專利名稱：檢測人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及病毒學、分子生物學和生物制品領域，尤其是一種檢測人西尼羅病毒 IgG抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
西尼羅病毒(West Nile Virus，WNV)為黃病毒科黃病毒屬(Flavivirus)，為單股正鏈RNA病毒，表達的蛋白可以分為10個單獨的蛋白結構3個結構蛋白，囊膜蛋白( E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(C)，以及7個非結構蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、 NS4B和NS5結構與登革病毒等黃病毒相似。西尼羅病毒感染人體以后可以引起一種稱之為“西尼羅熱”的急性傳染病。這種病毒可以引起高熱、頭痛、肌肉疼痛、皮疹、淋巴結腫大等癥狀，可侵犯中樞神經系統(tǒng)，產生腦膜腦炎癥狀，嚴重者危及病人生命。目前尚無有效的治療方法和疫苗接種，因此該病一旦暴發(fā)流行極易引起人們的恐慌，已構成全球性公共衛(wèi)生的新威脅。西尼羅病毒感染的主要流行地區(qū)是非洲、北美洲、歐洲，但近年來，印度、馬來西亞、泰國、菲律賓、土耳其、以色列、印度尼西亞、巴基斯坦等我國周邊的國家相繼出現，并有向我國傳入的趨勢，加強西尼羅病毒傳入的監(jiān)測和防范工作非常必要，尤其需要加強出入境人員、動物的感染監(jiān)測以及出入境血液制品、生物制品等生物物質檢測工作，并盡快調查國內動物血清學感染情況。因此，急需建立一種快速、簡便的西尼羅病毒診斷方法。目前，國內建立的檢測WNV抗體的方法有PCRJaciMan RT2PCR、NASBA、SYBR Green RT-PCR等核酸檢測，病毒分離培養(yǎng)，補體結合實驗，血凝抑制實驗等等。上述技術和方法雖然可以檢測WNV及其抗體水平，在實踐中也取的一定的效果，但均存在試驗操作復雜，耗時長，需要特定的專業(yè)技能和儀器設備等，常限于實驗室內進行，很難普及和推廣。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，內設置有包被西尼羅病毒樣顆粒的可拆96孔酶標板，酶結合物工作液，cutoff血清，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，洗滌液，TMB底物溶液和終止液。進一步，所述西尼羅病毒樣顆粒是通過基因重組技術，以真核細胞表達系統(tǒng)共表達病毒衣殼的蛋白成分，通過病毒形態(tài)學和分子免疫學鑒定，蔗糖梯度離心結合超速離心純化，獲得西尼羅病毒的VLPs。進一步，所述樣品稀釋液為的0. 01M、pH7. 4的磷酸緩沖液；所述洗滌液為含0. 1% 吐溫-20的0. 1M、pH7. 4的磷酸緩沖液，所述終止液為2M硫酸溶液。利用上述試劑盒間接ELISA診斷人西尼羅病毒的方法，具體為
1)被檢測血清、cutoff血清、標準陽性血清和標準陰性血清都用血清稀釋液作 1:100稀釋后，按酶標板加樣模式每孔加入IOOul，37度放置Ih ；
2)倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置:3min，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
3)每反應孔加入辣根過氧化物酶羊抗人IgG使用液，每孔100ul，37度放置0. 5h， 倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
4)每個顯色孔加顯色底物IOOul，室溫放置15min ；
5)每個顯色孔加終止液50ul終止反應；
6)用酶標儀測定OD值在450nm波長下測定各孔吸光光。進一步，所述方法檢測樣本的判定標準為每板、或同一板的孔條或孔檢測時，必須包括cut-off校準樣和兩個對照樣，判定結果以待測樣本OD45tl值與cutoff OD450值比值 P/C，大于等于1. 5判定為陽性，小于等于1. 3判定為陰性，介于1. 3-1. 5之間為可疑，須重檢，重檢時P/C值大于等于1. 5判定為陽性，小于等于1. 3判定為陰性。本發(fā)明應用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達的西尼羅病毒樣顆粒為包被抗原建立了 ELISA方法，由于病毒樣顆粒(VLPs)是含有一個或多個病毒結構蛋白的空心顆粒，沒有病毒的核酸，不能自主復制，而且具有與天然病毒同樣的構象和抗原表位，因此對人不具有感染性，穩(wěn)定性好，不易失活，有較高的安全性，免疫原性更接近天然病毒。本發(fā)明為檢測人西尼羅病毒IgG抗體提供一種安全，特異，敏感，快速，操作簡單，經濟的試劑盒，為預防和控制西尼羅病毒從國外入我國方面提供了技術手段和方法。


圖1為具有完整序列的四株西尼羅病毒資料統(tǒng)計圖2A為具有完整序列的西尼羅病毒株M氨基酸進化樹比對圖； 圖2B為具有完整序列的西尼羅病毒株E氨基酸進化樹比對圖； 圖2C為具有完整序的西尼羅病毒北美株與亞洲株M氨基酸進化樹比對圖； 圖2D為具有完整序列的西尼羅病毒北美株與亞洲株E氨基酸進化樹比對圖； 圖3A — 1為正常細胞在IOX倍下鏡下圖； 圖3Α — 2為正常細胞在40Χ倍下鏡下圖； 圖3Α — 3為正常細胞在100Χ倍下鏡下圖:3Β — 1為轉染P⑶NA5-WNV-JME后的細胞在IOX倍下鏡下結果圖； 圖:3Β — 2為轉染P⑶NA5-WNV-JME后的細胞在40Χ倍下鏡下結果圖； 圖:3Β — 3為轉染P⑶NA5-WNV-JME后的細胞在100Χ倍下鏡下結果圖； 圖4Α為SDS-PAGE結果圖4Β為用西尼羅病毒E單抗(millipore)進行Wfestern印跡雜交圖； 圖5A為蔗糖密度梯度超速離心純化后共表達西尼羅病毒Μ、E蛋白的真核細胞表達系統(tǒng)形成西尼羅病毒樣顆粒電鏡圖； 圖5B為圖5A中的A部放大圖； 圖6為ELISA結果圖。
具體實施例方式如圖1至圖6所示，圖4A為SDS-PAGE結果，泳道1為正常細胞超聲破碎，離心上清，過濾、超濾管濃縮后樣品；泳道2為蛋白Marker ；泳道3為共表達西尼羅病毒包膜蛋白的細胞培養(yǎng)上清液過濾、超濾管濃縮后樣品；泳道4為共表達西尼羅病毒包膜蛋白的細胞超聲破碎，離心上清，過濾、超濾管濃縮后樣品。圖4Β為用西尼羅病毒E單抗(mi 11 ipore)進行Wfestern印跡雜交。泳道1為共表達西尼羅病毒包膜蛋白的細胞培養(yǎng)上清液過濾、超濾管濃縮后樣品；泳道2為共表達西尼羅病毒包膜蛋白的細胞超聲破碎，離心上清，過濾、超濾管濃縮后樣品；泳道3為正常細胞超聲破碎，離心上清， 過濾、超濾管濃縮后樣品；泳道2為蛋白Marker。圖5A、5B顯示蔗糖密度梯度超速離心純化后共表達西尼羅病毒M、E蛋白的真核細胞表達系統(tǒng)形成西尼羅病毒樣顆粒電鏡照片。這些顆粒是由西尼羅病毒包膜M、E蛋白在細胞中共表達而產生于細胞胞內自動組裝形成的。本發(fā)明一種檢測人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，采用的技術策略是 通過基因重組技術，以真核細胞表達系統(tǒng)共表達病毒衣殼的蛋白成分，通過病毒形態(tài)學和分子免疫學鑒定，獲得西尼羅病毒的VLPs，以用于抗體檢測試劑盒的組裝工作以及西尼羅病毒單克隆抗體的篩選工作。在GENEBANK中檢索西尼羅病毒(WNV)，挑取完整全序列病毒株，用生物軟件對這完整全序列病毒株Μ、E蛋白進行氨基酸序列分析比對，篩選出典型西尼羅病毒株 NY99-crow-V76/l ；
調出其目的基因片段PrMO CpreM和M)和ft~E0，分別合成，合成后克隆入pET30_a載體中.以其為模板，設計合適的引物，PCR擴增M，E片段，然后設計合適的引物，以其PCR產物為模板擴增，得到重組基因WNV-ME ；最后引入信號肽，再克隆到P⑶NA5-FRT載體上，轉化篩選、測序鑒定，即得到了重組質粒PCDNA5-WNV-JME ；
采用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，將重組質粒PCDNA5-WNV-JME，轉染至細胞，通過間接免疫熒光、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、Western blotting等方法鑒定目的蛋白表達，透射電鏡下鑒定VLPs形成，采用蔗糖梯度離心結合超速離心對表達產物進行純化；
以表達的病毒樣顆粒為基礎，通過酶聯免疫技術研制一種檢測人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒。一.篩選典型西尼羅病毒株NY99-crow_V76/l
在GENEBANK中檢索西尼羅病毒(WNV)，共獲得102株，其中完整全序列共四株。用生物軟件對這四株M、E蛋白進行氨基酸序列分析比對，著重分析北美株與印度株表達的M、E 蛋白在氨基酸水平上的同源性，最終選擇典型毒株NY99-Crow-V76/l為研究對象(附圖1和 2)
二.重組質粒PCDNA5-WNV-JME的構建
1. WNV病毒的prM和E基因合成及融合PCR擴增prME基因片段根據WNV NY99-crow-V76/l毒株的基因組序列(GenBank序列號為FJ151394. 1)，分別合成prM禾口 E 基因片段，合成后克隆入pET30-a載體中。設計用于prM和E基因融合PCR的上下游引物， 其序列為
prM的上游引物MEMPl
5’ GAAGATCTGGATCCGAACCACCATGGATGTTACCCTCTCTAACT3’， prMM的下游引物MEMP2:5' ctcattccaaggcagttgaaGCTGTAAGCTGGGGCCACCA3'； E的上游引物MEEPl
5’ TGGTGGCCCCAGCTTACAGCttcaactgccttggaatgag3，， E的下游引物MEEP2:
5’ CGGAATTCCTCGAGCCTATTAATGATGATGATGATGGTGAG3'。劃線部分分別為BamH I和Xho I酶切位點。分別將prM_pET30a和E_pET30a作為模板，擴增PrM和E片段，擴增條件分別是95°C5 min，然后95°C30 s, 72°C 30s, 72°C 1 min，擴增；35 個循環(huán)，72°C延伸 10 min; 95°C 5 min，然后 95°C30 s,72°C 30s,72°C 2 min, 擴增30個循環(huán)，72°C延伸10 min。然后以擴增出的prM和E片段為模板，用prM的上游引物MEMPl和E的下游引物MEEP2通過融合PCR擴增prME基因全長，擴增條件95°C 5 min, 然后 95°C30 s，72°C 30s，72°C 2. 5 min，擴增；35 個循環(huán)，72°C 10 min。2.引入信號肽，獲得重組基因WNV-JME設計用于信號肽和WNV-ME基因融合PCR 的上下游引物，其序列為
信號肽上游引物WJP2-1: 5’ CGGGATCCGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3’ ； E下游引物WWP8
5' CCGCTCGAGCTATTAAGCGTGCACGTTCACGGAG 3'；
劃線部分分別為BamH I和)(h0 I酶切位點.以信號肽和WNV-ME基因作模板，用 PfuUltra II高保真聚合酶拼接擴增WNV-JME片段。PCR 反應體系為(50μ1) :WJP2-1 (10UM) μ1、·Ρ8 (10UM) Ιμ 、dNTPmix (2. 5mmol/ Ι_ 5μ1, PfuUltra II 10xBuffer5Pl、PfuUltra II 高保真聚合酶 μ 、ddH20 35μ1, WNVME PCR產物(稀釋100倍) μ1，信號肽WNV-SignalPCR產物(10倍稀釋) μ1進行PCR擴增。擴增條件95°C預變性5 min，95°C變性30 s，72°C退火30s，72°C延伸3 min，；35個循環(huán)后72°C 延伸10 min。3.將重組基因WNV-JME克隆到PCDNA5-FRT載體上 WNV-JMEW純化產物經BamHI 和BioI雙酶切后，在T4連接酶的作用在，插入到BamHI和BioI雙酶切的載體pcDNA5/FRT 上，即獲得了重組質粒PCDNA5-WNV-JME。三.表達產物的表達及鑒定
將重組質粒P⑶NA5-WNV-JME通過PEI或脂質體轉染法轉染至細胞，48h后收集細胞和細胞培養(yǎng)上清，通過間接免疫熒光、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、Western blotting等方法鑒定。1、間接免疫熒光法初步檢測西尼羅病毒蛋白在細胞中的表達。收集轉染4 后的細胞，用預冷的IxPBS清洗細胞兩遍，取適量細胞滴到八孔顯微鏡載玻片上，晾干，冷丙酮固定lOmin，加入稀釋的抗WNV抗體(使用PBS 1 40稀釋)37度孵育1 h，漂洗液洗滌 5次，每次;3min;加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗小鼠IgG室溫結合40min(使用伊文思蘭1:50稀釋)。漂洗液洗滌5次后于熒光顯微鏡下觀察。結果轉染的細胞出現綠色熒光，為轉染的細胞未出現綠色熒光，表明西尼羅病毒蛋白轉染后的細胞中表達了(附圖3)。2、表達產物的SDS-PAGE和蛋白印跡鑒定。將收集到細胞上清過濾和超濾管濃縮進行初步純化，電泳前將初步純化的表達產物3體積加入1體積的4X SDS樣品處理液，100 度水浴lOmin，冷卻后加樣行12% SDS-PAGE.蛋白分離后經考馬斯亮藍染色，脫色液脫色后 GL200凝膠成像系統(tǒng)分析結果，行Wfestern blotting時，蛋白分離后，電轉至PVDF膜，37°C 5%脫脂奶粉封閉1.5h，一抗(鼠抗西尼羅病毒E 1:100)4°C過夜，二抗37°C孵育lh，增強化學發(fā)光法(ECL)顯影，暗室壓片。結果既表明西尼羅病毒包膜蛋白E的表達又表明表達產物保持了西尼羅病毒的抗原性(附圖4)。3、純化產物的TEM電鏡觀察
取少量純化產物，經磷酸鎢負染后，TEM(透射電鏡)電鏡下觀察可見到直徑大約50nm 左右，圓形的顆粒物，表面有類似刺突樣的結構，結構類似天然WNV顆粒(附圖5)。4、 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)鑒定。(1)試劑配制
包被液Na2C03 1.59克，NaHC03 2. 93克，加蒸餾水至1000mL。PBS :ΚΗ2Ρ04 0. M 克，Na2HP04 · 12H20 3· 58 克，NaCl 8· 0 克，KCl 0. 2 克，加蒸溜水至 lOOOmL，pH7. 4。PBST :KH2P04 0. 24 克，Na2HP04 · 12H20 3. 58 克，NaCl 8. 0 克，KCl 0. 2 克，加蒸餾水至lOOOmL，pH7. 4，再加Iml的吐溫-20，用于洗滌。封閉液PBS中加入15%胎牛血清，用于封閉。終止液2M硫酸溶液
(2)操作過程
1)將初步純化的抗原用ELISA包被液稀釋，反應板每孔加100ul，4°C冰箱過夜；
2)倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上， 使孔中洗滌液流盡；
3)加封閉液300ul，37°C放置2h；
4)倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上， 使孔中洗滌液流盡；
5)將西尼羅病毒陽性血清和陰性血清用封閉液1:200倍稀釋，反應板每孔lOOul，同時作稀釋液對照，37 °C放置Ih;
6)倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上， 使孔中洗滌液流盡；
7)加辣根過氧化物酶羊抗人IgG(1:5000倍稀釋)，每孔lOOul，37°C放置0.釙；
8)倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上， 使孔中洗滌液流盡；
9)加底物加TMB100ml，室溫暗處放置15min ；
10)加終止液每孔50ul；
11)觀察結果用酶聯免疫檢測儀記錄450nm讀數
(3)結果陽性血清OD45tlnm和陰性血清OD45tlnm有明顯的差異。(附圖6)
至此，通過間接免疫熒光、^festern blotting、TEM電鏡以及酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)鑒定，表明了西尼羅病毒包膜蛋白(PrM/M，Ε)在哺乳動物細胞系統(tǒng)中的表達并且在細胞中自動組裝而形成病毒樣顆粒，保持其完整的抗原性及其顆粒形態(tài)，ELISA的結果說明該表達產物具有開發(fā)西尼羅病毒檢測ELISA試劑盒的潛力。四.人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒的制備、組裝及使用本試劑盒應用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達的病毒樣顆粒作為包被抗原。1.試劑盒的組分
①ELISA板條每個試劑盒裝有1塊錫箔真空包裝的ELISA板，每個ELISA板含有可拆卸的已包被抗原的ELISA板條，包被抗原為哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達的西尼羅病毒樣顆粒，規(guī)格8孔xl2條
②洗滌液和血清稀釋液洗滌液為10倍濃縮的PH7. 4 PBST溶液100ml，血清稀釋液為含有PH 7.4 PBS，萬分之一的硫柳汞和保護蛋白的溶液100ml.
③酶標二抗辣根過氧化物酶羊抗人IgG使用液，15ml/瓶
④底物顯色液直接使用，15ml/瓶
⑤終止液2molH2S0415ml/瓶
⑥cutoff 血清0. Iml
⑦標準陽性血清0.Iml
⑧標準陰性血清0.Iml 2.組分的制備
①抗原的制備
細胞培養(yǎng)上清10000 rpm離心IOmin去除細胞碎片，澄清后的上清通過0. 45um的過濾器過濾，濾過液經100KD超濾管濃縮至5ml，樣品做進一步的超速離心純化。將樣品轉入 Ultra-clear 離心管，50000rpm，3h，4°C，(SW 55Ti 轉子)棄去上清，200 ulPBS 重懸。超離心管加入4. 8ml的10%-60%的連續(xù)性蔗糖溶液(離心緩沖液配制，w/w)，頂端加入初步純化的樣品200 ul，30000rpm，2. 5h，4 °C ( Sff 55Ti轉子)，從上往下每管400ul收集樣品， 共收集13管。ELISA法確定并收集富含目的蛋白的樣品，將樣品轉入Ultra-clear離心管， 50000rpm,3h,4°C, (Sff 55Ti轉子)棄去上清，200 ulPBS重懸，分裝保存。② 陽性對照、陰性對照與cutoff對照的制備
將篩選獲得的西尼羅病毒陽性血清按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，按萬分之一的比例加入硫柳汞，無菌過濾，作為陽性對照；將篩選獲得的西尼羅病毒陽性血清按1000U/ ml加入青霉素和鏈霉素，按萬分之一的比例加入硫柳汞，無菌過濾，作為陽性對照；應用建立的檢測人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA方法對100份已知陰性的血清樣品進行檢測。對于這些血清數據經統(tǒng)計學分析，確定一個能區(qū)分陰性和陽性血清的校準值，這個校正值即定義為cutoff校正值，接近cutoff校正值的血清作為cutoff血清。將按篩選得到的 cutoff血清，按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，按萬分之一的比例加入硫柳汞，無菌過濾， 作為cutoff對照。③試劑配制
1)包被液為pH9. 6 0. 05M碳酸鹽緩沖液(Na2C03 1. 59克，NaHC03 2. 93克，加蒸餾水至1000mL。2)樣品稀釋液為的0. OlM的磷酸緩沖液(KH2P04 0. 24克，Na2HP04 · 12H20 3. 58 克，NaCl 8.0 克，KCl 0. 2 克，加蒸餾水至 lOOOmL，pH7. 4)。3) 10倍濃縮的洗滌液為含0. 1%吐溫-20的0. IM的磷酸緩沖液(KH2P04 2.克，Na2HP04 · 12H20 35. 8 克，NaCl 80 克，KCl 2 克，加蒸溜水至 IOOOmL, ρΗ7· 4，取 990ml 再加 IOml的吐溫-20)
4)封閉液為含15%胎牛血清的0.OlM的磷酸緩沖液(KH2P04 0. M克，Na2HP04 ·12Η20 3. 58 克，NaCl 8. 0 克，KCl 0. 2 克，加蒸餾水至 IOOOmL, ρΗ7· 4，取 850ml 加 150ml 的胎牛血
清)
5)終止液為2M硫酸溶液，即量取111.2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至1000ml。④ELISA檢測板條的制備
1)將抗原用包被液按一定濃度稀釋后，包被ELISA板，每孔包被100ul，4度包被過夜。2)將包被了抗原的微孔板用PBST (PBS+0. l%Tween_20)洗滌3次，每次3min，最
后一次拍干。3)用封閉液進行封閉，每孔300ul，37度放置池
4)用PBST洗滌3次，室溫晾干，每次3min，最后一次甩干，室溫晾干，真空包裝，4度保存。3.使用
①被檢測血清、CUtOff血清、標準陽性血清和標準陰性血清都用血清稀釋液作 1 100稀釋后，按酶標板加樣模式每孔加入IOOul，37度放置lh，倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
②每反應孔加入辣根過氧化物酶羊抗人IgG使用液，每孔IOOul，37度放置0.證，倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
③每個顯色孔加顯色底物IOOul，室溫放置15min；
④每個顯色孔加終止液50ul終止反應；
⑤用酶標儀測定OD值在450nm波長下測定各孔吸光光度值。4. 結果判定
每板檢測時(或同一板的孔條或孔)必須包括CUt-Off校準樣和兩個對照樣，判定結果以待測樣本OD45tl值(去除空白OD45tl值)與cutoff OD45tl值(去除空白OD45tl值)比值(P/C)， 大于等于1. 5判定為陽性，小于等于1. 3判定為陰性。介于1. 3-1. 5之間為可疑，須重檢， 重檢時P/C值大于等于1. 5判定為陽性，小于等于1. 3判定為陰性。本發(fā)明中所用的診斷抗原為西尼羅病毒樣顆粒，它是由西尼羅病毒包膜蛋白 (PrM/M, Ε)在哺乳動物細胞系統(tǒng)中的表達并在細胞中自動組裝而形成的空心顆粒，沒有病毒的核酸，不能自主復制，而在形態(tài)結構、抗原性等方面具有與原病毒非常相似。與其他免疫診斷抗原相比較①西尼羅病毒樣顆粒在形態(tài)結構、空間構像、抗原性等方面都接近于天然病毒，它既能解決具有病毒抗原表位的合成肽抗原的抗原表位少的問題，又能克服基因重組抗原只有線性抗原表位而無(或者含有很少)構象抗原表位的缺陷。②滅活的病毒作為抗原，提取的抗原純度相對較差，影響測定的特異性和靈敏性，且存在散毒的危險，病毒樣顆粒，是空心顆粒，無核酸，不能自主復制，不存在散毒的危險，且能保證測定的特異性和靈敏性。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)相對于原核表達系統(tǒng)和桿狀病毒表達系統(tǒng)產物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白最接近，糖基化后加工更準確。本發(fā)明中所用的診斷抗原是采用基因重組技術，通過哺乳動物表達系統(tǒng)獲得，保證了抗原的特異性和敏感性。
用西尼羅病毒樣顆粒建立ELISA診斷方法，具有操作簡便、快捷，所需試劑及實驗條件簡單的優(yōu)點，并具有良好的特異性與敏感性，為西尼羅病毒感染的診斷及免疫評價提供了良好的方法。
權利要求
1.檢測人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，該試劑盒內設置有包被西尼羅病毒樣顆粒的可拆96孔酶標板，酶結合物工作液，cutoff血清，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，洗滌液，TMB底物溶液和終止液。
2.如權利要求1所述的檢測人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，所述西尼羅病毒樣顆粒是通過基因重組技術，以真核細胞表達系統(tǒng)共表達病毒衣殼的蛋白成分，通過病毒形態(tài)學和分子免疫學鑒定，蔗糖梯度離心結合超速離心純化，獲得西尼羅病毒的VLPs。
3.如權利要求1所述的檢測人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液為的0. 01M、pH7. 4的磷酸緩沖液；所述洗滌液為含0. 1%吐溫-20的 0. 1Μ、ρΗ7. 4的磷酸緩沖液，所述終止液為2M硫酸溶液。
4.利用上述試劑盒間接ELISA診斷人西尼羅病毒的方法，其特征在于，該方法具體為1)被檢測血清、cutoff血清、標準陽性血清和標準陰性血清都用血清稀釋液作 1:100稀釋后，按酶標板加樣模式每孔加入IOOul，37度放置Ih ；2)倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置:3min，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；3)每反應孔加入辣根過氧化物酶羊抗人IgG使用液，每孔100ul，37度放置0.證，倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；4)每個顯色孔加顯色底物IOOul，室溫放置15min；5)每個顯色孔加終止液50ul終止反應；6)用酶標儀測定OD值在450nm波長下測定各孔吸光光。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法檢測樣本的判定標準為每板、 或同一板的孔條或孔檢測時，必須包括cut-off校準樣和兩個對照樣，判定結果以待測樣本OD45tl值與cutoff OD45tl值比值P/C，大于等于1.5判定為陽性，小于等于1.3判定為陰性， 介于1. 3-1. 5之間為可疑，須重檢，重檢時P/C值大于等于1. 5判定為陽性，小于等于1. 3 判定為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開一種檢測人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明應用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達的西尼羅病毒樣顆粒為包被抗原建立了ELISA方法，由于病毒樣顆粒(VLPs)是含有一個或多個病毒結構蛋白的空心顆粒，沒有病毒的核酸，不能自主復制，而且具有與天然病毒同樣的構象和抗原表位，因此對人不具有感染性，穩(wěn)定性好，不易失活，有較高的安全性，免疫原性更接近于天然病毒。本發(fā)明為檢測人西尼羅病毒IgG抗體提供一種安全，特異，敏感，快速，操作簡單，經濟的試劑盒，為預防和控制西尼羅病毒從國外輸入我國方面提供了技術手段和方法。
文檔編號G01N33/543GK102183637SQ20111002642
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權日2011年1月25日
發(fā)明者咸慶杰, 平芮巾, 張麗萍, 楊鵬飛, 胡孔新, 郭雪, 馬雪征 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院