專利名稱：巴馬丁在治療西尼羅病毒感染藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，更具體涉及一種巴馬丁在制備治療或預防抗西尼羅病毒感染藥物中的應用。
背景技術：
西尼羅病毒(West Nile Virus,麗V)于1937年在非洲的烏干達首次被發(fā)現(xiàn)，從西尼羅地區(qū)的一位發(fā)熱的成年婦女血液中分離到，因此得名西尼羅病毒。其廣泛分布于非洲，歐洲，澳大利亞，亞洲以及西半球的美國，加拿大，墨西哥，加勒比和中美洲以及南美洲，主要引起西尼羅河熱。鳥是該病毒的存貯宿主，是該病毒的主要傳染源，蚊子是該病毒的傳播媒介。目前，已經(jīng)從很多鳥類體內(nèi)檢査到該病毒，蚊子叮咬感染鳥類后，病毒在蚊體內(nèi)經(jīng)過10-14天的時間便存在于蚊的唾腺中，可以經(jīng)由叮咬其他動物或人類而傳播病毒，病毒進入動物或人的血液后，會透過血腦屏障進入腦內(nèi)，引發(fā)腦炎。目前一般使用對西尼羅病毒敏感的哺乳動物細胞系來分離病毒。目前還沒有針對WNV感染的特效治療藥物，同時也沒有批準上市的人用西尼羅病毒疫苗。因此，對于抗西尼羅病毒的藥物的開發(fā)和人用西尼羅病毒疫苗的研究是十分緊急和迫切的任務。中國目前尚未發(fā)現(xiàn)WNV感染的臨床病例，但是這并不能使我們放松對該病毒的警惕，因為中國的氣候、地理環(huán)境復雜，蚊蟲種類繁多，具備傳播條件，同時隨著國際交流的日益頻繁，WNV傳入中國境內(nèi)的可能性非常大。另外，中國每年都有相當數(shù)量病因不明的病毒性腦炎病例，由于國內(nèi)對WNV的研究還沒有深入的研究。因此，也不能完全排除已存在麗V感染病例的可能性，對WNV應提高警惕。
因此，我們應該高度重視這些病原，加強對其的科研力度，做好相關知識和藥物的儲備。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種巴馬丁在制備治療或預防西尼羅病毒感染藥物中的應用，以WNV編碼的絲氨酸蛋白酶為對象進行體外的藥物篩選，研究結果顯示黃連水提取液對絲氨酸蛋白酶具有較強抑制效果，在5g/L (藥物質(zhì)量/溶液體積)濃度下，其對蛋白酶的抑制率達到99.179L同時，來源于黃連的有效成分巴馬丁在100 M濃度下對這些病毒抑制率分別為97. 71%。巴馬丁在濃度分別為100 M條件下，Vero細胞的存活率為92. 93%。巴馬丁能夠有效地抑制西尼羅病毒，但是對細胞沒有毒性，可進一步開發(fā)為治療這些病毒感染引起的疾病的藥物，具有廣泛的應用前景。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案-
巴馬丁來源于中藥黃連，是黃連的主要成份之一，目前，巴馬丁已經(jīng)在臨床上用于治療婦科炎癥,菌痢，腸炎，呼吸道及泌尿道感染,外科感染等。
A. NS3蛋白的體外表達
采用原核表達的方式在￡ co7/BL21 (DE3)(美國AMERSHAM)中表達WNV編碼的NS3蛋白，對表達的NS3蛋白進行純化，同時用蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白的濃度，分裝后于-7CTC保存。
B. 體外篩選體系
NS3蛋白能特異性的識別底物pERTKR-細C (R&D Systems公司)，同時能對pERTKR-AMC進行切割，因此在激發(fā)波長為380 nm和發(fā)射波長為460 nm下，通過熒光讀取儀讀取值。將藥物與NS3蛋白作用30分鐘，然后加入底物，檢測激發(fā)波長為380 nm和發(fā)射波長為460 nm的值。
C. 巴馬丁對Vero細胞的毒性實驗
Vero細胞是WNV的易感細胞。因此，本實驗首先檢測巴馬丁對Vero細胞的細胞毒性，以不同濃度的巴馬丁作用于Vero細胞，來了解在細胞存活率為90%以上的巴馬丁的最大使用濃度，為后續(xù)的巴馬丁對WNV的抑制作用實驗提供參考數(shù)據(jù)。
D. 巴馬丁對WNV的抑制實驗以不同濃度的巴馬丁作用于已經(jīng)感染了 WNV的Vero細胞，來獲得巴馬丁對病
毒的抑制效率。本實驗中的巴馬丁的使用濃度均在使Vero細胞在90%以上存活率的濃度的范圍內(nèi)，因此，可以排除巴馬丁的濃度過高而對實驗數(shù)據(jù)的分析產(chǎn)生影響。
一種巴馬丁在作為制備治療或預防西尼羅病毒感染藥物中的應用，其基本過 程是
A、 NS3蛋白的表達和純化
將質(zhì)粒pWNVNS2BNS3 (參考文獻Niklaus HM， Changsuek Y， Vannakambadi KG， Padmanabhan R. INT J BIOCHEM CELL B (2007) 39: 606-614.)轉(zhuǎn)入￡ BL21 (DE3)(美國認ERSHAM)，用接種環(huán)接種于含30嗎/ml Kan (美國AMRESCO)的固 體LB培養(yǎng)基，待長出單菌落后，挑取單菌落接種于含30 pg/ral Kan的液體LB培養(yǎng) 基中，培養(yǎng)12h，置2 8 。C過夜(12-16 h)，次日將2 8i:過夜的菌液按iy。(v/v) 接種于l L新鮮的含30 p g/ml Kan的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至0D6。。為0. 60時， 加終濃度為O. 5咖ol/L的IPTG (美國Sigma)，在16 。C培養(yǎng)16 h;將菌液以8000 r/min離心10分鐘，棄上清，收集菌體，在_70 。C過夜，然后加入20 ml結合緩沖 液[20 mM Tris-HCl (美國AMRESCO) ， 0. 5 M NaCl (國藥集團化學試劑有限公 司)，5 mM Imidazole (美國AMRESCO)， pH 7.9)， 4 。C振蕩l h后，用超聲波充 分破碎。破碎的溶液在4 'C環(huán)境下經(jīng)20，000 g，離心30 niin,收集上清。使用 His-BindKits (美國Novagen公司)來純化蛋白，對純化的蛋白進行透析，然后 使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)檢測蛋白的濃度，分裝 成小管后置-7(TC保存?zhèn)溆?。從而獲得純化的NS3蛋白。
B、 以NS3為靶標的體外篩選體系
以10 mM Tris-HCl, pH 8.0， 20% (v/v) glycerol (國藥集團化學試劑 有限公司)為反應的緩沖體系，整個反應的體積為0. 1 mL [蛋白酶的終濃度為5 g/L，底物pERTKR-AMC (腿D Systems公司)的終濃度為50 M ]。稱取5 g 黃連，加入10 mL無菌去離子水，煎煮30 min,然后10000 g離心5 min，棄沉 淀，收集上清,于-70 。C保存?zhèn)溆?。巴馬丁購自于成都曼思特生物科技有限公司， 黃連購自于北京同仁堂武漢大藥房。
實驗步驟將中藥黃連水提取液和巴馬丁分別與NS3蛋白混合，于室溫 (20-25'C以下相同)作用60min,然后加入底物。對照不加藥物，在激發(fā)波長 ( " excitation wavelength) 為 380 nm禾口發(fā)射波長(柳，emission
5wavelength)為460 nm的條件下使用Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (BioTek Instruments, Winooski, USA)讀取值。
表1黃連水提取液和巴馬丁對NS3蛋白的抑制作用
檢測內(nèi)容測量值
黃連水提取液530520521
巴馬丁145711475415002
對照631296301163212
C.巴馬丁對Vero細胞的毒性實驗:
Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)是WNV的易感細胞。實驗中的Vero細胞購買 于中國科學院上海生科院細胞資源中心；MTT試劑盒購于碧云天生物技術研究 所；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)購買于美國GIBCO公司；細胞培養(yǎng)板購 買于德國Greiner bio one公司；DMEM培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基購買于美國 GIBCO公司。
實驗步驟如下
1:接種Vero細胞用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個細 胞懸液，以每孔1000—10000個細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種體積100
2:培養(yǎng)Vero細胞在37°C, 5% (v/v) C02培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2天； 3:加入巴馬丁吸棄每個孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個孔中加入100pl用 含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應濃度(0nM,0.4nM， 1.2^M, 3,7jiM, ll|aM,33pM, 100|aM,300 nM)的巴馬丁，對照孔加不加含10% (v/v) 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100
4-呈色培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT溶液10 pi,在37 °C， 5% (v/v) C02 培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，然后加入Formazan溶解液，在37 °C， 5% (v/v) C02 培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，直至在普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)fomiazan全部溶 解；
5.測量在570nm測定吸光值。表2不同濃度的巴馬丁對Vero細胞的毒性實驗
Concentration(nM)OD570 nm
00.7880.7670.834
0.40.8100.7380.764
1.20.7420.8020.812
3.70.7340.7460.758
110.7540細0,747
330.7390.7630.766
1000.7180.7470.753
3000.6310.6960.674
D、巴馬丁對WNV的抑制實驗；
以Vero細胞為培養(yǎng)病毒W(wǎng)NV的細胞，MOI為0.1 ，實驗步驟如下-在24孔細胞培養(yǎng)板中接入Vero細胞，24小時后細胞長至單層(細胞覆蓋 孔底的面積約為80-卯％)，吸出培養(yǎng)基，接入病毒樣品200 nl， 37 。C吸附2小 時。吸附完成后，吸棄各孔中的病毒液，用DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。 加入用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的指定濃度(0 0.4 pM， 1.2 3.7 jaM, 11 ^M， 33 ^M, 100 )liM)的巴馬丁，于37 。C、 5% (v/v) C02的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)42小時，收集各個孔中的上清，做病毒噬斑實驗。
病毒噬斑實驗在24孔板中接入Vero細胞，24小時后細胞長至單層(細 胞覆蓋孔底的面積約為80-90%),吸棄各孔中的培養(yǎng)基，接入用含3% (v/v)胎 牛血清的DMEM培養(yǎng)基10倍系列稀釋的病毒樣品200pl, 37°C吸附2小時。吸 附完成后將各個孔的上清板吸棄，用10% (v/v) FBS的DMEM培養(yǎng)基洗去未 吸附的病毒。加入新鮮的45。C預熱的半固定培養(yǎng)基[A成分3% (v/v) FBS， 2xMEM培養(yǎng)基，青霉素(美國AMRESCO)和鏈霉素(美國AMRESCO)終濃度分 別為100U/ml， 0.1mg/ml; B成分1% (w/v)的瓊脂糖(法國Biowest)。 A成 分B成分-l: 1 (v/v)]，于37。C、 5% (v/v) C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 72小 時。待噬斑形成后用結晶紫(美國AMRESCO)染色(2。/。 (w/v)結晶紫溶于10% 甲酲)，2小時后用流水沖去結晶紫和瓊脂糖，在顯微鏡下對每孔產(chǎn)生的 細胞噬斑，根據(jù)噬斑數(shù)和稀釋倍數(shù)計算病毒的滴度(PFU/ml， PFU: plaque formation unit噬斑形成單位)。PFU-病毒稀釋度xP/V， (P:空蝕斑數(shù)目；V:接種 量)。在2次不同的時間進行實驗。表3不同濃度的巴馬丁對WNV滴度降低實驗
ConcentrationOiM) Viral titer (108 PFU/mL)
03428
0.42824
1.22421
3.71814
11"10
333.42.7
1000.720.69
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果:
本發(fā)明利用體外建立的以WNV的NS3絲氨酸蛋白酶為耙標的藥物篩選平 臺，篩選具有抑制NS3絲氨酸酶活性的藥物。絲氨酸蛋白酶對WNV的成熟具 有十分重要的作用，該酶的生物學活性如果被抑制，病毒將不能存活。因此，以 該酶為靶標進行抗該病毒的藥物篩選，具有十分現(xiàn)實的意義，目標明確，能夠有 效地節(jié)約時間和減少藥物篩選的工作量。巴馬丁來源于中藥黃連，獲取十分方便， 由于中藥是中國重要的自然資源，具有很強的民族特色，而且一些報道也顯示 中藥在預防和治療一些疾病的過程中發(fā)揮著重要的作用。中藥在一定程度上能有 效地增強機體的免疫力，毒副作用較小甚至無毒副作用，同時，由于巴馬丁已經(jīng) 用于臨床治療婦科炎癥,菌痢，腸炎,呼吸道及泌尿道感染,外科感染等。鑒于巴馬丁 在臨床上已經(jīng)使用多年，因此，其臨床使用很安全性。
黃連的水提取液對NS3絲氨酸酶的抑制率達到99.17%。同時，來源于黃連 的有效成分巴馬丁在100 ^M濃度下對這些病毒抑制率分別為97.71%。巴馬丁在 濃度分別為100 ^M條件下，Vero細胞的存活率為92.93%。巴馬丁能夠有效地 抑制西尼羅病毒，但是對細胞沒有毒性，可進一步開發(fā)為治療這些病毒感染引起 的疾病的藥物，具有廣泛的應用前景。
圖l蛋白的表達和純化
1、蛋白質(zhì)Marker (Fermentas); 2.純化后的蛋白，蛋白大小約為36 kDa 圖2黃連水提取液和巴馬丁對NS3絲氨酸蛋白酶的抑制作用 1、巴馬?。?.黃連水提取液反應體系為100pL,巴馬丁，黃連水提取液在反應中的終濃度分別為355 pM， 5 g/L，對絲氨酸蛋白酶的抑制率分別為76.59%, 99.17%。 圖3巴馬丁對Vero細胞的毒性實驗
巴馬丁對Vero的細胞毒性實驗，在0 kiM， 0.4 1.2 3.7 |iM, 11 pM, 33 ^M, 100 ^M, 300 濃度下，Vero細胞的平均存活率分別為100%, 96.87%, 98.70%, 93.77%, 96.56%,95.04%， 92.93%,83.88%。 圖4巴馬丁對WNV的抑制作用
巴馬丁對WNV的抑制作用，在0iiM, 0.4 iaM， 1.2 pM， 3.7 (aM, 11 ^M， 33 liM，lOO pM濃度下，分別在不同的時間進行實驗，病毒的滴度分別為3.4X109 PFU/mL, 2.8 X109 PFU/mL, 2.4 X109 PFU/mL, 1.8 X109 PFU/mL， 1.1 X109 PFU/mL, 3.4X 108 PFU/mL， 7.2X 107 PFU/mL和2.8X 109 PFU/mL, 2.4X 109 PFU/mL, 2.1 X 109PFU/mL， 1.4X109 PFU/mL, 1.0X109 PFU/mL, 2.7X108 PFU/mL， 6.9X107 PFU/mL，其平均抑制率分別為0%, 15.97%, 27.21%, 48.53%, 65.97%, 90.18%, 97.71%。
圖5巴馬丁的結構和分子式
中文名巴馬丁，英文名Palmatine，分子式C21H22N04 ，分子量352.40， CAS 號3486-67-7。
具體實施例方式
本發(fā)明中所用的LB培養(yǎng)基的制備方法為配制1L的用量:蛋白胨10g酵母 抽提物5gNaCl 10g調(diào)pH值至7.0-7.2.分裝后于121。C滅菌15 min。 實施例1:
一種巴馬丁在作為制備治療或預防西尼羅病毒感染藥物中的應用，其步驟是 B、 NS3蛋白的表達和純化
將質(zhì)粒pET28a-WNV-NS2BCF44NS3 (編碼有NS3基因，由美國Wadsworth center的石沛勇博士惠贈，基因和質(zhì)料必須寫明文獻的出處，不能寫惠贈)轉(zhuǎn)入 co//BL21 (DE3)(美國AMERSHAM)，用接種環(huán)接種于含30 pg/ml Kan (美國 AMRESCO)的固體LB培養(yǎng)基，待長出單菌落后，挑取單菌落接種于含30 pg/ml Kan的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h,置2 8 。C過夜(12-16h)，次日將2 8X:過 夜的菌液按1% (v/v)接種于l L新鮮的含30ng/mlKan的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至OD6oo為0.60時，加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG (美國Sigma)，在16 。C培養(yǎng) 16 h;將菌液以8000r/min離心10分鐘，棄上清，收集菌體，在-70 。C過夜，然后 加入20ml結合緩沖液[20mMTris-HCl (美國AMRESCO) ,0.5MNaCl (國藥 集團化學試劑有限公司)，5 mM Imidazole (美國AMRESCO)， pH 7.9)， 4 。C振蕩l h后，用超聲波充分破碎。破碎的溶液在4 。C環(huán)境下經(jīng)20，000g,離心30min，收 集上清。使用His-BindKits (美國Novagen公司)來純化蛋白，對純化的蛋白進 行透析，然后使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)檢測蛋白 的濃度，分裝成小管后置-7(TC保存?zhèn)溆?。從而獲得純化的NS3蛋白。結果見圖l。
B、 以NS3為靶標的體外篩選體系
以10 mM Tris-HCl, pH 8.0， 20% (v/v) glycerol (國藥集團化學試劑有限公 司)為反應的緩沖體系，整個反應的體積為0.1mL[蛋白酶的終濃度為5iag/L， 底物pERTKR-AMC(R&D Systems公司)的終濃度為50 pM ]。稱取5 g黃連，加 入10 mL無菌去離子水，煎煮30 min，然后10000 g離心5 min,棄沉淀，收集上 清，于-70 'C保存?zhèn)溆谩０婉R丁購自于成都曼思特生物科技有限公司，黃連購自于 北京同仁堂武漢大藥房。
實驗步驟將中藥黃連水提取液和巴馬丁分別與NS3蛋白混合，于室溫 (20-25°C)作用60 min，然后加入底物。對照不加藥物，在激發(fā)波長(Xex， excitation wavelength)為380 nm禾卩發(fā)射波長(Xem， emission wavelength)為460 nm的條件下使用 Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (BioTek Instruments, Winooski, USA)讀取值。結果見圖2。
C. 巴馬丁對Vero細胞的毒性實驗
Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)是WNV的易感細胞。 實驗步驟如下
1:接種Vero細胞用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個 細胞懸液，以每孔1000—10000個細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種體積
歸pi;
2:培養(yǎng)Vero細胞在37'C,5。/。
(v/v) C02培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2天； 3:加入巴馬丁吸棄每個孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個孔中加入100^用 含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應濃度(0!iM,0.4ixM, 1.2(xM,
103.7 nM, 11 33 ^M, 100 jiM, 300 |aM)的巴馬丁，對照孔加不加含10% (v/v) 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100
4:呈色培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT溶液IO 在37 °C, 5% (v/v) C02 培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，然后加入Formazan溶解液，在37 。C, 5% (v/v) C02 培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，直至在普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)formazan全部溶 解；
5. 測量在570nm測定吸光值。
6. 實驗結果見圖3。
D、巴馬丁對WNV的抑制作用
以Vero細胞為培養(yǎng)病毒W(wǎng)NV的細胞，MOI為0.1 ，實驗步驟如下 1.在24孔細胞培養(yǎng)板中接入Vero細胞，24小時后細胞長至單層(細胞 覆蓋孔底的面積約為80-90%)，吸出培養(yǎng)基，接入病毒樣品200^d， 37 C吸附2 小時。吸附完成后，吸棄各孔中的病毒液，用DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。 加入用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的指定濃度(0 pM, 0.4 ^M, 1.2 ^M， 3.7岸，11 pM， 33 ^M， 100 ^M)的巴馬丁，于37 。C、 5% (v/v) C02的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)42小時，收集各個孔中的上清，做病毒噬斑實驗。
2. 病毒噬斑實驗在24孔板中接入Vero細胞，24小時后細胞長至單層 (細胞覆蓋孔底的面積約為80-90%)，吸棄各孔中的培養(yǎng)基，接入用含3% (v/v)
胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10倍系列稀釋的病毒樣品200pl， 37°C吸附2小時。 吸附完成后將各個孔的上清板吸棄，用10% (v/v) FBS的DMEM培養(yǎng)基洗去 未吸附的病毒。加入新鮮的45'C預熱的半固定培養(yǎng)基[A成分3% (v/v) FBS， 2xMEM培養(yǎng)基，青霉素和鏈霉素終濃度分別為100U/ml， 0.1 mg/ml; B成分 1% (w/v)的瓊脂糖(法國Biowest)。 A成分B成分4: 1 (v/v)]，于37°C、 5% (v/v) C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 72小時。待噬斑形成后用結晶紫(美國 AMRESCO)染色(2% (w/v)結晶紫溶于10% (v/v)甲醛)，2小時后用流水沖 去結晶紫和瓊脂糖，在顯微鏡下對每孔產(chǎn)生的細胞噬斑，根據(jù)噬斑數(shù)和稀釋倍數(shù) 計算病毒的滴度(PFU/ml， PFU: plaque formation unit噬斑形成單位)。PFl^病 毒稀釋度xP/V， (P:空蝕斑數(shù)目；V:接種量)。
3. 實驗結果見圖4。
1權利要求
1、一種巴馬丁在制備治療或預防西尼羅病毒感染藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種巴馬丁在制備治療或預防西尼羅病毒感染藥物中的應用。巴馬丁對西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)具有很好抑制作用，巴馬丁在100M濃度下對這些病毒抑制率分別為97.71％。而巴馬丁在濃度分別為100M條件下，Vero細胞的存活率為92.93％。巴馬丁能夠有效地抑制西尼羅病毒，但是對細胞沒有毒性，可進一步開發(fā)為治療這些病毒感染引起的疾病的藥物，具有廣泛的應用前景。
文檔編號A61K31/4375GK101596194SQ20091006316
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月14日 優(yōu)先權日2009年7月14日
發(fā)明者晶 李, 石沛勇, 蔡全信, 袁志明, 凡 賈, 罡 鄒, 鄭大勝, 閆建平 申請人:中國科學院武漢病毒研究所