專利名稱：組合物、口腔護(hù)理產(chǎn)品及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物礦物組合物和口腔護(hù)理產(chǎn)品。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備和使用生物礦物組合物和口腔護(hù)理產(chǎn)品的方法。
背景技術(shù)：
近年來，在納米(生物)技術(shù)中，參與納米級(jí)范圍生物礦化的自然過程的生物分子開始逐漸引起人們的興趣?！白匀患{米技術(shù)”的實(shí)例是(i)珍珠，其由碳酸鈣晶體(即文石)組成，或(ii)鮑魚-貽貝的殼，其由方解石晶體構(gòu)成，該晶體通過結(jié)合特定蛋白產(chǎn)生新的有利的物質(zhì)性質(zhì)，或(iii) mOphiocoma wendtii的光學(xué)微型透鏡系統(tǒng)。特別地，一些海生生物或水生生物，比如硅藻和硅質(zhì)海綿具有由生物起源的二氧化硅建立骨架結(jié)構(gòu)的能力。硅質(zhì)海綿具有在在室溫下，在溫和條件下，采用酶機(jī)制形成二氧化硅(“生物硅”) 的令人驚奇的能力，如在 Siimizu 等人的Natl Acad. Sci USA 95，6234-6238 (1998)中公開的。相反，用于制備二氧化硅的無機(jī)化學(xué)方法需要使用高溫和更侵襲性化學(xué)品。由海綿產(chǎn)生的生物硅用于建立針狀骨架成分(即，“骨針”)，如例如在MUller等 K, FEBS J. 272，3838-3852 Q005)和 Miiller 等人，Iicro/ 37，107-120 Q006)中公開的。涉及的酶，即，硅聚合酶(silicateins)可以是從海生硅質(zhì)海綿寄居蟹皮海綿 (Suberites i/ofiMwcWa)和大量其它海綿克隆的，如在 Krasko 等人，^/ro/7. J. Biochem. 267:4878-4887 QOOO)中公開的。硅聚合酶及其技術(shù)描述在例如PCT/US99/30601、DE 1003 72 70 Al、PCT/EP01/084 23、EP 132 0624 和 US 7，169,589 B2 (即，提及硅聚合酶-α和硅聚合酶)；DE 103 52 433.9 (提及硅聚合酶-β)；以及DE 102006001759. 5 (即，公開了 Lubomirskia baicalensis的四種硅聚合酶同工型)。利用上述酶，有可能在室溫下制備納米級(jí)的生物硅，如公開在例如khroder等人， J. Biol. Chem. 281，12001-12009 O006)和 Schroder 等人，Μ ΓΝ··5·56 ·^Α3Λ· 94， 339-359 (2007)中。通過固定的蛋白質(zhì)形成生物硅可以利用各種技術(shù)來證實(shí)，所述技術(shù)包括，但不限于如公開在Tahir等人，Chem. Commun. 2848-2849 Q004)中的“掃描力顯微鏡術(shù)”(SFM)和“掃描電子顯微鏡術(shù)”(SEM)。硅聚合酶同時(shí)具有合成代謝(即，二氧化硅-聚合酶)和分解代謝(即，二氧化硅-酯酶)活性，因此，其使得可能制備柔性二氧化硅殼，經(jīng)由表達(dá)的硅聚合酶的酯酶活性可以對(duì)其修飾或打孔。硅聚合酶的二氧化硅-酯酶活性所基于的機(jī)制顯示在圖IA中。低聚/多硅酸鹽基質(zhì)的水解是基于硅聚合酶活性中心中絲氨酸基團(tuán)的羥基親核攻擊聚合物基質(zhì)的硅原子之一。在這種情況下，聚合物硅酸鹽中的氧鍵裂解。該反應(yīng)受到活性中心中組氨酸的咪唑-氮和絲氨酸的羥基之間氫橋鍵形成的促進(jìn)，其導(dǎo)致絲氨酸-氧的親核性增加。酶和基質(zhì)之間的過渡性共價(jià)鍵被水所水解，釋放出硅酸。圖IB顯示硅聚合酶的二氧化硅-聚合酶活性的機(jī)制。該酶活性中心中的組氨酸基團(tuán)起酸-堿催化劑的作用。將質(zhì)子從原硅酸轉(zhuǎn)移到咪唑-氮導(dǎo)致形成活性硅酸鹽物種，其能夠攻擊第二個(gè)原硅酸鹽分子。然后，形成的帶負(fù)電、五價(jià)中間體化合物轉(zhuǎn)變成焦硅酸(或高級(jí)低聚物)，釋放出水，其是由來自組氨酸基團(tuán)的質(zhì)子化咪唑環(huán)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移所形成的。
大量出版物公開了硅聚合酶的如下用途(i)在多種基質(zhì)上形成無機(jī)涂層，所述基質(zhì)包括金屬、金屬氧化物、塑料、碳纖維、羊毛纖維、棉纖維、藥品添加劑(例如淀粉)和半導(dǎo)體載體(參見例如，MUller等人，美國(guó)專利申請(qǐng)公布No. 2007/0280921，第W115]至
段，和MUller等人，美國(guó)專利No. 7，169，589，第10欄，第55-59行)，(ii)改良石頭的外表面(參見，Miiller等人，美國(guó)專利No. 7，229，807，第16欄，第6_15行)，和(iii)體外形成二氧化硅和硅氧烷聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(參見，Morse等人的美國(guó)專利No. 6，670，438)。進(jìn)一步，Goldberg等人的美國(guó)專利申請(qǐng)公布No. 2007/ 0238808公開了生物催化劑(例如硅聚合酶)形成包括聚合基質(zhì)材料和在該聚合基質(zhì)材料上和/或其內(nèi)部的生物催化劑(例如硅聚合酶)的牙齒修復(fù)材料的用途，其中所述生物催化劑促進(jìn)礦物質(zhì)(例如二氧化硅)沉積在聚合基質(zhì)材料上和/或其內(nèi)部。該聚合基質(zhì)材料通常是熱固性(即可硬化的)材料(參見，第W056]段)，在聚合化和/或固化之后，形成得到的牙齒材料的整體部件。所公開的牙齒材料可以用作修復(fù)物和牙齒結(jié)構(gòu)之間的粘合劑，如公開在第W089]段中的。一直努力開發(fā)酶/生物催化劑比如硅聚合酶的另外的用途，以及包含這樣的酶/ 生物催化劑的組合物。進(jìn)一步，一直努力開發(fā)利用酶/生物催化劑比如硅聚合酶的催化性質(zhì)，和向牙齒提供保護(hù)/修復(fù)性質(zhì)而不會(huì)在牙齒上形成含有機(jī)聚合物層的生物硅產(chǎn)品。發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明涉及包含酶和前體物質(zhì)的組合物的發(fā)現(xiàn)，所述前體物質(zhì)被所述酶催化形成無機(jī)涂層物質(zhì)(例如二氧化硅)。該組合物可以使用在其中期望無機(jī)或礦物涂層的多種應(yīng)用中， 并且特別地用作能夠在動(dòng)物牙齒上形成無機(jī)涂層的牙齒護(hù)理組合物(即，應(yīng)用在動(dòng)物牙齒上的組合物)。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括(i)酶，和(ii)前體物質(zhì)，其能夠被所述酶催化形成無機(jī)涂層物質(zhì)。所述組合物也可包括保護(hù)劑，其從化學(xué)上或物理上保護(hù)所述酶避開該混合物內(nèi)的前體物質(zhì)，以便阻止酶與前體物質(zhì)過早反應(yīng)，或口腔護(hù)理組分比如含磷化合物、清洗劑(例如，表面活性劑比如月桂基硫酸鈉)、拋光劑、磨擦劑、抗微生物物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、生色添加劑、香味添加劑、含氟化物物質(zhì)、生產(chǎn)加工助劑(例如聚乙二醇)、增稠劑或其混合物。所述組合物也可包括加速劑、促進(jìn)劑、活化劑或其混合物，其起增加前體物質(zhì)聚合速率的作用。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物包括口腔護(hù)理組合物，其中所述口腔護(hù)理組合物包括一種混合物，其包括酶；前體物質(zhì)，其能夠與所述酶反應(yīng)形成無機(jī)涂層物質(zhì)；和保護(hù)劑，該保護(hù)劑分開酶與所述混合物中的前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與所述前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。示例性的口腔護(hù)理組合物可包括任何口腔護(hù)理物質(zhì)或裝置或與其一起使用，所述任何口腔護(hù)理物質(zhì)或裝置包括，但不限于牙膏、口香糖、嗽口水、牙刷、護(hù)齒器或牙托、牙齒貼片、牙齒排列矯正器、食品、飲料、糖錠、或其它可食用物質(zhì)，及其組合。另外，本發(fā)明的組合物可以與任何口腔護(hù)理產(chǎn)品一起用于任何動(dòng)物。這樣的物質(zhì)可包括典型的成分， 包括，但不限于含磷化合物、清洗劑、抗微生物物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、生色添加劑、香味添加劑、含氟化物物質(zhì)、生產(chǎn)加工助劑、增稠劑、填充金屬、水或其混合物。理想地，所述牙齒護(hù)理組合物包括可涂層的組合物，即，具有使用常規(guī)涂布方法能夠使所述組合物涂布在基質(zhì)上的粘度的組合物。
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在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括口腔護(hù)理組合物，其中所述口腔護(hù)理組合物包括含有酶和能夠與該酶反應(yīng)形成無機(jī)涂層物質(zhì)的前體物質(zhì)的牙膏。所述牙膏可進(jìn)一步包括另外的成分，比如在牙膏中通常存在的那些，以及在牙膏通常不存在的那些(例如保護(hù)劑比如聚交酯、加速劑、促進(jìn)劑、活化劑或其混合物)。合適的另外的成分可包括，但不限于保護(hù)劑，其從化學(xué)上或物理上分開所述酶與該混合物之內(nèi)的前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與所述前體物質(zhì)的過早反應(yīng)，含磷化合物、清洗劑、抗微生物物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、生色添加劑、香味添加劑、含氟化物物質(zhì)、生產(chǎn)加工助劑、增稠劑、填充金屬和水。在包括本發(fā)明的口腔護(hù)理組合物的任一種公開的組合物中，所述酶可以包括能夠催化前體物質(zhì)的任何酶，比如例如硅聚合酶、組織蛋白酶L、木瓜蛋白酶等。所述前體物質(zhì)可以包括例如金屬氧化物，比如二氧化硅、硅酸鹽、硅酸、硅醇鹽、或具有通式Si (R1)m(R2)n(R3) P(R4)tl的化合物、其縮合產(chǎn)物或其混合物，其中禮、&、R3和R4各自獨(dú)立地包括H、OH、C1至 C12烷烴基，或C1至C12烷氧基；m、n、p和q各自獨(dú)立地為0或1至4的整數(shù)；和(m + η + ρ + q) =4。在本發(fā)明的一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，這些物質(zhì)可以是對(duì)任何動(dòng)物無毒的或無害的。在任一種公開的組合物中，比如本發(fā)明的口腔護(hù)理組合物，所述含磷化合物可以包括例如焦磷酸四鈉、焦磷酸四鉀、焦磷酸二鈉或兩種或多種磷酸鹽的組合，而清潔劑可以包括例如表面活性劑比如十二烷基硫酸鈉。本發(fā)明還涉及制備包含酶和能夠與該酶反應(yīng)形成無機(jī)涂層物質(zhì)的前體物質(zhì)的組合物的方法。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，制備組合物的方法包括形成包含如下組分的混合物(i)酶，( )前體物質(zhì)，其能夠與所述酶反應(yīng)形成無機(jī)涂層物質(zhì)，和(iii)至少一種另外的組分或口腔護(hù)理組合物的組分，所述另外的組分包括保護(hù)劑，其從化學(xué)上或物理上分開所述酶與所述混合物中的前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。另外的組分可以包括至少一種加速劑、促進(jìn)劑、含磷化合物、清潔劑、磨擦劑、拋光劑、抗微生物物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、生色添加劑、香味添加劑、含氟化物物質(zhì)、生產(chǎn)加工助劑、增稠劑或其混合物。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，制備組合物的方法包括形成口腔護(hù)理組合物。一種制備口腔護(hù)理組合物的示例性的方法包括形成包含下述組分的混合物酶；前體物質(zhì)， 其能夠被所述酶催化形成無機(jī)涂層物質(zhì)；和保護(hù)劑，其從化學(xué)上或物理上分開所述酶和在該混合物內(nèi)的前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與所述前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。制備口腔護(hù)理組合物的方法可以進(jìn)一步包括向該混合物中加入一種或多種另外的成分，其中一種或多種另外的成分包括，但不限于至少一種促進(jìn)劑、加速劑、含磷化合物、清潔劑、拋光劑、磨擦劑、抗微生物物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、生色添加劑、香味添加劑、含氟化物物質(zhì)、生產(chǎn)加工助劑、增稠劑、填充金屬、水或其任意組合。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，制備組合物的方法包括形成口腔護(hù)理組合物，其中該口腔護(hù)理組合物包括牙膏。制備牙膏的方法包括形成包括下述組分的混合物酶，和能夠與該酶反應(yīng)形成無機(jī)涂層物質(zhì)的前體物質(zhì)。制備牙膏的方法可以進(jìn)一步包括向該混合物中加入至少一種另外的成分，其中至少一種另外的成分可以包括，但不限于保護(hù)劑，含磷化合物、拋光劑、磨擦劑、促進(jìn)劑、加速劑、清潔劑、抗微生物物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、生色添加劑、香味添加劑、含氟化物物質(zhì)、生產(chǎn)加工助劑、增稠劑、填充金屬、水或其任意組合，其中所述保護(hù)劑從化學(xué)上或物理上分開所述酶與該混合物之內(nèi)的前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與所述前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及在基質(zhì)上形成涂層的方法。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，在基質(zhì)上形成涂層的方法包括用包含下述組分的混合物涂布至少一部分基質(zhì)酶；前體物質(zhì)， 其能夠被所述酶催化形成無機(jī)涂層物質(zhì)；和保護(hù)劑，其從化學(xué)上或物理上分開在該混合物內(nèi)的所述酶和所述前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與所述前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。在基質(zhì)上形成涂層的方法可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)另外的步驟，該步驟包括，但不限于從所述酶中除去保護(hù)劑；使該酶與前體物質(zhì)接觸，以便引發(fā)酶與前體物質(zhì)之間的反應(yīng)；和向該混合物中加入至少一種另外的反應(yīng)性或非反應(yīng)性成分，其中至少一種另外的反應(yīng)性或非反應(yīng)性成分包括，但不限于含磷化合物、促進(jìn)劑、加速劑、清潔劑、抗微生物物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、生色添加劑、香味添加劑、含氟化物物質(zhì)、生產(chǎn)加工助劑、增稠劑、填充金屬、水或其任意組合。所述基質(zhì)可以包括各種基質(zhì)，包括，但不限于牙齒和骨。本發(fā)明進(jìn)一步涉及經(jīng)由上述方法形成的無機(jī)涂層和涂布的基質(zhì)。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，所述涂層包括生物硅和/或羥基磷灰石，所述涂布的基質(zhì)包括至少部分地涂布有包括生物硅和/或羥基磷灰石的涂層的牙齒或骨。本發(fā)明可以進(jìn)一步用于填充牙齒和骨骼中的裂縫或裂痕，以便修復(fù)牙齒或骨。在回顧下述公開實(shí)施方案的詳細(xì)說明和附加權(quán)利要求書之后，本發(fā)明的這些及其它特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。附圖
簡(jiǎn)述
圖IA描述酶硅聚合酶的二氧化硅-酯酶活性的機(jī)制； 圖IB描述酶硅聚合酶的二氧化硅-聚合酶活性的機(jī)制； 圖2A-2D描述使用本發(fā)明的組合物在牙齒上提供保護(hù)性無機(jī)涂層的示例性步驟； 圖3描述編碼在下述實(shí)施例2中形成的羥磷灰石-結(jié)合硅聚合酶-α蛋白的cDNA的擴(kuò)增；
圖4描述擴(kuò)增子與細(xì)菌表達(dá)載體pTRC-His2經(jīng)由如在下述實(shí)施例2中描述的T/ A克隆的連接；
圖5A-5D描述在用如下述實(shí)施例5中描述的本發(fā)明的無機(jī)涂層物質(zhì)涂布之前和之后， 在兩個(gè)不同放大倍數(shù)下，牙齒的示例性的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像；和
圖6描述如在實(shí)施例5中描述的，在豬牙齒上形成的生物硅/生物磷灰石層的EDX (“能量色散X射線”)譜圖。發(fā)明詳述
為了促進(jìn)理解本發(fā)明的原理，下面描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案并使用特定術(shù)語描述具體實(shí)施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的范圍并不意味著受到使用特定術(shù)語的限制。所討論的本發(fā)明原理的變更、進(jìn)一步改良和這樣的進(jìn)一步應(yīng)用都預(yù)期是本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常能想到的。必須指出，如在本說明書和附加權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式“一個(gè)(種)”和“所述的”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有清楚的規(guī)定。因此，例如，提及“氧化物”包括這樣的氧化物的復(fù)數(shù)形式，提及“氧化物”包括提及一個(gè)或多個(gè)氧化物和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其
等同物等。在對(duì)本公開的實(shí)施方案的描述中，使用“約”來修飾例如某種組分在組合物中的量、濃度、體積、處理溫度、處理時(shí)間、回收率或產(chǎn)率、流速等值及其范圍時(shí)，指可能例如通過典型的測(cè)量和處理程序、通過這些方法中的偶然誤差、通過用于進(jìn)行這些方法的組分的差異以及類似的近似理由而產(chǎn)生的數(shù)值變化。術(shù)語“約”還包括由于具有特定初始濃度或混合物的制劑的老化而導(dǎo)致不同的量，和由于具有特定初始濃度或混合物的制劑的混合或處理而導(dǎo)致不同的量。無論是否用"約"修飾，附加的權(quán)利要求書都包括這些量的等同物。如本文使用的術(shù)語“金屬氧化物”定義二元含氧化合物，其中所述金屬為陽離子， 所述氧化物為陰離子。金屬也可包括類金屬。金屬包括元素周期表上從硼到釙所畫對(duì)角線左邊的那些元素。類金屬或半金屬包括位于此線上的那些元素。金屬氧化物的實(shí)例包括二氧化硅、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯等，及其混合物。優(yōu)選地，所述金屬氧化物是無定形的，比如例如沉淀法二氧化硅。如本文使用的術(shù)語“礦物質(zhì)”或“無機(jī)物質(zhì)”定義為由金屬氧化物組成的物質(zhì)。如本文使用的術(shù)語“酶”定義為由在植物或動(dòng)物細(xì)胞中形成的或合成的多種蛋白組成的物質(zhì)，其在引發(fā)或加速某些化學(xué)反應(yīng)中起有機(jī)催化劑的作用。本發(fā)明涉及組合物，其包含酶和能夠被該酶催化形成無機(jī)涂層物質(zhì)(例如二氧化硅)的前體物質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備包含酶和能夠被該酶催化形成無機(jī)涂層物質(zhì)的前體物質(zhì)的組合物的方法。本發(fā)明甚至進(jìn)一步涉及在基質(zhì)上形成涂層的方法，其中所述涂層包括(i)酶，和能夠被該酶催化形成無機(jī)涂層物質(zhì)的前體物質(zhì)，或(ii)所述酶和所述前體物質(zhì)之間反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物(例如，無機(jī)涂層物質(zhì)形式的反應(yīng)產(chǎn)物)。本發(fā)明甚至進(jìn)一步涉及涂層和涂布的基質(zhì)，比如涂布的牙齒或骨。本發(fā)明的組合物可以提供之前組合物和其形成的涂層領(lǐng)域沒有提到的一個(gè)或多個(gè)益處和/或技術(shù)優(yōu)勢(shì)。例如，公開的組合物和其形成的最終涂層不需要聚合物基質(zhì)物質(zhì)或潛在地毒性組合物組分(例如，不適用于人類消費(fèi)品的組分)。進(jìn)一步，得到的無機(jī)涂層物質(zhì)(例如，生物硅和/或羥基-磷灰石)提供優(yōu)越的抗拉強(qiáng)度、韌性、自我修復(fù)能力和對(duì)給定基質(zhì)(例如牙齒)的粘附力。這樣的涂層在化學(xué)組成上與天然牙質(zhì)/釉質(zhì)幾乎不能區(qū)別，且不包含潛在的毒性聚合物基質(zhì)物質(zhì)。示例性的組合物和組合物組分的說明提供如下 I.組合物
本發(fā)明的組合物可以包括大量獨(dú)立組分。獨(dú)立組分和獨(dú)立組分組合的說明提供如下。 進(jìn)一步，本發(fā)明的組合物可以以多種形式存在。組合物類型的說明也提供如下。A.組合物組分
本發(fā)明的組合物可以包括一種或多種下述組分。1.酶
本發(fā)明的組合物包括至少一種酶。合適的酶包括能夠催化前體物質(zhì)導(dǎo)致形成無機(jī)納米層的酶。合適的酶包括二氧化硅蛋白質(zhì)，比如硅聚合酶，和類似蛋白質(zhì)，比如組織蛋白酶、木瓜蛋白酶等，及其突變體。在某些實(shí)施方案中，所述酶包括硅聚合酶，比如硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y ；包含動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌的硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y結(jié)構(gòu)域的多肽，其與下述SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3所顯示的序列具有至少25%的序列相似性；或其同源多肽。在其它實(shí)施方案中，所述酶包括包含硅聚合酶-α、硅聚合酶或硅聚合酶-Y結(jié)構(gòu)域的上述多肽，其與SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3所顯示的序列和低聚谷氨酸序列具有至少25%的序列相似性。合適的酶(例如，來自符合SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3的寄居蟹皮海綿 iSuberites)的硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-γ，其同源多肽，即在硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的多肽，其與顯示在例如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3中的序列具有至少25%的序列相似性)可以是從天然形式的動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌提取的，或者可以合成制備，或者其中所述多肽存在于原核細(xì)胞或真核細(xì)胞提取物中或細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中。所述細(xì)胞提取物或溶胞產(chǎn)物可以由間接體內(nèi)或間接體外的細(xì)胞，例如由重組細(xì)菌細(xì)胞或海綿產(chǎn)生?？梢愿鶕?jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的常規(guī)方法純化多肽，因而，其可以不含其它蛋白質(zhì)。編碼來自寄居觸皮海綿(5 domuncula)的硅聚合酶-α多肽或硅聚合酶-β多肽以及來自核苷酸序列的多肽的cDNAs的性質(zhì)描述在例如PCT/US99/ 3060UDE 10037270 AUPCT/ EPOl/ 08423和DE 103 52 433. 9中，將每篇的主題都全部引入作為參考。一種或多種酶在本發(fā)明的組合物中的存在量通常為基于該組合物的總重量計(jì)超過0重量％ (wt%)，至多50 wt%0在一些示例性的實(shí)施方案中，所述組合物包括一種或多種酶，含量為基于該組合物總重量計(jì)約0.0001 wt%至約10 wt%，更通常地為約0.001襯％至約5 wt%，甚至更通常地為約0. 01 wt%至約1 wt%。Z前體物質(zhì)
本發(fā)明的組合物也包括至少一種前體物質(zhì)，其能夠被所述酶催化形成無機(jī)涂層物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，所述前體物質(zhì)包括金屬氧化物，比如二氧化硅、硅酸鹽、硅酸、 硅醇鹽或具有通式Si(R1)m(R2)n(R3)p(R4)q的化合物、其縮合產(chǎn)物或其混合物，其中RpI^R3 和R4各自獨(dú)立地包括IC1至C12烷烴基，或C1至C12烷氧基；m、n、p和q各自獨(dú)立地為0或 1至4的整數(shù)；和(m + η + ρ + q) = 4。一些示例性的前體物質(zhì)包括，但不限于硅酸、單烷氧基硅烷三醇、二烷氧基硅烷二醇、三烷氧基甲硅烷醇、四烷氧基硅烷及硅酸的螯合復(fù)合物。一種或多種前體物質(zhì)可以加入到本發(fā)明的組合物中。一種或多種前體物質(zhì)在本發(fā)明的組合物中的存在量通常為基于組合物的總重量計(jì)超過0重量％ (wt%)，至多約80 wt%0 在某些示例性的實(shí)施方案中，所述組合物包括一種或多種前體物質(zhì)，含量為基于該組合物總重量計(jì)約0.01 wt%至約30 wt%，更通常地為約0. 1 wt%至約20 wt%，并且甚至更通常地為約1 wt%至約10 wt%。3.保護(hù)劑
本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括至少一種保護(hù)劑，其從化學(xué)上或物理上分開所述酶與給定混合物中的前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。保護(hù)劑可以比如通過包封、分離或包含所述酶而從物理上分離所述酶。保護(hù)劑也可以比如通過分子內(nèi)鍵合或分子間鍵合或位阻等而從化學(xué)上保護(hù)所述酶。通常，當(dāng)存在時(shí)，使用一種或多種保護(hù)劑保護(hù)酶，而不保護(hù)前體物質(zhì)；然而，可以使用一種或多種保護(hù)劑單獨(dú)地保護(hù)酶、單獨(dú)地保護(hù)前體物質(zhì)或同時(shí)保護(hù)酶和前體物質(zhì)。合適的保護(hù)劑包括，但不限于聚交酯、聚乙烯醇、海藻酸鹽、共聚物比如聚(丙交酯-共-ε-己內(nèi)酯)。最好是，保護(hù)劑是(i)水溶性的，(ii)在唾液的存在下可降解，或 (iii)同時(shí)具有⑴和(ii)。
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當(dāng)存在時(shí)，一種或多種保護(hù)劑在本發(fā)明的組合物中的存在量通常為基于組合物的總重量計(jì)超過0重量％ (wt%)，至多約60 wt%0在某些示例性的實(shí)施方案中，所述組合物包括一種或多種保護(hù)劑，含量為基于該組合物總重量計(jì)約0. 1襯％至約30 wt%，更通常地為約 1 wt%至約20 wt%，并且甚至更通常地為約2 wt%至約15 wt%。4.含磷化合物
本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種含磷化合物。合適的含磷化合物包括，但不限于磷酸鹽，比如磷酸鈉、磷酸二鈉、磷酸三鈉、磷酸四鈉、偏磷酸鈉、三磷酸五鈉、單氟磷酸鈉、單氟磷酸鹽、十二烷基磷酸鈉(月桂基磷酸鈉)、磷酸鈣鈉、磷酸四鉀、三磷酸五鉀、焦磷酸二鈉、焦磷酸四鈉、焦磷酸四鉀、磷酸錫(磷酸亞錫)和焦磷酸錫(焦磷酸亞錫)。當(dāng)存在時(shí)，一種或多種含磷化合物在本發(fā)明的組合物中的存在量通常為基于組合物的總重量計(jì)超過0重量％ (wt%)，至多約90 wt%0在某些示例性的實(shí)施方案中，所述組合物包括一種或多種含磷化合物，含量為基于該組合物總重量計(jì)約0. lwt%至約50 wt%，更通常地為約1 wt%至約30 wt%，并且甚至更通常地為約1 wt%至約20 wt%。5.促進(jìn)劑/加速劑
本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種促進(jìn)劑、加速劑或活化劑，其能夠增強(qiáng)酶促反應(yīng)。用于增強(qiáng)酶促反應(yīng)的試劑可以是活化所述酶親核攻擊前體物質(zhì)的那些。合適的試劑包括，但不限于各種金屬、金屬鹽、金屬氧化物、及其混合物。實(shí)例包括i^、Se、F、Al鹽及其氧化物。當(dāng)存在時(shí)，一種或多種促進(jìn)劑，加速劑或活化劑在本發(fā)明的組合物中的存在量通常為基于組合物的總重量計(jì)超過0重量％ (wt%)，至多約30 wt%。在某些示例性的實(shí)施方案中，所述組合物包括一種或多種促進(jìn)劑、加速劑或活化劑，含量為基于該組合物總重量計(jì)約 0. 001 wt%至約20 wt%，更通常地為約0. 01 wt%至約10 wt%，并且甚至更通常地為約0. 1 wt% 至Ij 約 5 wt%。6.磨擦劑和拋光劑
本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種磨擦劑和拋光劑。所述磨擦劑和拋光劑可以除去任何過量的無機(jī)物質(zhì)。合適的磨擦劑試劑包括金屬氧化物顆粒，比如硅膠、沉淀二氧化硅或煅制二氧化硅、或其混合物。合適的拋光劑包括金屬氧化物顆粒，比如膠體二氧化硅。當(dāng)存在時(shí)，一種或多種磨擦劑和拋光劑在本發(fā)明的組合物中的存在量通常為基于組合物的總重量計(jì)超過0重量％ (wt%)，至多約30 wt%0在某些示例性的實(shí)施方案中，所述組合物包括一種或多種磨擦劑和拋光劑，含量為基于該組合物總重量計(jì)約0. 001wt%至約 20 wt%，更通常地為約0. 01 wt%至約10 wt%，并且甚至更通常地為約0. 1 wt%到約5 wt%。7.另外的成分
本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種另外的組分。適合用在本發(fā)明的組合物中的另外的組分包括，但不限于清潔劑、牙齒增白劑、呼吸清新劑、調(diào)味劑或甜味劑、芳香劑、 著色劑、PH調(diào)節(jié)劑、抗微生物劑、發(fā)泡劑、增稠劑、用于將酶結(jié)合到另一種組合物組分(例如保護(hù)劑)的雙功能連接劑、生產(chǎn)加工助劑及其組合。大量市售可獲得的清潔劑可以用在本發(fā)明的組合物中。合適的市售清潔劑(即表面活性劑)包括，但不限于從M^an (Northfield, IL)可買到的十二烷基硫酸鈉。合適的調(diào)味劑包括，但不限于薄荷調(diào)味劑(例如綠薄荷或歐薄荷調(diào)味劑)、橙調(diào)味齊U、櫻桃調(diào)味劑、酸橙調(diào)味劑、泡泡糖調(diào)味劑等。合適的甜味劑包括，但不限于葡萄糖、山梨醇、三氯半乳蔗糖、紐甜(neo-tame)、乙酰舒泛鉀等。在本發(fā)明的一個(gè)示例性的實(shí)施方案中， 本發(fā)明的組合物包括山梨醇作為甜味劑。合適的芳香劑包括，但不限于檸檬、橙、薄荷、松樹、青蘋果、桉樹、茉莉和各種 spa-like 香料。合適的著色劑包括，但不限于FD& C Blue #_1、FD & C Green #_3、FD & C Yellow #_5和FD & C Red #_40。在本發(fā)明的一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括FD & C Blue #_1 或 FD & C Yellow #_5。適合用于本發(fā)明的pH調(diào)節(jié)劑包括，但不限于檸檬酸、磷酸、碳酸鈉、檸檬酸鈉、苯甲酸鈉、苯甲酸、檸檬酸鈉、檸檬酸銀、檸檬酸二氫銀或其組合。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，所述PH調(diào)節(jié)劑包括檸檬酸(即2-羥基-1，，2，3-丙烷三羧酸)、磷酸、苯甲酸鈉或其任
思組合。適合用于本發(fā)明的增稠劑或膠凝劑包括，但不限于堿金屬淀粉、羧基纖維素化合物、纖維素膠、黃原膠、聚丙烯酸及所有天然存在的樹膠和淀粉。如本文使用的上述增稠劑或膠凝劑包括交聯(lián)的和未交聯(lián)的增稠劑或膠凝劑。例如，任何上述的淀粉、樹膠、纖維素基化合物或聚合物都可以經(jīng)由給定化合物或聚合物之內(nèi)的鍵合力或經(jīng)由加入一種或多種交聯(lián)劑來交聯(lián)。合適的生產(chǎn)加工助劑包括，但不限于聚乙二醇、堿金屬碳酸鹽、堿金屬碳酸氫鹽、 麥芽糖糊精等。在本發(fā)明的一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括聚乙二醇。在本發(fā)明中可以使用大量市售的另外的組分。合適的市售的另外組分包括，但不限于泡沫增強(qiáng)劑比如可以從M^an (Northfield, IL)買到的商品名ΝΙΝΟΙ；的泡沫增強(qiáng)劑；和牙齒保護(hù)劑，比如可以從Univar USA (Bellevue, WA)買到的氟化鈉。在本發(fā)明中可以使用許多種市售的增稠劑。合適的市售增稠劑包括，但不限于可以從 W. R. Grace & Co.-Conn.購(gòu)得的硅膠；Sigma Aldrich (St. Louis, MO)以商品名 Sigma Aldrich G 1253 銷售的黃原膠；和 Dow Chemical ((Midland, MI)以商品名 METH0CEL 比如METH0CEL 40-202銷售的羥丙基甲基纖維素。在本發(fā)明中可以使用許多種市售的加工助劑。合適的市售的加工助劑包括，但不限于可以從 Dow Chemical (Midland, MI)購(gòu)得的 CARB0WAX 8000 和從 Union Carbide (Houston, TX)購(gòu)得的 PEG 3350o每種另外的組分的存在量可以為基于給定組合物的總重量計(jì)超過0至約60 wt%0 在某些示例性的實(shí)施方案中，當(dāng)存在時(shí)，每種另外的組分在給定組合物中的存在量為基于該組合物總重量計(jì)約0. 01wt%至約50 wt%，更通常地為約0. 05 wt%至約40 wt%，并且甚至更通常地為約0. 1 wt%至約30 wt%。B.組合物形式
本發(fā)明的組合物可以配制成具有一種或多種下述形式。1.粉末
本發(fā)明的組合物可以配制成粉末混合物。
2.液體和懸浮液
本發(fā)明的組合物也可以配制成具有液體基質(zhì)和懸浮在該液體基質(zhì)中的顆粒材料的溶液、分散液或懸浮液。. .3.糊劑和乳膏劑
本發(fā)明的組合物可以配制形成糊劑比如牙膏或乳膏劑。4.氣霧劑
本發(fā)明的組合物可以配制形成氣霧劑。II制備組合物、無機(jī)涂層和涂布的基質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備包含酶和能夠與該酶反應(yīng)形成無機(jī)涂層物質(zhì)的前體物質(zhì)的組合物的方法。所述制備組合物的方法可以包括形成包括如下組分的混合物(i)酶，和(ii) 前體物質(zhì)，其能夠與所述酶反應(yīng)形成無機(jī)涂層物質(zhì)。可以進(jìn)一步將一種或多種另外的組合物組分加入到包括本文公開的一種或多種組分的任意組合的混合物中。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，制備組合物的方法包括形成口腔護(hù)理組合物，其中所述方法包括形成包含下述組分的混合物酶；前體物質(zhì)，其能夠與所述酶反應(yīng)形成無機(jī)涂層物質(zhì)；和保護(hù)劑，其從化學(xué)上或物理上保護(hù)所述酶免于接觸該混合物內(nèi)的所述前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與所述前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。制備口腔護(hù)理組合物的方法可以進(jìn)一步包括向所述混合物中加入至少一種另外的成分，其中所述至少一種另外的成分包括，但不限于加速劑、促進(jìn)劑、活化劑、磨擦劑、拋光劑、牙齒增白劑、呼吸清新劑、調(diào)味劑或甜味齊U、 芳香劑、著色劑、PH調(diào)節(jié)劑、抗微生物劑、發(fā)泡劑、增稠劑、用于將酶結(jié)合至另一種組合物組分的雙功能連接劑、生產(chǎn)加工助劑、填充材料、含氟化物物質(zhì)、含磷化合物、清潔劑、水及其任意組合。示例性的口腔護(hù)理組合物可以包括或與任何口腔護(hù)理物質(zhì)或裝置一起使用，其包括但不限于牙膏、口香糖、嗽口水、牙刷、護(hù)齒器或牙托、牙齒貼片、牙齒排列矯正器、食品、飲料、糖錠、或其它可食用物質(zhì)，及其組合。組合物的制備方法可以包括形成口腔護(hù)理組合物，其中所述口腔護(hù)理組合物包括牙膏。制備牙膏的方法可以包括形成包含下述組分的混合物酶，和能夠與該酶反應(yīng)形成無機(jī)涂層物質(zhì)的前體物質(zhì)。制備牙膏的方法可以進(jìn)一步包括向該混合物中加入一種或多種另外的成分，其中所述一種或多種另外的成分可以包括，但不限于保護(hù)劑，含磷化合物、清潔劑、拋光劑、磨擦劑、加速劑、促進(jìn)劑、活化劑、抗微生物物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、生色添加劑、香味劑、含氟化物物質(zhì)、生產(chǎn)加工助劑、增稠劑、填充材料、水、本文公開的任何其它組分和本文公開的組分的任何組合，其中所述保護(hù)劑從化學(xué)上或物理上分開所述酶與該混合物之內(nèi)的前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與所述前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，將至少一種保護(hù)劑加入到該混合物中，其中所述至少一種保護(hù)劑從化學(xué)上或物理上分開所述酶與該混合物中的前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。通常，至少一種保護(hù)劑將存在于該混合物中的一種或多種酶包封。然而，在某些實(shí)施方案中，可以使用一種或多種保護(hù)劑包封一種或多種酶、一種或多種前體物質(zhì)或兩
者ο當(dāng)使用一種或多種保護(hù)劑時(shí)，化學(xué)分離所述酶與前體物質(zhì)的方法包括將一種或多種酶鍵合到組合物中的一種或多種組分，比如一種或多種保護(hù)劑。這樣的鍵可以是分子內(nèi)鍵，比如共價(jià)鍵或離子鍵，或分子間鍵，比如氫鍵或偶極與偶極鍵(例如范德華力)。例如，
12酶可以共價(jià)鍵合保護(hù)劑或經(jīng)由氫鍵鍵合保護(hù)劑。在其它示例性的實(shí)施方案中，可以使用雙功能的連接劑將一種或多種酶鍵合到組合物中的一種或多種組分，比如一種或多種保護(hù)劑。所述保護(hù)劑可以是化學(xué)惰性的或反應(yīng)性的，并且可以是有機(jī)的或無機(jī)的。保護(hù)酶或前體也可以通過改變pH來實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，制備組合物的方法可以進(jìn)一步包括將納米球引入組合物中， 比如由可生物降解的聚合材料比如聚交酯形成的納米球。在該實(shí)施方案中，一種或多種酶可以直接地或經(jīng)由雙功能連接劑鍵合到聚交酯納米球的表面。例如，所述雙功能連接劑可以包括包含次氮基三乙酸基團(tuán)的聚合物，所述次氮基三乙酸基團(tuán)經(jīng)由絡(luò)合至連接組氨酸標(biāo)記的多肽鍵合到所述酶，所述多肽比如包括動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y結(jié)構(gòu)域的多肽，其與在例如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3中顯示的序列具有至少25%的序列相似性。在其它的實(shí)施方案，所述酶鍵合至無機(jī)材料，比如金屬氧化物(例如二氧化硅顆粒)。所公開的形成組合物的方法可以進(jìn)一步包括使一種或多種酶和一種或多種前體物質(zhì)彼此接觸，以便(i)使酶與前體物質(zhì)反應(yīng)，和(ii)形成無機(jī)涂層物質(zhì)。使一種或多種酶與一種或多種前體物質(zhì)接觸的步驟可以包括例如化學(xué)地或物理地從該組合物混合物之內(nèi)的酶或前體物質(zhì)中轉(zhuǎn)移和/或除去保護(hù)劑。轉(zhuǎn)移和/或除去保護(hù)劑可以包括例如利用機(jī)械作用(例如，經(jīng)由刷牙步驟期間的機(jī)械摩擦)以物理方式轉(zhuǎn)移保護(hù)劑，或通過增溶和/ 或降解保護(hù)劑(例如，經(jīng)由刷牙步驟期間與唾液中的淀粉酶接觸)除去保護(hù)劑。從所述酶或前體以化學(xué)方式除去保護(hù)劑可以通過反應(yīng)、調(diào)節(jié)溫度或PH等來進(jìn)行。本發(fā)明還涉及形成涂層的方法和形成涂布的基質(zhì)的方法。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，公開了一種形成涂層的方法，其中所述方法包括將任一種上述組合物施加于基質(zhì)上。 得到的帶涂層的基質(zhì)包括用如上所述混合物(即，反應(yīng)前或反應(yīng)后)至少部分地涂布的基質(zhì)。形成涂層的方法可以進(jìn)一步包括在將所述組合物/混合物施加于基質(zhì)上之前或之后， 使一種或多種酶與一種或多種前體物質(zhì)接觸的步驟。形成涂布的基質(zhì)的方法可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)另外的制備步驟。合適的另外的制備步驟包括，但不限于從涂布的基質(zhì)中除去任何未反應(yīng)的混合物組分(例如，經(jīng)由漂洗或洗滌步驟)，再將任一種上述混合物施加于涂布的基質(zhì)上(即，該混合物與最初或之前施加的組合物/混合物相同或不同)，使一種或多種酶與隨后施加的組合物/混合物之內(nèi)的一種或多種前體物質(zhì)反應(yīng)，并重復(fù)任一個(gè)上述步驟。優(yōu)選的是，得到的無機(jī)涂層物質(zhì)、涂層和涂布的基質(zhì)(即，涂層在其上)包括(更優(yōu)選的是，“基本上由其組成”，最好是“由其組成”)非晶形二氧化硅(二氧化硅)、羥基磷灰石或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，形成涂布的基質(zhì)的方法包括至少部分地涂布具有外表面、內(nèi)表面或兩者的牙齒。形成涂布的牙齒的方法得到至少部分地蓋住牙齒的外表面、內(nèi)表面或外表面和內(nèi)表面兩者的涂層。在任一種上述的方法中，所述酶最好包括硅聚合酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和/ 或具有低聚谷氨酸酯序列的多肽，所述前體物質(zhì)最好包括金屬氧化物，比如二氧化硅、硅酸鹽、硅酸、硅醇鹽和/或具有通式Si (R1)ffl(R2)n(R3)p(R4)q的化合物、其縮合產(chǎn)物和/或這些物質(zhì)混合物，其中R1A2A3和R4各自獨(dú)立地包括OHC1至C12烷烴基，或C1至C12烷氧基；m、n、p和q各自獨(dú)立地為0或1至4的整數(shù)；和(m + η + ρ + q) = 4。典型地，所述酶包括硅聚合酶，比如硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-γ ；包含動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Υ結(jié)構(gòu)域的多肽，其與下述SEQ ID No. 1或 SEQ ID No. 3所示的序列具有至少25%的序列相似性；或與其同源的多肽。在其它的實(shí)施方案中，所述酶包括包含硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y結(jié)構(gòu)域的上述多肽， 其與如在SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3中所顯示的序列和低聚谷氨酸酯序列具有至少25% 的序列相似性。典型地，所述前體物質(zhì)包括硅酸、單烷氧基硅烷三醇、二烷氧基硅烷二醇、三烷氧基甲硅烷醇、四烷氧基硅烷及硅酸的螯合復(fù)合物。進(jìn)一步，在任一種上述方法中，所述方法可以進(jìn)一步包括向所述混合物中加入一種或多種含磷化合物。一種或多種含磷化合物可以進(jìn)一步與一種或多種酶反應(yīng)，形成羥基磷灰石。在形成其中基質(zhì)為牙齒的涂布的基質(zhì)的方法中，該混合物最好包括一種或多種含磷化合物。合適的含磷化合物包括，但不限于磷酸鹽，比如磷酸鈉、磷酸二鈉、磷酸三鈉、磷酸四鈉、偏磷酸鈉、三磷酸五鈉、單氟磷酸鈉、單氟磷酸鹽、十二烷基磷酸鈉(月桂基磷酸鈉)、磷酸鈣鈉、磷酸四鉀、三磷酸五鉀、焦磷酸二鈉、焦磷酸四鈉、焦磷酸四鉀、磷酸錫(磷酸亞錫)和焦磷酸錫(焦磷酸亞錫)。本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括至少一種保護(hù)劑，其從化學(xué)上或物理上分開所述酶與給定混合物中的前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。保護(hù)劑可以比如通過包封、分離或包含所述酶而從物理上分離所述酶。保護(hù)劑也可以比如通過分子內(nèi)鍵合或分子間鍵合或位阻等而從化學(xué)上保護(hù)所述酶。通常，當(dāng)存在時(shí)，使用一種或多種保護(hù)劑保護(hù)酶，而不保護(hù)前體物質(zhì)；然而，可以使用一種或多種保護(hù)劑單獨(dú)地保護(hù)酶、單獨(dú)地保護(hù)前體物質(zhì)或同時(shí)保護(hù)酶和前體物質(zhì)。一種用于化學(xué)上分開酶與前體物質(zhì)的示例性的方法可以包括將一種或多種酶鍵合到組合物中的一種或多種組分，比如一種或多種保護(hù)劑。這樣的鍵可以是分子內(nèi)鍵，比如共價(jià)鍵或離子鍵，或分子間鍵，比如氫鍵或偶極與偶極鍵(例如， 范德華力)。例如，酶可以共價(jià)鍵合保護(hù)劑或經(jīng)由氫鍵鍵合保護(hù)劑。在其它示例性的實(shí)施方案中，可以使用雙功能的連接劑將一種或多種酶鍵合到組合物中的一種或多種組分，比如一種或多種保護(hù)劑。所述保護(hù)劑可以是化學(xué)惰性的或反應(yīng)性的，并且可以是有機(jī)的或無機(jī)的。保護(hù)酶或前體也可以通過改變PH來實(shí)現(xiàn)。[00891合適的保護(hù)劑包括，但不限于聚交酯、聚乙烯醇、海藻酸鹽、共聚物比如聚 (丙交酯-共己內(nèi)酯。最好是，保護(hù)劑是⑴水溶性的，( )在唾液存在下可降解的， 或( )同時(shí)具有⑴和(ii)。本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種能夠增強(qiáng)酶促反應(yīng)的促進(jìn)劑、加速劑或活化劑，以及如本文提及的其它另外的組分。III.應(yīng)用/用途
如上討論的，本發(fā)明的組合物可以用于在基質(zhì)上形成涂層。合適的基質(zhì)包括，但不限于牙齒、骨等。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于形成生物活性的口腔護(hù)理產(chǎn)品，其封閉和保護(hù)硬的牙齒組織(釉質(zhì)/牙質(zhì))。所述組合物引起酶催化形成由非晶形二氧化硅(生物硅)組成的納米層，因而，閉合了釉質(zhì)/牙質(zhì)中的裂痕。對(duì)于酶催化而言，使用的多肽最好是上述包括動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y 結(jié)構(gòu)域的多肽，其與在例如SEQ ID No. 1或SEQID No. 3中顯示的序列具有至少25%的序列相似性。在某些示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于形成生物活性的口腔護(hù)理產(chǎn)品，其封閉和保護(hù)硬的牙齒組織(釉質(zhì)/牙質(zhì))，其中該組合物引起酶催化形成由非晶形二氧化硅(生物硅)和生物磷灰石組成的納米層。所述生物磷灰石與生物硅一起閉合齒面的釉質(zhì)/牙質(zhì)中的裂痕。示例性的口腔護(hù)理組合物可以包括或與任何口腔護(hù)理物質(zhì)或裝置一起使用，其包括但不限于牙膏、口香糖、嗽口水、牙刷、護(hù)齒器或牙托、牙齒貼片、牙齒排列矯正器、食品、飲料、糖錠、或其它可食用物質(zhì)，及其組合。另外，本發(fā)明的組合物可以與用于任何動(dòng)物的任何口腔護(hù)理產(chǎn)品一起使用。圖2A-2D描述使用本發(fā)明的組合物在牙齒上提供保護(hù)性無機(jī)涂層的示例性步驟。 如圖2A所示，可以將包括酶20 (例如硅聚合酶)、前體物質(zhì)(例如二氧化硅)22和含磷酸鹽化合物25的牙膏組合物10遞送到牙齒12上具有裂痕13和齲15的釉質(zhì)11周圍。在酶20 催化的第1階段中，硅聚合酶形成的二氧化硅構(gòu)建塊在釉質(zhì)11的上表面19上形成生物硅的納米級(jí)層17，部分地或完全地閉合和封閉齲污染的裂痕13，如圖2B所示。形成齲15的兼性需氧菌被切斷氧氣和葡萄糖，隨時(shí)間逐漸敗壞。如圖2C所示，磷酸鹽構(gòu)建塊在生物硅層17上形成生物羥基磷灰石18，得到層21 形式的與釉質(zhì)相同的物質(zhì)。如圖2D所示，在最終階段，二氧化硅清潔體27，比如磨擦劑或拋光金屬氧化物顆粒(沒有顯示在上圖中)，其是牙膏10的一種可能的組分，可以從釉質(zhì)11 除去任何剩余的生物羥基磷灰石層21，但是留下沉積在裂痕13之內(nèi)的生物羥基磷灰石18 的層19。本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其使有可能用二氧化硅納米層(例如，生物硅17的納米級(jí)層)獲得齒面(例如，釉質(zhì)11的上表面19)的致密和緊緊粘附的封閉，其也引起甚至最細(xì)微的裂痕的封閉。篩分酶形成的生物硅納米顆粒，以便(i)穿透最細(xì)微的裂痕，比如具有最小尺寸約20納米(nm)的裂痕，和(ii)沉積在裂痕(例如裂痕13)的側(cè)壁代表的內(nèi)表面上。與本發(fā)明中形成的酶促形成的生物硅納米顆粒相比，在許多牙膏中作為磨料存在的二氧化硅顆粒不能閉合細(xì)微裂痕，因?yàn)槠涑叽缣貏e是平均最小尺寸(例如直徑)為至少 20 nm。生物硅納米顆粒穿透并隨后形成磷灰石沉積物，閉合裂痕，生成齲的細(xì)菌比如任選的厭氧性變異葡萄球菌Staphylococcus mutans)被切斷了其需要的葡萄糖和氧氣的供應(yīng)。本發(fā)明的方法也可以利用上述酶和前體物質(zhì)形成硅化的納米球(例如，聚交酯納米球)。一種或多種上述酶可以鍵合到大量納米球(例如聚交酯納米球)的表面，并沉積在牙齒周圍。一種單獨(dú)的組合物組分可以包括一種或多種前體物質(zhì)。該一種或多種前體物質(zhì)可以被另一種物質(zhì)包封，或者以其它方式與酶活性納米顆粒分離，以便使(i)納米球 (即，位于最細(xì)微的裂痕之內(nèi))，和(ii) 一種或多種前體物質(zhì)之間接觸的時(shí)間延遲。當(dāng)反應(yīng)時(shí)，通過如下方式進(jìn)行硅化(i)在納米球的表面上形成無機(jī)涂層或部分層(例如二氧化硅殼)，或(ii)形成二氧化硅核心。作為前體物質(zhì)，可以使用任一種上述前體物質(zhì)(例如，硅酸、單烷氧基硅烷三醇、二烷氧基硅烷二醇、三烷氧基甲硅烷醇、四烷氧基硅烷、硅酸的螯合復(fù)合物)。在使用本發(fā)明的組合物的任一種上述方法中，用于酶催化(和閉合裂痕)的多肽
15包括低聚谷氨酸序列，所述酶最好包括硅聚合酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和/或具有低聚谷氨酸酯序列的多肽。進(jìn)一步，在任一個(gè)上述使用本發(fā)明組合物的方法中，用于形成無機(jī)涂層物質(zhì)(和閉合裂痕)的前體物質(zhì)包括金屬氧化物，比如二氧化硅、硅酸鹽、硅酸、硅醇鹽和/或具有通式Si (R1)m(R2)n(R3)p(R4)q的化合物、其縮合產(chǎn)物和/或這些物質(zhì)混合物，其中 R1^ R2> R3和R4各自獨(dú)立地包括OH、H、C1至C12烷烴基，或C1至C12烷氧基；m、η、ρ和q各自獨(dú)立地為0或1至4的整數(shù)；和(m + η + ρ + q) = 4。通常，所述酶包括硅聚合酶，硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-γ ；包含動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y結(jié)構(gòu)域的多肽，其與如在下述SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3中顯示的序列具有至少25%的序列相似性；或其同源的多肽。在其它的實(shí)施方案中，所述酶包括包含硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-γ結(jié)構(gòu)域的上述多肽，其與如SEQ ID No. 1或 SEQ ID No. 3顯示的序列和低聚谷氨酸序列具有至少25%的序列相似性。通常，所述前體物質(zhì)包括硅酸、單烷氧基硅烷三醇、二烷氧基硅烷二醇、三烷氧基硅烷醇、四烷氧基硅烷和硅酸的螯合復(fù)合物。在任一個(gè)上述使用本發(fā)明組合物的方法中，所述組合物可以配制成適合用作口腔護(hù)理產(chǎn)品，其為低粘性液體形式或呈高粘性糊劑或乳膏劑。所述組合物可以用于每日口腔衛(wèi)生。進(jìn)一步，所述組合物可以在醫(yī)師指導(dǎo)下以調(diào)整的劑量使用，或者可以由醫(yī)師以改良的形式用于在門診過程中修復(fù)牙齒。例如，所述酶和前體可以由醫(yī)師施用于患者牙齒，而不使用保護(hù)物質(zhì)。通過下述實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，其不應(yīng)當(dāng)解釋為以任何方式對(duì)發(fā)明的范圍施加限制。相反，應(yīng)當(dāng)清楚地理解，在閱讀了本說明書之后，可以允許各種其它實(shí)施方案、修改和其等同物存在，這些實(shí)施方案、修飾和等同物對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，而不背離本發(fā)明的精神和/或所附權(quán)利要求的范圍。
實(shí)施例試驗(yàn)方法
在下述實(shí)施例中使用下述試驗(yàn)方法。硅聚合酶活性的測(cè)定
為了測(cè)定(重組)硅聚合酶的酶活性，可以應(yīng)用基于在四乙氧基甲硅烷(TEOS)水解和隨后聚合之后，測(cè)量聚合的和沉淀的二氧化硅的試驗(yàn)。在這一點(diǎn)上，通常將所述酶溶于1 ml 的MOPS緩沖液(pH 6.8)中，并與1 ml的1-4.5 mmol的四乙氧基甲硅烷溶液混合。通常在室溫下，進(jìn)行酶促反應(yīng)不同的時(shí)間。為了檢測(cè)二氧化硅產(chǎn)物，離心出所述物質(zhì)，用乙醇洗滌，并風(fēng)干。然后，用1 M的 NaOH水解沉淀物。在產(chǎn)生的溶液中，使用鉬酸鹽-支持的檢測(cè)方法(例如，從Merck Company 可獲得的硅測(cè)定法)來定量地測(cè)量釋放的硅酸鹽。二氧化硅形成的測(cè)定
可以利用多種方法(即，SEM、SDS-PAGE、在外源硅酸鈉或四乙氧基甲硅烷的存在下二氧化硅形成的鉬酸鹽測(cè)定、酶譜法等)分析硅聚合酶基因產(chǎn)物的功能活性、硅聚合酶介導(dǎo)的形成和多孔(生物)二氧化硅納米層的物理化學(xué)特性。通過用熒光染料羅丹明123染色形成的二氧化硅顆粒(即，在形成顆粒中結(jié)合熒光染料)或利用β-硅鉬酸鹽-染色系統(tǒng)(即，硅酸鹽檢測(cè)試劑“Aquaquant試劑盒”)，如公開在 Cha 等人，Natl. Acad. Sci USA 96:361-365 (1999)；和 Krasko 等人， J. Biochem. 267:4878-4887 (2000)中的，測(cè)定生物硅的形成。另外，可以利用EDX( “能量色散X射線”)分析來分析樣品。實(shí)施例1-重組硅聚合酶多肽的牛成
從寄居蟹皮海綿Suberites domuncula的cDNA庫分離出硅聚合酶-α和硅聚合酶-β 的 cDNAs，所述海綿 Suberites domuncula 是例如在 pBK-CMV 載體(從 Stratagene (La Jolla, CA)可獲得的)中生成的。利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用合適的引物，獲得對(duì)應(yīng)于成熟蛋白質(zhì)的開放閱讀框(ORF)。重組蛋白質(zhì)(硅聚合酶-α ；SEQ ID No. 1;硅聚合酶-β SEQ ID No. 3)的生成是在大腸桿菌中進(jìn)行的(盡管在酵母菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生成是另外的選擇)。將相應(yīng)的cDNA克隆在表達(dá)載體例如pQE-30中。在大腸桿菌轉(zhuǎn)化之后，用IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳吡喃糖苷)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)(如描述在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1995)中。重組蛋白質(zhì)的純化在 Ni-NTA基質(zhì)上借助組氨酸標(biāo)記進(jìn)行。(應(yīng)當(dāng)注意到在低聚組氨酸和硅聚合酶之間，可以引入對(duì)應(yīng)于腸激酶缺口位點(diǎn)的序列。然后可以用腸激酶切割融合蛋白)。使用低聚組氨酸表達(dá)載體pBAD/glllA (從hvitrogen (Carlsbad, CA)購(gòu)得)在大腸桿菌中生產(chǎn)重組硅聚合酶，其中，基于基因III的信號(hào)序列，重組蛋白質(zhì)被分泌到周質(zhì)間隙(periplasmatic space)中。利用PCR，使用下述引物(硅聚合酶-α的短形式) 擴(kuò)增編碼硅聚合酶-α的cDNA序列(S卩，如下顯示的SEQ ID No. 2) :(i)正向引物TAT CC ATG GAC TAC CCT GAA GCT GTA GAC TGG AGA ACC,和(ii)反向引物TAT T CTA GA A TTA TAG GGT GGG ATA AGA TGC ATC GGT AGC ；并克隆在pBAD/glllA中(即，插入表達(dá)載體中的限制性核酸酶Ncol和)(bal)。在大腸桿菌XLl-Blue轉(zhuǎn)化之后，用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。應(yīng)當(dāng)注意到也可以使用包括全部衍生的硅聚合酶_α蛋白(長(zhǎng)形式) 的插入片段。也使用與上述類似的方法表達(dá)硅聚合酶-β的短形式和長(zhǎng)形式(cDNA:SEQ ID No. 4 ；其衍生的氨基酸序列SEQ ID No. 3)。實(shí)施例2-重組羥磷灰石-結(jié)合硅聚合酶-α蛋白的生產(chǎn)
如下進(jìn)行重組硅聚合酶的生產(chǎn)，該重組硅聚合酶不僅由于存在6xHis標(biāo)記而可以通過 Ni-NTA金屬親和層析純化，而且由于存在SxGIu標(biāo)記具有羥基磷灰石-結(jié)合性質(zhì)。在用正向引物和反向引物生產(chǎn)修飾的硅聚合酶-α擴(kuò)增子中，使用寡核苷酸，所述正向引物包括 5’ GAA GAG GAA GAG GAA GAG GAA GAGCCT GAA GCT GTA GAC TGG 3’ (下劃線ΗΑ_ 結(jié)合 GIu標(biāo)記；雙下劃線成熟硅聚合酶蛋白質(zhì)的開始)，所述反向引物包括5’ TAG GGT GGG ATA AGA TGC ATC GGT 3’(下劃線編碼成熟硅聚合酶_ α的最后密碼子)。.在PCR步驟中， 在所有退火溫度(即，56-60°C )下，擴(kuò)增都是成功的，如圖3所示。經(jīng)由T/ A 克隆，用細(xì)菌表達(dá)載體 pTRC-His2 (從 hvitrogen (Carlsbad, CA) 購(gòu)得)進(jìn)行擴(kuò)增子的連接反應(yīng)，如圖4所示。在大腸桿菌BL21細(xì)胞(從^witrogen (Carlsbad, CA)購(gòu)得)中，進(jìn)行構(gòu)建物的克隆。分離十個(gè)菌落，每個(gè)都具有整合在其中的校
17正構(gòu)建物。最終重組蛋白質(zhì)具有下述形態(tài)
i^ZEEEEEEEEPEAVDWRTKGAVTAVKDQGDCGASYAFSAMGALEGANALAKGNAVSLSEQNΠDCSIPYGNH GCHGGNMYDAFLYVIANEGVDQDSAYPFVGKQSSCNYNSKYKGTSMSGMVSIKSGSESDLQAAVSNVGPVSVAIDGA NSAFRFYYSGVYDSSRCSSSSLNHAMVVTGYGSYNGKKYWLAKNSWGTNWGNSGYVMMARNKYNQCGIATDASYPTL KGEFEA TVEQKLISEEDLNSA VDHHHHHH
(標(biāo)記為下劃線的；載體序列為草書體的)。用1 mmol的IPTG刺激各個(gè)克隆小時(shí))，進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的合成。實(shí)施例3-各種組合物混合物的制備如下制備組合物混合物樣品A-E
通過如下方法制備組合物3A:將在實(shí)施例1中形成的酶硅聚合酶-α包封在聚交酯 (來源，城市，狀態(tài))中，以便形成具有聚交酯外殼和硅聚合酶-α內(nèi)核的球狀顆粒。實(shí)施例4-牙膏形式的組合物混合物的制備
通過形成在下表1中顯示的組分的混合物來制備適用作牙膏的組合物。表1.牙膏組合物
權(quán)利要求
1.組合物，其包括酶；前體物質(zhì)，其能夠被所述酶催化形成無機(jī)涂層物質(zhì)；和保護(hù)劑，所述保護(hù)劑將所述酶與在該混合物內(nèi)的所述前體物質(zhì)分開，以便阻止所述酶與所述前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述包含硅聚合酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和/或具有低聚谷氨酸序列的多肽。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述前體物質(zhì)包括二氧化硅、硅酸鹽、硅酸、硅醇鹽、 和/或具有通式Si (R1)ffl(R2)n(R3)p(R4)q的化合物、其縮合產(chǎn)物或這些物質(zhì)的混合物，其中 R1^ R2> R3和R4各自獨(dú)立地包括OH、H、C1至C12烷烴基，或C1至C12烷氧基；m、η、ρ和q各自獨(dú)立地為0或1至4的整數(shù)；和(m + η + ρ + q) = 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的組合物，其進(jìn)一步包括含磷化合物。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述酶、所述前體物質(zhì)和所述含磷化合物彼此反應(yīng)形成羥基磷灰石。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述含磷化合物包括磷酸鹽，比如磷酸鈉、 磷酸二鈉、磷酸三鈉、磷酸四鈉、偏磷酸鈉、三磷酸五鈉、單氟磷酸鈉、單氟磷酸鹽、十二烷基磷酸鈉(月桂基磷酸鈉)、磷酸鈣鈉、磷酸四鉀、三磷酸五鉀、焦磷酸二鈉、焦磷酸四鈉、焦磷酸四鉀、磷酸錫(磷酸亞錫)和焦磷酸錫(焦磷酸亞錫)。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述保護(hù)劑化學(xué)鍵合所述酶或前體物質(zhì)。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的組合物，其中所述保護(hù)劑包封所述酶。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的組合物，其中所述保護(hù)劑包括聚交酯。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的組合物，其中所述保護(hù)劑進(jìn)一步包括用于將所述酶或前體結(jié)合至所述保護(hù)劑的連接劑。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物是口腔護(hù)理組合物，其包括牙膏、口香糖、嗽口水、牙刷、護(hù)齒器或牙托、牙齒貼片、牙齒排列矯正器、食品、飲料、糖錠、或其它可食用物質(zhì)，及其組合。
12.涂層，其包括權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的組合物。
13.涂層，其包括由權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的組合物內(nèi)的反應(yīng)性組分之間反應(yīng)形成的反應(yīng)產(chǎn)物。
14.基質(zhì)，至少部分地被權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的組合物覆蓋。
15.基質(zhì)，至少部分地被權(quán)利要求12或13的涂層覆蓋。
16.權(quán)利要求14或15的基質(zhì)，其中所述基質(zhì)包括具有外表面、內(nèi)表面或兩者的牙齒。
17.權(quán)利要求16的基質(zhì)，其中所述涂層至少部分地覆蓋所述外表面、所述內(nèi)表面或兩者。
18.一種形成組合物的方法，所述方法包括形成包含下述組分的混合物酶；前體物質(zhì)，其能夠被所述酶催化形成無機(jī)涂層物質(zhì)；和保護(hù)劑，其從化學(xué)上或物理上分開所述酶和所述前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與所述前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。
19.一種在牙齒上形成無機(jī)涂層物質(zhì)的方法，所述方法包括 混合酶和能夠被該酶催化形成無機(jī)涂層物質(zhì)的前體物質(zhì)；和用無機(jī)涂層物質(zhì)涂布所述牙齒，在至少部分所述牙齒上形成無機(jī)涂層。
20.權(quán)利要求19的方法，其進(jìn)一步包括保護(hù)劑，其從化學(xué)上或物理上分開所述酶和所述前體物質(zhì)，以便阻止所述酶與所述前體物質(zhì)的過早反應(yīng)。
21.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)的方法，其中該混合物進(jìn)一步包括含磷化合物。
22.。
23.權(quán)利要求18至22中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括硅聚合酶；所述前體物質(zhì)包括二氧化硅、硅酸鹽、硅酸、硅醇鹽、和/或具有通式si (RiagnOgpO 山的化合物、其縮合產(chǎn)物或這些物質(zhì)的混合物，其中I^、I 2、I 3和R4各自獨(dú)立地包括OHC1至C12烷烴基，或C1 至C12烷氧基；m、η、P和q各自獨(dú)立地為0或1至4的整數(shù)；和(m + η + ρ + q) = 4。
24.權(quán)利要求19至23的任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括使所述酶與所述前體物質(zhì)接觸，以便引發(fā)所述酶和所述前體物質(zhì)之間的反應(yīng)。
25.權(quán)利要求對(duì)的方法，其中所述涂層包括羥基磷灰石。
全文摘要
本發(fā)明公開了組合物和口腔護(hù)理產(chǎn)品。本發(fā)明還公開了制備和使用組合物和口腔護(hù)理產(chǎn)品的方法。
文檔編號(hào)A61K8/66GK102231975SQ200980146714
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月24日
發(fā)明者H.C.施勒德爾, H.H.赫費(fèi)爾, J.G.米勒, M.維恩斯, P.拉克, W.E.米勒, W.格伊爾特森 申請(qǐng)人:格雷斯股份有限兩合公司