專利名稱：流感病毒的中和抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定、生產(chǎn)和設(shè)計(jì)(engineer)針對(duì)甲型流感病毒(influenza A vimses)的中和抗體的方法和手段，還涉及產(chǎn)生的中和抗體。特別是，本發(fā) 明涉及針對(duì)各種甲型流感病毒亞型的中和抗體，包括針對(duì)H1、 H2、 H3、 H5、 H7和H9中兩種或更多種(例如所有Hl 、 H2、 H3和H5亞型)的中和抗 體，還涉及用于制備所述抗體的方法和手段(means)。更具體地，本發(fā)明涉 及能夠中和多于一種，優(yōu)選所有的曱型流感病毒亞型的分離物的抗體。
背景技術(shù)：
流行性感冒(flu)是一種由流感病毒引起的傳染性呼吸系統(tǒng)疾病。其引起 輕度至重度疾病，且有時(shí)可導(dǎo)致死亡。在美國，每年有5-20%人口感染流行 性感冒，住院約200,000例，SI起約36,000例死亡。
流感病毒在由咳。軟和噴咬產(chǎn)生的呼吸飛沫(respiratory droplet)中傳播， 其通常在人與人之間傳播。對(duì)流感表面抗原(特別是血凝素)的免疫力使感染 的可能性和(如果感染發(fā)生)疾病的嚴(yán)重性減少。雖然流感疫苗是可用的，但 因?yàn)獒槍?duì)一種類型流感病毒或亞型的抗體對(duì)另一種類型或亞型的流感賦予 有限的保護(hù)或沒有保護(hù)，所以有必要在每年的流感疫苗中并入一種或多種 新菌株。
流感病毒是分段的負(fù)鏈RNA病毒(segmented negative-strand RNA viruses),屬于正粘病毒一牛(0^2om少xovzWcbe family)。曱型流感病毒由9種結(jié) 構(gòu)蛋白組成，且另外編碼一種具有調(diào)節(jié)功能的非結(jié)構(gòu)NS1蛋白。非結(jié)構(gòu)NS1 蛋白在生殖周期中大量合成，定位在受感染細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠(cytosol)和核 中。病毒基因組的分段性質(zhì)允許在細(xì)胞與不同病毒抹混合感染期間發(fā)生遺 傳重排列(genetic reassortment)(基因組節(jié)段的交換)的機(jī)制。根據(jù)其表面上顯 示的不同血凝素(hemagglutinin) (HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase) (NA)病 毒蛋白質(zhì)，將曱型流感病毒進(jìn)一步劃分成不同亞型。
通過兩種病毒表面糖蛋白，血凝素(HA或H)和神經(jīng)氨酸酶(NA或N),來鑒定甲型流感病毒亞型。每種流感病毒亞型通過其H和N蛋白質(zhì)的組合
來鑒定。存在16種已知的HA亞型和9種已知的NA亞型。曱型流感病毒 可感染人類、禽類、豬、馬和其它動(dòng)物，但野生鳥類是這些病毒的天然宿 主。當(dāng)前在人類中傳播的僅是某些曱型流感亞型(即，H1N1、H1N2和H3N2)， 但在禽類中(特別是野生水禽(wild waterfowl)和岸禽(shorebird)中)已經(jīng)鑒定 出16 H和9 NA亞型的所有組合。此外，有越來越多的證據(jù)表明H5和H7 流感病毒也可引起人類疾病。
甲型流感病毒的HA包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)上不同的區(qū)域，即球狀頭區(qū)(globular head region)和千區(qū)(stem region)。 J求狀頭區(qū)包含受體結(jié)合部位，其負(fù)責(zé)病毒 附著到靶細(xì)胞，并參與HA的血凝活性。干區(qū)包含融合肽，其對(duì)于病毒包膜 和細(xì)胞的內(nèi)體膜之間的膜融合是必要的，因而與融合活性有關(guān)(Wiley等，爿朋. T ev.腸c/z置，56:365-394 (1987》。
大流行(pandemic)是指全球性疾病暴發(fā)。當(dāng)新的甲型流感病毒有以下情 況時(shí)，發(fā)生流感大流行(l)在人群中出現(xiàn)對(duì)其有很少或沒有免疫性，(2)開 始引起嚴(yán)重的疾病，然后(3)很容易在世界各地人對(duì)人傳播。在20世紀(jì)中， 已有3次這樣的流感大流行。第一次在1918年，"西班牙流感，，流感大流4亍， 造成在美國至少500,000人死亡，全世界高達(dá)4000萬人死亡。這次大流行 是由甲型流感H1N1亞型引起的。第二次在1957年，"亞洲流感"流感大流 行，由曱型流感H2N2亞型引起，造成在美國至少70,000人死亡，全世界 100-200萬人死亡。最近地在1968年，"香港流感，，流感大流行，由曱型流感 H3N2亞型引起，導(dǎo)致美國大約34,000人死亡，全世界700,000人死亡。
1997年，香港報(bào)道了首例甲型流感H5N1病例。這是第一次這種禽類 病毒直接感染人類，但沒有產(chǎn)生大流行，因?yàn)闆]有觀察到人對(duì)人的傳播。
Lu等，i ew. A饑7:43 (2006) (doi: 10.1186/1465-992-7_43)報(bào)道，從用滅 活的H5N1病毒接種的馬制備抗-H5Nl IgGs和H5Nl-特異性F(ab，)2片段， 其被描述用于保護(hù)以H5N1病毒感染的BALB/c小鼠。
Hanson等，W邵.L 7:126 (doi: 10.1186/1465-9921-7-126)描述了特異 于曱型流感H5病毒血凝素的嵌合單克隆抗體用于被動(dòng)免疫小鼠的用途。
考慮到某些曱型流感病毒引起的呼吸系疾病的嚴(yán)重性，及潛在的大流 行威脅，迫切需要有效的預(yù)防和治療方法。本發(fā)明通過提供針對(duì)病毒各種H 亞型的曱型流感中和抗體來滿足這一需要，所述亞型包括但不限于甲型流
9感病毒的HI和H3亞型，以及H5亞型。本發(fā)明進(jìn)一步提供能夠中和給定 的曱型流感病毒亞型的多于一種(優(yōu)選全部)分離物(菌抹)的抗體，所迷分離 物包括但不限于獲自各種人類和非人類物種的分離物和來自各種流感流行 和/或大流行的受害者和/或存活者的分離物。
可將所述中和抗體用于預(yù)防和/或治療流感病毒感染，包括在流行或大 流行的情況下受感染或有感染危險(xiǎn)的人群的被動(dòng)免疫。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及中和抗體，其中和甲型流感病毒亞型的多于 一種分離物或者曱型流感病毒的多于一種亞型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體中和甲型流感病毒亞型的基本上所有分
離物，如H5、 H7和H9亞型的一種或多種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體中和特定的甲型流感病毒亞型的多于 一種分離物，如H5、 H7和H9亞型的一種或多種分離物。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體中和曱型流感病毒的多于一種亞型和 至少一種亞型的多于一種分離物。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，由本文的抗體所中和的至少一種亞型和/或分 離物具有感染人類的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種分離物來自于禽類，包括例如野禽 (wild-fowls)和家禽(chicken)。
在具體的實(shí)施方案中，本文的抗體中和甲型流感病毒的H5N1亞型。
優(yōu)選地，所述抗體中和該曱型流感病毒亞型的多于一種分離物，或者甚至 更優(yōu)選地，基本上所有分離物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文的抗體中和H5N1亞型和至少一種額外的 選自下組的亞型H1N1、 H1N2和H3N2亞型。
在另外的實(shí)施方案中，本文的抗體中和額外的亞型的多于一種分離物， 優(yōu)選基本上所有分離物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的中和抗體結(jié)合H5蛋白。優(yōu)選地，所述 抗體結(jié)合H5蛋白的多于一種變體，或者甚至更優(yōu)選地，H5蛋白的基本上 所有變體。
在另外的實(shí)施方案中，本文的抗體與H5蛋白及至少一種額外的H蛋白，如H1、 H2和/或H3蛋白結(jié)合。
在不同的方面，本發(fā)明涉及含有本文所述的中和抗體的組合物。 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及鑒定抗體的方法，所述抗體能夠中和單 個(gè)曱型流感病毒亞型的多于一種分離物或多個(gè)曱型流感病毒亞型。該方法 包括在抗體文庫中鑒定抗體(所述抗體與曱型流感病毒亞型的第 一和第二分 離物反應(yīng)，或者與曱型流感病毒的第一和第二亞型反應(yīng))，以及使鑒定的抗
體-進(jìn)ff連續(xù)交替4侖次的選擇(successive alternating rounds of selection)(分另1」 根據(jù)它們結(jié)合第一和第二分離物，或第一和第二亞型的能力)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，已通過至少兩輪單獨(dú)的抗體富集(enrichment of antibodies)(分別與第 一分離物和第二分離物反應(yīng))鑒定了與第 一和第二甲型 流感病毒亞型分離物都反應(yīng)的抗體，并重組經(jīng)鑒定的抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使可與第一和第二甲型流感亞型分離物都反應(yīng) 的抗體在進(jìn)行分別根據(jù)其結(jié)合第 一和第二分離物的能力的連續(xù)交替輪次的 選擇之前進(jìn)行誘變。如果需要，可以根據(jù)其結(jié)合多于一種曱型流感亞型的 能力額外選擇能結(jié)合第一和第二分離物的抗體。
通?？梢詫⑺龈患夹g(shù)的應(yīng)用類似地應(yīng)用于抗體，不管它們所結(jié)合 的靶物(target)。本發(fā)明特別包括所述一般的富集/選擇方法作為一部分。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及由本發(fā)明的中和抗體所共享的序列的集合。
在還更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及治療受試者中曱型流感感染的方法， 其包括向受試者施用有效量的本文的中和抗體或抗體組合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及預(yù)防曱型流感感染的方法，其包括向處于 發(fā)生甲型流感感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用有效量的本發(fā)明的中和抗體。
在不同的方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生不同多功能抗體集合的方法，其包括 (a)比對(duì)至少兩個(gè)功能上不同的抗體的CDR序列，(b)鑒定在比對(duì)的CDR序 列之間保守的氨基酸殘基，和(c)使用簡并寡核苷酸探針，在至少一個(gè)比對(duì) 的CDR序列中進(jìn)行多個(gè)非保守氨基酸殘基的誘變，所述探針編碼至少在功
在的氨基酸殘基，如果需要，用一個(gè)或多個(gè)變體重復(fù)步驟(b)和(c),直到抗 體集合達(dá)到所需程度的多樣性和/或大小。
在具體的實(shí)施方案中，比對(duì)的CDR序列具有一樣的長度。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，保守的氨基酸殘基被保留在至少兩個(gè)比對(duì)的
iiCDR序列中。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種抗體集合，其包括多個(gè)在至少一種 性質(zhì)上彼此不同的中和抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及獨(dú)特地鑒定集合中核酸的方法，其包括用獨(dú)特的條 碼標(biāo)記核酸，所述條碼連接于或并入所述集合中存在的核酸的序列中。
附圖簡述


圖1顯示15種已知的血凝素(H)蛋白質(zhì)亞型的氨基酸序列。
圖2顯示典型的淘選富集流程圖，用于增加對(duì)兩個(gè)不同靶(A和B)的反 應(yīng)強(qiáng)度。每一輪富集增加庫(pool)對(duì)各靶的反應(yīng)強(qiáng)度。
圖3顯示用于選擇與靶A和靶B交叉反應(yīng)的克隆的策略，其中每個(gè)連 續(xù)輪增強(qiáng)所得的庫對(duì)兩個(gè)靶的反應(yīng)強(qiáng)度。
圖4顯示用于增加對(duì)兩個(gè)不同靶(靶A和靶B)反應(yīng)強(qiáng)度的策略，通過重 組平行發(fā)現(xiàn)庫(parallel discovery pool)以產(chǎn)生/增加交叉反應(yīng)性。重組抗體文 庫的每輪選擇增加所得的庫對(duì)兩個(gè)靶的反應(yīng)強(qiáng)度。
圖5顯示用于增加對(duì)靶B的交叉反應(yīng)性而維持對(duì)靶A的反應(yīng)性的策略。 首先，選擇與靶A反應(yīng)的克隆，然后制備與靶A反應(yīng)的克隆的誘變文庫， 如所示進(jìn)行選擇，得到顯示與靶A和靶B強(qiáng)反應(yīng)性的一個(gè)或多個(gè)抗體克隆。
圖6顯示代表性的i秀變方法，用于通過"目的i秀變(destinational mutagenesis)"方法產(chǎn)生不同的多功能抗體集合。
圖7顯示獲自土耳其(Turkish) H5N1禽流感暴發(fā)的6名人類存活者的血 樣的H5血凝素(HA)血清學(xué)結(jié)果。數(shù)據(jù)表明存在針對(duì)HA抗原的抗體。
圖8顯示用12名當(dāng)?shù)毓┱叩难鍢颖镜玫降难鍖W(xué)結(jié)果，對(duì)H5抗原 (A/Vietnam (越南)/1203/2004)以及H1N1 (A/New Caledonia (新喀里多尼 亞)/20/99)和H3N2 (A/ Panama (巴拿馬)/2007/99)病毒進(jìn)行試驗(yàn)。
圖9顯示在抗體噬菌體文庫構(gòu)建中使用的獨(dú)特的條碼方法(barcoding approach)。
圖10顯示獲自土耳其禽流感存活者的匯合文庫(pooled library)的5個(gè)不 同克隆的對(duì)H5蛋白和H5N1病毒的scFvELISA試驗(yàn)結(jié)果。
圖ll顯示序列比對(duì)，比較來自報(bào)道的土耳其分離物的H5血凝素蛋白 質(zhì)的序列和從洛斯阿拉莫斯國家實(shí)驗(yàn)室(Los Alamos National Laboratory)序列數(shù)據(jù)庫下載的 一種越南(Vietnamese)分離物。
圖12和圖13顯示在土耳其供者的匯合抗體文庫中鑒定的獨(dú)特克隆的 重鏈可變區(qū)序列，連同相應(yīng)的輕鏈和種系起源序列(germline origin sequences)。圖12顯示的序列(3-23個(gè)重鏈克隆)源于3輪淘選后所有土耳其 供者所有重鏈和輕鏈的匯合文庫。圖13顯示的序歹'J(3-30個(gè)重鏈克隆)源于 兩輪淘選后所有土耳其供者所有重鏈和輕鏈的匯合文庫。
圖14A-D顯示經(jīng)4輪淘選后，從各土耳其供者的抗體文庫鑒定的額外 的獨(dú)特H5N1特異性抗體重鏈可變區(qū)序列。
圖15和圖16顯示使用目的誘變創(chuàng)建不同的抗體重鏈和輕鏈文庫，利 用通過分析土耳其禽流感存活者血清和骨髓而鑒定的抗體重鏈(圖15)和輕 鏈(圖16)序列。
圖17和圖18顯示ELISA維果，證實(shí)某些獲自H5N1越南病毒scFv抗 體的Fab片段與HA蛋白的土耳其和印尼(Indonesian)變體的交叉反應(yīng)性。
發(fā)明詳述 A.定義
領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 一 般理解的含義相同。Singleton等，DW/o"a^ o/ Mz'cra6/o/ogy M /ecw/or祝o/ogy 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供許多用于本申請(qǐng)中的術(shù)語的 一般指導(dǎo)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到與本文所述類似或等同的許多方法和材料， 這些方法和材料可用于實(shí)施本發(fā)明。實(shí)際上，本發(fā)明絕不限于所述的方法 和材料。就本發(fā)明而言，下列術(shù)語定義如下。
術(shù)語"曱型流感亞型，，或"曱型流感病毒亞型"可互換使用，指的是曱型流 感病毒變體，其特征在于血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)病毒表面蛋白質(zhì)的各種 組合，因此通過H數(shù)和N數(shù)的組合來標(biāo)記，例如H1N1和H3N2。所述術(shù) 語特別包括各亞型內(nèi)的所有菌抹(strain)(包括滅絕的菌抹)，其通常由突變產(chǎn) 生并顯示不同的病原語(pathogenic profile)。所述菌4朱還稱為病毒亞型的不 同"分離物，，，包括所有過去、現(xiàn)在和將來的分離物。因此，在上下文中，可 互換使用術(shù)語"菌抹"和"分離物"。
術(shù)語"流行性感冒(流感)"用來指由流感病毒引起的傳染性疾病。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"抗體，，(Ab)以最廣義使用，并包括對(duì)特定抗 原顯示結(jié)合特異性的多肽以及免疫球蛋白和其它缺乏抗原特異性的抗體樣 分子。后一種多肽例如由淋巴系統(tǒng)以低水平產(chǎn)生，和由骨髓瘤以增加的水 平產(chǎn)生。在本申請(qǐng)中，術(shù)語"抗體"具體包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗 體和抗體片段。
"天然抗體，，通常是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩條相同 的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過共價(jià)二硫鍵與重鏈連 接，但不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕 鏈也具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有可變區(qū)(VH),隨后是 許多恒定區(qū)。每條輕鏈在一端具有可變區(qū)(VO，在其另一端具有恒定區(qū)；輕 鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)對(duì)齊，而輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)對(duì) 齊。人們相信，特定的氨基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變區(qū)之間的界面， Chothia等，■/ Mo/.腸/. 186:651 (1985); Novotny and Haber， Prac.胸/. Jcacf. t/^. 82:4592(1985)。
關(guān)于抗體鏈的術(shù)語"可變的，，用來指抗體鏈的部分，其在抗體中在序列 上大量不同，并參與每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。所述變 異性集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為高變區(qū)(hypervariable region)的3個(gè)部 分中。可變區(qū)保守性更高的部分稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū) 各包括4個(gè)FR (分別為FR1 、 FR2、 FR3和FR4)，主要采取(3-折疊構(gòu)型， 由3個(gè)高變區(qū)連接，其形成環(huán)狀連接(并在某些情況下形成部分的)(3-折疊結(jié) 構(gòu)。每條鏈中的高變區(qū)通過FR緊密相鄰地結(jié)合在一起，并與來自其它鏈的 高變區(qū)結(jié)合，促進(jìn)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabat等，Se《Me"cM o/ /V(9/ez>w o/ 7www o/og7'C(3/ /"&reit, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669)。在抗體與抗原的結(jié) 合中不直接涉及恒定區(qū)，但其顯示多種效應(yīng)子功能，如在抗體依賴性細(xì)胞 毒性作用中抗體的參與。
當(dāng)在本文使用時(shí)，術(shù)語"高變區(qū)"指的是負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸 殘基。高變區(qū)包括來自"互補(bǔ)性決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(即，輕鏈可 變區(qū)中的殘基30-36 (Ll)、46-55 (L2)和86-96 (L3)以及重鏈可變區(qū)中的30-35 (Hl)、 47-58 (H2)和93-101 (H3); MacCallum等.JMo/飾/. 1996.)。"框架，， 或"FR"殘基是那些如本文定義的除高變區(qū)殘基之外的可變區(qū)殘基。根據(jù)抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將抗體歸為不同種類。有5種
主要類別的抗體IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM,可將其中幾種進(jìn)一步分成 子類(同種型)，例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和IgA2。
相應(yīng)于不同種類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為a、 S、 s、 y和P。 基于其恒定區(qū)的氨基酸序列，可將來自任意脊推動(dòng)物物種的抗體的"輕 鏈"歸為兩種顯然不同的類型(稱為kappa(k)和lambda(X))中的一種。
"抗體片段"包括全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合或可變區(qū)。抗 體片^R的例子包括但不限于Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片段，由抗體片段形成 的線性抗體、單鏈抗體分子、雙特異抗體(diabody)和多特異性抗體。
術(shù)語"單克隆抗體，，用來指由B細(xì)胞的單個(gè)克隆合成的抗體分子。修飾 語"單克隆，，表示抗體的特征為從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得，不應(yīng)解釋成需 要通過任意特定方法產(chǎn)生抗體。因而，可通過由Kohler和Milstein, A^fM 256:495 (1975); J. /mm頭o/. 6:511 (1976)首次描述的雜交瘤方法，用重組 DNA技術(shù)制備單克隆抗體，或者也可從噬菌體抗體文庫分離單克隆抗體。 術(shù)語"多克隆抗體"用來指由B細(xì)胞群體合成的抗體分子的群體。 "單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包括抗體的Vh和VL區(qū)，其中這些區(qū)域存在 于單個(gè)多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽在Vh和V^區(qū)之間進(jìn)一步包括多肽接頭， 其使得sFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述參見PlUckthim于277e P/wr應(yīng)co/ogy o/ Mcwoc/o加/爿/7必oti&, vol. 113, Rosenburg和Moore編 Springer-Verlag， New York, pp. 269-315 (1994)。單鏈抗體在例如WO 88/06630
和WO 92/01047中公開。
術(shù)語"雙特異抗體"指的是有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段
包括重鏈可變區(qū)(VH)，其連接到相同多肽鏈(VH-vo中的輕鏈可變區(qū)(Vij。通 過使用接頭(其太短以至于不能允許在相同鏈上兩個(gè)區(qū)域之間配對(duì))，所述區(qū)
域被迫與另 一鏈的互補(bǔ)區(qū)配對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。在例如EP 404,097; WO 93/11161; 和Hollinger等，尸rac. Ato/.爿cad Scz'. 90:6444-6448 (1993)中更全面地描述雙特異抗體。
術(shù)語"雙特異性抗體(bispecific antibody)，，指的是對(duì)兩種不同類型抗原顯 示特異性的抗體。如本文使用的術(shù)語具體包括但不限于顯示對(duì)靶抗原和對(duì) 有利于傳遞到特定組織的其它靶物的結(jié)合特異性的抗體。類似地，多特異 性抗體具有兩種或多種結(jié)合特異性。
15詞語"線性抗體"用來指包括一對(duì)串連的FcUt(VH-CHl-VH-CH1),其形成 一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性或單一特異性的，例如由Zapata 等，8(10): 1057-1062 (1995)描述。
術(shù)語"中和抗體"在本文以最廣義使用，指的是抑制流感病毒重復(fù)感染 耙細(xì)胞的任何抗體，而不管實(shí)現(xiàn)中和的機(jī)制。因而，舉例來說，可通過抑 制病毒附著或粘附到細(xì)胞表面來實(shí)現(xiàn)中和，例如通過設(shè)計(jì)抗體，所述抗體
直接結(jié)合到，或者接近于，負(fù)責(zé)病毒附著或粘附的位點(diǎn)。還可以通過定向 到病毒體(virion)表面的抗體來實(shí)現(xiàn)中和，其導(dǎo)致病毒體的聚集?？赏ㄟ^抑 制病毒附著到耙細(xì)胞以后病毒和細(xì)胞膜融合，通過抑制胞吞作用 (endocytosis),抑制來自受感染細(xì)胞的子代病毒等，進(jìn)一步發(fā)生中和。本發(fā) 明的中和抗體不受限于實(shí)現(xiàn)中和的機(jī)制。
術(shù)語"抗體諳(antibody repertoire)，，在本文中以最廣義使用，指的是抗體 或抗體片段的集合，所述抗體或抗體片段可用于篩選特殊的性質(zhì)，如結(jié)合 能力、結(jié)合特異性、胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)能力、穩(wěn)定性、親和性等。該術(shù)語具體包 括抗體文庫，例如包括所有形式的組合庫，例如抗體噬菌體展示文庫，包 括但不限于來自任4可來源的單纟連Fv (scFv)和Fab抗體噬菌體展示文庫，包 括未免疫的(naiVe)、合成和半合成文庫。
"噬菌體展示文庫，，是蛋白質(zhì)表達(dá)文庫，其將克隆的蛋白質(zhì)序列集合表 達(dá)為與噬菌體外殼蛋白的融合物。因而，短語"噬菌體展示文庫"在本文指的 是噬菌體(例如絲狀噬菌體)的集合，其中所述噬菌體表達(dá)外部(extemal)(通 常為異源)蛋白質(zhì)。外部蛋白質(zhì)自由地與和噬菌體接觸的其它部分相互作用 (結(jié)合)。每種展示外部蛋白質(zhì)的噬菌體都是噬菌體展示文庫的"成員"。
"抗體噬菌體展示文庫，，指的是展示抗體或抗體片段的噬菌體展示文 庫?？贵w文庫包括噬菌體群體或編碼所述噬菌體群體的載體的集合，或者 攜帶所述噬菌體或載體集合的細(xì)胞。該文庫可以是單價(jià)的，每個(gè)噬菌體顆 粒平均展示一個(gè)單鏈抗體或抗體片段，或者是多價(jià)的，每個(gè)病毒顆粒平均 展示兩個(gè)或更多個(gè)抗體或抗體片段。術(shù)語"抗體片段，，包括但不限于單鏈Fv (scFv)片段和Fab片段。優(yōu)選的抗體文庫包括平均超過106,或超過107，或 超過108,或超過109個(gè)不同成員。
術(shù)語"絲狀噬菌體"指的是能夠在其表面展示異源多肽的病毒顆粒，包 括但不限于fl、 fd、 Pfl和M13。絲狀噬菌體可以包含選擇性標(biāo)記，如四環(huán)素(例如"fd-tet，，)。各種絲狀噬菌體展示系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的 (參見例如Zacher等，G簡9:127-140 (1980), Smith等，S"'e聽228:1315-1317 (1985);及Parmley和Smith，73:305-318 (1988))。
術(shù)語"淘選(panning)，，用來指在對(duì)承載(carry)對(duì)靶點(diǎn)有高親和性和特異 性的化合物(例如抗體)的噬菌體的鑒定和分離中的多輪篩選過程。
如本文使用的術(shù)語"非人動(dòng)物，，例如包括但不限于哺乳動(dòng)物，如非人類 靈長類(primates)、嚙齒類(rodents)(例如小鼠和大鼠)以及非嚙齒類動(dòng)物如兔 (rabbits)、豬(pigs)、纟帛羊(sheep)、山羊(goats)、牛(cows)、豬(pigs)、馬(horses) 和驢(donkeys)。其還包括禽類(birds)(例如雞(chickens)、火雞(turkeys)、鴨 (ducks)、鵝(geese)等)。如本文使用的術(shù)語"非靈長類動(dòng)物"指的是除了靈長 類外的哺乳動(dòng)物，包括但不限于上面具體列出的哺乳動(dòng)物。
短語"功能上不同的抗體"及其語法變體用來指在至少一種性質(zhì)上彼 此不同的抗體，包括但不限于結(jié)合特異性、結(jié)合親合力和任何免疫學(xué)或生 物學(xué)功能，如中和靶物的能力、生物活性的程度或質(zhì)量等。
短語"保守的氨基酸殘基"用來指在彼此對(duì)齊的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序 列之間相同的氨基酸殘基。
B.通用^支術(shù)
用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室教 科書中描述，所述教材包括例如Ausubel等，CWre"f /Votoco/s o/Mo/ecw/ar 所o/ogy, John Wiley and Sons (1997); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第三版，J. Sambrook和D. W. Russell編，Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Antibody Phage Display: Methods and Protocols, P.M. O'Brian和R. Aitken編,Humana Press,于Methods in Molecular Biology, Vol. 178; Phage Display: A Laboratory Manual, C.R Barbas III等編,Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; 以及Antibodies, G. Subramanian編，Kluwer Academic, 2004 。例 如，可以使用定點(diǎn)誘變來進(jìn)行誘變(Kunkel等，尸rac. vVa" Jcad <SW 82:488-492 (1985》。
在以下的說明中，參考某些類型的抗體文庫說明本發(fā)明，但本發(fā)明不 限于使用任何特定類型的抗體文庫。重組單克隆抗體文庫可以基于免疫片段或未免疫片段(nai've fragments)。來自免疫抗體文庫的抗體通常用VH和 V^基因庫構(gòu)建，將所述Vh和Vl基因庠從源B細(xì)胞克隆至適當(dāng)?shù)妮d體表達(dá) 以產(chǎn)生隨機(jī)組合庫，其隨后可被選擇和/或篩選。其它類型的文庫可以包括 來自對(duì)與抗原結(jié)合的克隆不明顯存在偏好的基因來源的抗體片段。因而， 天然抗體文庫源于天然的、非免疫的、重排的V基因。合成的抗體文庫完 全通過體外方法構(gòu)建，將完全或特定簡并的區(qū)域引入一個(gè)或多個(gè)V基因的 CDR。半合成文庫組合天然的和合成的多樣性，經(jīng)常創(chuàng)建半合成文庫以增 加天然多樣性并維持所需水平的功能多樣性。因而，所述文庫可以例如通 過改組天然的CDR區(qū)而創(chuàng)建(Soderlind等，Ato.所otec/mo/. 18:852-856 (2000)),或者通過將來自人B細(xì)胞的天然重排的CDR序列與合成的CDR1 和CDR2多樣性組合而創(chuàng)建(Hoet等，Ato.歷o/ec/z"o/. 23:455-38 (2005))。本 發(fā)明包括未免疫的、合成的和半合成的抗體文庫，或其任何組合的使用。
同樣地，本發(fā)明的方法不受任何用于抗體展示的特定技術(shù)所限制。盡 管參考噬菌體展示說明本發(fā)明，但是本發(fā)明的抗體也可用其它展示和富集 技術(shù)來鑒定，例如核糖體或mRNA展示(Mattheakis等，尸rac. Ato/. Jcad Sc/.
91:9022-9026 (1994); Hanes和Pluckthun,尸rac. A^/. ^cad 5W. L 4 94:4937-4942 (1997))、微生物細(xì)胞展示如細(xì)菌展示(Georgiou等，淑臟 所Wec/z. 15:29-34 (1997))或酵母細(xì)胞展示(Kieke等，Prafe/w 10:1303-1310 (1997))、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上展示、芽孢展示、病毒展示如逆轉(zhuǎn) 錄病毒展示(Urban等，7Vwc/dc爿"A i^ , 33:e35 (2005)、基于蛋白質(zhì)-DNA連 鎖(protein-DNA linkage)的展示(Odegrip等，Proc. Acad. Natl. Sci. 101:2806-2810(2004); Reiersen等，齒c/eZcUs L 33:el0 (2005))，以及微 珠展示(Sepp等，i^^SLe". 532:455-458 (2002))。
在核糖體展示中，通過核糖體連接抗體和編碼mRNA,使核糖體在翻 譯mRNA的末端停止，不釋放多肽。選擇總體上是基于三元復(fù)合體。
在mRNA展示文庫中，用嘌呤霉素(puromycin)在抗體和編碼mRNA之 間建立共價(jià)鍵，用作銜接分子(Wilson等，Ato/. Jc^ . 5W. 98:3750-3755 (2001))。關(guān)于該技術(shù)用于展示抗體，參見例如Lipovsek和 Pluckthun, / /mmw"o/. TWeAoA. 2卯:51-67 (2004)。
微生物細(xì)胞展示技術(shù)包括在酵母上表面展示，所述酵母如釀酒酵母 (Sacc/zaram_yc&s cerev^7'ae) (Boder和 Wittmp， Ato.說'otec/mo/. 15:553-557
18(1997))。因而，舉例來說，可通過與ot-凝集素酵母粘著受體(a-agglutininyeast adhesion receptor)(其定位在酵母細(xì)胞壁上)融合將抗體展示在釀酒酵母OS. c6revWae)的表面上。該方法提供通過流式細(xì)胞術(shù)選擇語的可能性。通過用 焚光標(biāo)記的抗原和抗-表位標(biāo)記試劑將細(xì)胞染色，可根據(jù)細(xì)胞表面上抗原結(jié) 合和抗體表達(dá)的水平來將酵母細(xì)胞分類。也可將酵母展示平臺(tái)與噬菌體組
合(參見例如Van den Beucken等，F(xiàn)五^SZe". 546:288-294 (2003))。
關(guān)于選擇和篩選抗體文庫技術(shù)的綜述，參見例如Hoogenboom, Atoww 說》fec/wo/. 23(9):1105-1116 (2005)。
C.優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)il明
本發(fā)明涉及中和甲型流感亞型的多于一種菌抹(分離物)(包括滅絕的菌 株的分離物)的單克隆抗體以及針對(duì)多于 一種甲型流感亞型(包括特征為存在 H5血凝素的亞型)的中和抗體的選擇、生產(chǎn)和使用。在具體的實(shí)施方案中， 本發(fā)明涉及中和多于一種曱型流感亞型和/或一種或多種亞型的多于一種分 離物，或多于兩種分離物，或多于三種分離物，或多于四種分離物，或多于 五種分離物等，最優(yōu)選所有分離物的單克隆抗體的選擇、生產(chǎn)和使用。
曱型流感病毒的病毒體包含8個(gè)線性負(fù)義單鏈RNA區(qū)段。總基因組長 度為13600個(gè)核苷酸，而所述8個(gè)區(qū)段長度分別為2350個(gè)核苷酸；2350個(gè) 核苷酸；2250個(gè)核苷酸；1780個(gè)核苷酸；1575個(gè)核苷酸；1420個(gè)核苷酸； 1050個(gè)核苷酸；和卯0個(gè)核苷酸。曱型流感病毒的宿主特異性和減毒作用 已歸因?yàn)椴《狙?H,HA)、核蛋白(NP)、基質(zhì)(M),以及非結(jié)構(gòu)(NS)基因 單獨(dú)或與病毒基因結(jié)合(參見例如Rogers等，Wra/ogy 127:361-373 (1983); Scholtissek等，Wra/ogy 147:287-294 (1985); Snyder等，,C7/". M/cra&o/. 24:467-469 (1986); Tian等，Wra/. 53:771-775 (1985); Treanor等，Kra/ogy 171:1-9 (1989)。
曱型流感病毒和它們的表面蛋白(包括血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白)的核 苷酸和氨基酸序列可以從GenBank和其它序列數(shù)據(jù)庫得到，所述其它數(shù)據(jù) 庫例如由洛斯阿拉莫斯國家實(shí)驗(yàn)室理論生物學(xué)與生物物理學(xué)研究組 (Theoretical Biology and Biophysics Group of Los Alamos National Laboratory ) 維護(hù)的流感序列數(shù)據(jù)庫(Influenza S叫uence Database)。甲型流感病毒血凝素 15種已知的H亞型(H1-H15)的氨基酸序列示于圖1 (SEQIDNOS: 1-15)。最近從瑞典紅嘴雞(black-headed gulls)分離到另夕|、一種曱型流感病毒血凝素亞 型(H16)，并由Fouchier等，乂 Wra/. 79(5):2814-22 (2005)報(bào)道。每種H亞型 的各種各樣的菌抹也是已知的。例如，圖1中命名為H5A/Hong Kong/156/97 的HA蛋白的序列是由1997年5月在香港從人分離的曱型流感H5N1病毒 確定的，顯示其與Suarez等，Wra/. 72:6678-6688 (1998)中獲自其它相關(guān) H5N1分離物的幾種另外的菌抹序列相比較。
流感病毒神經(jīng)氨酸酶的催化位點(diǎn)和抗原位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)已由Colman等， A^wre 303:41-4 (1983)公開，神經(jīng)氨酸酶序列可從GenBank和其它序列數(shù)據(jù) 庫得到。
已知由受感染個(gè)體的免疫應(yīng)答產(chǎn)生的病毒特異性抗體通常通過與病毒 血凝素相互作用從而中和病毒(Ada等，Cmw 7b/7. Af/cra6z-o/. /wmw"o/. 128:1-54 (1986); Couch等，7Vf/co&o/. 37:529-549 (1983))。已經(jīng)確 定并公開了流感病毒血凝素的三維結(jié)構(gòu)和流感病毒血凝素與中和抗體之間 的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，參見例如Wilson等，Atowe 289:366-73 (1981); Ruigrok 等，乂 P7ra/. 69 (Pt 11):2785-95 (1988); Wrigley等，Wra/ogy 131(2):308-14 (1983); Daniels等，￡細(xì)0 J 6:1459-1465 (1987);和Bizebard等，胸訓(xùn) 376:92-94(2002)。
根據(jù)本發(fā)明，從一種或多種抗體文庫鑒定出具有所需性質(zhì)的抗體，所 述抗體文庫可來自于許多種來源并且可以是不同類型的。
綜合(comprehensive)人類流感抗體文庫
可以由從各種先前發(fā)生的流感、季節(jié)性暴發(fā)流行和大流行(包括1968 香港流感(H3N2)、 1957亞洲流感(H2N2)、 1918西班牙流感(H1N1)和 2004/2005禽流感(H5N1))康復(fù)者獲得的抗體來創(chuàng)建綜合人類流感抗體文庫。 為了制備所述文庫，從已知或懷疑已受流感病毒感染的個(gè)體收集血液或骨 髓樣品。外周血樣品(特別是來自地理上遠(yuǎn)距離來源的外周血樣品)在運(yùn)輸和 使用之前可能需要使之穩(wěn)定化。為此目的的試劑盒是眾所周知的且在商業(yè) 上可得到，例如BD Vacutainer CP丁TM細(xì)胞制備管可用于離心純化淋巴細(xì)胞， 胍、Trizol或RNAlater用于穩(wěn)定樣品。 一旦得到穩(wěn)定化的淋巴細(xì)胞或全骨 髓，利用本領(lǐng)域已知的免疫球蛋白寡聚引物進(jìn)行RT-PCR以挽救(rescue)重 鏈和輕鏈譜。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，將PCR譜產(chǎn)物與接頭寡聚物組合以產(chǎn)生scFv文庫，在與m13 pill蛋白質(zhì)相應(yīng)的框中(in frame with)直接克隆。
在通常的方案中，可用眾所周知的血清學(xué)試驗(yàn)來檢測(cè)人血清中的抗體， 包括例如用眾所周知的血凝素抑制(HAI)試驗(yàn)(Kendal, A. R， M. S. Pereira和 J. J. Skehel. 1982. Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia), 或者微量中和試驗(yàn) (Harmon等， / C7/". Mkro^o/. 26:333-337 (1988))。如果已經(jīng)確認(rèn)血清樣品包 含流感中和抗體，則該檢測(cè)步驟可能不是必要的。接著用本領(lǐng)域已知的方 法處理來自全血的淋巴細(xì)胞或骨髓中存在的淋巴細(xì)胞。用Tri BD試劑(Sigma) 從新鮮的或RNAlater穩(wěn)定化的組織提取總RNA。隨后，用Oligotex purification (Qiagen)將分離的供體總RNA進(jìn)一步純化為mRNA。接著，根 據(jù)AccuScript反轉(zhuǎn)錄酶(Stratagene)的規(guī)程，使用隨機(jī)的九聚體寡核芬酸和或 寡聚(dT)!s (oligo (dT),8)引物產(chǎn)生第一鏈cDNA合成。簡言之，將100 ng mRNA、 0.5 mMdNTPs和300 ng隨機(jī)的九聚物和或500 ng寡聚((1丁)18引物 在AccuscriptRT緩沖液(Stratagene)中于65 。C溫育5分鐘，之后迅速冷卻至 4°C 。然后，向每個(gè)反應(yīng)中加入100 mM DTT、 Accuscript RT和RNAse Block， 于42i:溫育1小時(shí)，通過在7(TC加熱15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶。獲得的cDNA 可用作抗體重鏈和輕鏈V基因RT-PCR擴(kuò)增的模板，然后可將其克隆入載 體，或者，如果噬菌體展示文庫是預(yù)期的，則將其克隆入噬菌粒載體。該 步驟產(chǎn)生抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)克隆的語(VH和VL文庫)，其可以根據(jù)篩選 目的保持分離或組合。
可用類似于上述的方式恢復(fù)、穩(wěn)定和挽救來自較早的流行或大流行(如 1918西班牙流感)存活者的外周淋巴細(xì)胞的免疫球蛋白譜。對(duì)于另外的HI 和H3文庫，可以從適當(dāng)時(shí)間接種的當(dāng)?shù)貋碓吹墓┱呋厥兆V。作為一種額外 的選擇，可以從商業(yè)來源購買商業(yè)上可得到的骨髓總RNA或mRNA，以產(chǎn) 生適合H1和H3抗體篩選的文庫，根據(jù)供者的背景也適用于H2抗體篩選。
通用抗體文庫(UAL)^^成的人-樣譜
在本發(fā)明的方法中，可以用通用抗體文庫代表合成的人源抗體譜，所述 通用抗體文庫可以用本領(lǐng)域已知的方法制備或由商業(yè)來源獲得。因而，舉例 來說，在2003年12月11日公開的美國專利申請(qǐng)公開號(hào)20030228302中，描述了通用免疫球蛋白文庫，包括所述文庫的亞類，其全部公開內(nèi)容由此通過
引用明示地(expressly)并入本文。簡言之，該專利公開描述感興趣的原型免疫 球蛋白的文庫，其中單個(gè)預(yù)定的氨基酸已在感興趣的免疫球蛋白的一個(gè)或多 個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)被取代。所述文庫的亞類包括突變的免疫球 蛋白，其中預(yù)定的氨基酸已在免疫球蛋白的6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的一個(gè)或多個(gè)中 的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)以所有可能的組合被置換。所述突變可以例如通過走查突 變(walk-through mutagenesis)產(chǎn)生，如美國專利Nos. 5,798,208、 5,830,650、 6,649, 340和美國專利申請(qǐng)公開號(hào)20030194807中所述，它們的全部公開內(nèi)容 由此通過引用明示地并入本文。在走查突變中，產(chǎn)生免疫球蛋白文庫，其中 單個(gè)預(yù)定的氨基酸至少一次被并入免疫球蛋白中感興趣的一個(gè)限定的區(qū)域 或幾個(gè)限定的區(qū)域的每個(gè)位點(diǎn)，例如并入免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定 區(qū)(CDRs)或框架(FR)區(qū)。產(chǎn)生的突變的免疫球蛋白與原型免疫球蛋白不同， 因?yàn)樗鼈兙哂胁⑷朊庖咔虻鞍椎囊粋€(gè)或多個(gè)區(qū)域(例如CDRs或FR區(qū))內(nèi)一個(gè) 或多個(gè)位點(diǎn)的單個(gè)預(yù)定的氨基酸，代替原型免疫球蛋白中相同的一個(gè)位點(diǎn)或 多個(gè)位點(diǎn)存在的"天然的，，或"野生型"氨基酸。突變的免疫球蛋白的組包括感 興趣的限定區(qū)域的每個(gè)位點(diǎn)的各突變免疫球蛋白；因而，對(duì)于感興趣的限定 區(qū)域(例如CDR或FR)中每個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)突變的免疫球蛋白或者具有在原型 免疫球蛋白中發(fā)現(xiàn)的氨基酸，或者具有預(yù)定的氨基酸，且所有突變的免疫球 蛋白的混合物包含所有可能的變體。
可將有各種突變的抗體重鏈和輕鏈的特定子文庫組合，從而為本發(fā)明 的抗體提供框架構(gòu)建體，之后在重鏈和輕鏈的CDRs中都引入多樣性。該多 樣性可以通過本領(lǐng)域已知的方法實(shí)現(xiàn)，例如通過Kunkel誘變(Kunkel mutagenesis),為了進(jìn)一步增加多樣性，可將其重復(fù)幾次。因此，舉例來說， 可以通過多輪Kunkel誘變，將多樣性分別或同時(shí)引入重鏈和輕鏈CDR1和 CD2區(qū)域。如果需要，可以根據(jù)CDR長度分離各種Kunkel克隆，和/或可 以例如通過用模板特異性限制酶消化來移除靶向CDR (例如CDR1或CDR3) 中缺乏多樣性的克隆。這些步驟一旦完成，文庫的大小應(yīng)該超過約109個(gè)成 員，但有更少成員的文庫也是有用的。
在具體的實(shí)施方案中，免疫抗體文庫和通用抗體文庫都被用于鑒定本 發(fā)明的中和抗體。這兩種類型的文庫從根本上不同。根據(jù)具體情況，通用 抗體文庫是具有預(yù)測(cè)的結(jié)合蛋白質(zhì)和肽的能力的人-樣抗體的回顧性合成的集合，而免疫譜將包含特異地識(shí)別禽類H5血凝素，和/或Hl、 H2或H3血 凝素的序列。因而，理論上將免疫語優(yōu)化以識(shí)別靶向的流感亞型的關(guān)鍵組 分。作為這些差異的結(jié)果，這兩種方法產(chǎn)生不同組的抗體，從而為鑒定所 需的中和抗體提供更有效的方法。
超免疫非人靈長類抗體文庫
在這種方法中，從超免疫非人靈長類(例如短尾浙吳(macaque)或狒狒 (baboons))挽救抗體文庫。具體地，用曱型流感病毒的各種亞型或用各種血 凝素(H)蛋白質(zhì)免疫非人靈長類。用曱型流感病毒亞型或血凝素免疫動(dòng)物， 將出現(xiàn)識(shí)別所述曱型流感病毒亞型或血凝素的抗體效價(jià)的動(dòng)物處死，收獲 它們的脾臟。收集經(jīng)免疫的動(dòng)物的血液或骨髓，如上所述收集并擴(kuò)增產(chǎn)生 的抗體用于綜合流感抗體文庫。
分離本發(fā)明的中和抗體的策略
不管抗體文庫的類型或使用的文庫，可以通過受控制的交叉反應(yīng)選擇 和/或定向組合的和/或誘變的工程發(fā)現(xiàn)并優(yōu)化具有雙重特異性(例如顯示與 兩種不同曱型流感亞型和/或與相同亞型的兩個(gè)菌抹(分離物)，和/或與人類 和非人類分離物的反應(yīng)性)的抗體。
在圖2中顯示的典型的富集方案中，將包括對(duì)兩種耙(命名為靶A和靶 B)顯示交叉反應(yīng)性的抗體的文庫進(jìn)行多輪富集。如果富集是基于與靶A的 反應(yīng)性，則每輪富集將增加庫對(duì)靶A的反應(yīng)強(qiáng)度。同樣地，如果富集是基 于與靶B的反應(yīng)性，則每輪富集將增加庫對(duì)靶B的反應(yīng)強(qiáng)度。雖然圖2提 及淘選，其是篩選噬菌體展示文庫時(shí)使用的選擇方法(見下文)，但該方法同 樣適用于上述任何類型的文庫、本領(lǐng)域其它另外已知的文庫，且適用于任 何類型的展示技術(shù)。靶A和靶B包括與抗體結(jié)合的任何靶物，包括但不限 于流感病毒的各種分離物、類型和亞型。
由于本發(fā)明的目標(biāo)是鑒定有多種特異性的中和抗體，故已制定了交叉 反應(yīng)發(fā)現(xiàn)選擇方案(cross-reactive discovery selection)。 為了簡單，在顯示選 擇有雙重特異性的抗體的圖3中說明該方案。在此情況下，對(duì)于包括顯示 與兩個(gè)耙(乾A和耙B)的反應(yīng)性的抗體的抗體文庫，首先選擇與靶之一(例 如耙A)的反應(yīng)性，然后是選擇與另一個(gè)靶(例如靶B)的反應(yīng)性。每個(gè)連續(xù)選
23擇輪都增強(qiáng)所得的庫對(duì)兩個(gè)靶的反應(yīng)強(qiáng)度。因此，該方法對(duì)于鑒定有雙重 特異性的抗體特別有用。當(dāng)然，通過包括對(duì)另外的靶的額外輪富集，可以
選的文庫是噬菌體展示文庫，.則通過交叉反應(yīng)淘選進(jìn)行選擇，但也可使用 其它文庫和其它選擇方法。
上面討論的兩種方法的組合包括對(duì)分別針對(duì)耙A和靶B的反應(yīng)性的兩 輪單獨(dú)富集，將獲得的兩個(gè)庫重組，以及隨后的交叉反應(yīng)選擇輪次，如上
所述。該方法在圖4中說明。正如在完全交叉反應(yīng)選擇中，重組文庫的每
輪選擇增加所得的庫對(duì)兩個(gè)靶的反應(yīng)強(qiáng)度。
在圖5顯示的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，首先鑒定克隆，其顯示與靶A的 強(qiáng)反應(yīng)性，并具有與靶B的可檢測(cè)的交叉反應(yīng)性。根據(jù)該克隆，制備誘變 的文庫，然后在交替輪中選擇該文庫分別與靶B和靶A的反應(yīng)性。該方案 將產(chǎn)生保持與靶A的強(qiáng)反應(yīng)性并具有與靶B增加的反應(yīng)性的抗體。正如上 文，如果篩選的文庫是噬菌體展示文庫，選擇是通過淘選進(jìn)行的，但按照 相同的策略也可以使用其它文庫、其它展示技術(shù)以及其它選擇方法。
如上所述，耙A和把B可以例如是曱型流感病毒的兩種不同亞型、相 同曱型流感病毒的兩個(gè)不同菌林(分離物)、來自兩個(gè)不同物種的亞型或分離 物，其中一個(gè)物種優(yōu)選人類。因而，舉例來說，靶A可為H5N1病毒2004 越南(Vietnam)分離物的 一種分離物，而靶B可為H5N1病毒1997香港(Hong Kong)分離物。強(qiáng)調(diào)的是，這些例子僅僅是說明性的，可以以類似方式鑒定、 選擇和優(yōu)化對(duì)任意兩個(gè)或多個(gè)靶具有雙重特異性或多特異性的抗體。
或者，如果使用允許分離不連續(xù)框架和CDR長度的抗體文庫(如UAL) 以發(fā)現(xiàn)針對(duì)靶A的抗體，那么能夠篩選B抗原，并且文庫可局限于類似參 數(shù)的不同集合。 一旦發(fā)現(xiàn)針對(duì)B抗原的抗體，那么可以將基于各抗體A和 抗體B的嵌合或誘變抗體用于設(shè)計(jì)雙重特異性集合。
噬菌體展示
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用噬菌體展示抗體文庫從功能上發(fā)現(xiàn) 具有多(包括雙重)特異性的中和單克隆抗體。所述抗體可例如為能夠中和多 于 一種曱型流感病毒亞型和/或相同亞型的多于 一種菌才朱(分離物)的單克隆 抗體，所述甲型流感病毒亞型包括H5、 H7和/或H9亞型，如H5和Hl;
24H5和H2; H5和H3; H5、 Hl和H2; H5、 H1和H3; H5、 H2和H3; Hl、 H2和H3等亞型。
為了產(chǎn)生噬菌體抗體文庫，將獲自任何來源的cDNA文庫(包括上述文 庫)克隆入噬菌粒載體。
因而，舉例來說，將如上所述通過RT-PCR從淋巴細(xì)胞或骨髓挽救的抗 體重鏈和輕《連i普的集合重新裝配成與ml3 pill蛋白質(zhì)融合的scFv文庫。所 述組合文庫將包含約超過106，或超過107,或超過108，或超過109個(gè)不同 成員，優(yōu)選超過107個(gè)不同成員或以上。關(guān)于質(zhì)量控制，對(duì)隨機(jī)克隆測(cè)序以 評(píng)估總體語復(fù)雜性。
同樣地，在來自未經(jīng)免疫的或經(jīng)免疫的人類，或者超免疫非人靈長類 抗體文庫的重鏈和輕鏈可變區(qū)的最初PCR挽救之后，使PCR產(chǎn)物與4妄頭寡 核香酸組合，以產(chǎn)生scFv文庫，從而在與m13 pIII蛋白質(zhì)相應(yīng)的框中直接 克隆。該文庫將包含約超過106,或超過107，或超過108,或超過109個(gè)不 同成員，優(yōu)選超過107個(gè)不同成員或以上。作為質(zhì)量控制步驟，將隨機(jī)克隆 測(cè)序以評(píng)估總鐠的大小和復(fù)雜性。
抗體噬菌體展示文庫可以包含不同形式的抗體，例如單鏈Fv (scFv)或 Fab形式。關(guān)于綜述參見例如Hoogenboom, Mo/.所o/. 178:1-37
(2002)。
篩選
用于鑒定具有所需中和性質(zhì)的抗體的篩選方法已在上文描述?？梢愿?據(jù)直接與所需血凝素蛋白結(jié)合估計(jì)反應(yīng)性。
血凝素(HA)蛋白生產(chǎn)
可以用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)血凝素(HA)蛋白。在該方法中，將HA基因 克隆入適當(dāng)?shù)妮d體，優(yōu)選在桿狀病毒(baculovims)感染的昆蟲細(xì)胞(如草地貪 夜蛾(5)wJo;^ra/n^;peWa) (Sf9)細(xì)胞)中表達(dá)的桿狀病毒表達(dá)載體。
將編碼HA蛋白的核酸插入帶有或沒有C-末端表位標(biāo)簽(如多聚-組氨 酸(六聚組氨酸標(biāo)簽))的桿狀病毒表達(dá)載體，如Bac-to-Bac (Invitrogen)。多聚 -組氨酸標(biāo)簽可為容易通過鎳螯合層析法純化做準(zhǔn)備。
通常，克隆包括從個(gè)別合成的寡聚物通過組裝PCR (assembly PCR)制備參比cDNAs。相應(yīng)的分離物變體HA蛋白或者通過將適當(dāng)?shù)耐蛔児丫畚?代入另外的組裝PCR,或者通過誘變技術(shù)(例如通過Kunkel誘變)而制備。 對(duì)于H5，存在兩簇HA蛋白序列，即1997和2004亞型分離物。因此，對(duì) 每簇制備單一的參比蛋白。同樣地，對(duì)于1918西班牙流感(Spanishflu) (Hl)、 1958亞洲流感(Asian Flu) (H2)、 1968香港流感(Hong Kong Flu) (H3)以及當(dāng) 前的H1、 H2、 H3分離物，產(chǎn)生參比蛋白。
通過使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑(lipofectin)(可從Gibco-BRL商業(yè)上得到)將上述 桿粒(Bacmid)轉(zhuǎn)染入Sf9細(xì)胞(ATCC CRL 1711)，從而產(chǎn)生重組桿狀病毒。 在28。C溫育4-5天后，收獲釋放的病毒并用于進(jìn)一步擴(kuò)增。如O'Reilley等, 7 flcw/ov/rw5 五:^e肌'o 7 Pfectors.' JGZ>orator_y Mia麗fl/ (Oxford: Oxford University Press, 1994)所述進(jìn)行病毒感染和蛋白質(zhì)表達(dá)。
然后可以例如通過如下N產(chǎn)-螯合親和層析來純化表達(dá)的多聚-組氨酸 標(biāo)記的HA多肽。如Rupert等，A^mw 362:175-179 (1993)所述從重組的病毒 感染的Sf9細(xì)胞收集上清液。制備N產(chǎn)-NTA瓊脂糖柱(從Qiagen商業(yè)上可 得到)，柱床體積5mL,用25mL水洗滌，用25mL加樣緩沖液平衡。將經(jīng) 過濾的細(xì)胞提取物以每分鐘0.5mL加樣到柱上。用加樣緩沖液將柱洗至基 線A28Q，在該點(diǎn)開始級(jí)分收集。然后，用次級(jí)洗滌緩沖液(secondary wash buffer) (50 mM磷酸鹽；300 mM NaCl， 10%甘油，pH 6.0)洗柱，其洗脫非特異 性結(jié)合的蛋白質(zhì)。重新達(dá)到A加基線后，用0-500mM咪哇梯度在次級(jí)洗滌 緩沖液中洗脫(develop)柱。收集l-mL級(jí)分，通過SDS-PAGE和銀染色或用 N產(chǎn)-NTA-綴合于堿性磷酸酶(Qiagen)的Western印跡進(jìn)行分析。匯合包含洗 脫的His1()-標(biāo)記的HA多肽的級(jí)分，并相對(duì)加樣緩沖液透析。
或者，可以利用已知的層析技術(shù)進(jìn)行IgG-標(biāo)記的(或Fc-標(biāo)記的)HA多 肽的純化，所述已知的層析技術(shù)包括例如蛋白A或蛋白G柱層析。
作為使用Sf9細(xì)胞的替代，還可以在其它重組宿主細(xì)胞、原核生物、 酵母或高等真核生物中產(chǎn)生HA蛋白。合適的原核生物包括但不限于真細(xì) 菌，如革蘭陰性或革蘭陽性生物體，例如腸桿菌科(五"fera6acfen'aceae)如埃 希氏菌屬Cfoc/zen'c/n'a)，例如大腸桿菌(￡. co")、腸桿菌屬(五"fera6acter)、歐 文氏菌屬0&nWm'a)、克雷伯氏菌屬(《/￡&&//0)、變形桿菌屬(尸ratew"、沙門 氏菌屬0S<3/mcwe//(3)i。鼠"f另寒'沙門氏菌(Sa/wcwe〃a (y; /n'm、沙、雷氏菌屬 (5^rah.a)如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serra"a warcescamO ，和志賀氏菌屬0S7n'ge//<3),以及芽孢桿菌屬(to,如枯草芽孢桿菌(及s由/fe)和地衣芽孢桿菌(及
M柳/。鹿'力(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中所公開的地衣芽 孑包桿菌41P)、假單胞菌屬CP化Mcfomowa"如銅綠假單胞菌(/: aen^g/"a^)，和 鏈霉菌屬(&repto/^ce力。各種大腸桿菌菌抹是可公開得到的，例如大腸桿菌 K12菌抹MM294 (ATCC 31,446);大腸桿菌XI776 (ATCC 31,537);大腸桿 菌菌株W3110 (ATCC 27,325);和K5 772 (ATCC 53,635)。
除了原核生物外，真核微生物如絲狀真菌或酵母是含有編碼HA多肽 的斗亥酸的載體合適的克隆或表達(dá)宿主。西良酒酵母OSa"/z"TO附少cay cwev/W"g) 是通常使用的低等真核宿主微生物。但許多其它屬、種和菌抹是通?？傻?的并在本文中有用，例如粟酒裂殖酵母(Sc/H'ztwacc/zarawycaspow6e) (Beach 和Nurse, Atow廠e 290: 140 (1981); 1985年5月2日公開的EP 139,383);克 魯維酵母屬(《/M"eramyce力宿主(美國專利No. 4,943,529; Fleer等， 歷o/rec/wo/ogy 9:968-975 (1991))， 例如乳酸克魯維酵母(K Lacto) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等，J Sactenb/. 737 (1983》、脆 壁克魯維酵母(尺Frag///》(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(尺 5w/gan'c^) (ATCC 16,045)、威克克魯維酵母(《.iWc/^ram") (ATCC 24,178)、 尺.vra/& (ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K DrcwopMa m) (ATCC 36,906; Van den Berg等，Ao/rec/mo/ogy 8:135 (1990))、耐熱克魯維酵母(尺 77zwnoto/erara)和馬克斯克魯維酵母(L Marx/朋w力；西洋蓍霉屬(y^row-") (EP 402,226);巴斯德畢赤酵母(乃'c/^paWon》(EP 183,070; Sreekrishna等，J 5aw'c Micra6zW. 28:265-278 (1988)); 念珠菌屬(Ca"c/W力；里氏木霉 (7Hc/ (9(^/7wa /'eey/a) (EP 244,234); ^B4造月永孑包霉(7V"eMrosporfl c廠owa) (Case等, 尸rac. A^/. Jcad. "&4 76:5259-5263 (1979));許旺酵母屬(5b/mw7剛'omyce》 如許旺酵母(Sc/wa朋/omyc^ occWeMto/^) (1990年10月31日公開的EP 394,538);以及絲狀真菌例如脈孢菌屬(JVewras; ora)、青霉屬(Pem'"7"iim)、 彎頸霉屬(7b/，oc/a&Mm) (1991年1月10日公開的WO 91/00357),和曲霉 菌屬(j^yperg/〃w力宿主如構(gòu)巢曲霉(A wWw/a"力(Ballance等,歷oc厶em.所op/z".
Cowm麗.112:284-289 (1983); Tilburn等，26:205-221 (1983); Yelton 等，」c^/. 81:1470-1474 (1984))和黑曲霉(A Kelly
和Hynes,五MBO 4:475-479 (1985)。本文中曱基營養(yǎng)酵母(Methylotropic yeasts)是適合的，包括^:旦不限于能夠在甲醇上生長的選自以下屬的酵母漢
27遜酵母屬(/7朋"做/a)、念珠菌屬(Cawfefa)、克勒克酵母屬(《/oecfera)、畢赤 酵母屬(朽c/^a)、酵母屬(&cc/wramj;ce"、球擬酵母屬(7brw/o;w&)和紅酵母屬 (A/zoafoforM/a)?？稍贑. Anthony, T7ze Sz'oc/zemZsfr少o/iWef/iy/o&op/w 269 (1982) 中發(fā)現(xiàn)作為該類酵母的示例的特定種的列表。 .
用于表達(dá)HA蛋白的合適的宿主細(xì)胞包括多細(xì)胞生物的細(xì)胞。無脊推動(dòng) 物細(xì)胞的例子包括上述昆蟲細(xì)胞例如果蠅屬(Drosophila) S2和夜蛾屬 (Spodoptera) Sf9,以及植物細(xì)胞。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子包括中 國倉鼠卵巢(CHO)和COS細(xì)胞。更特別的例子包括由SV40 (COS-7， ATCC CRL1651)轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系；人胚腎細(xì)胞系(懸浮培養(yǎng)生長的HEK293 或亞克隆的HEK 293細(xì)胞(Graham等，■/ Wra/. 36:59 (1977));中國倉鼠卵 巢細(xì)胞ADHFR (CHO, Urlaub和Chasin，Ato/. ^cad 5W. t/W 77:4216 (1980));小鼠支持細(xì)胞(TM4， Mather,所o/.i eprod 23:243-251 (1980》；人肺細(xì) 胞(W138, ATCC CCL 75);人肝細(xì)胞(H印G2, HB 8065);以及小鼠乳房腫瘤 (MMT 060562, ATCC CCL51)。選擇適當(dāng)宿主細(xì)胞被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)。
血凝素(HA)蛋白淘選
將HA蛋白固定在孩么量滴定孔或磁珠的表面上，以淘選上述文庫。在 具體的實(shí)施方案中，用0.2M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.5)洗脫HA特異性結(jié) 合克隆之前，使每個(gè)文庫在4。C結(jié)合H5蛋白2小時(shí)，然后用冷PBS充分洗 滌。通過感染易感宿主大腸桿菌來pH中和并擴(kuò)增回收的噬菌體。隨后，可 以誘導(dǎo)噬菌粒產(chǎn)生，以重復(fù)陽性克隆的富集及隨后的克隆分離用于分類 (triage)。 一旦充分富集，通過感染將全庫轉(zhuǎn)移至非琥珀抑制子大腸桿菌菌林 如HB2151，以表達(dá)可溶性scFv蛋白?；蛘?，可以將所述庫亞克隆入單體 scFv表達(dá)載體如pBAD,并表達(dá)重組的可溶性scFv蛋白，用于體外分析和 表征，如下所述。
表征
首先檢驗(yàn)H5克隆對(duì)如上所述產(chǎn)生的H5蛋白的結(jié)合親合力。在特定的 例子中，檢驗(yàn)了與2004 H5蛋白(Refseq AAS65618, Isolate; A/Thailand/2 (SP-33)/2004(H5Nl))的結(jié)合，平行試驗(yàn);險(xiǎn)驗(yàn)與1997 H5蛋白(Refseq AAF74331, Isolate; A/Hong Kong/486/97(H5Nl))的結(jié)合，但其它分離物也可以單獨(dú)或以任意組合^f吏用。用2004和1997 H5蛋白得到的陽性克隆將分成 兩種主要類型2004選擇性和2004/1997非選擇性。用于中和的代表性功 能試驗(yàn)包括使用與紅血細(xì)胞結(jié)合的全病毒的血凝抑制試驗(yàn)。由于安全性問 題，優(yōu)選用重組蛋白質(zhì)和紅血細(xì)胞的可選的血凝試驗(yàn)。為了消除對(duì)全血的 需要，可在氣道上皮細(xì)胞上進(jìn)行血凝素結(jié)合抑制試驗(yàn)。結(jié)合試驗(yàn)可以以任 意配置(configuration)進(jìn)行，其包括但不限于任何基于流式細(xì)胞計(jì)量或細(xì)胞 ELISA(cELISA)的試驗(yàn)。使用cELISA是有利的，因?yàn)槠浔苊馐褂冒嘿F的流 式細(xì)胞術(shù)設(shè)備，并且能夠提供更自動(dòng)化的克隆評(píng)估和更大的數(shù)據(jù)收集。另 一方面，流式細(xì)胞術(shù)可以提供更高的靈敏度、 一致性和速度。
可以檢驗(yàn)H1克隆與任何H1蛋白的結(jié)合，包括與當(dāng)前的2004 Hl的結(jié) 合，平行檢驗(yàn)與1918和1976蛋白質(zhì)的結(jié)合。陽性克隆將分成兩個(gè)主要類 型2004選擇性和2004非選擇性。關(guān)鍵還是使用類似于上述的方法學(xué)檢驗(yàn) 中和。
可以以類似的方式表征其它HA蛋白，如H2和H3 。 優(yōu)化
對(duì)于流感流行和大流行(包括與由禽類(H5)病毒引起的人類感染有關(guān)的 潛在大流行)的有效處理，需要有效中和H蛋白(如H5蛋白)的當(dāng)前分離物以 及未來突變的抗體。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，需要鑒定結(jié)合靶向血凝素亞型的 所有已知分離物的各種H (例如H5)中和克隆。
如果需要，可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)一步改進(jìn)交叉反應(yīng)性，例如 通過精確突變(Look Through Mutagenesis) (LTM)，如2005年6月23日公開 的美國專利申請(qǐng)公開號(hào)20050136428中所述，其全部內(nèi)容由此通過引用明 示地并入本文。
審核突變(Look Through Mutagenesis) (LTM)是多維誘變方法，同時(shí)評(píng)估 并優(yōu)化所選氨基酸的組合突變。該方法集中于在一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū) (CDR)域內(nèi)精確分布，研究氨基酸側(cè)鏈化學(xué)作用的協(xié)同貢獻(xiàn)。LTM在CDR 內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)位置系列的(a positional series of)單突變，其中用許多選定的氨基 酸之一系統(tǒng)地取代每個(gè)野生型殘基。將突變的CDRs組合，以產(chǎn)生組合的單 鏈可變片段(scFv)文庫，其復(fù)雜性和大小增加，而不抑制所有變體的定量展 示。陽性選擇后，將性質(zhì)改進(jìn)的克隆測(cè)序，將那些有益的突變繪圖。為了
29鑒定HA結(jié)合性質(zhì)改進(jìn)的協(xié)同突變，可以用混合的DNA探針來生產(chǎn)表達(dá)所 有有益置換(permutation)的組合文庫(組合的有益突變，CBMs)，對(duì)其進(jìn)行陽 性選擇，分析以鑒定一組優(yōu)化的scFv候選者?？梢砸耘cFv和其它抗體文庫 類似的方式進(jìn)4于該方法。
還可以如上所述通過走查突變(WTM)進(jìn)行誘變。
另有一種有用的誘變方法，其有意地設(shè)計(jì)本文抗體與多于一種曱型流 感亞型和/或相同亞型的多于一種分離物的交叉反應(yīng)性，該方法在本文稱為 "目的"誘變?？蓪⒛康恼T變用于合理設(shè)計(jì)基于一個(gè)或多個(gè)抗體克隆的抗體集 合，優(yōu)選為不同反應(yīng)性的。在本發(fā)明的上下文中，將目的誘變用于編碼由 相似序列上類似位點(diǎn)限定的單個(gè)或多個(gè)殘基，所述相似序列如抗體的各 CDRs中的那些序列。在此情況下，利用寡聚物筒并性產(chǎn)生這些集合以獲得 在相應(yīng)位置中發(fā)現(xiàn)的殘基范圍。預(yù)期在該集合內(nèi)，親本克隆間或甚至親本 克隆外的那些將存在特異性的連續(xù)體(continuum)。目的誘變的目標(biāo)在于，在 兩個(gè)或多個(gè)分離的(discrete)實(shí)體或集合間產(chǎn)生不同多功能抗體集合或文庫。 就流感來說，可以利用該方法從而使用識(shí)別兩種不同表位的兩種抗體、分 離物，或亞型及兩種功能性質(zhì)轉(zhuǎn)變?nèi)雴蝹€(gè)抗體。舉例來說，第一種曱型流 感抗體可對(duì)曱型流感病毒H5亞型的越南(Vietnam)分離物特異，而第二種抗 體對(duì)H5亞型的泰國(Thailand)或土耳其(Turkish)分離物特異。為了創(chuàng)建目的 誘變文庫，首先獲得并比對(duì)兩種抗體的CDR序列。接著，用單個(gè)密碼子將 保守特性的所有位點(diǎn)固定到匹配的殘基。在非保守位點(diǎn)并入筒并密碼子以 編碼兩種殘基。在某些情況下，所述簡并密碼子將僅編碼在該位點(diǎn)的兩個(gè) 親本殘基。但在某些情況下，產(chǎn)生額外的副產(chǎn)物。可以調(diào)控(dial in)副產(chǎn)物 產(chǎn)生的水平以根據(jù)大小限制或目標(biāo)強(qiáng)制副產(chǎn)物產(chǎn)生或消除其產(chǎn)生。
因而，舉例來說，如果兩種抗體的第一位點(diǎn)分別為蘇氨酸和丙氨酸， 在最初兩個(gè)位點(diǎn)中有A/G-C-的簡并密碼子將僅編碼蘇氨酸或丙氨酸，與第 三個(gè)位點(diǎn)的堿基無關(guān)。如果例如，下一個(gè)位點(diǎn)殘基是賴氨酸和精氨酸，簡 并密碼子A-A/G-A/G將僅編碼賴氨酸或精氨酸。但如果使用了筒并密碼子 A/C-A/G-A/G/C/T,那么也將產(chǎn)生天冬酰胺、組氨酸、谷氨酰胺和絲氨酸副 產(chǎn)物。
為了方便起見，僅使用具有相匹配的CDR長度的抗體是更簡單的。強(qiáng) 制使用有相匹配的CDR長度的抗體的 一種方式是對(duì)第二抗原篩選大小受限的文庫，基于CDR長度和可能甚至是由最初發(fā)現(xiàn)的抗體賦予的框架限制。
但有人指出，使用等長的CDRs僅僅是方便，而不是要求。很容易看到，雖
然該方法將用于創(chuàng)建甲型流感病毒中和抗體的大的功能上不同的文庫，但 其適用范圍更廣?？蓪⒃撜T變技術(shù)用于生產(chǎn)任何抗體的功能上不同的文庫
或集合。因而，本文包括圖6,使用TNF-a抗體和CDlla抗體的CDRs作 為誘變的親本序列，以說明目的誘變方法的用途。
其它例示性誘變方法包括飽和資變(saturation mutagenesis)和易錯(cuò)聚合 酶鏈反應(yīng)(error prone PCR)。
飽和誘變(Hayashi等，Aofec/zm々w^ 17:310-315 (1994))是一種技術(shù)，其 中在蛋白質(zhì)中的特定位置所有20個(gè)氨基酸被取代，分析相應(yīng)于各變體的克 隆特定的表型(還參見美國專利Nos. 6,171,820; 6,358，709和6,361,974)。
易錯(cuò)PCR (Leung等，歸m— 1:11-15 (1989); Cadwell和Joyce,尸Ci A/"/zoJ^^/z'c. 2:28-33 (1992))是一種改良的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，其 將隨機(jī)點(diǎn)突變引入克隆的基因?？蓪⑺玫腜CR產(chǎn)物克隆以產(chǎn)生隨機(jī)突變 體文庫，或者如果將T7啟動(dòng)子并入適當(dāng)?shù)腜CR引物內(nèi)，則可將所得的PCR 產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)錄。
其它謙變4支術(shù)也是眾所周知的，例如描述于In Vitro Mutagenesis Protocols, J. Braman， Ed.， Humana Press, 2001 。
在目前情況下， 一個(gè)主要的目標(biāo)是設(shè)計(jì)一種抗體(或多種抗體)以有效地 處理當(dāng)前的H5 (或H7或H9)分離物以及未來的突變。為設(shè)計(jì)能夠識(shí)別新分 離物中的突變的有耐受性的抗體，應(yīng)鑒定結(jié)合許多種H5分離物(包括例如 近來的2004分離物和先前的1997分離物)的H5中和克隆。可以預(yù)期如果 克隆根據(jù)2004分離物選擇，其將以較低程度結(jié)合/中和1997分離物。該情 況下，目標(biāo)是在改進(jìn)(或至少維持)2004分離物結(jié)合的背景下，顯著地改進(jìn) 1997識(shí)別。因此，首先對(duì)改進(jìn)1997參比蛋白進(jìn)行選擇，然后對(duì)2004蛋白 選擇。這樣做對(duì)新菌抹提供更大的選擇壓力，而對(duì)第二參數(shù)維持壓力。
優(yōu)化可以基于任何上述文庫，或本領(lǐng)域已知的任何其它類型文庫，單 獨(dú)或任意組合。在具體的實(shí)施方案中，可通過篩選三種類型LTM文庫；三 重(triple)誘變的輕鏈文庫、三重誘變的重鏈文庫以及六重誘變的(輕鏈+重鏈) 文庫開始優(yōu)化?；旧先缟纤鎏赃xH5，盡管可能需要較小的修飾。例如， 在甘氨酸-HCl洗脫之前，人們可以用以下方法中的一種或兩種通過每輪增加洗滌嚴(yán)格性(washing stringencies)來選擇改進(jìn)的結(jié)合在室溫或37。C充分 洗滌，或在過量可溶性親本scFv存在下長時(shí)間溫育。這些選4奪修飾應(yīng)改進(jìn) 所得克隆中的解離速率(off-rate)動(dòng)力學(xué)。3-4輪選擇后，我們將測(cè)序隨機(jī)克 隆，并用ELISA檢測(cè)結(jié)合。對(duì)改進(jìn)的克隆進(jìn)行序列分析后，將所有容許的 改進(jìn)的突變組合入組合的有益誘變(CBM)文庫，以選4奪對(duì)兩種亞型H5分離 物結(jié)合的協(xié)同改進(jìn)。通過合成簡并寡核香酸以代表在所有位置所有改進(jìn)的 和原始的親本殘基，從而制得CBM文庫。在增加的嚴(yán)格性下選擇所得的文 庫，類似于LTM篩選。充分選擇之后，將庫亞克隆入pBAD表達(dá)載體，以 從大腸桿菌表達(dá)并純化單體scFv蛋白，用于如上所述的結(jié)合和中和試驗(yàn)。
可以以類似方式優(yōu)化Hl中和抗體。在該情況下，人們可以利用來自 1918、 1976和當(dāng)前的任何參比蛋白序列或者作為起點(diǎn)或者作為終點(diǎn)來選擇 和優(yōu)化。
另外，用中和抗體克隆檢驗(yàn)型間識(shí)別(intertype recognition).型間識(shí)別 的例子是從H5來源的或優(yōu)化的克隆巧合的(coincidental)或設(shè)計(jì)的Hl結(jié)合。
一旦已鑒定了具有所需性質(zhì)的中和抗體，則可能期望鑒定優(yōu)勢(shì)表位 (dominant epitope)或由大多數(shù)所述抗體識(shí)別的表位。用于表位作圖的方法是 本領(lǐng)i或眾所周知的，并且例如在Morris, Glenn E" Epitope Mapping Protocols, Totowa, NJ. ed., Humana Press, 1996; 和Epitope Mapping: A Practical Approach, Westwood禾口 Hay, eds., Oxford University Press, 2001中公開。
通過應(yīng)用區(qū)別不同抗體集合的獨(dú)特的條碼，可以大大促進(jìn)抗體文庫的 處理，所述文庫如來自不同供體的文庫或特征為與病毒(包括但不限于流感 病毒)亞型的不同分離物的反應(yīng)性的文庫。條碼優(yōu)選被選擇，以使它們能夠 連同標(biāo)記的克隆一起增殖。
因而，所述條碼可以是長度約1-24個(gè)非編碼核苷酸的非編碼DNA序 列，其可以通過測(cè)序或特定的PCR引物去巻曲(deconvoluted)。以這種方式， 核酸集合(如抗體語)可以在克隆步驟被連接。
在另一個(gè)例子中，條碼是沉默突變的編碼序列。如果文庫利用識(shí)別中 斷的回文序列(例如Sfi GGCCNNNNNGGCC)的限制酶，則可以并入不同的 核苷酸代替"N，s，，以區(qū)別不同克隆的集合，如抗體文庫。這種條碼方法優(yōu)點(diǎn) 在于譜在擴(kuò)增步驟被連接。
在不同的例子中，條碼是編碼序列，其編碼免疫學(xué)上不同的肽或與噬
32菌體顆粒融合的蛋白質(zhì)序列。實(shí)例包括例如與pin、 pvm、 pVII或pIX噬
菌體的表位(例如Myc、 HA、 FLAG)融合物。表位可以單獨(dú)或以各種組合使
構(gòu)型提供:、、、- 、 '， — 、" ^ \ , 、 ， ^
酶學(xué)噬菌體修飾(對(duì)于噬菌體文庫)。所述標(biāo)記對(duì)于單輪選擇是優(yōu)選的。
雖然在本文說明了條碼用于區(qū)別抗體文庫，但普通技術(shù)人員將理解， 所述方法通?？蓮V泛適用于獨(dú)特地標(biāo)記和區(qū)別核酸分子和核酸的集合。
中和抗體的產(chǎn)生
一旦具有所需中和性質(zhì)的抗體得以鑒定，可以用本領(lǐng)域眾所周知的方 法生產(chǎn)所述抗體(包括抗體片段)，所述方法包括例如雜交瘤技術(shù)或重組DNA技術(shù)。
在雜交瘤方法中，將小鼠或其它適當(dāng)宿主動(dòng)物(如倉鼠)免疫，以抽取產(chǎn) 生或能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特異性結(jié)合于用于免疫的蛋白 質(zhì)?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后使用合適的融合劑(如聚乙二醇) 使淋巴細(xì)月包與骨髓瘤細(xì)月包融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986》。
將這樣制備的雜交瘤細(xì)胞接種并在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長，所述培養(yǎng)基 優(yōu)選包含一種或多種抑制非融合的、親本骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。 例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥。票呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶 (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) (HGPRT或HPRT)， 用于雜 交瘤的培養(yǎng)基通常將包括次黃噪呤、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(HAT培 養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細(xì)胞生長。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些有效融合，通過選擇的抗體生成細(xì)胞支持穩(wěn)定 高水平抗體生產(chǎn)，以及對(duì)培養(yǎng)基(如HAT培養(yǎng)基)敏感的細(xì)胞。其中，優(yōu)選的 骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤細(xì)胞系，如源自MOPC-21和MPC-ll小鼠腫瘤(可 乂人Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAl尋到)禾口 SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection), Rockville, Maryland USA得到)的那些細(xì)胞系。也已描述了 人骨髓瘤和小鼠-人異種骨髓瘤細(xì)胞系用于生產(chǎn)人單克隆抗體(Kozbor, X/m應(yīng)/w/. 133:3001 (1984);和Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987》。
分析雜交瘤細(xì)胞正在其中生長的培養(yǎng)基中定向針對(duì)抗原的單克隆抗體 的產(chǎn)生。優(yōu)選地，用免疫沉淀法或體外結(jié)合測(cè)定(如放射性免疫測(cè)定(RIA) 或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELIS A))來測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié) 合特異性。
可以例如通過分離編碼所需抗體鏈的DNA和使用用于共表達(dá)的編碼 序列共轉(zhuǎn)染重組宿主細(xì)胞(使用眾所周知的重組表達(dá)載體)，來生產(chǎn)重組單克 隆抗體。重組宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，例如上述那些細(xì)胞。
低抗原性非常重要。根據(jù)所謂的"最佳適合(best-fit)"方法，針對(duì)已知的人可 變區(qū)序列的全庫篩選嚙齒類抗體的可變區(qū)序列。然后將最接近于嚙齒類序 列的人類序列作為人源化抗體的人類框架區(qū)(FR) (Sims等，J /mm腦o/. 151:2296 (1993); Chothia等， / Jkfo/.所o/. 196:901 (1987》。重要的是，被人源 化的抗體保留對(duì)抗原的高親和性和其它有利的生物學(xué)性質(zhì)。為了達(dá)到這個(gè) 目的，根據(jù)優(yōu)選的方法，通過以下方法制備人源化抗體利用親本和人源 化序列的三維模型分析親本序列和各種概念上的(conceptual)人源化產(chǎn)物。
另外，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)人抗體。例如，可以制得轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物(例如小鼠)，其一旦免疫，就能夠在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生時(shí)產(chǎn) 生人抗體全譜。參見例如Jakobovits等，i^oc.淑/. Jcad t/&4 90:2551 (1993); Jakobovits等,淑,362:255-258 (1993); Bmggermann等,腸r /w附柳a 7:33 (1993);和美國專利Nos. 5,591,669、 5,589,369和5,545,807。
中和抗體的用途
本發(fā)明的流感中和抗體可以用于預(yù)防和/或治療曱型流感感染。對(duì)于治 療應(yīng)用，通常以藥物組合物的形式使用抗體或其它分子，通過使用抗體或 基于抗體的運(yùn)輸序列促進(jìn)所述抗體或其它分子的傳遞。通?？梢栽?Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，Mack Publishing Co. (Easton， Pa. 1990)中找到技術(shù)和配方。也參見Wang和Hanson "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: 'Stability and Stabilizers," Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42-2S (1988)。
34抗體通常以凍干配方或水溶液的形式配制。可接受的載體、賦形劑或 穩(wěn)定劑在使用的劑量和濃度對(duì)于受者是無毒的，包括緩沖液如磷酸鹽、檸
檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八基 二曱千基氯化《會(huì)(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride); 氯己雙4妄 (hexamethonium chloride); 苯扎氯銨(benzalkonium diloride)、 千索氯按 (benzethonium chloride);苯酚、丁醇或苯曱醇；烷基對(duì)羥苯甲酸酯類(alkyl parabens)如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚(catechol);間苯 二酚(resorcinol);環(huán)己醇(cyclohexanol); 3-戊酉f和間曱酚(m-cresol)); 4氐分子 量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親 水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone);氨基酸如甘氨酸、谷氨 酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類包括 葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA;糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或 山梨醇；成鹽反荷離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非 離子型表面活性劑如TWEEN 、 PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。
也可將抗體包埋到例如通過凝聚技術(shù)或界面聚合(分別例如羥曱基纖
維素或明膠微嚢和聚-(甲基丙烯酸甲酯)(poly-(methylmethacylate))微嚢)在 膠體藥物傳遞系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米嚢) 中或在粗乳狀液中制備的樣吏嚢劑中。所述技術(shù)在Remington's Pharmaceutical Sciences,見上文中公開。
還可將本文公開的中和抗體配制成免疫脂質(zhì)體。用本領(lǐng)域已知的方法 制備含有所述抗體的脂質(zhì)體，如描述于Epstein等，尸rac. Ato/. ^cad 5W. 82:3688 (1985); Hwang等，尸rac. Ato"cW. 77:4030 (1980);美國專
利Nos. 4,485,045和4,544,545;以及1997年10月23日公開的W097/38731 。 在美國專利No. 5,013,556中公開循環(huán)時(shí)間增加的脂質(zhì)體。
可以通過反相蒸發(fā)法用包括磷脂酰膽石咸、膽固醇和PEG-衍生的磷脂酰 乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物產(chǎn)生特別有用的脂質(zhì)體。通過限定孔徑的濾 器擠出脂質(zhì)體，以產(chǎn)生有所需直徑的脂質(zhì)體。可以通過二硫互換(disulfide interchange)反應(yīng)，將本發(fā)明抗體的Fab'片段綴合于如Martin等J!所o/. C/rew. 257:286-288 (1982)中所述的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體內(nèi)任選地包含化學(xué)治療劑。參 見Gabizon等乂 Ato/o腦/ Owce〃"W. 81(19)1484 (1989)。
對(duì)于疾病的預(yù)防或治療，抗體的合適劑量將取決于待治療感染的類型、疾病的嚴(yán)重性和病程(course),以及是否為預(yù)防或治療目的施用抗體。將抗 體合適地施用于患者， 一次(at one time)或經(jīng)一系列治療。根據(jù)疾病的類型 和嚴(yán)重性，約1昭/kg至約15 mg/kg抗體是施用于患者的通常初始候選劑量， 不論例如通過一次或多次分別施用，還是通過連續(xù)輸注施用。
通過以下非限制性實(shí)施例說明本發(fā)明進(jìn) 一 步的細(xì)節(jié)。
實(shí)施例
來自較早禽流感爆發(fā)存活者的抗體文庫及中和抗體的制備
材津+和方法
骨髓規(guī)程和血清制備
通過標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺術(shù)(venopuncture)得到血液，使其凝塊，并處理以回 收血清。血清于-20。C貯藏3-4天，直到將其通過干冰運(yùn)送。通過注射局部 麻醉藥使供者麻醉，從每個(gè)H5N1存活者的髖骨(pelvic bone)移出5ml骨髓。 接著將這5ml骨髓放入含45 ml RNAlater (Ambion)的無菌50-ml管中。將混 合物輕輕顛倒大約8-20次，直到?jīng)]有可見凝塊(clump),骨髓和RNAlater 良好混合。然后將樣品在2-10。C冷藏過夜。過夜冷藏后，將樣品于-2(TC貯 藏3-4天，直到將其通過千冰運(yùn)送。 一旦收到，就將含有RNAlater/骨髓和 血清的管貯藏于-80。C直至對(duì)其進(jìn)行處理。
血清學(xué)
通過室溫過夜溫育，用lOO[il溶于1XELISA板包被溶液的100ng/mL H5血凝素(Protein Sciences, A/Vietnam/1203/2004)包被ELISA板(Thermo, Immulon 4HBX 96W)。第二天，用300 ^ PBS/ 0.05% Tween-20 (PBST)洗板 3次。洗滌后，加入300 fxl封閉溶液(blocking solution)(溶于PBS/ 0.05% Tween-20的4%脫脂乳粉)，并在室溫溫育1小時(shí)。封閉步驟之后，用300 |il PBS/ 0.05% Tween-20洗板3次。接著，將在PBS/ 0.05% Tween中1:20,000 稀釋的100 (il血清樣品在室溫溫育1-2小時(shí)，然后用300 pi PBS/ 0.05% Tween-20洗滌3次。將在PBS/ 0.05% Tween中1:5,000稀釋的100 pi抗-人 Fc-HRP綴合物在室溫溫育1-2小時(shí)，然后用300 (il PBS/ 0.05% Tween-20洗 滌3次。這次最終洗滌之后，加入100 |il生色底物溶液(TMBl Substrate, BioFx),足量時(shí)間后，通過加入100 jil STOP溶液(BioFx)終止。在平板讀取 器(Molecular Devices Thermomax微孔板閱讀器，應(yīng)用Softmax Pro軟件)上 讀取了 450nm的吸光度，記錄數(shù)據(jù)，隨后用Excel (Microsoft)繪圖。骨髓RNA提取和mRNA純化
通過離心法除去RNA later從而回收骨髓(20 ml RNA later中 2.5 ml)(之 前貯藏于-80。C),然后重懸于含300jid乙酸的11.25 ml TRIBD試劑(Sigma)。 然后劇烈渦旋沉淀。接著，加入1.5 ml BCP(l-溴-3-氯丙烷，Sigma),通過渦 旋混合，在室溫溫育5分鐘，然后在4°C 12000 xg離心15分鐘。小心移除 水相而不擾亂界面。接著添加25 ml異丙醇^f吏總RNA /人水相析出，在室溫 溫育10分鐘，并在4。C 12000 xg離心10分鐘。隨著異丙醇的加入，由于 殘留的RNAlater而形成兩相，導(dǎo)致析出的RNA沉降在界面。為了去除殘留 的RNAlater并允許最大程度回收RNA，加入溶于水的50%異丙醇的5 ml 等分試樣并混合直到無顯著的相分離，在該點(diǎn)通過于4匸12000 xg離心10 分鐘來沉淀RNA。用75Q/。EtOH洗滌RNA沉淀，將其轉(zhuǎn)入無RNA酶的1.6 ml微量離心管，再通過離心回收。最后，將RNA沉淀物重懸于100fillmM Na-磷酸鹽(pH 8.2)中，讀取A26()和A280來估計(jì)RNA純度。
在反轉(zhuǎn)錄之前，按照Qiagen Oligotex mRNA純化試劑盒從總RNA純化 mRNA。簡言之，用無RNA酶的水使50-200嗎骨髓RNA達(dá)250 pl，并與 250 (il OBB緩沖液和Oligotex懸浮液混合，之后在70。C溫育3分鐘。使 01igotex顆粒的寡聚dT3o和mRNA聚腺苷酸尾之間的雜交在室溫進(jìn)行10分 鐘。然后將雜交懸液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)柱(spincolumn)并離心1分鐘。用400 |al緩 沖液OW2洗滌旋轉(zhuǎn)柱兩次。然后通過離心用20 pi熱(70。C)緩沖液OEB洗 脫純化的mRNA兩次。通常產(chǎn)量為500 ng-1.5 (ig總RNA。
利用N9和Oligo dT對(duì)骨髓mRNA反轉(zhuǎn)錄
通過將75-100 ng mRNA與2 |il 1 OX Accuscript RT緩沖液(Stratagene)、 0.8 pi 100 mM dNTPs以及或者N9 (300 ng)或者寡聚dT引物(IOO ng)混合在 一起，然后加水使最終體積至17 fil，來完成反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)。將混合物65°C 加熱5分鐘，然后使其冷卻至室溫。接著將2 |il DTT、 0.5 pi RNase Block (Stratagene)、 0.5 |il AccuScript RT (Stratagene)加入每個(gè)反應(yīng)。然后，將N9 引發(fā)的反應(yīng)在室溫溫育lO分鐘，將寡聚-dT引發(fā)的反應(yīng)在冰上溫育10分鐘。 最后，將兩個(gè)反應(yīng)在42°C溫育60分鐘，然后70°C溫育15分鐘以破壞酶。
從源自骨髓的cDNAPCR
基本上利用先前描述的方法和簡并引物(O'Brien, P.M., Aitken R. Standard protocols for the construction of scFv Libraries. Antibody PhageDisplay — Methods and Protocols, vol 178, 59-71, 2001, Humana Press),基于人 種系V和J區(qū)，從骨髓cDNA擴(kuò)增了抗體重鏈和輕鏈譜。
簡言之，將利用Oligo dT引發(fā)的cDNA (來自75 ng mRNA用于人輕鏈) 和N9引發(fā)的cDNA (來自75 ng mRNA用于k輕鏈，來自lOOng m認(rèn)A用 于重鏈)的PCR反應(yīng)與以下混合在一起5 (il 10X擴(kuò)增緩沖液(Invitrogen)、 1.5 |il dNTPs (10 mM)、 1 pi MgS04 (50 mM)、 2.5 pi V區(qū)引物(10 uM)和2.5 pi J區(qū)引物(10 uM) -10 uM用于VH、 0.5 |il Platinum Pfx聚合酶(Invitrogen)和無 菌dH20至終體積50 pl。 PCR參數(shù)如下步驟1-95°C 5分鐘，步驟2-95°C 30 秒，步驟3-58°C 30秒，步驟4-68。C 1分鐘，步驟5-步驟2-4循環(huán)40次， 步驟6-68°C 5分鐘。用Qiagen PCR Cleanup試劑盒提純輕鏈PCR產(chǎn)物。用 Qiagen Gel Extraction試劑盒從1.5。/。瓊脂糖凝膠中凝膠純化重鏈PCR產(chǎn)物， 然后再擴(kuò)增。重鏈再擴(kuò)增如下進(jìn)行混合lOpl lOX擴(kuò)增緩沖液(Invitrogen)、 3 pi dNTPs (10mM)、 2 pi MgS04 (50 mM)、 5 [xl各VH引物(10 uM)和JH引物 (IOuM)、 5 |il重鏈初級(jí)PCR產(chǎn)物、1 |il Platinum Pfk,用水將體積調(diào)整至100 |il。循環(huán)參數(shù)如下步驟1-95。C5分鐘，步驟2-95。C30秒，步驟3-58°C30 秒，步驟4-68°C 1分鐘，步驟5-步驟2-4循環(huán)20次，步驟6-68°C 5分鐘。 用Qiagen Extraction試劑盒從1.5。/。瓊脂糖-TAE凝膠中提純了再擴(kuò)增的重鏈 PCR產(chǎn)物。
抗體p藍(lán)菌體文庫構(gòu)建
使用插在非翻譯區(qū)末端pin終止密碼子之后的獨(dú)特的識(shí)別性3-核苷酸 條碼，構(gòu)建了對(duì)每個(gè)個(gè)體禽流感存活者單獨(dú)的抗體文庫。
輕鏈克隆
用Notl和BamHI消化每個(gè)供體匯合的k輕鏈和匯合的人輕鏈各1嗎， 并用Qiagen Gel Extraction試劑盒將其從1.5%瓊脂糖-TAE凝膠中凝膠純化。 用Notl和BamHI消化每種載體5 (ig,并用Qiagen Gel Extraction試劑盒將 其從1。/。瓊脂糖-TAE凝膠中凝膠純化。用200 ng凝膠純化的k或X插入片 段和l嗎凝膠純化的載體在60 |il中室溫1小時(shí)或14。C過夜進(jìn)行文庫連接。 用Edge BioSystem Perfroma旋轉(zhuǎn)柱將連接物除鹽。在80 pi TG-1或XL-1 Blue 等分試樣中以5次電穿孔轉(zhuǎn)化文庫，各自在lmlSOC中回收，匯合并在37 。C生長(outgrow) 1小時(shí)。在該生長后通過將來自每個(gè)轉(zhuǎn)化體的等分試樣鋪
38板來測(cè)定轉(zhuǎn)化體的總量。通過37。C在200 ml2YT+50fig/ml氨千青霉素+ 2%葡萄糖中過夜生長來擴(kuò)增剩余的電穿孔物。利用Qiagen High Speed Maxiprep試
重鏈克隆
以40 Unit過量/嗎DNA用Sfil和Xhol消化供體特異性重鏈(VHl 、 VH 2, 5， 6庫、VH 3和VH 4)各1.5-2jLig，并使用Qiagen Ge〗Extraction試劑盒將其從 1.5%瓊脂糖-TAE凝膠中凝膠純化。以40 Unit/昭DNA用Sfil和Xhol消化的 各輕鏈文庫載體15嗎，并用Qiagen Gel Extraction試劑盒將其從1%瓊脂糖 -TAE凝膠中凝膠純化。通過組合1.2嗎Sfil/Xhol消化的、凝膠純化的重鏈供 體集合和5嗎每種輕鏈文庫(K和X)在14。C過夜，從而建立文庫連接。然后用 Edge BioSystem Perfroma旋轉(zhuǎn)柱將文庫連接物除鹽，然后在80 pi TG-1等分 試樣中通過每個(gè)文庫20次電穿孔將文庫連接物轉(zhuǎn)化，各自在1 ml SOC中回 收，匯合并在37。C生長1小時(shí)。還是在該生長后，用每個(gè)轉(zhuǎn)化體的等分試樣 測(cè)定轉(zhuǎn)化體的總數(shù)，同時(shí)將剩余物轉(zhuǎn)移到lL2YT + 50(ig/ml氨千青霉素+2。/。 葡萄糖，使其在37。C以劇烈通氣生長至OD6oo為 0.3。然后以5:1的多重性 感染(MOI)加入M13K07輔助噬菌體，并在37。C無攪拌溫育1小時(shí)。接著通 過離心收獲細(xì)胞，重懸于lL2YT + 50嗎/ml氨千青霉素、70嗎/ml卡那霉素， 使細(xì)胞在37。C以劇烈通氣過夜生長，以使scFv噬菌粒產(chǎn)生。第二天早上通 過離心收集細(xì)胞并收集含噬菌粒的上清液。通過加入0.2倍體積20% PEG/5 M NaCl溶液并水上溫育1小時(shí)，4吏噬菌粒從上清液析出。然后通過離心收獲噬 菌粒文庫儲(chǔ)備物(stock)，并重懸于20 ml無菌PBS。通過額外的離心移除殘 余的細(xì)菌，并將最終的噬菌粒文庫于-2(TC貯藏在PBS+50。/。甘油中。
噬菌粒淘選和擴(kuò)增
用ELISA包被溶液(BioFX)中的100 ng/mL H5血凝素蛋白(Protein Sciences, A/Vietnam/1203/2004) 100 pl通過室溫過夜培養(yǎng)來包被ELISA板 (Immulon 4HBX平底，Nunc)。第二天，用300 pi PBST洗板3次。洗滌后， 加入300 (!l封閉溶液(PBS/0.05。/。Tween-20中4%脫脂乳粉)并在冰上溫育30 分鐘。封閉步驟之后，用300 plPBST洗板3次。就在噬菌體淘選之前，用 Millipore Amicon Ultra柱從冷凍噬菌粒儲(chǔ)備物除去甘油，然后在4%脫脂乳 粉中封閉15分鐘。接著，將噬菌粒的100 ^等分試樣分到8個(gè)孔(總噬菌體
39 lxl012CFU),在4。C溫育2小時(shí)后用300 (il PBST洗滌6-8次。在100 (il/ 孔洗脫緩沖液(0.2M甘氨酸-HCl, pH 2.2， 1 mg/ml BSA)中室溫10分鐘后，收 集噬菌粒。然后通過向每毫升洗脫液中加入56.25^1 2M Tris堿來中和洗脫 液。中和后，用0.5 ml中和的噬菌體在2-YT中在37°C不振搖感染5 ml TG1 細(xì)胞(OD6(K) 0.3) 30分鐘。該步驟后，將一些細(xì)胞鋪于LB AMP Glucose平板 上以測(cè)定總噬菌?；厥章?。將剩余的接種物置入10ml2-YTAG(終濃度2。/0 葡萄糖和50ug/ml氨千青霉素)，并在37。C以劇烈通氣生長至OD600 0.3。接 著，用M13K07輔助噬菌體以5:1的MOI感染培養(yǎng)物，并在37。C不振搖溫 育30-60分鐘。通過離心收集細(xì)胞并重懸于25ml 2-YTAK (氨千青霉素50 |ig/ml,卡那霉素70嗎/ml)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至新鮮培養(yǎng)瓶，并在37。C不振搖生長。 隨后的幾輪被類似地回收和擴(kuò)增。 scFv ELISA
來自生物淘選的噬菌體的大腸桿菌HB2151轉(zhuǎn)化細(xì)胞的各克隆于37°C 在1 ml 2YT+ 100 fig/ml AMP中過夜生長。第二天早上，通過離心收獲細(xì)胞， 重懸于1.5 ml胞質(zhì)裂解緩沖液(lml BBS (Teknova) + 0.5 ml 10mg/ml溶菌酶 + EDTA至10 mM終濃度)。通過離心再沉淀細(xì)胞并收集含胞質(zhì)裂解物的 scFv。將scFv裂解物與稀釋緩沖液(PBS/0.050/。 BSA) 1:1組合，加100 jul至 之前已經(jīng)用抗原包被的孔中，并用稀釋緩沖液封閉。在室溫將該樣品溫育2 小時(shí)，然后用PBS/ 0.05% Tween洗滌3次。接著將稀釋緩沖液中的1:5000 稀釋的生物素抗-組氨酸小鼠(Serotec) 100 (il加入每孔并在室溫溫育1小時(shí)。 這次溫育后，用PBS/ 0.05% Tween將孔洗滌3次，然后向每孔加入100 |il 1:2500抗生蛋白鏈菌素:HRP(Serotec)，并在室溫溫育1小時(shí)，然后用PBS/ 0.05% Tween洗滌3次。這次最終洗滌后，加入100 |il生色底物;容液(TMB1 Substrate, BioFx)，在足量時(shí)間后，通過加入100 |al STOP溶液(BioFx)來終止。 在平斧反"i賣耳又器(Molecular Devices Thermomax《鼓孑14反讀器，具有Softmax Pro 軟件)上讀取450nm的吸光度，記錄數(shù)據(jù)，隨后用Excel (Microsoft)繪圖。
測(cè)序
為了推出重鏈和輕鏈序列，使各克隆生長并提取質(zhì)粒DNA (Qiagen)。 對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序。 血凝素抑制(HAI)試驗(yàn)基本上按照Rogers等，P7油gy 131:394-408 (1983)的方法，每孔使用4 HAU(血凝單位)的病毒或蛋白在圓底微孔板(Coming)中進(jìn)行血凝抑制。對(duì)于 HAI測(cè)定，在每個(gè)微量滴定孔中將純化的單鏈可變片段(scFv)的25^1樣品與 含4 HAU4全驗(yàn)病毒的25 pl PBS混合。室溫預(yù)孵化15分鐘后，加入25|il 0.75%人紅細(xì)胞并混合。在室溫溫育60分鐘后通過目測(cè)確定HAI抗體活性。
結(jié)果
在2006年1月土耳其發(fā)生H5N1禽流感爆發(fā)，大約爆發(fā)4個(gè)月后，從 其中6名存活者收集骨髓和血液樣本。對(duì)于所有6名存活者，根據(jù)由土耳 其衛(wèi)生部(Turkish Ministry of Health)核準(zhǔn)的體格檢查、臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)和分 子診斷測(cè)定來進(jìn)行禽流感的初次診斷。這些存活者中4名另外由世界衛(wèi)生 組織(WHO)確認(rèn)。用上述血清學(xué)方案分析血清樣本，以證實(shí)存在對(duì)H5血凝 素(A/Vietnam/1203/2004)的抗體。如圖7所示，所有6名患者(分別稱為SLB H1-H6)的血液樣本表明存在對(duì)H5抗原的抗體。此證實(shí)之后，從這些個(gè)體的 骨髓樣本提取RNA,利用如上所述的規(guī)程純化并反轉(zhuǎn)錄骨髓mRNA。然后 如上所述從骨髓cDNA擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈語，對(duì)每個(gè)存活者分別克隆各 抗體重鏈和輕鏈?zhǔn)删w文庫，其使用上述三-核香酸條碼以區(qū)別各文庫。
還從2006年因流感癥狀而治療的12名當(dāng)?shù)毓┱呤占斯撬韬脱簶?本。如上所述進(jìn)行血清學(xué)，以證實(shí)存在分別針對(duì)H1、 H3和H5血凝素的抗 體。如圖8所示，所有血清樣本對(duì)于針對(duì)Hl和/或H3血凝素的抗體4全測(cè)為 陽性，其中某種亞型的優(yōu)勢(shì)取決于曱型流感病毒亞型，特定供者大多數(shù)他 的或她的整個(gè)一生暴露于所述曱型流感病毒亞型。有趣的是，還存在其血 清包含顯著水平的H5血凝素抗體的供者(圖8中供者SLB1和SLB5)。此證 實(shí)之后，從供者的骨髓樣本提取RNA，利用如上所述的規(guī)程純化并反轉(zhuǎn)錄 骨髓mRNA。然后如上所述從骨髓cDNA擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈語，對(duì)每個(gè) 供者分別克隆各抗體重鏈和輕鏈?zhǔn)删w文庫，其使用上述三-核苷酸條碼以 區(qū)別各文庫。
如圖9所示，使用可用的4個(gè)核苷酸中的3個(gè)允許產(chǎn)生64個(gè)獨(dú)特的條碼。 從由土耳其禽流感存活者的骨髓樣本制備的匯合抗體文庫的三輪淘選 后得到的48個(gè)隨機(jī)克隆中，用ELISA檢驗(yàn)40個(gè)與H5血凝素蛋白(Protein Sciences, A/Vietnam/1203/2004)的結(jié)合，以及與滅活的越南H5N1病毒(CBER, A/Vietnam/1203/2004)的結(jié)合。將克隆測(cè)序。在40個(gè)克隆中，發(fā)現(xiàn)5個(gè)是不
41同的。如圖10所示，所有5個(gè)不同的克隆(克隆F5和Gl具有相同的序歹'J) 與H5蛋白和越南H5N1病毒都結(jié)合。圖11顯示序列比對(duì)，其比較來自土 耳其供者的H5血凝素蛋白序列和用在上述實(shí)驗(yàn)中的越南分離物的H5血凝 素序列。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，盡管序列不同，但檢驗(yàn)到抗體與土耳其和 越南H5蛋白和病毒都結(jié)合，因此顯示了與H5N1病毒的多于一種分離物的 交叉反應(yīng)性。
從通過第二輪淘選產(chǎn)生的12個(gè)克隆中鑒定了 4個(gè)額外的獨(dú)特克隆。
圖12和圖13顯示在土耳其供者的匯合抗體文庫中鑒定的獨(dú)特克隆的 重鏈可變區(qū)序列，連同相應(yīng)的輕鏈和種系起源序列。特別地，圖12顯示的 序列(3-23.個(gè)重鏈克隆)源于3輪淘選后所有土耳其供者的所有重鏈和輕鏈的 匯合文庫。圖13顯示的序列(3-30個(gè)重鏈克隆)源于兩輪淘選后所有土耳其 供者的所有重鏈和輕鏈的匯合文庫。
利用上述ELISA規(guī)程，在4輪淘選后，從各土耳其供者的抗體文庫鑒 定了額外的獨(dú)特H5N1特異性抗體重鏈可變區(qū)序列。圖14A-D中顯示這些 H5N1 ELISA陽性克隆的序列。
圖15和圖16顯示使用目的誘變創(chuàng)建不同的抗體重鏈和輕鏈文庫，其 使用通過分析如上所述的土耳其禽流感存活者的血清和骨髓而鑒定的抗體 重鏈(圖15)和輕鏈(圖16)序列。
圖17和圖18顯示ELISA結(jié)果，其證實(shí)某些獲自H5N1越南(Vietnam) 病毒scFv抗體的Fab片段與HA蛋白質(zhì)的土耳其(Turkish)和印尼(Indonesian) 變體的交叉反應(yīng)性。
盡管在上述說明中參考某些實(shí)施方式說明了本發(fā)明，但本發(fā)明并不受 這些實(shí)施例的限制。事實(shí)上，除本文指出和描述的那些之外，根據(jù)上述說 明，本發(fā)明的各種修飾將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，并且落入所 附的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
說明書各處引用的所有參考文獻(xiàn)由此通過引用明示地并入本文。
4權(quán)利要求
1.一種中和抗體，其中和甲型流感病毒亞型的多于一種分離物和/或甲型流感病毒的多于一種亞型。
2. 權(quán)利要求1的中和抗體，其中和甲型流感病毒H1亞型的多于一種 分離物。
3. 權(quán)利要求1的中和抗體，其中和曱型流感病毒H3亞型的多于一種 分離物。
4. 權(quán)利要求1的中和抗體，其中和曱型流感病毒Hl和H3亞型。
5. 權(quán)利要求4的中和抗體，其中和曱型流感病毒Hl和/或H3亞型的 多于一種分離物。
6. 權(quán)利要求1的中和抗體，其中和曱型流感病毒亞型的基本上所有分離物。
7. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求6的中和抗體，其中所述亞型選自下組H5、 H7和H9亞型。
8. 權(quán)利要求7的中和抗體，其中所述亞型是H5亞型。
9. 權(quán)利要求8的中和抗體，其中所述抗體中和曱型流感病毒H5亞型 的基本上所有分離物。
10. 權(quán)利要求7的中和抗體，其中所述亞型是H7亞型。
11. 權(quán)利要求10的中和抗體，其中所述抗體中和曱型流感病毒H7亞 型的基本上所有分離物。
12. 權(quán)利要求7的中和抗體，其中所述亞型是H9亞型。
13. 權(quán)利要求12的中和抗體，其中所述抗體中和曱型流感病毒H9亞 型的基本上所有分離物。
14. 權(quán)利要求7的中和抗體，其進(jìn)一步中和曱型流感病毒的至少 一種額 外的H亞型。
15. 權(quán)利要求14的中和抗體，其中所述額外的H亞型選自下組Hl、 H2和H3亞型。
16. 權(quán)利要求15的中和抗體，其中和所述曱型流感病毒的額外的H亞 型的多于一種分離物。
17. 權(quán)利要求l的中和抗體，其中和曱型流感病毒的H5N1亞型。
18. 權(quán)利要求17的中和抗體，其中和曱型流感病毒的H5N1亞型的多于一種分離物。
19. 權(quán)利要求18的中和抗體，其中至少一種所述分離物具有感染人類的能力。
20. 權(quán)利要求19的中和抗體，其中至少一種所述分離物已從人類受試 者獲得。
21. 權(quán)利要求20的中和抗體，其中所述人類受試者是患病的。
22. 權(quán)利要求20的中和抗體，其中所述人類受試者從曱型流感病毒的 H5N1亞型的感染中恢復(fù)。
23. 權(quán)利要求19的中和抗體，其中至少一種所述分離物已從非人動(dòng)物獲得。
24. 權(quán)利要求23的中和抗體，其中所述非人動(dòng)物是禽類。
25. 權(quán)利要求24的中和抗體，其中所述非人動(dòng)物是野禽。
26. 權(quán)利要求24的中和抗體，其中所述非人動(dòng)物是家禽。
27. 權(quán)利要求18的中和抗體，其中和曱型流感病毒的H5N1亞型的基 本上所有分離物。
28. 權(quán)利要求17的中和抗體，其中和H5N1亞型和選自下組的至少一 種額外的亞型H1N1、 H2N2和H3N2亞型。
29. 權(quán)利要求28的中和抗體，其中和甲型流感病毒的H5N1亞型的多 于一種分離物。
30. 權(quán)利要求29的中和抗體，其中和曱型流感病毒的H5N1亞型的基 本上所有分離物。
31. 權(quán)利要求30的中和抗體，其中和所述額外的亞型的多于一種分離物。
32. 權(quán)利要求31的中和抗體，其中和所述額外的亞型的基本上所有分離物。
33. 權(quán)利要求1的中和抗體，其中所述抗體與H5蛋白結(jié)合。
34. 權(quán)利要求33的中和抗體，其中所述抗體與H5.蛋白的多于一種變體結(jié)合。
35. 權(quán)利要求34的中和抗體，其中所述抗體與H5蛋白的所有變體結(jié)合。
36. 權(quán)利要求35的中和抗體，其中所述抗體與至少一種額外的H蛋白結(jié)合。
37. 權(quán)利要求36的中和抗體，其中所述額外的H蛋白選自下組Hl、 H2和H3蛋白。
38. 權(quán)利要求37的中和抗體，其中所述抗體與所述額外的H蛋白的多 于一種變體結(jié)合。
39. 權(quán)利要求38的中和抗體，其中所述抗體與所述額外的H蛋白的基 本上所有變體結(jié)合。
40. —種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的中和抗體。
41. 一種用于鑒定抗體的方法，所述抗體能夠中和甲型流感病毒亞型的 多于 一種分離物或曱型流感病毒的多于一種亞型，該方法包括鑒定在抗體 文庫中與所述甲型流感病毒亞型的第 一和第二分離物都反應(yīng)的抗體或與所述曱型流感病毒亞型的第一和第二亞型反應(yīng)的抗體，以及使鑒定的抗體經(jīng)連續(xù)交替輪次的選擇，分別基于它們結(jié)合所述第一和第二分離物，或所述 第一和第二亞型的能力。
42. 權(quán)利要求41的方法，其包括至少兩輪選擇。
43. 權(quán)利要求41的方法，其中所述第一和第二分離物是所述曱型流感 病毒H5N1亞型的不同分離物。
44. 權(quán)利要求41的方法，其中通過對(duì)分別與第一分離物和第二分離物 反應(yīng)的抗體的至少兩輪單獨(dú)富集，來鑒定所述與第一和第二曱型流感病毒 亞型分離物都反應(yīng)的抗體，并重組鑒定的抗體。
45. 權(quán)利要求41的方法，其中所述可與所述第一和所述第二曱型流感 亞型分離物都反應(yīng)的抗體在進(jìn)行所述分別基于它們結(jié)合所述第一和第二分 離物的能力的連續(xù)交替輪次的選擇之前進(jìn)行誘變。
46. 權(quán)利要求41的方法，其中所述抗體文庫是噬菌體展示文庫。
47. 權(quán)利要求46的方法，其中通過生物淘選進(jìn)行選擇。
48. 權(quán)利要求41的方法，其中所述曱型流感病毒亞型是H5N1亞型。
49. 權(quán)利要求48的方法，其中所述第一分離物是H5N1病毒的2006 土 耳其(Turkish)分離物。
50. 權(quán)利要求48的方法，其中所述第一分離物是H5N1病毒的 2003/2004越南(Vietnam)分離物。
51. 權(quán)利要求48的方法，其中所述第二分離物是H5N1病毒的 2003/2004越南(Vietnam)分離物。
52. 權(quán)利要求50的方法，其中所述第二分離物是H5N1病毒的1997香 港(Hong Kong)分離物。
53. 權(quán)利要求48的方法，其中所述第一和所述第二分離物源于不同物種。
54. 權(quán)利要求53的方法，其中至少一種所述物種是人類。
55. 權(quán)利要求53的方法，其中至少一種所述物種是禽類。
56. 權(quán)利要求41的方法，其中所述能夠結(jié)合所述第一和所述第二分離 物的抗體是基于它們結(jié)合多于 一種曱型流感亞型的能力而另外選擇的。
57. —種序列的集合，所述序列由通過權(quán)利要求41至56中任一項(xiàng)的方 法鑒定的中和抗體共享。
58. —種序列的集合，所述序列包含圖11、圖12、圖13和圖14 A-D 中所示的 一種或多種獨(dú)特的重鏈和/或輕鏈序列或者基于所述序列的共有序 列或變體序列。
59. —種可通過權(quán)利要求41至56中任一項(xiàng)的方法鑒定的中和抗體或其片段。
60. 權(quán)利要求59的中和抗體或其片段，其包含選自圖11、圖12、圖 13和圖14 A-D中所示的獨(dú)特序列的重鏈和/或輕鏈序列或者基于所述序列 的共有序列或變體序列。
61. 權(quán)利要求59或權(quán)利要求60的中和抗體或抗體片段，其能夠賦予禽 類或哺乳動(dòng)物受試者針對(duì)曱型流感病毒感染的被動(dòng)免疫。
62. 權(quán)利要求61的中和抗體或抗體片段，其中所述哺乳動(dòng)物受試者是人。
63. 權(quán)利要求62的中和抗體或抗體片段，其中所述曱型流感病毒感染 是由選自下組的病毒引起的H5N1、 H1N1、 H2N2和H3N2亞型。
64. —種用于預(yù)防和/或治療受試者中甲型流感感染的方法，其包括向 所述受試者施用有效量的權(quán)利要求40的組合物。
65. —種用于治療受試者中曱型流感感染的方法，其包括向所述受試者 施用有效量的權(quán)利要求59的中和抗體。
66. 權(quán)利要求64或權(quán)利要求65的方法，其中所述受試者是人類患者。
67. —種用于預(yù)防曱型流感感染的方法，其包括向有發(fā)生曱型流感感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用有效量的權(quán)利要求40的組合物。
68. —種用于預(yù)防曱型流感感染的方法，其包括向有發(fā)生曱型流感感染 風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用有效量的權(quán)利要求59的中和抗體。
69. 權(quán)利要求67或權(quán)利要求68的方法，其中所述受試者是人類患者。
70. —種用于產(chǎn)生不同多功能抗體集合的方法，其包括(a)比對(duì)至少兩 個(gè)功能上不同的抗體的CDR序列，(b)鑒定在比對(duì)的CDR序列之間保守的 氨基酸殘基，和(c)使用簡并寡核苷酸探針，在至少一個(gè)比對(duì)的CDR序列中 進(jìn)行多個(gè)非保守氨基酸殘基的誘變，所述探針編碼至少在功能上不同的抗 體中在經(jīng)誘變產(chǎn)生比對(duì)的CDR序列的多個(gè)變體的非保守位置存在的氨基酸 殘基，并且，如果需要，用一個(gè)或多個(gè)所述變體重復(fù)步驟(b)和(c)，直到所 述抗體集合達(dá)到所需程度的多樣性或大小。
71. 權(quán)利要求70的方法，其中比對(duì)的CDR序列具有一樣的長度。
72. 權(quán)利要求70的方法，其中步驟(c)中產(chǎn)生的經(jīng)誘變的變體保留所有
73. 權(quán)利要求70的方法，其中步驟(c)中產(chǎn)生的經(jīng)誘變的變體保留所有 在所有比對(duì)的CDR序列中存在的保守殘基。
74. 權(quán)利要求70的方法，其中所述功能上不同的抗體與靶抗原上的不 同表位結(jié)合。
75. 權(quán)利要求70的方法，其中所述功能上不同的抗體與不同靶抗原結(jié)合。
76. 權(quán)利要求75的方法，其中所述不同靶抗原是相同抗原的變體。
77. 權(quán)利要求70的方法，其中所述功能上不同的抗體具有不同的結(jié)合 親合力。
78. 權(quán)利要求70的方法，其中所述功能上不同的抗體具有不同的生物 學(xué)性質(zhì)。
79. 權(quán)利要求70的方法，其中所述功能上不同的抗體與曱型流感病毒處會(huì)Z口口 0
80. 權(quán)利要求79的方法，其中至少兩種所述功能上不同的抗體與相同 曱型流感病毒上的不同表位結(jié)合。
81. 權(quán)利要求79的方法，其中所述功能上不同的抗體與不同曱型流感病毒亞型結(jié)合。
82. 權(quán)利要求79的方法，其中至少兩種所述功能上不同的抗體與相同曱型流感病毒亞型的不同分離物結(jié)合。
83. 權(quán)利要求79的方法，其中至少兩種所述功能上不同的抗體與相同 曱型流感病毒亞型的不同分離物和不同曱型流感病毒亞型結(jié)合。
84. 權(quán)利要求70至83中任一項(xiàng)的方法，其中至少兩種所述功能上不同 的抗體具有不同的結(jié)合親合力。
85. 權(quán)利要求70至83中任一項(xiàng)的方法，其中至少兩種所述功能上不同 的抗體在它們中和其所結(jié)合的曱型流感病毒的能力上不同。
86. —種抗體集合，其包含在至少一種性質(zhì)上相互不同的多個(gè)中和抗體。
87. 權(quán)利要求86的抗體集合，其包含至少約IOO個(gè)中和抗體。
88. 權(quán)利要求87的抗體集合，其由權(quán)利要求70至83中任一項(xiàng)的方法制備。
89. —種用于獨(dú)特地鑒定集合中的核酸的方法，其包括用獨(dú)特的條碼標(biāo) 記所述核酸，所述條碼連接于或整合入所述集合中存在的核酸的序列中。
90. 權(quán)利要求89的方法，其中所述條碼是長度為1個(gè)至約24個(gè)核苷酸 的非編碼核苷酸序列。
91. 權(quán)利要求90的方法，其中所述非編碼核苷酸序列連接于標(biāo)記的核 酸序列的3'非編碼區(qū)。
92. 權(quán)利要求89的方法，其中所述條碼是整合入標(biāo)記的核酸序列中的 一個(gè)或多個(gè)沉默突變的編碼序列。
93. 權(quán)利要求89的方法，其中所述條碼是肽或多肽序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定、生產(chǎn)和設(shè)計(jì)針對(duì)甲型流感病毒的中和抗體的方法和手段，還涉及產(chǎn)生的中和抗體。特別是，本發(fā)明涉及針對(duì)各種甲型流感病毒亞型的中和抗體，例如包括針對(duì)H1、H2、H3、H5、H7和H9中兩種或多種(例如所有H1、H2、H3和H5亞型)的中和抗體，還涉及用于制備所述抗體的方法和手段。更具體地，本發(fā)明涉及能夠中和甲型流感病毒亞型的多于一種，優(yōu)選所有的分離物的抗體。
文檔編號(hào)C07K16/08GK101495511SQ200780025877
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2007年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月15日
發(fā)明者勞倫斯·霍羅威茨, 拉梅什·R·巴特, 阿倫·K·卡什亞普 申請(qǐng)人:航道生物技術(shù)有限責(zé)任公司