多種方法的組合。這些多種產(chǎn)生方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是周知的。優(yōu)選地， 本發(fā)明的多肽是由重組原核或真核細(xì)胞產(chǎn)生的。本發(fā)明的多肽因此可在細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的融合蛋白，蛋白或嵌合蛋白。術(shù)語“多肽”指蛋白以及修飾的多肽。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的多肽是糖基化的。SEQ ID NO :1的多肽特別在存在于位置102和141的賴氨酸氨基酸處具有0-糖基化位點(在GXY三聯(lián)體的位置3)。 在一個優(yōu)選實施方案中，SEQ ID NO 1的多肽的位置93處的天冬酰胺殘基是糖基化的。本發(fā)明還涉及編碼上述定義的多肽的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，“多核苷酸”意指單鏈的核苷酸鏈或其DNA或RNA互補物，或雙鏈核苷酸鏈，其可為互補或基因組DNA。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸是DNA，特別是雙鏈DNA。術(shù)語“多核苷酸”還意指修飾的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸是從其天然環(huán)境分離或純化的。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸可通過如 Sambrook 等(MolecularCloning :A Laboratory Manual, 1989)中所述的經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)或通過化學(xué)合成來制備。在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及SEQ ID NO :2的多核苷酸。在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及SEQ ID NO :2的多核苷酸，其序列位于SEQ ID NO :2的位置73與位置459 之間。這些多核苷酸編碼上述定義的多肽。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其與SEQ ID NO 2的多核苷酸或其序列位于SEQ ID NO 2位置73和位置459之間的多核苷酸具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%且優(yōu)選至少99%同一性。這些多核苷酸優(yōu)選編碼保留SEQ ID NO :1的多肽的生物活性的多肽?！跋嗤暮塑账帷币庵冈趦蓚€序列之間不變或未變化的多核苷酸。這些多核苷酸可與參照多核苷酸相比具有至少一個核苷酸的缺失、添加或取代。本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO :2的多核苷酸或其序列位于SEQ ID NO :2位置75和位置459之間的多核苷酸具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%且優(yōu)選至少99% 同源性的多核苷酸。這些多核苷酸優(yōu)選編碼保留SEQ ID NO :1的多肽的生物活性的多肽?！巴葱浴币庵负怂嵝蛄兄g相似性的量度。這些多核苷酸可與參照多核苷酸相比具有至少一個核苷酸的缺失、添加或取代。兩個序列之間的同源程度，用分?jǐn)?shù)量化，是基于序列的保守取代和/或同一性的百分比。測量和鑒定核酸序列之間同一性程度和同源性程度的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是周知的。例如，可使用 Vector NTi 9. 1. O 軟件包(Invitrogen INFORMAX, http://www. invitrogen.com)的AlignX比對工具(Clustal W算法)，優(yōu)選使用缺省設(shè)定。本發(fā)明還涉及能夠選擇性與SEQ ID NO :2的多核苷酸或其序列位于SEQID NO 2 位置73和位置459之間的多核苷酸雜交的多核苷酸。優(yōu)選地，選擇性雜交是在中等嚴(yán)格條件下且優(yōu)選在高嚴(yán)格條件下進(jìn)行的。這些多核苷酸優(yōu)選編碼具有SEQ ID NO :1的多肽的生物活性的多肽。根據(jù)本發(fā)明，“能夠選擇性雜交的序列”意指與參照序列以顯著高于背景噪音的水平雜交的序列。由能夠選擇性雜交的序列與參照序列之間的相互作用生成的信號水平通常是其它生成背景噪音的DNA序列的相互作用10倍以上，優(yōu)選強(qiáng)至100倍以上那么強(qiáng)。使得能夠進(jìn)行選擇性雜交的嚴(yán)格雜交條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是周知的。一般而言，雜交和洗滌溫度在給定PH和給定離子強(qiáng)度比參照序列的Tm低至少5°C。通常，雜交溫度對于15至50個核苷酸的多核苷酸為至少30°C，且對于多于50個核苷酸的多核苷酸為至少60°C。例如，雜交在下述緩沖液中實施6X SSC,50mM Tris-HCl (pH 7. 5), ImM EDTA, 0. 02% PVP，0. 02%Ficoll,0. 02% BSA，500 μ g/ml 變性的鮭精 DNA。例如，洗滌是如下所述連續(xù)進(jìn)行的，對于低嚴(yán)格條件，在2X SSC,0. 1% SDS緩沖液中，對于中等嚴(yán)格條件，在0.5X SSC,0. 1% SDS緩沖液中，而對于高嚴(yán)格條件，在0. IX SSC,0. 1% SDS緩沖液中。當(dāng)然，雜交可根據(jù)其它本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的常用方法來進(jìn)行(特別參見Sambrook等，Molecular Cloning =At Laboratory Manual, 1989) 0優(yōu)選地，與參照多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸保留參照序列的功能。本發(fā)明通常涉及編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸。由于遺傳密碼的簡并性，不同的多核苷酸可編碼相同的多肽。本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合于SEQ ID NO 1的多肽的抗體。“特異性結(jié)合”意指這些抗體僅結(jié)合于SEQ ID NO 1的多肽。具體而言，所述抗體并不結(jié)合于其它抗原，且特別地不結(jié)合于其它膠原性蛋白。本發(fā)明的抗體優(yōu)選為特異性的單克隆抗體，特別是鼠類來源的，其可為嵌合的或人源化的，這可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的標(biāo)準(zhǔn)方法來獲得。一般而言，制備單克隆抗體或其功能性片段(特別是鼠類起源的)的技術(shù)，可選自手冊 Antibodies (Harlow 禾口 Lane, Antibodies :A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, p. 726,1988)中具體描述的那些，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的基于雜交瘤的制備技術(shù)?！翱贵w”也意指嵌合的或人源化抗體。本發(fā)明還涉及在轉(zhuǎn)錄方向包含下述的表達(dá)盒-宿主生物中的功能性啟動子，-本發(fā)明的多核苷酸，-相同宿主生物中的功能性終止序列。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，將編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的克隆技術(shù)插入表達(dá)盒。該表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼本發(fā)明的多肽的序列所需的元件。有利地，該表達(dá)盒同時包含導(dǎo)致宿主細(xì)胞產(chǎn)生多肽的元件和調(diào)節(jié)該表達(dá)所需的元件。任何類型的啟動子序列可用于本發(fā)明的表達(dá)盒。啟動子的選擇特別地取決于選擇用于表達(dá)目標(biāo)基因的宿主生物。某些啟動子使得能夠發(fā)生組成型表達(dá)，而相反其它啟動子是可誘導(dǎo)的。在細(xì)菌中的功能性啟動子中，可特別提出噬菌體T7 RNA聚合酶的啟動子。在酵母中的功能性啟動子中，可提出釀酒酵母的GALl基因啟動子或GAL4和ADH啟動子。在高等真核細(xì)胞，特別是在哺乳動物細(xì)胞中的功能性啟動子中，可提出CMV(巨細(xì)胞病毒)、SV40、 RSF(勞氏肉瘤病毒)、人或雞β -肌動蛋白、β -珠蛋白、PKG(磷酸甘油酸激酶)、EF1 α、胸苷激酶和MMTV(小鼠乳房腫瘤病毒)。所有這些啟動子描述于文獻(xiàn)中，且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是周知的。本發(fā)明的表達(dá)盒還可包含表達(dá)多肽或多核苷酸所需的任何其它序列，例如使得由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽能夠分泌的調(diào)節(jié)元件或信號序列。可特別使用增加插入表達(dá)盒中的編碼序列的表達(dá)水平的任何調(diào)節(jié)序列。根據(jù)本發(fā)明，其它位于啟動子和編碼序列之間的調(diào)節(jié)序列，如轉(zhuǎn)錄激活子(“增強(qiáng)子”)，可特別地與啟動子調(diào)節(jié)序列組合使用。可在本發(fā)明的表達(dá)盒中使用廣泛種類的終止序列；這些序列能使轉(zhuǎn)錄終止和 mRNA多聚腺苷酸化。可使用任何在所選宿主生物中有功能的終止序列。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明表達(dá)盒的多核苷酸，有利地，本發(fā)明的表達(dá)盒插入載體中。
因此，本發(fā)明還涉及用于轉(zhuǎn)化宿主生物的復(fù)制或表達(dá)載體，其包含至少一個本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)盒。該載體可特別地對應(yīng)于其中插入了本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)盒的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒。用于構(gòu)建這些載體和用于將本發(fā)明的多核苷酸插入這些載體的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是周知的。一般而言，可使用在宿主細(xì)胞中能夠維持、能夠自我復(fù)制或能夠繁殖以特別地誘導(dǎo)多核苷酸或多肽表達(dá)的任何載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會根據(jù)待轉(zhuǎn)化的宿主生物和根據(jù)使用的轉(zhuǎn)化技術(shù)選取合適的載體。本發(fā)明的載體特別地用于轉(zhuǎn)化宿主生物，以供在所述宿主生物中復(fù)制所述載體和 /或表達(dá)本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還涉及用于制備本發(fā)明的多肽的方法，包括下述步驟-用包含本發(fā)明的表達(dá)盒的表達(dá)載體和/或用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主生物。-分離由宿主生物產(chǎn)生的多肽。本發(fā)明還涉及通過在宿主生物中整合至少一個本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)盒或載體來轉(zhuǎn)化前述宿主生物的方法。所述多核苷酸可整合入宿主生物的基因組中，或以穩(wěn)定方式在宿主生物中復(fù)制。轉(zhuǎn)化宿主生物的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是周知的，并在文獻(xiàn)中廣泛描述。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的多核苷酸、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的宿主生物?！八拗魃铩?根據(jù)本發(fā)明特別地意指任何單細(xì)胞或多細(xì)胞，低等或高等生物，特別是選自細(xì)菌、酵母或高等真核生物的細(xì)胞，特別是哺乳動物細(xì)胞如CHO(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)、BHK(幼倉鼠腎)、 HEK493(人胚胎腎細(xì)胞系)、NS0(小鼠骨髓瘤細(xì)胞系)、Per. C6 (Crucell)和YB2/0 (ATCC 號CRL 1662)?！八拗魃铩币庵阜侨松铩１景l(fā)明還涉及用作藥物的組合物，其包含本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的表達(dá)盒、本發(fā)明的載體和/或本發(fā)明的宿主生物。因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的表達(dá)盒、本發(fā)明的載體和/或本發(fā)明的宿主生物的藥物組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療血栓癥的組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療止血的病癥的組合物。本發(fā)明還涉及所述組合物用作瘢痕形成劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明組合物還可用作-檢測下述的診斷試劑 某些血小板功能障礙 血液學(xué)疾病-皮膚學(xué)和化妝品乳劑的組成中的止血繃帶和粘著劑的活性組分。本發(fā)明還涉及治療血栓癥的治療方法，包括將有效量的本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的表達(dá)盒、本發(fā)明的載體和/或本發(fā)明的宿主生物施用于個體。最后本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽、多核苷酸和轉(zhuǎn)化的宿主生物在制備藥物中的用途。本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含如本發(fā)明中定義的多肽、多核苷酸或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及合適的藥學(xué)賦形劑。所述組合物可配制用于施用于哺乳動物包括人。給藥方案根據(jù)所述治療和疾病而變化。所述組合物以這樣的方式制備使得能夠通過消化途徑或腸胃外途徑施用。在本發(fā)明用于經(jīng)口、舌下、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、局部或直腸施用的藥物組合物中，活性成分可與經(jīng)典的藥學(xué)載體混合，以單位給藥形式施用于動物或人。合適的單位給藥形式包括通過經(jīng)口途徑的形式如片劑、明膠膠囊劑、散劑、顆粒劑和口服溶液或懸液； 舌下和含服給藥形式；皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)給藥形式；以及直腸給藥形式。當(dāng)制備片劑形式的固體組合物時，將主要的活性成分與藥學(xué)賦形劑(如明膠、淀粉、乳糖、硬脂酸鎂、滑石、阿拉伯膠或類似物)混合。片劑可用蔗糖或其它合適的材料涂覆，或可以這樣的方式處理使得其具有延長的或延遲的活性，且其連續(xù)釋放預(yù)定量的活性成分。明膠膠囊劑的制備物是通過將活性成分與稀釋劑混合，并將獲得的化合物傾入軟或硬明膠膠囊而獲得的。糖漿劑或酏劑形式的制備物可含有活性成分連同增甜劑、抗菌劑以及增香劑和合適的著色劑?？伤稚⒌纳┗蝾w粒劑可含有與分散劑或潤濕劑或懸浮劑以及香味修正劑 (flavour correctors)或增甜劑混合的活性成分。本發(fā)明還涉及包含如上所述的多肽的化妝品組合物。而且，這些組合物還可包含經(jīng)典地用于皮膚學(xué)的活性成分如潤膚劑(emollient)、 水化活性成分、表皮障礙重構(gòu)劑(cutaneous barrier restructuring agent)、抗刺激劑和安撫劑(soothing agent) 0本發(fā)明的化妝品組合物可配制為多種適于局部施用的制備物的形式。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，多種制備物適于局部施用，且包括乳膏(creams)、乳劑、 乳、香膏劑(pomades)、洗劑(lotions)、油、水或水-醇或乙二醇溶液、散劑、噴霧劑、膠凍劑 (jellies)、凝膠劑、水凝膠或用于外部施用的任何其它產(chǎn)品。這些化妝品組合物還可含有抗氧化劑、防腐劑等。本發(fā)明還涉及化妝處理、衛(wèi)生護(hù)理或裝飾的方法和/或熏香粘膜和/ 或皮膚的方法，所述粘膜和/或皮膚為正常的、干燥的、油性的、混合的、脫水的、衰老的、敏感的、刺激的、不舒服的、無法忍受的，具有與內(nèi)在、外在或激素老化相關(guān)或者涉及外源攻擊 (污染物、PV、脅迫等)的不平衡，具有變應(yīng)性傾向，或具有色素沉著病癥，其特征為其由施用本發(fā)明的組合物組成。附1 編碼以瞬時方式轉(zhuǎn)染的粘著CHO-S細(xì)胞中的蛋白的信使RNA的表達(dá)。圖2 圖2代表由在腎上腺素存在或不存在下以瞬時方式轉(zhuǎn)染的粘著CHO-S細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)誘導(dǎo)的血小板聚集。圖3 圖3代表編碼所述蛋白的信使RNA在穩(wěn)定細(xì)胞克隆中的表達(dá)。圖4 圖4顯示通過Western印跡檢測蛋白_6X_組氨酸在純化之后獲得的多種細(xì)菌級分中的存在。圖5 圖5顯示由細(xì)菌中產(chǎn)生的蛋白誘導(dǎo)的血小板聚集。圖6 圖6顯示通過Western印跡驗證89日的免疫接種之后獲得的兔血清的特異性。
實施例
A.通過哺乳動物細(xì)胞的瞬時產(chǎn)生1.載體構(gòu)津質(zhì)粒I(NVHOOl-A)質(zhì)粒NVH001-A含有下述元件-來自質(zhì)粒 pCIneo (Promega :pCIneo Mammalian Expression Vector)的內(nèi)含子-來自載體pUC57-NVH001(從GeneCust定購)并擁有III型膠原信號肽 (NP_000081)的本發(fā)明蛋白NVH001-來自hGH mRNA(NM_000515)的多聚 A 尾- ^ g pCDFl-MCSl-EFl-copGFP(System Biosciences :pCDF cDNACloning and Expression Lentivectors)的 CMV 啟動子。質(zhì)粒2 (NVH001-B1)、3 (NVH001-B2)、4 (NVH001-C1)和 5 (NVH001-C2)質(zhì)粒NVH001-B1和NVH001-C1含有下述元件-來自衍生的質(zhì)粒pSV2-Neo (在載體 ATCC 37149 中的 ori SV40 1-989)的 SV40起點。-可為 Molecular Cloning :A Laboratory Manual 第 3 版，Sambrook andRussell,2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press 中所述的男|3些之一的啟云力子 / 增強(qiáng)子-來自 pMono-hygro-mcs (Invivogen)的潮霉素盒-來自載體pUC57-NVH001(從GeneCust定購)并擁有III型膠原信號肽 (NP_000081)的本發(fā)明蛋白NVHOOl-來自質(zhì)粒pUC57_proC(從GeneCust定購)的C-前肽-來自hGH mRNA(NM_000515)的多聚 A 尾質(zhì)粒NVHOO1-B2和NVH001-C2含有與質(zhì)粒NVH001-Bl和Cl相同的元件，除了 C-前肽。所有最終的質(zhì)粒經(jīng)測序驗證未在目標(biāo)蛋白的DNA中和在提供的元件中引入突變。2.哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒I(NVHOOl-A)1.以瞬時方式使用來自hvitrogen的Lipofectamine 2000試劑盒將載體 NVH001-A轉(zhuǎn)染至粘著并在含有5%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHO-S細(xì)胞中。2.在第3和4日收集培養(yǎng)上清，純化產(chǎn)生的蛋白，然后使用聚集度計測試其血小板結(jié)合活性。質(zhì)粒2 (NVH001-B1)、3 (NVH001-B2)、4 (NVH001-C1)和 5 (NVH001-C2)1.以瞬時方式使用來自hvitrogen的Lipofectamine 2000試劑盒將載體 NVH001-BUNVH001-B2,NVH001-Cl和NVH001-C2轉(zhuǎn)染至粘著并在含有5%胎牛血清的RPMI 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHO-S細(xì)胞中。在第1、2、3、4和5日通過添加800μ 1 TRIZOL (Invitrogen)提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RNA。 相應(yīng)的cDNA通過逆轉(zhuǎn)錄從IygS RNA獲得。對cDNA通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。然后在125V在 2%瓊脂糖凝膠上遷移30分鐘之后檢測擴(kuò)增子。還進(jìn)行了陽性對照(轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒)和陰性對照。使用分子量標(biāo)記(在左邊)以驗證擴(kuò)增子大小。
在用編碼本發(fā)明蛋白的mRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的表達(dá)在第1日觀察到。該表達(dá)隨時間略微增加，并在第5日之后維持。mRNA表達(dá)的進(jìn)展表示于

圖1。2.在第3和4日收集培養(yǎng)上清，純化產(chǎn)生的蛋白，然后使用聚集度計測試其血小板結(jié)合活性。3.本發(fā)明蛋白的牛物活件血小板聚集通過聚集度測定(aggregometry)來評價本發(fā)明蛋白的血小板結(jié)合活性。將檸檬酸試管中從健康的志愿者供體在簽字同意之后收集的血樣在150g離心15分鐘以獲得富含血小板的血漿(PRP)。將濃度調(diào)整至300giga/L。使用Regulest 血小板聚集度計在37°C 攪拌(IOOOrpm)下進(jìn)行聚集測試。該技術(shù)是基于根據(jù)Born方法的光度測定讀數(shù)，其由測量混濁介質(zhì)PRP響應(yīng)于血小板功能激活劑的光透射(transmission)的進(jìn)展組成。如果形成血小板聚集物，介質(zhì)被清除并觀察到光透射的增加。當(dāng)觀察到該透射中大于30%的增加連同(associated with)對應(yīng)于該清除的斜率的中斷時，分子被視為具有促聚集作用。圖2代表由在腎上腺素存在或不存在下以瞬時方式轉(zhuǎn)染的粘著CHO-S細(xì)胞的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的血小板聚集。反應(yīng)混合物由在存在或不存在0. 1 μ M腎上腺素下添加30 μ 1條件培養(yǎng)基的 290 μ 1 PRP組成。測量血小板應(yīng)答10分鐘。自聚集(-〇-)限定基線。添加0. 1 μ M腎上腺素誘導(dǎo)了基線的細(xì)微移動，穩(wěn)定了 10分鐘(-·-)。添加30μ 1條件培養(yǎng)基在2分鐘之后(-▽_)誘導(dǎo)了有限的應(yīng)答(18%)。該移動在10分鐘的觀察過程中是穩(wěn)定的。添加腎上腺素2分鐘，然后添加30μ 1條件培養(yǎng)基在5分鐘之內(nèi)誘導(dǎo)了總血小板聚集(-▼-)。該聚集是不是可逆的，表明形成的聚集物是穩(wěn)定的。添加非轉(zhuǎn)染粘著CHO-S細(xì)胞的30 μ 1條件培養(yǎng)基并不誘導(dǎo)聚集(結(jié)果未顯示)。B.由哺乳動物細(xì)胞的穩(wěn)定產(chǎn)生1.載體構(gòu)建質(zhì)粒I(NVHOOl-A)1.將內(nèi)含子-NVHOOl-hGHpA單元從構(gòu)建用于瞬時表達(dá)的載體去除，并在含有來自 pMono-hygro-mcs (Invivogen)的潮霉素盒的生產(chǎn)載體中克隆。2.將最終載體測序以驗證在目標(biāo)蛋白的DNA和在提供的元件中未引入突變。3.將直鏈化的載體以穩(wěn)定方式使用來自hvitrogen的Lipofectamine 2000試劑盒轉(zhuǎn)染至粘著的CHO細(xì)胞中。通過遞增水平的潮霉素B選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞。圖3代表在穩(wěn)定細(xì)胞克隆中表達(dá)編碼所述蛋白的信使RNA。在第1、2、3和4日通過添加800 μ 1 TRIZOL(Invitrogen)提取細(xì)胞RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄從 IygS RNA 獲得相應(yīng)的 cDNA。使用 5 ‘ -AGCTGGCGCGCCGCCACCATG-3 ‘ (S)和 5 ‘ -G CTTCCGGGAGGCCCTGGCTTCCCATC-3‘ (AS)引物對 cDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。然后在 125V 在 2%瓊脂糖凝膠上遷移30分鐘之后檢測擴(kuò)增子。使用對應(yīng)于質(zhì)粒DNA的陽性對照。使用分子量標(biāo)記(在右側(cè))驗證擴(kuò)增子大小。在細(xì)胞克隆中觀察到穩(wěn)定表達(dá)。C.在細(xì)菌中的產(chǎn)生1.構(gòu)建目標(biāo)分子的DNA (NVH001)通過PCR由載體pUC57_NVH001使用tagNVHOOl-有義引物GCTGCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGTCGCCCGGGAGCTCCTGGAGAGAGAGGATTG 和tagNVHOOl-反義引物GCACGGATCCTATTAGCCAGGGCAAGGTCCAGGGGCTC 進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物使得能夠在蛋白NVH001的N-末端側(cè)添加6X組氨酸標(biāo)記。將PCR產(chǎn)物克隆在載體pET3d中 (pET3d-NVH001)，使得所述分子能夠在細(xì)菌中生產(chǎn)(New England Biolab)。所述DNA的存在和正確序列通過測序驗證。2.產(chǎn)牛1.將載體pET3d_NVH001轉(zhuǎn)染至能使蛋白大量產(chǎn)生的BL21細(xì)菌。2.將細(xì)菌接種于11營養(yǎng)培養(yǎng)基中，并在37°C溫育直至獲得細(xì)菌處于指數(shù)期的 OD600nm ο3.通過IPTG在30°C、5小時誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生。4.沉淀并裂解細(xì)菌，在細(xì)菌的可溶性(上清)和不可溶性(包涵體)級分中在 Macherey-Nagel抗6X-組氨酸標(biāo)記柱上純化本發(fā)明蛋白。圖4顯示了通過Western印跡檢測蛋白_6X組氨酸在純化后獲得的多種細(xì)菌級分中的存在。將在洗脫抗-6X-組氨酸標(biāo)記柱之后獲得的每種級分的40 μ 1置于16%聚丙烯酰胺凝膠上。以18mA在遷移緩沖液(192mM甘氨酸，25mM Tris-HCl pH 6. 8和0. 1% SDS)中在分子量標(biāo)記(Amersham)存在下使用Mini-Protean 3遷移系統(tǒng)(Biorad)進(jìn)行電泳。將凝膠中分離的蛋白以70V轉(zhuǎn)移60分鐘至PVDF膜(Biorad)上。通過將膜在37°C在含有 5%脫脂乳的Tris+0. 1% Tween-20鹽水溶液(TBS-T)中攪拌溫育120分鐘來封閉非特異性結(jié)合。然后將膜在4°C與在TBS-T中稀釋至1/1000的抗-6X-組氨酸標(biāo)記單克隆抗體 (Cell Signaling) 一起溫育過夜。在TBS-T中洗滌三次5分鐘之后，將膜在室溫在稀釋至 1/10，000與過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠抗體(Jackson Laboratories)中溫育60分鐘。再次將膜在TBS中洗滌三次5分鐘。其結(jié)果通過化學(xué)發(fā)光技術(shù)使用ECL試劑盒(Amersham)顯現(xiàn)。在多個級分中觀察到蛋白的存在。獲得的主要條帶具有大約19kDa的分子量，對應(yīng)于該蛋白的單體形式。還可在特定級分中觀察到對應(yīng)于具有^kDa、43kDa和60kDa的分子量的蛋白的條帶。3.其生物活性的闡明血小板聚集通過聚集度計評價本發(fā)明蛋白的血小板結(jié)合活性。將檸檬酸試管中的從健康志愿者供體經(jīng)過簽名同意之后收集的血樣在150g離心15分鐘以獲得富含血小板的血漿(PRP)。 將濃度調(diào)整至300giga/L。使用Regulest 血小板聚集度計在37°C攪拌(IOOOrpm)下進(jìn)行聚集測試。該技術(shù)是基于根據(jù)Born方法的光度測定讀數(shù)，其由測量經(jīng)過作為混濁介質(zhì)起始的PRP響應(yīng)于血小板功能激活劑的光透射的進(jìn)展組成。如果形成血小板聚集物，介質(zhì)得到清除并觀察到光透射增加。當(dāng)觀察到該透射中大于30%的增加連同對應(yīng)于該清除的斜率上的中斷時，分子被視為具有促聚集作用。圖5顯示由細(xì)菌中產(chǎn)生的蛋白誘導(dǎo)的血小板聚集。收集了包含由Western印跡檢測到的蛋白的從抗_6X_組氨酸標(biāo)記柱洗脫的多個級分，并通過離心獲得凍干物。將該凍干物的一部分在0. 25%戊二醛的存在下在4°C溫育 3小時，然后針對IX PBS在4°C透析過夜，之后將其用于聚集度計量。反應(yīng)混合物由添加30 μ 1含有所述蛋白的PBS的290 μ 1 PRP組成。測量血小板應(yīng)答25分鐘。標(biāo)記-〇-和-的線分別顯示添加PBS溶液和透析的PBS-戊二醛的溶液之后獲得的響應(yīng)未觀察到聚集。添加含有未經(jīng)戊二醛聚集的蛋白(-▼_)或經(jīng)戊二醛聚集并透析(-·_)的蛋白的PBS在其添加10分鐘之后顯示了顯著的聚集。該聚集在20分鐘之后分別達(dá)到90%(-▼-)和100% (-·_)。P.在兔中產(chǎn)牛抗目標(biāo)蛋白的抗體1.如前所述在BL21細(xì)菌中大量產(chǎn)生所述蛋白。2.以3周間隔對兩只兔用補充弗氏佐劑(ν/ν)的純化蛋白免疫接種4次，即在DO、 D2UD42 和 D63。3.將兔在實驗結(jié)束時在D89處死，并在對動物放血之后通過離心回收血清。4.通過親和層析在特定柱上純化IgG以消除血漿蛋白。圖6顯示了通過Western印跡確證在免疫接種89天后獲得的兔血清的特異性。將10 μ 1細(xì)菌中產(chǎn)生的兩種蛋白質(zhì)制備物(其聚集活性通過聚集度計量驗證)置于16%聚丙烯酰胺凝膠上。以18mA在遷移緩沖液(192mM甘氨酸，25mMTris-HCl pH 6. 8和 0. 1% SDS)中在分子量標(biāo)記(Amersham)存在下使用Mini-Protean 3遷移系統(tǒng)(Biorad) 進(jìn)行電泳。將凝膠中分離的蛋白以70V轉(zhuǎn)移60分鐘至PVDF膜(Biorad)上。通過將膜在 37°C在含有5%脫脂乳的Tris+0. 1 % Tween-20鹽水溶液(TBS-T)中攪拌溫育120分鐘來封閉非特異性結(jié)合。然后將膜在4°C與免疫接種實驗中D89取出并稀釋至1/100的兔血清或在TBS-T中稀釋至1/1000的抗-6X-組氨酸標(biāo)記單克隆抗體(Cell Signaling) 一起溫育過夜。在TBS-T中洗滌三次5分鐘之后，將膜在室溫在稀釋至1/10，000與過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠或抗兔抗體(Jackson Laboratories)中溫育60分鐘。再次將膜在TBS中洗滌三次5分鐘。其結(jié)果通過化學(xué)發(fā)光技術(shù)使用ECL試劑盒(Amersham)顯現(xiàn)。顯影顯示具有60kDa分子量的雙重條帶的存在，其存在于兩個蛋白制備物(A，孔1 和2)中。還通過抗-6X-組氨酸標(biāo)記抗體檢測到了該條帶，顯示其確實為本發(fā)明蛋白(B，孔 1和幻。應(yīng)注意我們不再觀察到由抗-6X-組氨酸標(biāo)記抗體在細(xì)菌純化級分中檢測到的其它條帶。該結(jié)果顯示免疫接種僅對本發(fā)明蛋白的多聚體形式有效，或本發(fā)明蛋白一旦純化即裝配為多聚體。參考文獻(xiàn)Asselin 等，Biochem J. 1999 Apr 15 ；339 (Pt 2) 413-8Born 等，Nature 1962 June, 194 :927-9Boudko 禾口 Engel，J Mol Biol.2004 Jan 30 ；335 (5) :1289-97Bulleid 等，EMBO J. 1997 Nov 17 ；16(22) :6694-701Bulleid 等，Biochem J. 1996 Jul 1 ；317 (Pt 1) :195-202Farndale 等，Biochem Soc Trans. 2008 Apr ；36 (Pt 2) :241-50Hulmes DJ,J Struct Biol. 2002 Jan-Feb ； 137 (1-2) :2-10Jarvis 等，Blood. 2008 May 15 ；111(10) :4986-96Kim 等，J Biol Chem. 2005 S印 16;280(37) :32512-20Lisman T 等，Blood. 2006 Dec 1 ；108(12) :3753-6McAlinden 等，J Biol Chem. 2003 Oct 24 ；278 (43) :42200-7Monnet E 等，J Biol Chem. 2000 Apr 14 ；275 (15) :10912-7
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1.一種分離的多肽，其特征為其具有SEQ ID NO :1的多肽或SEQ IDNO :1的位置25至位置152的多肽的序列。
2.一種分離的多肽，其特征為-其在其全長與SEQ ID NO 1的多肽或與SEQ ID NO 1的位置25至位置152的多肽具有至少70%同一性，-其能夠在血小板聚集度計中在37°C以IOOOrpm攪拌下誘導(dǎo)超過30%的人血血小板的聚集。
3.權(quán)利要求2的分離的多肽，其特征為其包含至少下述肽基序-GX1X2GER,其中 X1 和 X2 獨立地代表選自 A、R、N、D、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y、V 和0的氨基酸；-(GPX3)n,其中η為4至10，且)(3代表P或0; -GPRGQX4GVMGFX5，其中&和&獨立地代表P或0。
4.權(quán)利要求2的分離的多肽，其特征為其包含至少下述肽基序 -GAPGER,-KPGEPGPK,-(GPP)η 其中 η 為 4-10, -RGD0
5.一種分離的多核苷酸，其特征為其編碼權(quán)利要求1-4之一的多肽。
6.權(quán)利要求5的分離的多核苷酸，其特征為其具有SEQID NO :2的多核苷酸的序列。
7.一種抗體，其特異性結(jié)合于SEQ ID NO :1的多肽。
8.—種表達(dá)盒，在轉(zhuǎn)錄方向包含下述 -宿主生物中的功能性啟動子，-權(quán)利要求5-6之一的多核苷酸， -相同宿主生物中的功能性終止序列。
9.一種載體，其特征為其包含權(quán)利要求5-6之一的多核苷酸和/或權(quán)利要求8的表達(dá)品.ο
10.一種非人的宿主生物，其用權(quán)利要求5-6之一的多核苷酸、權(quán)利要求8的表達(dá)盒和 /或權(quán)利要求9的載體轉(zhuǎn)化。
11.一種用作藥物的組合物，其特征為其包含權(quán)利要求1-4之一的多肽，權(quán)利要求5-6 之一的多核苷酸，權(quán)利要求8的表達(dá)盒，權(quán)利要求9的載體和/或權(quán)利要求10的宿主生物。
12.權(quán)利要求11的用作藥物的組合物，用于治療血栓形成疾病。
13.權(quán)利要求11的用作藥物的組合物，用于治療止血的病癥。
14.權(quán)利要求11的組合物，用作瘢痕形成劑。
15.一種化妝品組合物，其特征為其包含權(quán)利要求1-4之一的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠誘導(dǎo)血小板聚集的重組蛋白，并涉及其用途。
文檔編號A61K38/04GK102224167SQ200980146800
公開日2011年10月19日 申請日期2009年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月24日
發(fā)明者伊曼紐爾.德梅斯特, 埃多德.普羅斯特, 戴維.范德魯克斯 申請人:第戎大學(xué)醫(yī)療中心