專利名稱：含有中和乙型肝炎病毒的人抗體的藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有穩(wěn)定的中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗體的藥物液體制劑。
背景技術(shù)：
由于例如在長期儲存過程中，特別是當?shù)鞍妆恢瞥梢后w組合物時可溶的/不溶的 顆粒的形成，蛋白藥物傾向于降解、沉淀或構(gòu)象的改變。為了防止這樣的問題，就目的蛋白 藥物的物理性質(zhì)已經(jīng)開發(fā)各種技術(shù)以保存蛋白的功能性基團和與蛋白活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)。為了保存抗體藥物，通常使用冷凍干燥方法(W0 98/22136)。但是，在使用前儲存 冷凍干燥產(chǎn)品的過程可以帶來嚴重的不可再生性的問題。相反，主要使用液體制劑是因為 其使用的方便性。歐洲專利號73371公開了可靜脈內(nèi)注射的液體制劑，其含有維持在pH 3. 5-5. 0的 免疫球蛋白。但是，當注射時，這樣的具有低PH的制劑可以產(chǎn)生不想要的作用。美國專利號6，171，586公開了水質(zhì)抗體制劑，其含有pH 4. 48-5. 5的乙酸鹽緩沖 液、表面活性劑和多元醇。這一不含等滲控制劑的制劑也可以產(chǎn)生有害的副作用。韓國專利公開號2006-110305公開了水質(zhì)藥物制劑，其含有針對上皮生長因子受 體(EGF受體)的抗體，且所述制劑含有增強抗體長期儲存穩(wěn)定性的功能的氨基酸。另外，韓國專利公布號2006-7016023公開了含有抗EGFR抗體的高濃縮的液體制 劑，但是該制備制劑的方法包括通過超濾濃縮制劑的步驟，這使得該過程非常不經(jīng)濟。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的目的是提供一種藥物制劑，其可以在長期儲存過程中穩(wěn)定分散在液 相中的中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種藥物制劑，其含有用于預(yù)防或治療乙型肝炎 的中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗體、緩沖液、等滲調(diào)節(jié)劑和表面活性劑。
具體實施例方式本發(fā)明的制劑含有中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗體、緩沖液、等滲調(diào)節(jié)劑和表 面活性劑。本發(fā)明的液體制劑的一部分溶劑可以是水。中和HBV的人抗體可以是重組抗體，優(yōu)選地是從細胞系HBAb_49(登錄號 (Accession No.) :KCLRF-BP-00054)中產(chǎn)生的針對HBV表面抗原Ofepabig基因)的抗體。另外，抗體優(yōu)選是人抗體，其包含具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū) (Vh)和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(Vl)。本發(fā)明的制劑的抗體濃度范圍為0. l-50mg/ml，優(yōu)選地為2-lOmg/ml，最優(yōu)選為 5mg/mlο緩沖液可以是具有生理性藥物耐受性和pH控制能力的任何材料，例如檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽或其游離酸或堿的形式或其混合物。本文中的術(shù)語“混合物”包括由不同酸 衍生的鹽的混合物例如檸檬酸鹽和乙酸鹽的混合物；以及由一個酸衍生的不同鹽的混合物 例如不同檸檬酸鹽的混合物。優(yōu)選地，緩沖液可以是檸檬酸鹽、乙酸鹽或其游離酸。檸檬酸 鹽的游離酸可以包括檸檬酸、檸檬酸鹽一水合物、無水檸檬酸三鈉和檸檬酸鉀一水合物，乙 酸的游離酸可以包括乙酸、乙酸鈉和三水合乙酸鈉。在本發(fā)明的制劑中，緩沖液的濃度范圍 為 10-100mmol/l，優(yōu)選地為 2-50mmol/l，最優(yōu)選地為 20mmol/l。等滲調(diào)節(jié)劑可以是具有生理性藥物耐受性的鹽，如氯化鈉或氯化鉀，優(yōu)選地為氯 化鈉。在本發(fā)明的制劑中，等滲調(diào)節(jié)劑的范圍為20-250mmol/l，優(yōu)選地為100-200mmol/l。表面活性劑可以是通常用于藥物制劑的任何表面活性劑，優(yōu)選為聚氧乙烯失水山 梨糖醇酐脂肪酸酯(Tween 80)，例如聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯(polyoxyethylene sorbitan monolaurate)、聚氧乙煉山梨糖醇野單掠推 1 酸酉旨(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate)、聚氧乙；I；希山梨醇野單硬月旨酸酉旨(polyoxyethylene sorbitan monostearate)或聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酉旨(polyoxyethylene sorbitan monooleate)，優(yōu)選為聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯或或聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯，最 優(yōu)選為聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯。在本發(fā)明的制劑中，表面活性劑的濃度范圍為0.001-1. 0重量％。當聚氧乙烯失 水山梨糖醇酐脂肪酸酯用作制劑中的表面活性劑時，其濃度范圍為0. 005-0. 1重量％，優(yōu) 選為約0. 05重量％。另外，為了增強對胃腸外給藥的耐受性，本發(fā)明的藥物制劑具有的克分子滲透壓 濃度范圍為250-350m0smOl/kg。因此，可無遭受疼痛地將制劑直接給予至靜脈或動脈、皮下 組織或肌肉。制劑的PH可以是4. 0-7.0，優(yōu)選地為5. 0-6.0，最優(yōu)選為5.5。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施例中，藥物制劑含有10，000單位(5mg/ml)H印abig基 因、20mmol/l乙酸鹽緩沖液(pH 5. 5) U50mmol/1氯化鈉和0. 05重量％的聚氧乙烯失水山 梨醇單油酸酯。根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑可以通過將含有抗體或另一個氯化鈉溶液的乙酸鹽緩沖 液(pH5. 5)與作為補充物的其余成分混合而制備?？梢詫⑻囟▌┝康暮醒a充物的儲存溶液加入含有特定抗體量的溶液中，如果需 要，可以用水或緩沖溶液稀釋混合物至預(yù)定的濃度。另外，可以將固體形式的補充物加至含 有抗體的起始溶液中。另外，當抗體是固體形式時，例如冷凍干燥的產(chǎn)品，本發(fā)明的制劑可 以通過將抗體溶解于水中或含有至少一種成分的溶液中，然后以需要量加入含有該成分、 固體補充物和/或水的儲存溶液而制備。另外，抗體可以直接溶于含有所有成分的溶液中。在重組抗體制備的過程中或在最后的步驟中可以可選地加入本發(fā)明的藥物制劑 的至少一種成分。在本發(fā)明的一個實施例中，在最后純化步驟中將H印abig基因直接溶于 含有至少一種成分或所有成分的溶液中。另外，本發(fā)明的制劑可以可選地包括小量的具有 生理性藥物耐受性的另外的補充物例如抗氧化劑如抗壞血酸和谷胱甘肽；防腐劑如苯酚、 間甲酚、甲基-或?qū)αu基苯甲酸丙酯、三氯叔丁醇、硫柳汞和苯扎氯銨、聚乙二醇(PEG)如 PEG 400,PEG 3000,PEG 3500,PEG 4000和PEG 6000 ；二糖如海藻糖和蔗糖；或環(huán)糊精如羥 丙基-β -環(huán)糊精、磺丁基乙基-β -環(huán)糊精(sulfobutylethyl- β -cyclodextrin)、a_ 環(huán)糊 精和Y-環(huán)糊精。最優(yōu)選地，在用于抗體制備的純化的最后步驟中將另外的補充物直接溶于含有所有成分的溶液中。另外，當含有抗體和其它成分的溶液不具有想要的PH時，可以 通過加入酸或堿，優(yōu)選已經(jīng)存在于緩沖液中的酸或堿而調(diào)整PH。另外，調(diào)整了 PH的溶液可 以進行無菌過濾。本發(fā)明的藥物制劑可以容易地被制備并具有優(yōu)異的生理性藥物耐受性、高給藥準 確性和穩(wěn)定性從而使其將儲存過程中的降解產(chǎn)品和聚集體的形成最小化。本發(fā)明的制劑當 儲存在2-8°C時能夠維持抗體穩(wěn)定性1年或更長，或當儲存在25°C和60%的相對濕度時能 夠維持3個月或更長。本發(fā)明的藥物制劑可以用于預(yù)防或治療乙型肝炎，優(yōu)選用于通過中和HBV的肝移 植或慢性乙型肝炎的治療。下列實施例是為了說明本發(fā)明而不限制其范圍。比較性實施例IA =Hepabig基因制劑的制備將10，000單位的!fepabig基因(Greencross，Korea)和麥芽糖溶于蒸餾水至濃度 分別為5mg/ml和10重量％。向其中加入HCl以調(diào)整pH至4. 0。將所得溶液無菌過濾，將 濾液儲存在25°C和60%的相對濕度下。比較性實施例IB =Hepabig基因制劑的制備重復(fù)比較性實施例IA的過程，除了將溶液儲存在5°C。比較性實施例2A =Hepabig基因制劑的制備制備含有10，000單位(5mg/ml)的Hepabig基因、10mmol/l磷酸鈉緩沖液(1. 2g/ 1磷酸二氫鈉)(PH 7. 2)和150mmol/l氯化鈉的溶液，進行無菌過濾。將濾液儲存在25°C 和60%的相對濕度下。比較性實施例2B =Hepabig基因制劑的制備重復(fù)比較性實施例2A的過程，除了將溶液儲存在5°C。比較性實施例3A =Hepabig基因制劑的制備制備含有10，000單位(5mg/ml)的!fepabig基因、25mmol/l檸檬酸鹽緩沖液(包 括7. 3525g/l 二水合檸檬酸三鈉)(pH 6. 5)和150mmol/l氯化鈉的水溶液，進行無菌過濾。 將濾液儲存在25°C和60%的相對濕度下。比較性實施例3B =Hepabig基因制劑的制備重復(fù)比較性實施例3A的過程，除了將溶液儲存在5°C。比較性實施例4A =Hepabig基因制劑的制備制備含有10，000單位(5mg/ml)的!fepabig基因、20mmol/l乙酸鹽緩沖液(包括 2. 7216g/l三水合乙酸鈉)(pH 5. 5)和150mmol/l氯化鈉的水溶液，并進行無菌過濾。將濾 液儲存在25°C和60%的相對濕度下。比較性實施例4B =Hepabig基因制劑的制備重復(fù)比較性實施例4A的過程，除了將溶液儲存在5°C。實施例IA =Hepabig基因制劑的制備制備含有10，000單位(5mg/ml)的Ifepabig基因、10重量％的麥芽糖和0. 05重 量％的聚氧乙烯(80)失水山梨醇單油酸酯的水溶液，將其pH調(diào)整至4.0。將所得溶液無菌 過濾，將濾液儲存在25°C和60%的相對濕度下。實施例IB =Hepabig基因制劑的制備
5
重復(fù)實施例IA的過程，除了將溶液儲存在5°C。實施例2A =Hepabig基因制劑的制備制備含有10，000單位(5mg/ml)的Hepabig基因、10mmol/l磷酸鈉緩沖液(1. 2g/ 1磷酸二氫鈉)(pH 7. 2)、150mmol/l氯化鈉和0. 05重量％的聚氧乙烯(80)失水山梨醇單 油酸酯的水溶液，并進行無菌過濾，將濾液儲存在25°C和60%的相對濕度下。實施例2B =Hepabig基因制劑的制備重復(fù)實施例2A的過程，除了將溶液儲存在5°C。實施例3A =Hepabig基因制劑的制備制備含有10，000單位(5mg/ml)的Ifepabig基因、25mmol/l檸檬酸鹽緩沖液 (7. 3525g/l 二水合檸檬酸三鈉)(pH 6. 5)、150mmol/l氯化鈉和0. 05重量％的聚氧乙烯 (80)失水山梨醇單油酸酯的水溶液，并進行無菌過濾，將濾液儲存在25°C和60%的相對濕 度下。實施例3B =Hepabig基因制劑的制備重復(fù)實施例3A的過程，除了將溶液儲存在5°C。實施例4A =Hepabig基因制劑的制備制備含有10，000單位(5mg/ml)的！fepabig基因、20mmol/l乙酸鹽緩沖液 (2. 7216g/l三水合乙酸鈉)(pH 5. 5)、150mmol/l氯化鈉和0. 05重量％的聚氧乙烯(80)失 水山梨醇單油酸酯的水溶液，并進行無菌過濾。將濾液儲存在25°C，60%的相對濕度下。實施例4B =Hepabig基因制劑的制備重復(fù)實施例4A的過程，除了將溶液儲存在5°C。測試實施例1 制劑的穩(wěn)定性測試實施例IA至4B以及比較性實施例IA至4B的每種溶液的老化特征通過測定老 化前和老化后的蛋白的量而確定，其通過下列方法測定目測評估、吸收度測定(280nm)、 通過ELISA的滴度測定、HPLC尺寸排阻色譜法(SEC)、還原的和非還原的電泳分析 (SDS-PAGE), western印跡、等電聚集(IEF)分析和pH測定。結(jié)果顯示于表1和2中。(1)目測評估室溫在白色熒光燈下目測檢查含有樣品制劑的每個小瓶以評估溶液的顏色、外觀 和透明度。(2)蛋白的量將每個溶液稀釋5-10倍、15-30倍或更多，用分光光度計測定其吸光度(280nm)以 通過測定1. 40 (HigAiir1Cnr1的吸收系數(shù)確定蛋白的濃度。(3)滴度測定根據(jù)[ShinYW 等人，Antiviral Research, 75, pi 13-120，2007]中描述的方法測
定每個樣品的滴度。(4)通過SEC的聚集體和片段的測定使用柱(TSKG3000 SWXL , 7. 8 X 300mm), Gi 1 son 321 泵和 UV/VIS-155 系統(tǒng)進行 尺寸排阻色譜(SEC)。用流動相(50mmol/l MES, 150mmol/l氯化鈉，1. 5mole/l L-精氨酸鹽 酸鹽；pH 6. 0)稀釋樣品溶液至lmg/ml的濃度，以0. 5ml/分鐘等強度洗脫(isocratically eluted)30分鐘(注射體積50μ 1)。檢測在280nm的洗脫溶液的吸光度，使用GilsonTrillution LC 1. 4軟件進行積分。(5)電泳(SDS-PAGE)在緩沖液中在70°C加熱樣品溶液5分鐘，將5μ g所得蛋白加載至蛋白電泳凝膠 (Invitrogen, USA)上。用考馬斯將所得凝膠染色和脫色以觀察得到的條帶。(6) Western 印跡在緩沖液中在70°C加熱樣品溶液5分鐘，將1 μ g所得蛋白加載至蛋白電泳凝膠 (Invitrogen, USA)上。將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上，所述膜用5%脫 脂奶粉/PBS封閉1小時，與山羊抗人IgG過氧化物酶反應(yīng)，并用PBST洗滌3次。在此處理 TMB膜底物(KPL，USA)而使條帶顯影。(6)等電聚焦(IEF)使用Ampholine PAGplate 凝膠(pH 3. 5 9. 5)和 Multiphor II 系統(tǒng)(GE healthcare, Sweden)進行等電聚焦分析。(7) DH 泖丨定根據(jù)韓國Pharmacopoeia (第8版)通用測試方法“pH測定方法”進行樣品溶液的 PH測定。分析在25°C和60%的相對濕度下儲存達6個月的實施例IA至4A和比較性實施 例IA至4A的藥物制劑。另外，在儲存在5°C的制劑中，在達6個月的儲存期中觀察不含表面活性劑的比較 性實施例IB至4B的制劑。在達12個月的儲存期中觀察含有所有成分的實施例IB至4B 的制劑。表1 比較性實施例 表2:實施例 如在表1和2中顯示的儲存在25°C和60%的相對濕度下的實施例IA至4A，特別 是實施例4A的制劑顯示出優(yōu)異的穩(wěn)定性。另外，在不含表面活性劑并儲存在5°C的比較性實施例IB至4B的制劑中，形成了 顆粒和沉淀，含有所有成分的實施例IA至4A的制劑維持穩(wěn)定性達12個月。因此，當抗體儲存在液相中時，本發(fā)明的制劑可以長期維持抗體的穩(wěn)定性。測試實施例2 制劑安全性的測試為了測定本發(fā)明的制劑在給予人體時的安全性，通過使制劑與猴或人的血反應(yīng)而確定其溶血的可能性。具體地用相同體積的猴或人的血處理下列物質(zhì)中的每一種實施例4A(1，5或 10mg/ml)的制劑、從制劑中去除抗體的液體組合物(20mM乙酸鈉，150mM氯化鈉和0. 05 % Tween 80 ；pH 5. 5)、1 %皂角苷(陽性對照)和猴血漿(陰性對照)或人血漿(陰性對照)。 將從此獲得的化合物離心，分離上清液并通過用分光光度計測定發(fā)生溶血的紅細胞的血紅 蛋白濃度而分析上清液。結(jié)果顯示于表3中。表3:溶血的可能性 如表3中顯示的，當用猴或人血處理時，本發(fā)明的抗體不顯示溶血。另外，為了檢查本發(fā)明的制劑與血漿的相容性，將實施例4A的制劑(1，5或IOmg/ ml)或從制劑中去除抗體的液體組合物與相同體積的猴或人血漿混合，評估得到的混合物 從而判斷聚集或沉淀是否作為結(jié)果而發(fā)生。結(jié)果顯示于表4中。
表4 血漿相容性 如在表4中顯示的，本發(fā)明的制劑不與猴或人的血漿顯示任何的不相容性。因此， 本發(fā)明的制劑是安全的制劑，其不使猴或人的血溶血。測試實施例3 制劑的安全性測試為了檢查本發(fā)明的制劑在給予人時的安全性，將樣品制劑通過靜脈內(nèi)、靜脈周和 動脈內(nèi)注射進入16周大的雄性新西蘭(New Zealand)白兔(Hra (NZW) SPF兔)從而評估 局部區(qū)域的耐受性。具體地，如表5中所列，兔被分成組1和組2。對于組1中的每只兔，將1. 0ml和0. 21ml 的實施例4A的制劑(5mg/ml(10，000單位))分別注射進入左耳的靜脈(測試區(qū)C)和靜脈周(測 試區(qū)D)，對于對照組中的每只兔，將1. 0ml和0. 21ml的從制劑中去除抗體的液體組合物(20mM 乙酸鈉，150mM氯化鈉和0. 05% Tween 80 ；pH 5. 5)分別注射進入右耳的靜脈(測試區(qū)A)和靜 脈周(測試區(qū)B)。對于組2中的兔，將實施例4A的制劑(5mg/ml (10，000單位))和從制劑中去 除抗體的液體組合物(20mM乙酸鈉，150mM氯化鈉和0. 05% Tween 80 ；pH5. 5)的每種中的0. 5ml 分別注射進入左耳的靜脈(測試區(qū)F)。在各種時間點(注射前，注射后4小時、2天和3天)， 觀察3只兔的水腫或紅斑的出現(xiàn)，具有水腫或紅斑的兔的數(shù)目列在表6-9中。表5:局部耐受性測試 表6 注射前局部耐受性測試 表7 注射后4小時的局部耐受性測試 表8 注射后2天的局部耐受性測試 表9 注射后3天的局部耐受性測試 如表6-9中顯示的，在靜脈內(nèi)、靜脈周和動脈內(nèi)注射后本發(fā)明的制劑不顯示任何 嚴重的副作用。雖然已經(jīng)就上面的特定具體實施方式
描述了本發(fā)明，應(yīng)該理解的是可以做出各種 修飾和改變，所述修飾和改變也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，如接下來的權(quán)利要求所限定的。
權(quán)利要求
一種藥物制劑，其含有中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗體、緩沖液、等滲調(diào)節(jié)劑和表面活性劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其中抗體是從細胞系HBAb-49(登錄號 KCLRF-BP-00054)獲得的針對HBV表面抗原Ofepabig基因)的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其中抗體的濃度范圍是0.l-50mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其中緩沖液是檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽或其游離 酸或堿的形式，或其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑，其中緩沖液是乙酸鹽或乙酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其中緩沖液的濃度范圍是lO-lOOmmol/1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其中等滲調(diào)節(jié)劑是氯化鈉或氯化鉀。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其中等滲調(diào)節(jié)劑的濃度范圍是20-250mmol/l。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其中表面活性劑是聚氧乙烯失水山梨糖醇酐脂肪 酸酯.
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物制劑，其中表面活性劑是聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸 酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單棕櫚酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯或聚氧乙烯失水山梨 醇單油酸酯。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其中表面活性劑的濃度范圍是0.001-1.0重量％。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其進一步含有具有生理性藥物耐受性的補充物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物制劑，其中補充物是抗氧化劑、防腐劑、聚乙二醇 (PEG)、二糖或環(huán)糊精。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其具有范圍為250-350m0smOl/kg的克分子滲透 壓濃度和4. 0-7. 0的pH。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥物制劑，其中pH是5.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗體、緩沖液、等滲調(diào)節(jié)劑和表面活性劑的藥物制劑，本發(fā)明的液體制劑適合于胃腸外給藥并能夠在長期儲存過程中維持抗體的活性。
文檔編號A61K39/395GK101896199SQ200880118407
公開日2010年11月24日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者吳宣姃, 奉紀兌, 崔真設(shè), 張基奐, 徐東赫, 柳憬桓, 洪廣元, 辛庸源, 辛龍男, 金世鎬, 金判勁 申請人:株式會社綠十字