專利名稱：：抗a型肉毒毒素的人源性中和抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗A型肉毒毒素的中和抗體，具體地說是耙向抗A型肉毒毒素的特異性人源中和單克隆抗體及一種混合抗體。
背景技術(shù)：
：肉毒梭菌(aoW〃W/ww6o加/fm^)是一種厭氧的、革蘭氏陽性的孢子形成菌，肉毒毒素(botulinumneurotoxin,BoNT)是由肉毒梭菌分泌的一種神經(jīng)毒素，它可以作用于周圍運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢，神經(jīng)肌肉接點(diǎn)即突觸處，抑制突觸前膜釋放神經(jīng)介質(zhì)——乙酰膽堿，從而引起肌肉松馳性麻痹。食品污染、嬰兒腸道感染及傷口感染是引起人類肉毒毒素中毒的主要原因[2]。肉毒毒素(BoNT)作為目前已知毒性最強(qiáng)的細(xì)菌蛋白質(zhì)，共分為A-G七種血清型，其中A型肉毒毒素相比其它型可引起更嚴(yán)重的中毒癥狀和導(dǎo)致更高的死亡率。肉毒毒素?zé)o論是作為生物武器，還是作為生物恐怖戰(zhàn)劑，或者是偶爾肉毒中毒及突發(fā)事件，其潛在的危害不可估計(jì)。國家在制定防御策略時(shí)必須考慮肉毒毒素的預(yù)防和治療問題。因此，進(jìn)行肉毒毒素的防治研究無論是對(duì)國家生物安全、公共衛(wèi)生安全及人民生命健康安全都具有重要現(xiàn)實(shí)意義和巨大社會(huì)價(jià)值。隨著國際恐怖主義活動(dòng)的閂益猖獗，各國對(duì)于肉毒毒素中毒的防治也愈加重視。由于疫苗只能在中毒前發(fā)揮有效的預(yù)防作用，而肉毒毒素的中和抗體既可以在中毒前起到短期預(yù)防的效果，更可以在中毒后使用達(dá)到治療的目的，因此A型肉毒毒素中和抗體的研制不管對(duì)于普通民眾肉毒中毒的治療還是對(duì)于國家防御都具有重要意義。目前治療肉毒毒素的方法是使用馬源的抗毒素血清，但由于馬血清的異源性、費(fèi)用高、生產(chǎn)周期長等缺點(diǎn)，在一定程度上限制了它的應(yīng)用。而研制具有中和作用的人源基因工程抗體成為目前人們研究的主要方向。許多實(shí)驗(yàn)室獲得肉毒毒素中和抗體的方法是首先通過鼠雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體，然后對(duì)這些鼠源抗體進(jìn)行基因工程改造，使之能滿足人體使用的需要。但是這些抗體在人源化改造過程中往往存在親和力及活性下降等一系列問題。隨著抗體庫技術(shù)的F1漸成熟，應(yīng)用噬菌體抗體庫展示技術(shù)、酵母展示技術(shù)及核糖體展示技術(shù)等直接獲得親和力高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、中和活性高的人源中和抗體，成為目前獲得肉毒毒素基因工程中和抗體的主要方法，特別是利用噬菌體抗體庫技術(shù)制備人源性抗體是一種比較簡單、快速且經(jīng)濟(jì)的方法。隨著噬菌體抗體庫技術(shù)的快速發(fā)展，從大容量人噬菌體抗體庫中篩選制備中和性抗體具有很多優(yōu)勢首先它的快速、高通量篩選更利于在較短時(shí)間內(nèi)篩選到大量的候選克隆；其次由于抗體庫的容量較大，理論上更容易篩選到高親合力的特異性抗體；再次從人噬菌體抗體庫中篩選到的抗體均為人源抗體，不需要經(jīng)過改造便可直接應(yīng)用于人體。目前肉毒毒素基因工程中和抗體的研發(fā)均處于實(shí)驗(yàn)室研究或臨床前的中試生產(chǎn)階段，還沒有一種中和性抗體被批準(zhǔn)上市。肉毒毒素中和抗體的研制之所以比較困難，其中重要的一點(diǎn)就是目前所獲得的中和抗體，不論親和力多高，單一抗體均不能很好地完全中和毒素，而兩個(gè)或三個(gè)抗體聯(lián)合使用則會(huì)大大提高中和活性，這可能與毒素本身具有多個(gè)受體結(jié)合區(qū)有關(guān)。針對(duì)肉毒毒素與受體細(xì)胞結(jié)合的雙受體多表位的特點(diǎn)，必須研制多株具有不同表位的抗體進(jìn)行聯(lián)合使用，才能達(dá)到完全封閉結(jié)合表位的作用，從而起到較好的中和保護(hù)效果。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題和空白，本發(fā)明的目的在于提出兩種無需經(jīng)人源性改造即可直接應(yīng)用于人體的高親和性、高中和性抗A型肉毒毒素人源性中和抗體。本發(fā)明的另一目的在于，提出上述抗A型肉毒毒素人源性中和抗體的新應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明思路及技術(shù)方案為以A型肉毒毒素保護(hù)性抗原He為篩選抗原，通過對(duì)庫容量達(dá)到1.35x1010的大容量全合成人噬菌體單鏈抗體庫進(jìn)行篩選，在篩選方法上進(jìn)行了改進(jìn)，通過固相篩選、夾心法篩選及固相競爭篩選三種不同篩選方式共獲得兩個(gè)具有體內(nèi)外中和活性且針對(duì)不同抗原表位的A型肉毒毒素特異性抗體CIO、1B6，從而為A型肉毒毒素的中毒治療提供有效的治療手段。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明的具體技術(shù)方案為一種抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體，該抗體是針對(duì)A型肉毒毒素的抗體，其輕鏈CDR3區(qū)含有如序列表SEQIDNo.l所示序列的90-99位氨基酸殘基序列，其重鏈CDR3區(qū)含有如序列表SEQIDNo.2所示序列的99-106位氨基酸殘基序列。上述的一種抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體，其中，該抗體輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQIDNo.l所示，重鏈可變區(qū)基因序列如SEQIDNo.2所示。一種抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體，其中，該抗體是針對(duì)A型肉毒毒素的抗體，其輕鏈CDR3區(qū)含有如序列表SEQIDNo.3所示序列的90-99位氨基酸殘基序列，其重鏈CDR3區(qū)含有如序列表SEQIDNo.4所示序列的99-108位氨基酸殘基序列。上述的一種抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體，其中，該抗體輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQIDNo.3所示，重鏈可變區(qū)基因序列如SEQIDNo.4所示。上述抗體的形式可以為單鏈抗體、雙價(jià)抗體、Fab抗體和全抗體形式中的任何一種。上述的抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體在制備短期預(yù)防肉毒毒素疫苗中的應(yīng)用。上述的抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體在制備治療肉毒毒素中毒藥物中的應(yīng)用。另一種抗A型肉毒毒素的人源性中和混合抗體，其是由上述兩種抗體混合而成。所述混合抗體在制備短期預(yù)防肉毒毒素疫苗中的應(yīng)用。所述混合抗體在制備治療肉毒毒素中毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有針對(duì)A型肉毒毒素的中和抗體相比有以下優(yōu)點(diǎn)①首次從全合成人噬菌體抗體庫中篩選獲得的A型肉毒毒素中和抗體。②本發(fā)明公開的兩種抗體及其混合抗體均為人源抗體，無需經(jīng)人源化改造便可直接應(yīng)用于人體，簡化了制備步驟，降低了制備成本，克服了異源性抗體的缺陷，達(dá)到了很好的親和力。③C10全抗體的親和力高達(dá)6.46X10—"M，可完全滿足臨床使用要求。④C10和1B6抗體單獨(dú)使用及兩個(gè)抗體聯(lián)合使用時(shí)均具有較好的體內(nèi)外中和活性。上述內(nèi)容已經(jīng)充分的說明了本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩敘述，以使公眾對(duì)
發(fā)明內(nèi)容有更深入的了解，具體實(shí)施方式的實(shí)施例均為最佳的技術(shù)方案，而并非對(duì)本發(fā)明的限制。圖1為CIO和1B6單克隆抗體的特異性檢測的柱形圖。圖2為競爭ELISA法檢測C10和1B6針對(duì)不同抗原結(jié)合表位的柱形圖。從圖中的結(jié)果可以看到，CIO自身不同形式的抗體可以競爭抑制抗體與抗原的結(jié)合，而1B6和C10抗體之間不能互相競爭抑制與抗原的結(jié)合，說明C10和1B6這兩株抗體是針對(duì)不同抗原結(jié)合表位的抗體。圖3為采用細(xì)胞免疫熒光檢測法在熒光顯微鏡下觀察到的CIO(圖3B為綠色熒光代表有結(jié)合)和1B6(圖3C為綠色熒光代表有結(jié)合)全抗體對(duì)BoNT/A-Hc與PC-12細(xì)胞結(jié)合的抑制作用(注圖3A為紅色熒光為BoNT/A-Hc，3D為紅色熒光為BoNT/A-Hc+無關(guān)抗體對(duì)照)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l兩種A型肉毒毒素人源性中和抗體的獲得一.從大容量全合成抗體庫中篩選獲得A型肉毒毒素特異性抗體CIO本發(fā)明中所涉及的抗體庫由發(fā)明人構(gòu)建獲得，為本發(fā)明抗體序列的直接來源，其構(gòu)建過程為選擇部分使用頻率較高的人抗體胚系基因家族的框架區(qū)基因進(jìn)行人工合成，選用占k鏈可變區(qū)基因42.7%的Vk3和32.2%的Vk1，占入鏈基因30.5%的V人3和占28.6%的V人1，占重鏈可變區(qū)基因39.8%的VH3和占16.7%的VH5。在進(jìn)行框架區(qū)基因的設(shè)計(jì)時(shí)，首先根據(jù)報(bào)道的框架區(qū)的氨基酸序列轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的核苷酸序列，在轉(zhuǎn)換過程中，按照大腸桿菌優(yōu)勢密碼子進(jìn)行轉(zhuǎn)換。同時(shí)人工設(shè)計(jì)合成半隨機(jī)CDR3,通過重疊拼接延伸PCR的方法合成抗體基因。然后利用限制性內(nèi)切酶SfiI、NotI分別雙酶切抗體基因和噬菌體展示載體。連接后的重組噬粒通過電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1，構(gòu)建而成。以純化的BoNT/A-Hc蛋白為抗原，以PBS為陰性對(duì)照，對(duì)大容量全合成抗體庫共進(jìn)行了三輪固相篩選，第一輪的具體篩選方法為A)抗原包被包被濃度為10"g/mL，包被量為lmL，4。C包被18h以上。PBS洗滌2遍，2min/次，之后用1%酪蛋白37°C封閉2h。B)結(jié)合按照庫容量的50倍以上計(jì)算噬菌體抗體庫投入量，將抗體庫用0.5%酪蛋白和0.l%Tween20于37°C預(yù)封閉30min,加入封閉后的免疫管中，37°C作用lh，轉(zhuǎn)入室溫作用30min(輕搖)。C)洗滌用PBST洗滌10次，PBS洗滌5次，3min/次。D)洗脫用Ph2.2的0.1MHC1-Glycin(鹽酸甘氨酸緩沖系統(tǒng))洗脫，室溫?fù)u動(dòng)10min，吸出洗脫液，lMTris中和至PH7.4，將免疫管用對(duì)1.2mL數(shù)生長期的XL1-Blue直接感染，同時(shí)將HCl-Glycin洗脫的噬菌體用9倍體積的XL-Blue進(jìn)行感染。兩者均室溫感染10min，轉(zhuǎn)入37°C、150rpm培養(yǎng)lh,取1%、0.1%、0.01%涂板計(jì)算產(chǎn)出量。剩余部分混合離心后濃縮到為lmL，分別涂于3—5塊大培養(yǎng)板，37。C培養(yǎng)過夜。E)呈現(xiàn)將培養(yǎng)過夜培養(yǎng)板菌落刮下，取部分凍存，部分投入下一輪篩選。即將部分液加入到100mL2Y丁CTG(Tel:10"g/mL:Glucose:0.5%;Cm:100yg/mL)培養(yǎng)液中，使菌濃度為0D600=0.5左右，于37°C培養(yǎng)至OD600=0.7(菌量為2X108/mL)，加入50:1的輔助噬菌體M13K07,混勻后室溫靜置15min，于37°C、150rpm培養(yǎng)lh后加入等體積的2VTC(Cm:100yg/mL)，并加入Kana至50ug/mL，混勻后等分為3份，其中一份加入IPTG至終濃度為0.15mM，一份含0.25-0.5%葡萄糖，一份既不含有IPTG也不含有葡萄糖，為2YTCTKP培養(yǎng)液，三份均繼續(xù)于30。C，200rpm培養(yǎng)過夜(10—12h)。F)噬菌體上清回收次閂離心，回收噬菌體上清，加入1/4體積的PEG8000(20%PEG8000,2.5MNaCl)混勻后于冰上作用45min，10000g以上離心30min，將沉淀重懸于2—5mLPBS中(含1X酪蛋白或2。/。BSA)。取少量測定滴度，剩余-20。C保存?zhèn)溆?。G)噬菌體滴度測定取5uL待測噬菌體上清，稀釋到500uLLB培養(yǎng)基中，混勻后取5"L依次稀釋，共4次，取50uL稀釋到450uLLB中，混勻備用。取400uL稀釋的phagemid-噬菌體上清，與400"L的對(duì)數(shù)生長期的XLl-blue混合，室溫靜置感染15min，37°C，180rpm培養(yǎng)lh,取200yL鋪LBCTG平板，37°C培養(yǎng)過夜，計(jì)數(shù)菌落數(shù)并估算滴度。在第二輪篩選中，將抗原包被量降為lyg/mL，第三輪時(shí)將包被量降為0.3ng/mL，其它歩驟均與第一輪相同，三輪篩選結(jié)果見表l。表1anti-BoNT/A-Hc特異性噬菌體抗體的篩選富集情況統(tǒng)計(jì)表抗原包被量Oig/mL)投入量(cfu)產(chǎn)出量(cfu)投入/產(chǎn)出比第一輪101.25x1066.25xl(T8第二輪1lx10124.5x1054.5xl(T7第三輪0.3從表l可以看出，隨著篩選輪數(shù)的增加，獲得的噬菌體抗體逐漸獲得了富集，第三輪的投入產(chǎn)出比約為第一輪的20倍。從第三輪篩選獲得的噬菌體抗體克隆中，隨機(jī)挑取了約1000個(gè)克隆，采用噬菌體7ELISA的方法，以HRP標(biāo)記的鼠抗M13抗體為二抗，初歩鑒定陽性克隆，結(jié)果顯示與陰性對(duì)照孔相比，約70%的克隆為陽性克隆。挑取經(jīng)初歩鑒定OD492nm/630nm大于1.8的克隆，將這些克隆進(jìn)行噬菌體單克隆呈現(xiàn)后，離心收集噬菌體抗體上清，做進(jìn)一歩的特異性鑒定。以BoNT/A-Hc為陽性抗原，TNFa、ErBb2為對(duì)照抗原，以HRP標(biāo)記的鼠抗M13抗體為二抗進(jìn)行檢觀ij，ELISA顯色結(jié)果顯示，約90%的克隆特異性較高，均特異性地只與BoNT/A-Hc結(jié)合，而與其他無關(guān)蛋白不發(fā)生結(jié)合。從ELISA鑒定特異性好的陽性克隆中隨機(jī)挑取了18株克隆進(jìn)行測序，得到了5株序列不同的單鏈抗體基因H2、H3-3、CIO、Bll、3H3，測序結(jié)果顯示它們具有明顯的框架傾向性，輕鏈均為X3框架，CDR3區(qū)為10個(gè)氨基酸，重鏈均為H5框架，CDR3區(qū)為8個(gè)氨基酸，并且CDR3區(qū)中的某些氨基酸具有明顯的保守性。由于A型肉毒毒素抗體的抗原表位對(duì)于其是否具有中和活性具有很大的影響，如果所篩選到的抗體具有相同的抗原表位，則沒有必要將所有抗體均進(jìn)行進(jìn)一歩的研究。因此，又分別構(gòu)建了5株單鏈抗體不含E-tag標(biāo)簽的表達(dá)載體，與含有E-tag標(biāo)簽的單鏈抗體競爭與抗原的結(jié)合，采用競爭ELISA的方法首先驗(yàn)證了測序得到的5株單鏈抗體的抗原表位是否一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，與單株抗體的顯色值相比，各株抗體之間均存在不同程度的抑制作用，說明它們的抗原表位基本一致，或互有重疊。從上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看到，C10這株單鏈抗體對(duì)其它幾株的抑制作用最為明顯。此外，在與BoNT/A-Hc抗原結(jié)合的實(shí)驗(yàn)中，在抗體量基本相同的情況下，C10的顯色值最高。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為造成這種情況的原因是C10的親和力較高，而高親和力對(duì)于抗體的中和活性具有重要影響，因此認(rèn)為C10是一株極具潛力的抗體，值得做進(jìn)一歩的研究來證實(shí)它的中和活性。在最初的篩選中，還獲得了大量的沒有測序的陽性克隆，對(duì)于這些克隆，也采用競爭ELISA的方法驗(yàn)證了它們與C10的抗原表位是否一致。選取了49株噬菌體抗體進(jìn)行了單克隆呈現(xiàn)，通過比較加入C10單鏈抗體與噬菌體抗體競爭結(jié)合抗原后，顯色值是否降低，來判斷該噬菌體抗體是否與C10具有相同的表位。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，與克隆C10自身對(duì)照相比，C10單鏈抗體對(duì)這49株噬菌體抗體中的大部分均有不同程度的抑制作用，說明它們的表位基本一致。二.C10單鏈抗體原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)通過SfiI和NotI酶切含單鏈抗體基因的噬菌體質(zhì)粒載體，回收scFv基因與相同酶切的表達(dá)載體Kil-SN相連，構(gòu)建了單鏈抗體的大腸桿菌分泌表達(dá)載體。將構(gòu)建正確的單鏈抗體表達(dá)載體Kil-SN-scFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌KS1000(DE3),采用GMM培養(yǎng)基，37'C,200rpm培養(yǎng)至OD6咖m^0.6時(shí)加入IPTG至終濃度0.005mM，30。C誘導(dǎo)過夜。通過與Kil蛋白的共表達(dá)，促進(jìn)了目的蛋白的膜穿透，在培養(yǎng)上清中獲得了目的蛋白的較高表達(dá)，目的蛋白分子量約為28KD，用HRP標(biāo)記的鼠抗E-tag抗體進(jìn)行western-blot鑒定，結(jié)果顯示該蛋白為目的蛋白，而空載體對(duì)照無條帶出現(xiàn)。三.C10全抗體真核瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)H293和L293-CL分別是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的IgG4全抗體重鏈和X鏈表達(dá)載體，已經(jīng)連接有輕重鏈的恒定區(qū)(CH、CL)。采用PCR的方法擴(kuò)增獲得C10抗體的輕重鏈可變區(qū)(VH、VL)基因，將其連接入相應(yīng)的載體，分別構(gòu)建了C10全抗體的輕重鏈表達(dá)載體。將構(gòu)建好的C10IgG4全抗體輕重鏈表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293-F細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，分別收集l-4天的表達(dá)上清，通過ELISA的方法檢測C10IgG4全抗體的瞬時(shí)表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染后72h，抗體表達(dá)量達(dá)到最高，收集表達(dá)上清，利用全抗體Fc段與ProteinA蛋白特異性結(jié)合的特性，采用HiTrapTM卬rotdnAFF預(yù)裝柱純化C10全抗體。四.從大容量全合成抗體庫中篩選獲得A型肉毒毒素特異性抗體1B6為了篩選到更多與C10單克隆抗體具有不同抗原結(jié)合表位的抗體，采用夾心法及固相競爭篩選兩種方法分別對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大容量全合成噬菌體抗體庫進(jìn)行了兩輪和三輪篩選，在夾心法篩選的第二輪中，不僅將抗原的包被量降低為2pg/mL，抗體庫投入量降低至4xl011，而且還在抗體庫中加入C10Diabody純化抗體進(jìn)行預(yù)封閉，以減少篩選過程中抗抗體的產(chǎn)生。此外，為了盡量避免重復(fù)克隆，僅進(jìn)行了兩輪篩選后，便挑取克隆進(jìn)行鑒定。其中夾心法篩選的具體步驟如下A)抗體包被以大腸桿菌純化表達(dá)的C10Diabody抗體包被免疫管，包被濃度為l(Vg/mL，包被量為lmL，4。C包被18h以上。PBS洗滌2遍，2min/次，之后用1X酪蛋白37。C封閉2h。B)抗原結(jié)合將抗原BoNT/A-Hc用含1%酪蛋白的PBST稀釋至濃度為25嗎/mL，37°C預(yù)封閉15min后，加入封閉后的免疫管中，37。C作用lh。C)抗體庫結(jié)合:按照庫容量的50倍以上計(jì)算噬菌體抗體庫投入量,將抗體庫用0.5%酪蛋白和0.1%Tween20于37°C預(yù)封閉30min，加入封閉后的免疫管中，37°C作用lh，轉(zhuǎn)入室溫作用30min(輕搖)。D)洗滌用PBST洗滌10次，PBS洗滌5次，3min/次。E)洗脫用Ph2.2的0.1MHC1-Glycin(鹽酸甘氨酸緩沖系統(tǒng))洗脫，室溫?fù)u動(dòng)10min，吸出洗脫液，lMTris中和至PH7.4，將免疫管用對(duì)1.2mL數(shù)生長期的XL1-Blue直接感染，同時(shí)將HCl-Glycin洗脫的噬菌體用9倍體積的XL-Blue進(jìn)行感染。兩者均室溫感染10min，轉(zhuǎn)入37。C、150rpm培養(yǎng)lh，取1%、0.1%、0.01°/。涂板計(jì)算產(chǎn)出量。剩余部分混合離心后濃縮到為lmL，分別涂于3—5塊大培養(yǎng)板，37。C培養(yǎng)過夜。其余歩驟同之前的固相篩選。在固相競爭法篩選與C10具有不同抗原表位抗體的過程中，采用純化的BoNT/A-Hc抗原包被酶聯(lián)板，首先用純化的C10Diabody封閉其抗原表位，然后加入抗體庫競爭結(jié)合其它的抗原表位。在第二輪篩選中，選取了比第一輪更嚴(yán)格的篩選條件，經(jīng)過兩輪篩選后，抗體庫有了少許富集，在第三輪篩選中，為了使抗體庫獲得更多富集，并且減少前兩輪篩選中產(chǎn)生的抗抗體，采用了常規(guī)固相篩選方法，并采取了更加嚴(yán)格的篩選條件，從篩選結(jié)果顯示抗體庫有了明顯的富集，約富集了6倍左右。其中固相競爭篩選的具體步驟如下A)抗原包被以純化的BoNT/A-Hc抗原包被免疫管，包被濃度為5pg/mL,包被量為lmL，4。C包被18h以上。PBS洗滌2遍，2min/次，之后用lX酪蛋白37。C封閉2h。B)C10抗體與抗原結(jié)合將純化的C10Diabody抗體用含1%酪蛋白的PBST稀釋至濃度為15pg/mL，37。C預(yù)封閉15min后，加入封閉后的免疫管中，37°C作用lh。C)PBST洗滌4次，3min/次，洗去多余的C10Diabody抗體。D)抗體庫結(jié)合:按照庫容量的50倍以上計(jì)算噬菌體抗體庫投入量，將抗體庫用0.5%酪蛋白、0.1%Tween20和2pg/mL的C10Diabody于37°C預(yù)封閉30min，加入免疫管中，37°C作用lh，轉(zhuǎn)入室溫作用30min。E)洗滌用PBST洗滌10次，PBS洗滌5次，3min/次。F)洗脫用Ph2.2的0.1MHC1-Glycin(鹽酸甘氨酸緩沖系統(tǒng))洗脫，室溫?fù)u動(dòng)10min,吸出洗脫液，lMTris中和至PH7.4，將免疫管用對(duì)1.2mL數(shù)生長期的XL1-Blue直接感染，同時(shí)將HCl-Glycin洗脫的噬菌體用9倍體積的XL-Blue進(jìn)行感染。兩者均室溫感染lOmin，轉(zhuǎn)入37。C、150卬m培養(yǎng)lh，取1%、0.1%、0.01%涂板計(jì)算產(chǎn)出量。剩余部分混合離心后濃縮到為lmL，分別涂于3—5塊大培養(yǎng)板，37。C培養(yǎng)過夜。其余歩驟同之前的固相篩選法。經(jīng)過夾心法兩輪篩選和固相競爭篩選法三輪篩選后，挑取經(jīng)兩種方法篩選后獲得的克隆，首先采用噬菌體ELISA檢測了這些克隆與BoNT/A-Hc的結(jié)合情況。大部分克隆的顯色值均高于陰性對(duì)照3倍以上，選取顯色值較高的克隆，進(jìn)一歩鑒定它們與抗原BoNT/A-Hc結(jié)合的特異性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，約50%的克隆特異性較好，只與BoNT/A-Hc抗原結(jié)合，而與其它無關(guān)抗原沒有明顯結(jié)合。選取特異性較好的10株噬菌體抗體，采取競爭ELISA的方法檢測它們與C10的抗原表位是否一致。結(jié)果顯示2G4、1B6、1D7、2G1、1G8、1G2、1E2七株抗體C10具有不同的抗原結(jié)合表位。我們對(duì)這7株特異性較好且與C10具有不同抗原表位的抗體進(jìn)行了測序，獲得了輕鏈X3、重鏈H3框架的單克隆抗體1B6。五.1B6單鏈抗體原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)表達(dá)載體構(gòu)建方法及表達(dá)歩驟同"CIO單鏈抗體原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)"六.1B6全抗體真核瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)表達(dá)載體構(gòu)建方法及表達(dá)步驟同"CIO全抗體真核瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)"實(shí)施例2競爭ELISA法檢測C10和1B6針對(duì)不同抗原結(jié)合表位BoNT/A-Hc抗原l(ig/mL，50pL/孔，4'C包被酶聯(lián)板過夜。PBST洗滌4次，5min/次。將1B6和C10噬菌體上清與C10scFv表達(dá)上清各5(^L混合后室溫孵育15min后，加入酶聯(lián)板中，37t:反應(yīng)lh，同時(shí)設(shè)噬菌體上清與Kil-SN空載體表達(dá)上清混合物為對(duì)照。PBST洗滌4次，5min/次。加入HRP-anti-M13二抗，37。C反應(yīng)30-40min。加入OPD顯色液，50pL/孑L，顯色后用2MH2S04終止，酶標(biāo)儀492nm/630nm雙波長測定光吸收值。以加入Kil-SN空載體表達(dá)上清孔的顯色值為對(duì)照，觀察加入C10scFv表達(dá)上清后，噬菌體抗體的顯色值是否下降來判斷1B6抗體與C10抗體表位是否一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，為競爭ELISA法檢測C10和1B6針對(duì)不同抗原結(jié)合表位柱形圖。從圖中的結(jié)果可以看到，C10自身不同形式的抗體可以競爭抑制抗體與抗原的結(jié)合，而1B6和C10抗體之間不能互相競爭抑制與抗原的結(jié)合，說明C10和1B6這兩株抗體是針對(duì)不同抗原結(jié)合表位的抗體。實(shí)施例3實(shí)施例1制備的兩種A型肉毒毒素人源性中和抗體的體內(nèi)外中和活性檢測一.細(xì)胞免疫熒光法檢測CIO、1B6全抗體對(duì)BoNT/A-Hc與PC-12細(xì)胞結(jié)合的抑制作用采用細(xì)胞免疫熒光法檢測了C10和1B6全抗體的體外中和活性，將C10和1B6全抗體在體外分別與抗原BoNT/A-Hc孵育一段時(shí)間，使其充分作用后，再加入到NGF誘導(dǎo)分化的PC-12細(xì)胞中，觀察C10和1B6全抗體在體外是否能夠有效地抑制BoNT/A-Hc和PC-12細(xì)胞的結(jié)合。圖1為C10和1B6單克隆抗體的特異性檢測的柱形圖。從圖中可以看出，C10和1B6單克隆抗體均能夠和BoNT/A-Hc發(fā)生特異性結(jié)合，而與無關(guān)蛋白TNFa禾口ErBb2基本不發(fā)生結(jié)合。圖3為采用細(xì)胞免疫熒光檢測法在熒光顯微鏡下觀察到的C10(圖3B為綠色熒光代表有結(jié)合)和1B6(圖3C為綠色熒光代表有結(jié)合)全抗體對(duì)BoNT/A-Hc與PC-12細(xì)胞結(jié)合的抑制作用。(注圖3A為紅色熒光為BoNT/A-Hc，3D為紅色熒光為BoNT/A-Hc+無關(guān)抗體對(duì)照)。紅色熒光是襯染，綠色熒光代表有結(jié)合。從熒光顯色結(jié)果可以看出BoNT/A-Hc單獨(dú)存在(圖3A)或加入無關(guān)抗體時(shí)(圖3D)能夠與PC-12細(xì)胞發(fā)生結(jié)合，產(chǎn)生綠色熒光，而將BoNT/A-Hc與C10和1B6全抗體在體外混合作用30min后，再加入PC-12細(xì)胞中，則看不到綠色熒光(圖3B和圖3C)，說明C10和1B6全抗體在體外能夠有效地阻止BoNT/A-Hc與受體細(xì)胞的結(jié)合，具有體外中和活性。二.C10、1B6抗體的體內(nèi)中和活性采用小鼠體內(nèi)攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)分別檢測了C10和1B6兩個(gè)抗體單株使用、兩株聯(lián)合使用時(shí)的體內(nèi)中和活性。分別將20LD5o劑量的毒素與50嗎的單株抗體或抗體混合物在體外孵育一段時(shí)間后，進(jìn)行小鼠腹腔注射，不同時(shí)間觀察記錄小鼠存活情況(表2)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，注射毒素組，小鼠在21h內(nèi)全部死亡；1B6抗體單獨(dú)使用時(shí)，可以延長小鼠致死時(shí)間，但不能完全保護(hù)20LDso劑量的毒素攻擊；C10抗體單株使用12時(shí)，可以部分保護(hù)小鼠20LD5o劑量的毒素攻擊；1B6和C10兩株抗體聯(lián)合使用時(shí)50ug抗體能夠完全保護(hù)小鼠抵御20LD5Q劑量的毒素攻擊。表2小鼠體內(nèi)攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)中不同時(shí)間小鼠存活情況統(tǒng)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本發(fā)明C10和1B6混合抗體與馬源抗毒素比較，本發(fā)明體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)可以看出，本發(fā)明抗體可以與現(xiàn)有的馬源抗毒素具有同等的功效。但是，由于馬源抗毒素受供體馬數(shù)量的限制，能提供的血清是有限的，并且對(duì)于人而言，它屬于異源蛋白，在改造的過程中往往存在親和力及活性下降等一系列問題。馬源抗毒素具有高免疫原性，易引起一些副作用，9%的人使用后可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)，而且存在潛在病毒污染等問題，應(yīng)用受到很大限制，而本發(fā)明中的基因工程的人源抗體C10和1B6可以大量地生產(chǎn)提供抗毒素而且安全性高，因此與馬源抗毒素相比有很大的優(yōu)勢。序歹U表〈110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所<120〉抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體及其應(yīng)用〈130>〈160〉4<170〉Patentlnversion3.5〈210〉<211〉〈212〉<213〉〈400〉MetAlaSer1GlyGinThrTyrAlaSer35lieTyrGlu50GlySerAsn65AlaGluAspPheSerSer<210>21111PRT人工序列1TyrGluLeuThrGinProProSerValSerValAla20Trp5ArgGluVal100Ala85PhelieThrCysTyrGinGinAspSerLysSerGlyAsn70GluArg55ThrLys40ProSer25ProGlyGlyGlyThr10510GlyAlaThrLeuTyrTyrCysSer90LysAspAlaLeuGlyGinSerGlylieThr75SerAlaPro45ProGlu60lieSerLeuThrValGly30ValTrpAspAsnLeu110AlaPro15AspLysLeuValArgPheSerGlyThrGin80AspLeu95Gly14<211〉117<212>PRT<213〉人工序列〈400〉2GkiValGln1SerLeuLysTrplieGlylie50GinGly65LeuGlnValThrTrpAlaArgTrpVal115LeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyGlu51015lieSerCysLysGlySerGlyTyrSerPheThrSerTyr202530TrpValArgGlnMetProGlyLysGlyLeuGluTrpMet4045TyrProGlyAspSerAspThrArgTyrSerProSerPhe5560SerlieSerThrAlaTyr7580ThrAlaMetTyrTyrCys95TrpGlyGlnGlyThrLeu110Gly35lieGlnValThrSerSer85ThrVal100SerSerlieSerAlaAspLys70LeuLysAlaSerAsp90LysArgPheAlaTyr105<210〉3<211>111〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉3MetAlaSerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValAlaProGlyGinThrTyrAlaSer35lieTyrGlu50GlySerAsn65AlaGluAspGinPheVal5AlaArglieThrCys20TrpTyrGinGinLys40AspSerLysArgPro55SerGlyAsnThrAla70GluAlaAspTyrTyr85ValPheGlyGlyGly10010SerGlyAspAla25ProGlyGinAlaSerThrCysThr105GlyliePro60LeuThrlie75GinValTrp90LysLeuThr15LeuGlyAspLys30ProValILeuVal45GluArgPheSerSerGlyThrGin80AspAsnGlyArg95ValLeuGly110<210〉4〈211〉119<212〉PRT<213〉人工序列<400〉4GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrProSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlalieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal50556016LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgProPheSerPheSerGlylieMetAspAspTrpGlyGinGly100105110ThrLeuVaJThrValSerSer11權(quán)利要求1、一種抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體，其特征在于，該抗體是針對(duì)A型肉毒毒素的抗體，其輕鏈CDR3區(qū)含有如序列表SEQIDNo.1所示序列的90-99位氨基酸殘基序列，其重鏈CDR3區(qū)含有如序列表SEQIDNo.2所示序列的99-106位氨基酸殘基序列。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體，其特征在于，該抗體輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQIDNo.l所示，重鏈可變區(qū)基因序列如SEQIDNo.2所示。3、一種抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體，其特征在于，該抗體是針對(duì)A型肉毒毒素的抗體，其輕鏈CDR3區(qū)含有如序列表SEQIDNo.3所示序列的90-99位氨基酸殘基序列，其重鏈CDR3區(qū)含有如序列表SEQIDNo.4所示序列的99-108位氨基酸殘基序列。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體，其特征在于，該抗體輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQIDNo.3所示，重鏈可變區(qū)基因序列如SEQIDNo.4所示。5、根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述抗體的形式可以為單鏈抗體、雙價(jià)抗體、Fab抗體和全抗體形式中的任何一種。6、根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體在制備短期預(yù)防肉毒毒素疫苗中的應(yīng)用。7、根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體在制備治療肉毒毒素中毒藥物中的應(yīng)用。8、一種抗A型肉毒毒素的人源性中和混合抗體，其特征在于，其是由權(quán)利要求2和權(quán)利要求4所述抗體混合而成。9、權(quán)利要求8所述混合抗體在制備短期預(yù)防肉毒毒素疫苗中的應(yīng)用。10、權(quán)利要求8所述混合抗體在制備治療肉毒毒素中毒藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了兩種抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體，其中一種抗體的輕鏈可變區(qū)基因如SEQIDNo.1所示，重鏈可變區(qū)基因如SEQIDNo.2所示；另一種抗體輕鏈可變區(qū)基因如SEQIDNo.3所示，重鏈可變區(qū)基因如SEQIDNo.4所示組成。它們是以A型肉毒毒素保護(hù)性抗原Hc為篩選抗原，通過對(duì)庫容量達(dá)到1.35×10¹⁰的大容量全合成人噬菌體單鏈抗體庫進(jìn)行篩選而獲得的，這兩種抗體在體外能夠抑制抗原BoNT/A-Hc與受體細(xì)胞PC-12的結(jié)合，在體內(nèi)單株使用時(shí)兩種抗體對(duì)肉毒毒素均具有很好的抑制作用，聯(lián)合使用時(shí)兩者能夠發(fā)揮協(xié)同作用，抑制作用更佳。且本發(fā)明抗體特異性強(qiáng)、親和力高，具有很好的體內(nèi)外中和活性。文檔編號(hào)A61K39/08GK101503472SQ20091008002公開日2009年8月12日申請(qǐng)日期2009年3月17日優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日發(fā)明者蕊于,余云舟,俞煒源,孫志偉,林建波,雙王申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所