專利名稱：Drr1基因在制備抗腫瘤藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤基因治療領(lǐng)域，具體涉及DRR1基因及其編碼產(chǎn)物在制備抗腫瘤藥物及抗 腫瘤輔助藥物方面的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤基因治療的原理是將目的基因用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入耙細(xì)胞，使其表達(dá)此基因而獲得 特定的功能，繼而執(zhí)行或者介導(dǎo)對腫瘤的殺傷和抑制作用，從而達(dá)到治療之目的?；蛑委?涉及目的基因、載體及受體細(xì)胞三方面。有效的基因治療依賴于外源基因高效而穩(wěn)定的表達(dá) 。隨著人類基因組計劃的完成和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，將會有大批的腫瘤相關(guān)基因和 致癌基因被克隆并鑒定，腫瘤發(fā)病機(jī)制的分子基礎(chǔ)將被逐步闡明。這不僅為腫瘤的基因治療 提供更多的治療基因和有效的治療策略，而且也將大大拓寬腫瘤基因治療的臨床應(yīng)用前景。
細(xì)胞凋亡(apoptosis)是一切生物正常胚胎發(fā)生過程和發(fā)育過程中細(xì)胞清除的正常途徑 。這一過程的紊亂可導(dǎo)致發(fā)育異常，并給人類造成許多嚴(yán)重的疾病。許多證據(jù)表明，腫瘤 的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的失調(diào)有密切關(guān)系。腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，也與 細(xì)胞凋亡的異常有關(guān)。細(xì)胞凋亡參與了癌癥的起始過程，并對癌癥的發(fā)生起負(fù)調(diào)控作用。凋 亡調(diào)控失常的發(fā)生機(jī)制幾乎涉及細(xì)胞凋亡信號途徑的所有方面，凋亡異常對癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也 十分重要。由于腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制是腫瘤發(fā)生的一個重要原因，故通過細(xì)胞凋亡角度和機(jī) 制來設(shè)計對腫瘤的治療方法就是重建腫瘤細(xì)胞的凋亡信號轉(zhuǎn)遞系統(tǒng)，即抑制腫瘤細(xì)胞的生存 基因的表達(dá)，而激活其死亡基因的表達(dá)，以選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為目標(biāo)的基因治療已經(jīng)成為 治療惡性腫瘤的主要策略之一。
人腎癌下調(diào)基因(down-regulated in renal cell carcinoma, DRR1， GenBank NM—007177))亦稱為TU3A(Tohoku University cDNA clone A on chromosome 3)，該基因由 日本學(xué)者Horii等和美國學(xué)者Smith等分別獨(dú)立克隆和鑒定，該基因定位于染色體的3p21. 1。 Northern分析和基因芯片分析顯示，DRR1基因廣泛表達(dá)于正常的組織或細(xì)胞，而在許多癌細(xì) 胞系和原發(fā)腫瘤中表達(dá)受到抑制。DRRl基因的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可在個體發(fā)育或細(xì)胞分化時通過 變位剪接產(chǎn)生出組織或發(fā)育階段特異性的mRNA，這些mRNA剪接異構(gòu)體(splicing isoforms )編碼的各同源蛋白質(zhì)之間具有大致相同結(jié)構(gòu)或功能域，同時也具有特定的性質(zhì)差異。對 DRR1基因的功能、失活機(jī)制以及其與細(xì)胞轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系等尚不清楚，有待進(jìn)一步的深入研究。目前，尚未有將DRR1基因應(yīng)用于腫瘤基因治療的技術(shù)方案報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供人腎癌下調(diào)基因(down-regulated in renal cell carcinoma, DRR1)或DRRl基因表達(dá)產(chǎn)物在制備抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物方面的新 用途。GenBank中的人DRRl基因的序列為NM—007177。
其中，上述DRRl基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列為SEQ ID NO. 5、 SEQ ID NO. 6、 SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8所示。
其中，上述DRRl基因表達(dá)產(chǎn)物的cNDA序列如SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3 或SEQ ID NO. 4所示。
本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物。該抗腫瘤 藥物或抗腫瘤輔助藥物是由DRR1基因表達(dá)載體或DRR1基因表達(dá)產(chǎn)物作為主要活性成分并添加 藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成的。
其中，上述表達(dá)載體為真核表達(dá)質(zhì)?；虿《据d體。
其中，上述真核表達(dá)質(zhì)粒為pVAXl-DRRl。
進(jìn)一步的，上述抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物的活性成分被脂質(zhì)體所包被。 更進(jìn)一步的，上述抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物還含有腫瘤化療藥物作為活性成分。 本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種制備權(quán)利要求上述抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔 助藥物的方法。該方法包括以下步驟
a、 將DRRl基因或編碼DRRl基因表達(dá)產(chǎn)物的cDNA構(gòu)建入表達(dá)載體得到能夠表達(dá)DRRl的重 組載體；
b、 將a步驟所得的重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，擴(kuò)增制備重組載體；
c、 純化重組載體；
d、 將重組載體與脂質(zhì)體或其他輔料混合形成復(fù)合體；
e、 將步驟d產(chǎn)物制成注射劑或凍干制劑。
當(dāng)使用質(zhì)粒載體pVAX 1時，可以采用下述優(yōu)選的方法
a、 將DRRl基因或DRRl基因表達(dá)產(chǎn)物的cDNA構(gòu)建入質(zhì)粒載體pVAXl，得到能夠表達(dá)DRRl的 重組載體pVAXl-DRRl;
b、 將a步驟所得的重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，擴(kuò)增制備該重組載體；
c、 純化重組載體pVAXl-DRRl;d、 將重組載體pVAX1-DRRl與陽離子脂質(zhì)體(DOTAP:Chol)以lug : lnmol的比例混合 形成復(fù)合體，其中陽離子脂質(zhì)體(DOTAP:Chol)則是DOTAP和膽固醇(Chol)按照相同摩爾比制 備而成；
e、 將步驟d產(chǎn)物制成注射劑或凍干制劑。
其中，上述腫瘤可為鼻咽癌、肝癌、肺癌、白血病、宮頸癌或腎癌中的至少一種。 優(yōu)選的，上述腫瘤可為上皮來源的其他腫瘤。
具體而言，本發(fā)明提供了人腎癌下調(diào)基因(down-regulated in renal cell carcinoma ，DRR1)及其表達(dá)產(chǎn)物在制備抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物方面的新用途。人腎癌下調(diào)基因 表達(dá)產(chǎn)物是指其原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，及其原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在個體發(fā)育或細(xì)胞分化時通過變位剪接產(chǎn) 生出組織或發(fā)育階段特異性的mRNA，以及這些mRNA編碼的各同源蛋白質(zhì)。
DRR1基因的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可在個體發(fā)育或細(xì)胞分化時通過變位剪接產(chǎn)生出組織或發(fā)育階 段特異性的mRNA，這些mRNA剪接異構(gòu)體編碼的各同源蛋白質(zhì)之間具有大致相同結(jié)構(gòu)或功能域 ，具有相似的功能。
比如SEQ ID NO. 5所示的蛋白，其編碼cDNA序列為SEQ ID NO. l所示，是由DDR1 mRNA的 剪接異構(gòu)體l編碼；SEQ ID N0.6所示的蛋白，其編碼cDNA序列為SEQ ID NO. 2所示，是由 DDRl mRNA的剪接異構(gòu)體2編碼；SEQ ID NO. 7所示的蛋白，其編碼cDNA序列可SEQ ID NO. 3所 示是，由DDR1 mRNA的剪接異構(gòu)體3編碼；SEQ IDN0. 8所示的蛋白，其編碼cDNA序列可為SEQ ID NO. 4所示，是由DDR1 mRNA的剪接異構(gòu)體4編碼。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將DRR1基因構(gòu)建于表達(dá)載體中，將該重組表達(dá)載體與陽離 子脂質(zhì)體形成的復(fù)合體作為藥物應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的治療。其中，上述的載體為真核表達(dá) 載體，外源cDNA可以為SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示的 DRRl基因剪接異構(gòu)體。
本發(fā)明的有益效果在于創(chuàng)造性地提供了人腎癌下調(diào)基因(down-regulated in renal cell carcinoma, DRR1)基因及其編碼的產(chǎn)物在制備抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物方面的新 用途。本發(fā)明使用脂質(zhì)體包裹真核表達(dá)DRR1的重組質(zhì)粒制劑通過尾靜脈注射后能在荷瘤裸小 鼠的腫瘤組織中表達(dá)DRR1多肽并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制了腫瘤的生長。HE染色表明 治療心、肝、脾、肺、腎等重要器官無明顯損害。因此，DRRl基因重組制劑有望成為一種安 全有效的抗腫瘤藥物或者腫瘤放化療的輔助用藥，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1、質(zhì)粒載體pVAXl載體及其多克隆位點(diǎn)序列的圖譜。
圖2、 PC財廣增的DRR1 cDNA。 M: DL2000 DNA Marker (TaKaRa) ; 1: DRR1 cDNA。
圖3、為DRR1基因在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。M: GeneRular DNA ladder Mix (Fermentas); RT-PCR分析結(jié)果表明DRR1 mRNA僅在所檢測的腎細(xì)胞癌O S-RC-2細(xì)胞中有表 達(dá)，而在肺癌A549和SPC-A1、鼻咽癌HNE-1、宮頸癌HeLa、肝癌H印G2及白血病K562等細(xì)胞中 無表達(dá)。GAPDH為細(xì)胞內(nèi)管家基因，作為細(xì)胞內(nèi)總mRNA完整性的參照。
圖4、是臨床肺癌標(biāo)本的免疫組化染色。共檢測了20例非小細(xì)胞肺癌臨床標(biāo)本和2例癌 旁肺組織，其中有15例肺癌的DRR1表達(dá)缺失，在其余5例肺癌和2例癌旁組織中有表達(dá)。A代 表典型的DRR1表達(dá)缺失的肺癌；B表明DRR1蛋白在核內(nèi)有表達(dá)。C和D分別為A和B的局部(以 虛線方框表示)放大圖片。顯色底物為3， 3-二氨基聯(lián)苯胺(3， 3' -diaminobenzidine， DAB)。
圖5、表明體外轉(zhuǎn)染DRR1表達(dá)質(zhì)粒后能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長。用脂質(zhì)體 (Lipof ectamine 2000)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體(pVAXl)或重組質(zhì)粒(pVAXl-DRR1)至培養(yǎng)的A549細(xì)胞 ，轉(zhuǎn)染48 h后用MTS法測定細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒(pVAXl-DRRl)轉(zhuǎn)染組與空質(zhì) 粒載體(pVAXl)轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞相比，細(xì)胞的增值活性受到明顯抑制(P〈0.05;左圖)。
圖6、流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，表明體外轉(zhuǎn)染DRR1表達(dá)質(zhì)粒后能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長； 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果亦表明重組質(zhì)粒(pVAXl-DRRl)轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率(D)較空質(zhì)粒載體 (pVAXl)轉(zhuǎn)染組的凋亡率(C)提高了65. 1%; A和B分別代表為處理組和脂質(zhì)體 (Lipof ectamine 2000)處理組的凋亡率。
圖7、為DRR1基因表達(dá)抑制異種移植肺癌在裸小鼠體內(nèi)的生長。小鼠經(jīng)尾靜脈注射脂質(zhì) 體包裹的空質(zhì)粒載體(pVAXl)或重組質(zhì)粒(pVAXl-DRRl)，每周3次。治療約3周后，治療組 (pVAXl-DRRl)與對照組(pVAXl)相比，腫瘤的生長受到明顯的抑制(P〈0. 05)。
圖8、為動物實驗各處理組腫瘤免疫組化分析的典型結(jié)果。A、 B、 C和D分別代表來自 PBS處理組、脂質(zhì)體處理組、空載體處理組(pVAXl)以及基因治療組(pVAXl-DRRl)的腫瘤組織 ?；蛑委熃M(pVAXl-DRRl)的腫瘤組織細(xì)胞中有DRR1蛋白的表達(dá)。
圖9、為動物實驗各處理組腫瘤TUNEL分析的典型結(jié)果。結(jié)果表明，基因治療組 (pVAXl-DRRl)的腫瘤與空載體處理組(pVAXl)的相比，細(xì)胞凋亡顯著增加(P〈0. 05) 。 A、 B、 C和D分別代表來自PBS處理組、脂質(zhì)體處理組、空載體處理組(pVAXl)以及基因治療組 (pVAXl-DRR1)的腫瘤組織。
圖10、為動物實驗各處理組腫瘤TUNEL分析的結(jié)果圖。結(jié)果表明，基因治療組 (pVAXl-DRRl)的腫瘤與空載體處理組(pVAXl)的相比，細(xì)胞凋亡顯著增加。A、 B、 C和D分別代表來自PBS處理組、脂質(zhì)體處理組、空載體處理組(pVAXl)以及基因治療組(pVAXl-DRRl)的 腫瘤組織。
以下結(jié)合附圖通過對具體實施方式
的簡要描述來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這并非對本發(fā)明 的限制，本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員依據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種變型或改進(jìn)，只要基 于本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
具體實施例方式
實施例一 人DRR1 cDNA的克隆及重組載體的構(gòu)建
根據(jù)GenBank中的人DRRl基因的序列(NM—007177)，設(shè)計引物擴(kuò)增人DRR1 cDNA序列。為
了進(jìn)一步將DRR1 cDNA構(gòu)建于真核表達(dá)載體pVAXl (Invitrogen，圖l)，在引物的上、下游引
物中分別引入BamH I與Xho I酶切位點(diǎn)。 上游引物〔SEQ ID NO. 9):
^ -TATGGATCCATCTACTCGGAGATCCAGA-3';
下游引物〔SEQ ID NO. 10):
5" -TATCTCGAGTACAGCTCTCTCTCTTC-3';
下劃線示酶切位點(diǎn)。
以重組質(zhì)粒PQE30-DRR1 (由四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實驗室構(gòu)建和保存；原核表達(dá)載 體購自Qiagen公司，重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及其構(gòu)建過程已公開于Biotechnol Appl Biochem 2008;49 (Pt 1):17-23)為模板，用上述基因特異引物行PCR以擴(kuò)增DRR1 cDNA。反應(yīng)條件為 :94 。C變性30 s， 55 。C復(fù)性30 s， 72 。C延伸30 s，循環(huán)25次。PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長約450 bp的DNA片段，與理論預(yù)期大小一致(圖2)。
將上述PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl分別用BamH I /Xho I進(jìn)行雙酶切。1%瓊脂糖凝膠回 收后以T4連接酶在4 r反應(yīng)過夜，連接子轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，再經(jīng)卡那霉素抗性篩選陽性 克隆，提取質(zhì)粒行PCR和BamH I/Xho I雙酶切鑒定，最后進(jìn)行測序鑒定，得到真核表達(dá) pVAXl-DRRl。其中DRR1 cDNA的序列如SEQ ID NO. l所示，其編碼的蛋白質(zhì)序列如如SEQ ID NO. 5所示。
實施例二 DRR1基因在腫瘤細(xì)胞以及臨床腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)
通過RT-PCR的方法對DRR1基因在人鼻咽癌HNE-1、腎癌0S-RC-2、肝癌H印G2、肺小細(xì)胞肺癌A549、白血病K562以及宮頸癌HeLa等6種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。提取各細(xì)
胞的總RNA，用基因特異性引物進(jìn)行一步法擴(kuò)增。其中DRR1 cDNA的上游引物為
5'-GCTCATCAAGCCCAAGAAGC-3';下游引物為5'-GCTCTCTCTCTTCGCTGGTC-3'。細(xì)胞內(nèi)管家基因
GAPDH作為內(nèi)參，擴(kuò)增引物為5'-TCATCTCTGCCCCCTCTG-3'(上游)和
5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'(下游)。其表達(dá)的缺失情況見圖3。
應(yīng)用兔抗人DRR1多克隆抗體(由四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實驗室制備和保存，制備方 法公開于Biotechnol A卯l Biochem 2008;49 (Pt 1):17-23)，對20例臨床肺小細(xì)胞肺癌標(biāo) 本和2例癌旁肺組織中DRR1的表達(dá)進(jìn)行了免疫染色。結(jié)果表明，與2例DRR1表達(dá)正常的癌旁肺 組織相比，DRR1蛋白在15例肺癌中表達(dá)缺失(圖4)。
實施例三DRR1基因的再表達(dá)對腫瘤細(xì)胞的影響
在96孔板中接種1X1(^個A549細(xì)胞，于5% C02， 37 °(]孵箱培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合至60-70%時 ，參照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pVAXl或重組質(zhì)粒 pVAXl-DRRl，轉(zhuǎn)染48 h后吸出培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液100 yl以及20 y l四氮唑藍(lán)內(nèi) 鹽(MTS ， 3-(4，5-diethylthiazol-2-yl)-5-
(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium， i皿er salt, 購于 Promega)溶液，于5% C02， 37 °(]孵箱培養(yǎng)1 h后在酶標(biāo)儀上檢測各處理組在490 nm波長處的 吸光值(A490)。每個處理重復(fù)5次。實驗結(jié)果表明，DRR1在其表達(dá)陰性的A549細(xì)胞中重表達(dá) 后能抑制腫瘤細(xì)胞增殖(圖5)。
用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (Invitrogen)將對照質(zhì)粒pVAXl或重組質(zhì)粒pVAXl-DRRl轉(zhuǎn) 染A549細(xì)胞48 h后胰酶消化各組細(xì)胞，1000 rpm離心5 min沉淀細(xì)胞，再用PBS清洗細(xì)胞2次 ;隨即加入0.5 ml的碘化丙錠(PI)染液(5 yg/ml)重懸細(xì)胞，于4 。C避光靜置30 min后 進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做相同的處理。流式細(xì)胞分析 結(jié)果表明未處理組、脂質(zhì)體處理組、對照質(zhì)粒pVAXl以及重組質(zhì)粒pVAXl-DRRl處理組的細(xì)胞 凋亡率分別為4. 0%、 5.6%、 32. 4%和54. 5% (圖6)。
實施例四DRR1基因的表達(dá)對體內(nèi)腫瘤的生長的抑制
為證明DRR1基因的表達(dá)在體內(nèi)是否也具有抗腫瘤作用，本發(fā)明按常規(guī)方法建立了人肺小 細(xì)胞肺癌的異種移植瘤動物模型。具體是將2 X 1(^個對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于4 6周齡 雌性裸小鼠的肋腹側(cè)。待腫瘤體積達(dá)70 100 mm3時，將小鼠隨機(jī)分為以下4組(5 7只/組)進(jìn)行治療。
(1) PBS組每只小鼠尾靜脈注射PBS緩沖液300 yl/次，每周的l、 3、 5給藥，共4周
(2) Lipo組每只小鼠尾靜脈注射含有125 U g陽離子脂質(zhì)體DOTAP/Chol(由四川大學(xué) 生物治療國家重點(diǎn)實驗室制備)的PBS溶液300 yl;給藥方式和時間同上。
(3) NP組將空質(zhì)粒pVAXl與陽離子脂質(zhì)體D0TAP:Chol按照質(zhì)量比l:2. 5制備成脂質(zhì)體 -質(zhì)粒復(fù)合物溶液(300 yl);每只小鼠尾靜脈注射pVAXl質(zhì)粒2.5 mg/kg/次(50 y g/只/次 );給藥方式和時間同上。
(4) DRR1治療組將重組質(zhì)粒pVAXl-DRRl與陽離子脂質(zhì)體DOTAP/Chol按照質(zhì)量比 1:2. 5制備成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物溶液(300 y 1);每只小鼠尾靜脈注射pVAXl-DRRl質(zhì)粒2. 5 mg/kg/次(50 yg/只/次)；給藥方式和時間同上。
小鼠接種腫瘤細(xì)胞后，觀察腫瘤體積，從開始治療起用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(L) 和短徑(D)，用下列公式計算腫瘤體積腫瘤體積V(mm3盧0.52XLXD2。治療結(jié)束后的第 3天從每組中以頸椎脫臼法處死進(jìn)行腫瘤組織的分析。實驗結(jié)果表明，到治療后第3周時， DRR1治療組與對照組(NP組)的腫瘤相比生長速度明顯降低，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P〈0.05 ;圖7)。
為了驗證抗腫瘤效應(yīng)與DRR1基因的再表達(dá)之間是否具有相關(guān)性，取各組的腫瘤組織的進(jìn) 行免疫組化分析。免疫染色結(jié)果表明在治療組腫瘤細(xì)胞核中有明顯的陽性染色，而各對照組 的腫瘤組織均為陰性(圖8)，證明DRR1基因的表達(dá)是導(dǎo)致體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)的直接因素。
將各處理組的腫瘤組織進(jìn)一步用DeadEnd Fluorometric TUNEL System (Promega)進(jìn)行 檢測，結(jié)果見圖9和圖10。原位末端標(biāo)記法(TUNEL)分析結(jié)果顯示DRR1治療組凋亡細(xì)胞明顯增 加(圖10D)，而各對照組(圖10A， B， C)的腫瘤組織未見明顯的凋亡細(xì)胞。
綜上所述，本發(fā)明使用脂質(zhì)體包裹真核表達(dá)DRR1的重組質(zhì)粒制劑通過尾靜脈注射后能在 荷瘤裸小鼠的腫瘤組織中表達(dá)DRR1多肽并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制了腫瘤的生長。 HE染色表明治療心、肝、脾、肺、腎等重要器官無明顯損害。因此，DRR1基因重組制劑有望 成為一種新的抗腫瘤藥物。雖然本發(fā)明具體實施方式
只提供了肺小細(xì)胞肺癌模型中的抗腫瘤 結(jié)果，但結(jié)合實施例二的表達(dá)情況分析，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得知其在其他腫瘤的治療中也 會有效果，特別是在治療上皮來源的腫瘤中會有較好的療效。
以上實例僅是對本發(fā)明的舉例說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)本發(fā)明做出各種變型或改進(jìn) ，比如將權(quán)利要求書中各蛋白的編碼基因之間或它們與其他基因進(jìn)行組合；進(jìn)一步地，將上述組合應(yīng)用于抗腫瘤的基因治療或腫瘤放療、化療的增敏治療以及術(shù)后的輔助治療?？傊?， 只要不脫離將DRRl基因/蛋白及其變異體作為藥物而應(yīng)用于抗腫瘤的基本思想，都屬于本發(fā) 明的權(quán)利要求所要求保護(hù)的范圍。SEQUENCE LISTING
〈110> 四川大學(xué)
〈120> DRRl基因在制備抗腫瘤藥物中的用途
〈130> A090028k
〈160> 10
〈170> Patentln version 3.4
〈210> 1
〈211> 435
〈212> DNA
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial
〈400> 1
atgtactcggagatccagagggagcgggcagacattgggggcctgatggcccggccagaa60
tacagagagtggaatccggagctcatcaagcccaagaagctgctgaaccccgtgaaggcc120
tctcggagtcaccaggagctccaccgggagctgctcatgaaccacagaaggggccttggt180
gtggacagcaagccagagctgcagcgtgtcctagagcaccgccggcggaaccagctcatc240
aagaagaagaaggaggagctggaagccaagcggctgcagtgcccctttgagcaggagctg300
ctg卿cggcagc卿ggctgaaccagctggaaaaaccacc卿gaaggaagaggatcac360
gcccccgagtttattaaagtcagggaaaacctgcgg卿attgccacactgaccagcgaa420
gagagagagctgtag435
〈210> 2
〈211> 408
〈212> DNA
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial〈400> 2
atgtactcggagatccagagggagcgggcagacattgggggcctgatggcccggccagaa60
tacagagagtggaatccggagctcatcaagcccaagaagctgctgaaccccgtgaaggcc120
tctcggagtcaccaggagctccaccgggagctgctcatgaaccacagaaggggccttggt180
gtggacagcaagccagagctgcagcgtgtcctagagcaccgccggcggaaccagctcatc240
aagaagaagaaggaggagctggaagccaagcggctgcagtgcccctttgagcaggagctg300
ctg卿cggcaacagaggctgaaccaggtgggtgatgggcacccagcagggaccacgcat360
cctccagggctgtcctccagggaggagctctgctgtggccacagctag408
〈210> 3
〈211> 528
〈212> DNA
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial
〈400> 3
atgggagcagcccaggggaagaagaaaacatactctcctcaggccagatttcatagtgaa60
aatgagaagcagagacaaaatggctcagccgccatgtactcggagatccagagggagcgg120
gcagacattgggggcctgatggcccggccagaatacagagagtggaatccggagctcatc180
aagcccaagaagctgctgaaccccgtgaaggcctctcggagtcaccaggagctccaccgg240
gagctgctcatgaaccacagaaggggccttggtgtggacagcaagccagagctgcagcgt300
gtcctagagcaccgccggcggaaccagctcatcaagaaga卿aggaggagctggaagcc360
aagcggctgcagtgcccctttgagcaggagctgctgagacggcagc卿ggctgaaccag420
ctggaaaaaccaccagagaagga卿ggatcacgcccccgagtttattaaagtcagggaa■
aacctgcggagaattgccacactgaccagcgaagagagagagctgtag528
〈210> 4
〈211> 519
〈212> DNA
〈213> artificial〈220>
〈223> artificial 〈400> 4
atggcgc卿ggctgggcgagtgggcccgggggccctccgatgccaccgggctctaccgg60
gctgtgctgctccggtcggccgccatgtactcggagatcc卿gggagcgggcagacatt120
gggggcctgatggcccggccagaatacagagagtggaatccggagctcatcaagcccaag180
aagctgctgaaccccgtgaaggcctctcggagtcaccaggagctccaccgggagctgttc240
atgaaccacagaaggggccttggtgtggacagcaagccagagctgcagcgtgtcctagag300
caccgccggcggaaccagctcatcaagaaga卿aggaggagctggaagccaagcggctg360
cagtgcccctttgagcaggagctgctg卿cggcagc卿ggctgaaccagctggaaaaa420
ccaccagagaagga卿ggatcacgcccccgagtttattaaagtcagggaaaacctgcgg■
agaattgccacactgaccagcgaagagagagagctgtag519
〈210> 5
〈211> 144
〈212> PRT
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial 〈400> 5
Met Tyr Ser Glu lie 1 5 Ala Arg Pro Glu Tyr 20
Lys Leu Leu Asn Pro 35
Arg Glu Leu Leu Met 50
Pro Glu Leu Gin Arg
Gin Arg Glu Arg Ala Asp lie Gly Gly Leu Met
10 15
Arg Glu Trp Asn Pro Glu Leu lie Lys Pro Lys
25 30
Val Lys Ala Ser Arg Ser His Gin Glu Leu His
40 45
Asn His Arg Arg Gly Leu Gly Val Asp Ser Lys
55 60
Val Leu Glu His Arg Arg Arg Asn Gin Leu lie65
Lys Lys Lys Lys Glu 85
Glu Glii Glu Leu Leu 100
Pro Pro Glu Lys Glu 115
Glu Asn Leu Arg Arg 130
〈210> 6
〈211> 135
〈212> PRT
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial 〈400> 6
Met Tyr Ser Glu lie 1 5 Ala Arg Pro Glu Tyr 20
Lys Leu Leu Asn Pro 35
Arg Glu Leu Leu Met 50
Pro Glu Leu Gin Arg 65
Lys Lys Lys Lys Glu 85
Glu Glii Glu Leu Leu
70
Glu Leu Glu Ala
75
Arg Leu Gin Cys
Lys Arg Leu Gin Cys Pro 90 95
Arg Arg Gin Gin Arg Leu Asn Gin Leu Glu 105 110
Ala Pro Glu Phe lie Lys Val Arg
Glu Asp His 120
lie Ala Thr Leu Thr Ser 135
Glu 140
80 Phe
Lys
lie 125
Glu Arg Glu Leu
Gin Arg Glu Arg Ala Asp lie Gly Gly Leu Met 10
Pro Glu Leu lie
Arg Glu Trp Asn 25
Val Lys Ala Ser Arg Ser His 40
Arg Arg Gly Leu
Leu 15 Pro
Asn His 55
Val Leu Glu His Arg 70
Glu Leu Glu Ala
Gly 60
Arg Asn Gin Leu
Arg 75
Arg Leu Gin Cys
Lys
Lys 30
Gin Glu Leu His 45
Val Asp Ser Lys
Lys 90
Arg Arg Gin Gin Arg Leu Asn Gin Val Gly Asp
Pro
95
Gly
lie 80 Phe100
Gly His Pro Ala Gly 115
Glu Leu Cys Cys Gly 130
〈210> 7
〈211> 175
〈212> PRT
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial 〈400> 7
Met Gly Ala Ala Gin 1 5 Phe His Ser Glu Asn 20
Tyr Ser Glu lie Glu 35
Arg Pro Glu Tyr Arg 50
Leu Leu Asn Pro Val 65
Glu Leu Leu Met Asn 85
Glu Leu Gin Arg Val 100
Lys Lys Lys Glu Glu 115
Gin Glu Leu Leu Arg
Thr Thr His 120
His Ser 135
105
Pro Pro Gly Leu
Ser 125
110
Ser Arg Glu
Gly Lys Lys Lys Thr Tyr Ser Pro Gin Ala Arg 10 15 Gin Asn Gly Ser Ala Ala Met
Glu Lys Gin Arg 25
Arg Glu Arg Ala Asp lie Gly 40
Asn Pro Glu Leu
Glu Trp 55
Lys Ala Ser Arg Ser 70
His Arg Arg Gly
lie 60
His Gin Glu Leu 75
Gly Val Asp Ser
Ala 30
Gly Leu Met Ala 45
Lys Pro Lys Lys
Leu 90
Arg Arg Asn Gin
Leu Glu His Arg 105
Lys Arg Leu Gin
Leu Glu Ala 120
Arg Gin Gin Arg Leu Asn Gin Leu Glu Lys Pro
Cys 125 Leu
His Arg
80 Lys Pro 95
Leu lie Lys 110
Pro Phe Glu130 135 140
Pro Glu Lys Glu Glu Asp His Ala Pro Glu Phe lie Lys Val Arg Glu 145 150 155 160
Asn Leu Arg Arg lie Ala Thr Leu Thr Ser Glu Glu Arg Glu Leu 165 170 175
〈210> 8
〈211> 172
〈212> PRT
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial
〈400> 8 Met Ala Gin
Arg Leu Gly Glu Trp Ala Arg Gly Pro Ser Asp
1
Gly
Leu Tyr
lie Gin
Tyr
Pro
65
Met
Arg
50
Val
Arg
35
Glu
Arg
20
Glu
Arg Val Leu
Glu Glu
Leu 115
Glu 100 Glu
5
Ala
Val Leu Leu
Arg Ala Asp
Trp Asn Pro
Lys Ala Ser
Asn His Arg
Arg
85
His
Arg
70
Gly
Glu
55
Ser
lie
40
Leu
Arg
25
Gly
10
Ser
Ala Ala Met
Gly Leu Met
lie Lys Pro
His Gin Glu
Leu Gly Val
Arg Arg Arg
Ala Lys Arg
Leu 120
Asn 105 Gin
Asp
90
Gin
Leu
75
Ser
Lys
60
His
Ala
45
Lys
Cys Pro Phe
Glu 125
Tyr
30
Arg
Lys Pro Glu
Leu lie Lys
Lys 110 Gin
Ala Thr 15
Ser Glu Pro Glu
Leu Leu Asn
Arg Glu
Leu Phe
80 Leu Glii 95
Lys Lys Glu Leu
Leu Arg Arg Gin Gin Arg Leu Asn Gin Leu Glu Lys Pro Pro Glu Lys130 135 140
Glu Glu Asp His Ala Pro Glu Phe lie Lys Val Arg Glu Asn Leu Arg 145 150 155 160
Arg lie Ala Thr Leu Thr Ser Glu Glu Arg Glu Leu 165 170
〈210> 9 〈211> 28 〈212> DNA
〈213> artificial 〈220>
〈223> artificial 〈400> 9
tatggatcca tgtactcgga gatccaga 28
〈210> 10 〈211> 26 〈212> DNA
〈213> artificial 〈220>
〈223> artificial 〈400> 10
tatctcgagt acagctctct ctcttc 2權(quán)利要求
權(quán)利要求1DRR1基因或DRR1基因表達(dá)產(chǎn)物在制備抗腫瘤藥物與抗腫瘤輔助藥物中的用途。
2 根據(jù)權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于所述DRR1基因表達(dá)產(chǎn)物 的氨基酸序列為SEQ ID NO. 5、 SEQ ID NO. 6、 SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8所示。
3 根據(jù)權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于所述DRR1基因表達(dá)產(chǎn)物 的cNDA序列如SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示。
4 根據(jù)權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于所述腫瘤上皮來源的腫瘤。
5 根據(jù)權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于所述腫瘤為鼻咽癌、肝 癌、肺癌、白血病、宮頸癌或腎癌中中的至少一種。
6 一種抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物，是由DRR1基因編碼的蛋白或 DRR1基因表達(dá)載體作為主要活性成分添加藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成。
7 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物，其特征在于 :所述表達(dá)載體為真核表達(dá)質(zhì)?；虿《据d體。
8 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物，其特征在于 :所述藥物組合物的活性成分被脂質(zhì)體所包被。
9 根據(jù)權(quán)利要求6 8任一項所述的抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物， 其特征在于還含有腫瘤化療藥物作為活性成分。
10 一種制備權(quán)利要求7所述抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物的方法， 其特征在于包括以下步驟a、 將DRRl基因或編碼DRRl蛋白的cDNA構(gòu)建入表達(dá)載體，得到能夠表達(dá)DRR1的重組載體b、 將a步驟所得的重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，擴(kuò)增制備該重組載體；C、純化重組載體；d、 將重組載體與脂質(zhì)體或其他輔輔助性成分混合形成復(fù)合體；e、 將步驟d產(chǎn)物制成注射劑或凍干制劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于腫瘤基因治療領(lǐng)域，具體涉及DRR1基因在制備抗腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明提供了新的腫瘤基因治療的技術(shù)方案。該技術(shù)方案提供了DRR1基因及其編碼蛋白在制備抗腫瘤藥物與抗腫瘤輔助藥物中的用途。動物實驗結(jié)果表明DRR1的表達(dá)通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而顯著抑制異種移植腫瘤的生長。本發(fā)明將以脂質(zhì)體包裹的表達(dá)的重組表達(dá)載體經(jīng)靜脈注射給藥，能夠延長DNA藥物在體內(nèi)降解時間，抑瘤作用明顯。DRR1重組制劑具有生產(chǎn)簡單且使用方便的特點(diǎn)，將對腫瘤特別是上皮來源腫瘤的治療有重要意義。
文檔編號A61K48/00GK101474413SQ200910300378
公開日2009年7月8日 申請日期2009年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日
發(fā)明者勸 劉, 梁淑芳, 趙新宇, 魏于全 申請人:四川大學(xué)