專利名稱：：布雷菲德菌素a產(chǎn)生菌及發(fā)酵法生產(chǎn)布雷菲德菌素a的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥和食品
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說是涉及一種真菌及其發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法即一種被孢霉屬M(fèi)om'ere//"Coemans內(nèi)生真菌及其發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，更具體地說是涉及單孢被孢霉MoW/m/^mo"ospomLinnemann及其發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA的制備方法。
背景技術(shù)：
：(一)BrefeldinA的研究概況1、概述布雷菲德菌素A(英文名BrefeldinA，簡稱BFA,中文名稱或?yàn)椴祭追茽柕镁谹，亦有寫作布雷非德菌素A，也稱作斜臥菌素或藍(lán)菌素或殼二孢素)，是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，最草于〗958年分離自Pe/d/"ww^e/eW/a"w附。BrefeidinA具有多種生物活性，如抗真菌，抗病毒，抗腫瘤，抗線蟲等。BrefeldinA是一種廣泛應(yīng)用的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，當(dāng)細(xì)胞活化時(shí)用來阻斷細(xì)胞內(nèi)因子的分泌從而增強(qiáng)染色信號，染色細(xì)胞內(nèi)因子時(shí)尤為有效，它可以使絕大多數(shù)細(xì)胞因子聚集于高爾基體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。BrefeldiiiA為真菌的代謝產(chǎn)物，顯示多種抗生素活性既能夠阻斷有蛋白G介導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)包被蛋白b-COP和ARF與高爾基體的結(jié)合，也能夠阻斷蛋白向高爾基結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移，還能夠活化神經(jīng)鞘磷脂循環(huán)，在某些人類腫瘤細(xì)胞中還觀察到BrefeldinA介導(dǎo)的凋亡。2、BrefeldinA的化學(xué)結(jié)構(gòu)與制備方法BrefeldinA化學(xué)名l,6.7,8,9,lla，12,13，14，14a-Decahydro-l，13-dihydroxy-6-methyl-4H-cyelopent[fjoxacyclotri(tecin-'4-one;Ascotoxin',Cyanein，為無色晶體，分子結(jié)構(gòu)々口下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>H物理化學(xué)性質(zhì)分子式C16H24O4分子量280.36熔點(diǎn)Mp204-205°C閃點(diǎn)87°C旋光度[《+%(MeOH)uvX=H215(sll200)純度》99.0%(HPLC，物理特征棱晶(MeOH/Et20)CAS登錄號20350-15-6它的最佳使用方法依據(jù)細(xì)胞種類和孵育時(shí)間不同而改變。一般地抑制劑與活化劑在細(xì)胞收集前424小時(shí)內(nèi)與細(xì)胞一起進(jìn)行孵育。BrefeldinA溶液是1，000X濃縮液，使用前要將使用培養(yǎng)液稀釋至IX溶液。有研究報(bào)道，通過建立髙效布雷菲德菌素A產(chǎn)生菌篩選模型，獲得一株布雷菲德菌素A高產(chǎn)菌株A2702。經(jīng)鑒定，該菌株屬于Pew'c說/wwsp.;結(jié)合系統(tǒng)的菌種選育工作和培養(yǎng)條件優(yōu)化，建立了PemW仏wwsp.A2702分批發(fā)酵生產(chǎn)布雷菲德菌素A工藝，目標(biāo)產(chǎn)物累積濃度達(dá)到1000mg/l，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于能檢索到的報(bào)道水平(約300mg/l);后續(xù)的多因素優(yōu)化控制和分批補(bǔ)料策略進(jìn)一步提高了發(fā)酵液中布雷菲德菌素A的累積濃度；基于布雷菲德菌素A獨(dú)特的理化性質(zhì)，建立了從發(fā)酵液中提煉布雷菲德菌素A工藝和結(jié)晶工藝，提取收率在75%以上，產(chǎn)物純度達(dá)到95%左右，技術(shù)指標(biāo)達(dá)到國際先進(jìn)水平。世界各國市場上對布雷菲德菌素A需求很大，布雷菲德菌素A作為醫(yī)藥中間體的銷售價(jià)格約為1600萬元/公斤，大規(guī)模生產(chǎn)抗腫瘤藥物布雷菲德菌素A工藝具有良好的經(jīng)濟(jì)效益與社會效益。而目前的化學(xué)合成方法制備BrefeldinA工藝復(fù)雜，周期長，成本高，毒性大，且合成過程中不可避免對操作人員健康的損害。Young-GerSuh等關(guān)于BrefeldinA的化學(xué)全合成經(jīng)過15個(gè)步驟，最終產(chǎn)量為7.9%。83、BrefeldinA的藥理研究進(jìn)展大環(huán)內(nèi)酯類化合物(macrolides)是一類具有抗真菌、抗腫瘤活性的化合物，分子結(jié)構(gòu)中含有內(nèi)酯環(huán)，環(huán)的大小差別較大，從十元環(huán)到六十元環(huán)都有。大環(huán)內(nèi)酯屬于天然產(chǎn)物中的多烯酮類，大環(huán)內(nèi)酯的副作用比較少，是一種較為安全的藥物。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一類毒性低微、口服方便且價(jià)格較廉的藥，按其大環(huán)結(jié)構(gòu)含碳母核的不同，可分為14、15和16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，在治療學(xué)上的重要性僅略次于卩-內(nèi)酰胺類(青霉素類、頭孢菌素類等)和氨基糖甙類。自1952年美國禮來公司推出第一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)品——紅霉素后，該大類藥物不斷擴(kuò)充，迅速成為全球抗感染用藥中的一個(gè)十分重要的類別。目前沿用的大環(huán)內(nèi)酯類有紅霉素、麥迪霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、柱晶白霉素；大環(huán)內(nèi)酯類新品種(新大環(huán)內(nèi)酯類)有阿奇霉素、克拉霉素、羅紅霉素等，它們對流感嗜血桿菌、肺炎支原體或肺炎衣原體等的抗微生物活性增強(qiáng)。BrcfeldinA是一種天然存在的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，研究發(fā)現(xiàn)，BrefeldinA抑制蛋白質(zhì)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)過程，具有抗菌、抗病毒和抗癌活性。BrefeldinA具有多種生物活性，如抗真菌、抗病毒(抗生、抗濾過性病原體、抗有絲分裂、抑制細(xì)胞生長)、抗腫瘤等。BrefddinA的主要功能是能誘導(dǎo)高爾基體的分解，抑制蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(簡稱ER)中轉(zhuǎn)移為高爾基體的復(fù)合物(小分子BrefeldinA能非競爭性地抑制蛋白)，目前被作為一種重要的分子工具廣泛用于研究哺乳動物的信號傳導(dǎo)途徑的研究。國際腫瘤協(xié)會在抗腫瘤體外篩選中發(fā)現(xiàn)BrefeldinA作為血療法試劑有很大的應(yīng)用前景。BrefeldinA在抗腫瘤方面顯示了顯著的藥理活性，其抗人胃癌細(xì)胞(MKN45)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)及人白血病細(xì)胞(HL-60)的1(:5()均<0.001pg/ml，活性大于陽性對照阿霉素。(二)有關(guān)BrefeldinA產(chǎn)生菌——^孢被孢霉的研究*BrefeldinA的產(chǎn)生菌，經(jīng)鑒定為毛霉目(Mucorales)，被孢霉科(Mortierellaceae)，被孢霉屬(MW/"e〃flCoemans)的單孢被孢霉(她r"ere〃fl膨wo5/oraLinnemann)。該菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天以后，可見直徑0.51.5cm菌叢，邊緣不整齊，菌絲白色，低矮，絨狀。孢囊梗直立，1080itim不等，不分枝，頂生孢子囊，孢子囊單孢子，球形，無囊軸。接合孢子為一厚層的交織菌絲所包被。毛霉目是接合菌綱中最大、最重要的l目。通常菌絲體發(fā)達(dá)、多核、無隔，少數(shù)比較高等的類型也可在一開始就形成隔膜。氣生菌絲體往往生長繁茂，呈毛狀，中文的目名即由此而來。其大多為腐生菌，很多種類可以從土壤、動物糞便、動植物、食品上分離出來。少數(shù)種類為其他真菌、動植物以及人的寄生菌。9分類地位-真菌門[Fungi]藻菌纟岡[Phycomycetes]毛霉目[Mucorales]被孢霉科[Mortierellaceae]被孢霉屬[脅W/e/r〃"Coemans]單孢被孢霉[MoW/ere/Z"/wo"oj/oraLinnemann〗毛霉目下分為毛霉科、被孢霉科、枝霉科、輻枝霉科等九科；其中，被孢霉科有不具囊軸或囊軸極端退化的大型孢子囊、小型孢子囊或單孢孢子囊，各種孢子囊不在同一孢囊梗上，接合孢子有包被，配囊柄鉗狀。被孢霉科下分為被孢霉、拉曼被孢霉、多頭被孢霉、小被孢霉、土生被孢霉、葡酒色被孢霉、腫基被孢霉、深黃被孢霉、頂毛被孢霉等屬。單孢被孢霉(Mwriere//a/wo"o，raLinnemann)屬于被孢霉屬(MW/ere〃flCoemans)，是土壤真菌的一種，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)從單孢被孢霉中能夠分離得到抗生素類物質(zhì)。目前中國多采用被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸及Y-亞麻酸等?；ㄉ南┧釋儆赾o-6系列的多不飽和脂肪酸，是人體前列腺素合成的重要前體物質(zhì)，具有酯化膽固醇、抑制血小板聚集、增加血管彈性、降低血液黏度、調(diào)節(jié)白細(xì)胞功能、提高免疫力等一系列生理活性，已在保健食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。微生物發(fā)酵法為生產(chǎn)花生四烯酸開辟了新途徑，它具有不受原材料及氣候限制、生長周期短、培養(yǎng)工藝簡單、花生四烯酸含量高等特點(diǎn)，近幾年已成為世界各國研究的熱點(diǎn)。由于被孢霉發(fā)酵具有生物量大和油脂含量豐富的特點(diǎn)，世界各國專家學(xué)者對此進(jìn)行了大量的研究，并取得了顯著的效果(劉洋，謝飛.被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的研究進(jìn)展.江蘇食品與發(fā)酵.2007,2:13-16)。(三)常用的有效成分提取分離方法1、溶劑提取法(1)原理溶劑提取法是根據(jù)中草藥中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì)，選用對活性成分溶解度大，對不需要溶出成分溶解度小的溶劑，而將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來的方法。當(dāng)溶劑加到中草藥等原料(需適當(dāng)粉碎)中時(shí)，溶劑由于擴(kuò)散、滲透作用逐漸通過細(xì)胞壁透入到細(xì)胞內(nèi)，溶解了可溶性物質(zhì)，而造成細(xì)胞內(nèi)外的濃度差，于是細(xì)胞內(nèi)的濃溶液不斷向外擴(kuò)散，溶劑又不斷進(jìn)入藥材組織細(xì)胞中，如此多次往返，直至細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度達(dá)到動態(tài)平衡時(shí)，將此飽和溶液濾出，繼續(xù)多次加入新溶劑，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。中草藥等成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質(zhì)有關(guān)。溶劑可分為親水性有機(jī)溶劑及親脂性有機(jī)溶劑，被溶解物質(zhì)也有親水性及親脂性的不同。有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中親水性基團(tuán)多，其極性大而疏于油；有的親水性基團(tuán)少，其極性小而疏于水。各類溶劑的性質(zhì)，同樣也與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。這樣，發(fā)明人就可以通過對中草藥成分結(jié)構(gòu)分析，去估計(jì)它們的此類性質(zhì)和選用的溶劑?？偟恼f來，只要中草藥成分的親水性和親脂性與溶劑的此項(xiàng)性質(zhì)相當(dāng)，就會在其中有較大的溶解度，即所謂"相似相溶"的規(guī)律。這是選擇適當(dāng)溶劑自中草藥中提取所需要成分的依據(jù)之一。(2)溶劑的選擇運(yùn)用溶劑提取法的關(guān)鍵，是選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。溶劑選擇適當(dāng)，就可以比較順利地將需要的成分提取出來。選擇溶劑要注意以下三點(diǎn)①溶劑對有效成分溶解度大，對雜質(zhì)溶解度?。虎谌軇┎荒芘c中藥的成分起化學(xué)變化；③溶劑要經(jīng)濟(jì)、易得、使用安全等。常見的提取溶劑可分為以下三類①水水是一種強(qiáng)的極性溶劑。中草藥中親水性的成分，如無機(jī)鹽、糖類、分子不太大的多糖類、鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽、生物堿鹽及苷類等都能被水溶出。為了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及堿水作為提取溶劑。②親水性的有機(jī)溶劑也就是一般所說的與水能混溶的有機(jī)溶劑，如乙醇(又稱酒精)、甲醇(又稱木精)、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比較好，對中草藥細(xì)胞的穿透能力較強(qiáng)。親水性的成分除蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、果膠、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。難溶于水的親脂性成分，在乙醇中的溶解度也較大。還可以根據(jù)被提取物質(zhì)的性質(zhì)，采用不同濃度的乙醇進(jìn)行提取。用乙醇提取比用水量較少，提取時(shí)間短，溶解出的水溶性雜質(zhì)也少。乙醇為有機(jī)溶劑，雖易燃，但毒性小，價(jià)格便宜，來源方便，有一定設(shè)備即可回收反復(fù)使用，而且乙醇的提取液不易發(fā)霉變質(zhì)。由于這些原因，用乙醇提取的方法是歷來最常用的方法之一。甲醇的性質(zhì)和乙醇相似，沸點(diǎn)較低(64°C)，但有毒性，使用時(shí)應(yīng)注意。(D親脂性的有機(jī)溶劑也就是一般所說的與水不能混溶的有機(jī)溶劑，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙垸等。這些溶劑的選擇性能強(qiáng)，不能或不容易提出親水性雜質(zhì)。但這類溶劑揮發(fā)性大，多易燃(氯仿除外)，一般有毒，價(jià)格較貴，設(shè)備要求較高，且它們透入植物組織的能力較弱，往往需要長時(shí)間反復(fù)提取才能提取完全。如果藥材中含有較多的水分，用這類溶劑就很難浸出其有效成分，因此，大量提取中草藥原料時(shí)，直接應(yīng)用這類溶劑有一定的局限性。(3)提取方法用溶劑提取中草藥成分，常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法等。同時(shí)，原料的粉碎度、提取時(shí)間、提取溫度、設(shè)備條件等因素也都能影響提取效率，必須加以考慮。11①浸漬提取法(簡稱浸漬法)浸漬法系將中草藥粉末或碎塊裝入適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m宜的溶劑(如乙醇、稀醇或水)，浸漬藥材以溶出其中成分的方法。本法比較簡單易行，但浸出率較差，且如用水為溶劑，其提取液易發(fā)霉變質(zhì)，須注意加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?。②滲漉提取法(簡稱滲漉法)滲漉法是將中草藥粉末裝在滲漉器中，不斷添加新溶劑，使其滲透過藥材，自上而下從滲漉器下部流出浸出液的一種浸出方法。當(dāng)溶劑滲進(jìn)藥粉、溶出成分比重加大而向下移動時(shí)，上層的溶液或稀浸液便置換其位置，造成良好的濃度差，使擴(kuò)散能較好地進(jìn)行，故浸出效果優(yōu)于浸漬法。但應(yīng)控制流速，在滲渡過程中隨時(shí)自藥面上補(bǔ)充新溶劑，使藥材中有效成分充分浸出為止?；虍?dāng)滲滴液顏色極淺或滲涌液的體積相當(dāng)于原藥材重的10倍時(shí)，便可認(rèn)為基本上已提取完全。在大量生產(chǎn)中常將收集的稀浸出液作為另一批新原料的溶劑之用。③煎煮提取法(簡稱煎煮法)煎煮法是中國最早使用的傳統(tǒng)的浸出方法。所用容器一般為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿，不宜用鐵鍋，以免藥液變色。直火加熱時(shí)最好時(shí)常攪拌，以免局部藥材受熱太高，容易焦糊。有蒸汽加熱設(shè)備的藥廠，多采用大反應(yīng)鍋、大銅鍋、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加熱。還可將數(shù)個(gè)煎煮器通過管道互相連接，進(jìn)行連續(xù)煎浸。④加熱回流提取法應(yīng)用有機(jī)溶劑加熱提取，需采用回流加熱裝置，以免溶劑揮發(fā)損失。小量操作時(shí)，可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器。瓶內(nèi)裝藥材約為容量的20%60%，溶劑浸過藥材表面約12cm。在水浴中加熱回流，一般保持沸騰3~6小時(shí)，放冷過濾，再在藥渣中加溶劑，作第二、三次加熱回流分別約半小時(shí)，或至基本提盡有效成分為止。此法提取效率較冷浸法高，大量生產(chǎn)中多采用連續(xù)提取法。⑤連續(xù)回流提取法應(yīng)用揮發(fā)性有機(jī)溶劑提取中草藥有效成分，不論小型實(shí)驗(yàn)或大型生產(chǎn)，均以連續(xù)提取法為好，而且需用溶劑量較少，提取成分也較完全。實(shí)驗(yàn)室常用脂肪提取器或稱索氏提取器。連續(xù)提取法，一般需數(shù)小時(shí)才能提取完全。提取成分受熱時(shí)間較長，遇熱不穩(wěn)定易變化的成分不宜采用此法。2、分離和純化方法上述提取法所得到的中草藥提取液或提取物仍然是混合物，需進(jìn)一步除去雜質(zhì)，分離并進(jìn)行精制。(1)溶劑分離法一般是將上述總提取物，選用三、四種不同極性的溶劑，由低極性到高極性分步進(jìn)行提取分離。水浸膏或乙醇浸膏常為膠狀物，難以均勻分散在低極性溶劑中，故不能提取完全，可拌入適量惰性填充劑，如硅藻土或纖維粉等，然后低溫或自然干燥，粉碎后，再以選用溶劑依次提取，使總提取物中各組成成分，依其在不同極性溶劑中溶解度的差異而得到分離。利用中草藥化學(xué)成分，在不同極性溶劑中的溶解度進(jìn)行分離純化，是最常用的方法。(2)溶劑萃取法①萃取法溶劑提取萃取法又簡稱萃取法，是利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的方法。萃取時(shí)如果各成分在溶劑中分配系數(shù)相差越大，則分離效率越高；如果在水提取液中的有效成分是親脂性的物質(zhì)，一般多用親脂性有機(jī)溶劑，如苯、氯仿或乙醚進(jìn)行萃取，如果有效成分是偏于親水性的物質(zhì)，在親脂性溶劑中難溶解，就需要改用弱親脂性的溶劑，例如乙酸乙酯、丁醇等。還可以在氯仿、乙醚中加入適量乙醇或甲醇以增大其親水性。提取黃酮類成分時(shí)，多用乙酸乙脂和水萃取。提取親水性強(qiáng)的皂苷則多選用正丁醇、異戊醇和水作萃取。不過，一般有機(jī)溶劑親水性越大，與水作萃取的效果就越不好，因?yàn)槟苁馆^多的親水性雜質(zhì)伴隨而出，對有效成分進(jìn)一步精制影響很大。②逆流連續(xù)萃取法是一種連續(xù)的溶劑萃取法。其裝置可具有一根、數(shù)根或更多的萃取管。管內(nèi)用小瓷圈或小的不銹鋼絲圈填充，以增加溶劑萃取時(shí)的接觸面。如果一種中草藥的水浸液需要用比水輕的苯、乙酸乙酯等進(jìn)行萃取，則需將水提濃縮液裝在萃取管內(nèi)，而苯、乙酸乙酯貯于高位容器內(nèi)。萃取是否完全，可取樣品用薄層層析、紙層析及顯色反應(yīng)或沉淀反應(yīng)進(jìn)行檢查。③逆流分配法逆流分配法又稱逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法與溶劑逆流萃取法原理一致，但加樣量一定，并不斷在一定容量的溶劑中，經(jīng)多次移位萃取分配而達(dá)到混合物的分離。④液滴逆流分配法液滴逆流分配法又稱液滴逆流層析法。為近年來在逆流分配法基礎(chǔ)上改進(jìn)的溶劑萃取法。對溶劑系統(tǒng)的選擇基本同逆流分配法，但要求能在短時(shí)間內(nèi)分離成，并可生成有效的液滴。由于移動相形成液滴，在細(xì)的分配萃取管中與固定相有效地接觸、摩擦不斷形成新的表面，促進(jìn)溶質(zhì)在溶劑中的分配，故其分離效果往往比逆流分配法好。(3)大孔吸附樹脂法大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一類有機(jī)高聚物吸附劑，具有良好的吸附性能，近十余年來逐漸被應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的提取分離和中藥新藥的開發(fā)研制。大孔吸附樹脂為吸附和篩選原理相結(jié)合的分離材料。它的吸附性是由于范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果。篩選原理是由于其本身多孔性結(jié)構(gòu)所決定。由于吸附和篩選原理，有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定的溶劑洗脫而分開。這使得有機(jī)化合物尤其是水溶性化合物的提純得以大大簡化。大孔吸附樹脂的骨架由苯乙烯和二乙烯苯縮聚而生成，由于改性劑的加入，大孔吸附樹脂的極性發(fā)生改變，按照樹脂的表面性質(zhì)，吸附樹脂一般分為非極性、中極性和極性三類。非極性吸附樹脂是由偶極矩很小的單體聚合物制得的不帶任何功能基的吸附樹脂。典型的例子是苯乙烯-二乙烯苯體系的吸附樹脂，如D101、XAD-1、DiaionHP-10大孔吸附樹脂。中極性吸附樹脂指含酯基的吸附樹脂，如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯與雙甲基丙烯酸酯等交聯(lián)的一類共聚物。它是在非極性大孔吸附樹脂的基礎(chǔ)上，加入丙烯酸甲酯或丙烯腈縮聚而成，如中國國內(nèi)經(jīng)常使用的AB-8大孔吸附樹脂。極性吸附樹脂是指含酰胺基、腈基、酚羥基等含氮、氧、硫極性功能基的吸附樹脂。此外，有時(shí)把含氮、氧、硫等配體基團(tuán)的離子交換樹脂稱作強(qiáng)極性吸附樹脂，強(qiáng)極性吸附樹脂與離子交換樹脂的界限很難區(qū)別。極性大孔吸附樹脂可以由甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺或亞砜類縮聚而成，如日本三菱化工的DiaionHP2MG、美國Rohm-hass公司的XAD-IO，XAD-9大孔吸附樹脂。與活性炭和其它吸附劑相比，大孔吸附樹脂具有很多的優(yōu)點(diǎn)，如對某種物質(zhì)的吸附選擇性較高；物理化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度較好；品種規(guī)格較多，可根據(jù)需要改變樹脂物理或化學(xué)結(jié)構(gòu)；吸附樹脂一般為球狀顆粒，流體阻力較小等等。因而被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域，近年來關(guān)于大孔吸附樹脂在天然產(chǎn)物提取分離中的應(yīng)用研究報(bào)道越來越多。大孔吸附樹脂對中草藥化學(xué)成分如生物堿、黃酮、皂苷、香豆素及其他一些苷類成分都有一定的吸附作用。對糖的吸附能力很差，對色素的吸附能力較強(qiáng)。(4)沉淀法是在中草藥提取液中加入某些試劑使產(chǎn)生沉淀，以獲得有效成分或除去雜質(zhì)的方法。如鉛鹽沉淀法鉛鹽沉淀法為分離某些中草藥成分的經(jīng)典方法之一。由于醋酸鉛及堿式醋酸鉛在水及醇溶液中，能與多種中草藥成分生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀，故可利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離。然后將鉛鹽沉淀懸浮于新溶劑中，通以硫化氫氣體，使分解并轉(zhuǎn)為不溶性硫化鉛而沉淀。(5)鹽析法:鹽析法是在中草藥的水提液中，加入無機(jī)鹽至一定濃度，或達(dá)到飽和狀態(tài)，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而與水溶性大的雜質(zhì)分離。常用作鹽析的無機(jī)鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。(6)透析法透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，達(dá)到分離的方法。反之也可將大分子的雜質(zhì)留在半透膜內(nèi)，而將小分子的物質(zhì)通過半透膜進(jìn)入膜外溶液中，而加以分離精制。(7)結(jié)晶、重結(jié)晶和分步結(jié)晶法鑒定中草藥化學(xué)成分，研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)，必須首先將中草藥成分制備成單體純品。在常溫下，物質(zhì)本身性質(zhì)是液體的化合物，可分別用分餾法或?qū)游龇ㄟM(jìn)行分離精制。一般地說，中草藥化學(xué)成分在常溫下多半是固體的物質(zhì)，都1具有結(jié)晶體的通性，可以根據(jù)溶解度的不同用結(jié)晶法來達(dá)到分離精制的目的。3、常用干燥方法(1)真空干燥是基于這樣一基本原理水的飽和蒸氣壓與溫度緊密相關(guān)，在真空狀態(tài)下，水的沸點(diǎn)降低，即在真空下操作也就是在低溫下操作，可避免在高溫下營養(yǎng)成分如維生素等的破壞，同時(shí)提高了干燥速度。真空干燥在食品、制藥、化工等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，中國也開發(fā)和引進(jìn)了各種真空干燥設(shè)備，其結(jié)構(gòu)形式多種多樣。常用的形式主要有箱式真空干燥器、雙錐式真空干燥器、帶式真空干燥器等。這些傳統(tǒng)的真空干燥裝置主要采用熱風(fēng)，蒸汽或電等加熱，利用熱傳導(dǎo)、對流或輻射原理將熱量從外部傳到物料內(nèi)部。真空干燥具有干燥溫度低，干燥室內(nèi)相對缺氧，可避免脂肪氧化，色素褐變等一系列優(yōu)點(diǎn)，適合于熱敏感性食品物料的干燥，此外設(shè)備成本、干燥費(fèi)用也相對較低。(2)噴霧干燥是流化技術(shù)用于液態(tài)物料干燥的一種方法。因是瞬間干燥，特別適用于熱敏性物料，故所得產(chǎn)品質(zhì)量好，保持原來的色香味，且易溶解。利用噴霧干燥來制備微囊的研究正在進(jìn)行，它是將心料混懸在衣料的溶液中，經(jīng)離心噴霧器將其噴入熱氣流中，所得的產(chǎn)品是衣料包心料而成的微囊，這種微囊粉末可采用于直接壓片，也可制備膠囊劑、糖漿劑或混懸劑。(3)冷凍干燥是將干燥液體物料冷凍成固體，在低溫減壓條件下利用冰的升華性能，使物料低溫脫水而達(dá)到干燥的一種方法。由于物料在高度真空及低溫條件下干燥，故對某些極不耐熱物品的干燥很適合。王大林報(bào)道了一種噴霧通氣凍干新技術(shù)，是利用冷的空氣或氮?dú)庾鳛榻橘|(zhì)，迅速流經(jīng)凍結(jié)物使水升華，噴霧凍干制得的產(chǎn)品微粒小、干燥快、時(shí)間短、均勻、流動性好，并具良好的速溶性。近年來，對膏狀物料和粘稠物料干燥的研究取得了較大進(jìn)展，流態(tài)化技術(shù)、噴射技術(shù)、惰性載體技術(shù)，則是在此研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。旋轉(zhuǎn)閃蒸干燥機(jī)、熱噴射氣流干燥機(jī)、惰性載體干燥機(jī)均適合熱敏性物料和膏狀物料的干燥。這些新的研究成果用于中藥制劑生產(chǎn)，將大大改善中藥加工的技術(shù)水平，提高生產(chǎn)效率。(4)遠(yuǎn)紅外加熱干燥法:是一項(xiàng)新的干燥技術(shù)，其干燥原理是將電能轉(zhuǎn)變?yōu)檫h(yuǎn)紅外輻射，從而被藥材的分子吸收，產(chǎn)生共振，引起分子和原子的振動和轉(zhuǎn)動，導(dǎo)致物體變熱，經(jīng)過熱擴(kuò)散、蒸發(fā)和化學(xué)變化，最終達(dá)到干燥的目的。遠(yuǎn)紅外干燥可節(jié)省電能20%50%，效果較好。(5)微波干燥法是一項(xiàng)20世紀(jì)60年代迅速發(fā)展起來的新技術(shù)，微波干燥實(shí)際上是通過感應(yīng)加熱和介質(zhì)加熱，使被干燥物中的水分和脂肪不同程度地吸收微波能量，并把它轉(zhuǎn)變?yōu)闊崃繌亩_(dá)到干燥的目的。微波干燥可殺滅微生物和霉菌，并具有消毒作用。目前中國生產(chǎn)的微波加熱成套設(shè)備有915mhz和2450mhz兩個(gè)頻率。(四)抗真菌、抗病毒(抗生、抗濾過性病原體、抗有絲分裂、抑制細(xì)胞生長)、抗腫瘤的研究概況抗生素是由微生物或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類代謝物，以及甚至用化學(xué)方法合成或半合成的化合物。1981年中國第四次全國抗生素學(xué)術(shù)會議指出近些年來在抗生素的作用對象方面，除了抗菌以外，在抗腫瘤，抗病毒，抗原蟲、寄生蟲和昆蟲等領(lǐng)域也有較快發(fā)展。有些抗生素具有抑制某些特異酶的功能，另外一些抗生素則具有其他的生物活性或生理活性的作用。鑒于"抗菌素"早已越出了抗菌范圍，繼續(xù)使用抗菌素這一名詞已不能適應(yīng)專業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，也不符合實(shí)際情況了。因此，會議決定將抗菌素正式更名為抗生素。能抑制或殺滅真菌的藥物，除一些古老的抗真菌外用藥如水楊酸、碘劑、硫黃等外，抗真菌作用顯著的新藥有抗生素和合成藥兩大類。①抗生素。主要有灰黃霉素、制霉菌素和二性霉素B等?；尹S霉素只對皮膚癬菌病有效，主要是頭癬、體癬、股癬、手足甲癬等，口服時(shí)，2030天為一個(gè)療程，需合并外用治癬藥物。長期使用有少數(shù)淺部真菌產(chǎn)生耐藥菌株，可換用酮康唑。制霉菌素治療胃腸道念珠菌病，外用治療皮膚粘膜念珠菌感染，也可制成坐藥。二性霉素B主要治療深部真菌病，如系統(tǒng)性念珠菌病、隱球菌病、曲霉病、結(jié)合菌病、芽生菌病、巴西副球孢子菌病、球孢子菌病和組織胞漿菌病等。將此藥加入5%葡萄糖溶液中，緩慢靜脈滴注。②合成藥。包括咪唑類藥物(如克霉唑、益康唑、咪康唑和酮康唑等)、氟胞嘧淀等。抗生素抗真菌機(jī)理包括①對真菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的損害作用；②對真菌細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)的作用；③對細(xì)胞能量代謝的影響等(謝小梅，許楊.抗真菌中藥的作用機(jī)理研究進(jìn)展.中國中藥雜志.2004,3:200-202)?？鼓[瘤藥物，簡單說來有化療藥物、生物制劑?；熕幬锔鶕?jù)作用分為①干擾核酸生物合成的藥物，如二氫葉酸還原酶抑制藥甲氨蝶呤；②直接影響DNA結(jié)構(gòu)和功能的藥物，如破壞DNA的鉑類化合物；③干擾轉(zhuǎn)錄過程和阻止RNA合成的藥物，如放線菌素D;④抑制蛋白質(zhì)合成與功能的藥物，如微管蛋白活性抑制劑紫杉醇；⑤調(diào)節(jié)體內(nèi)激素平衡的藥物等幾類。真菌、病毒和腫瘤，時(shí)刻威脅著人類的生命健康，而抗生素是針對所有能夠醫(yī)治殺滅的生命體，包括細(xì)菌、真菌、病毒、腫瘤細(xì)胞等，使用率非常高。抗生素的不規(guī)范使用，是目前世界的一大難題，一個(gè)方面是引起細(xì)菌耐藥，細(xì)菌耐藥產(chǎn)生的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于社會新藥開發(fā)的速度，長此以往，人類可能會退回到二十世紀(jì)七、八十年代以前的狀態(tài)，沒有抗生素使用，人類將再一次面臨很多感染性疾病的威脅；另一方面，抗生素進(jìn)入人體后發(fā)揮治療效果的同時(shí)會引起很多的不良反應(yīng)，用的藥物越多，引起不良反應(yīng)的機(jī)會越高，中國藥物不良反應(yīng)監(jiān)測中心的記錄顯示，中國的藥物不良反應(yīng)三分之一是由抗生素引起的，這個(gè)比例和抗生素的使用比例是一致的。研究開發(fā)出療效好、副作用小的抗生素迫在眉睫。結(jié)合中國豐富的醫(yī)藥資源，從中發(fā)掘有效、低毒、價(jià)廉的抗真菌、抗病毒(抗生、抗濾過性病原體、抗有絲分裂、抑制細(xì)胞生長)、抗腫瘤的藥物來源及其制備方法與新的用途，都具有非常重要的意義。經(jīng)文獻(xiàn)檢索等，到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有BrefeldinA新的產(chǎn)生菌單孢被孢霉以及該產(chǎn)生菌發(fā)酵法制備BrefeldinA的方法方面的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題是公開了一種真菌及其制備方法與用途制備發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA，以及發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA的制備方法以及該發(fā)酵產(chǎn)物的用途，即該發(fā)酵產(chǎn)物用于制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。也就是說，本發(fā)明的一個(gè)目的是通過技術(shù)實(shí)驗(yàn)等研究和理論探索，意在明確一種真菌及其制備方法和用途，即單孢被孢霉似0^6^//"mowo^oraLinnemann及其制備方法和其用途發(fā)酵法制備其發(fā)酵產(chǎn)物BrefddinA。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA及其制備方法與用途——在抗真菌、抗病毒、抗腫瘤應(yīng)用方面的活性發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA及其藥物組合物作為制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品的應(yīng)用。在該組合物中，本發(fā)明所述的發(fā)酵產(chǎn)物占10%~90%(重量百分比)，優(yōu)選占50%~99%(重量百分比)，最優(yōu)選占85%(重量百分比)。(一)本發(fā)明所采用的定義本發(fā)明所述的抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品是包括抗真菌產(chǎn)品、抗病毒產(chǎn)品和抗腫瘤口廣即本發(fā)明所述的抗真菌產(chǎn)品是指直接用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究由真菌引起的疾病及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的一種或多種，所述的真菌優(yōu)選白色念珠菌rC^md/c/afl/6/ca^sJ、新生l^、球菌^CV7/7/ococcws"eq/^vwa/wJ、纟工色毛癬菌(7Wc/z(9p/^,o"n/6rwwJ或薰煙曲霉菌64spergi7/M5:/mm'gcrftwJ等中的一種或多種。本發(fā)明所述的抗病毒產(chǎn)品是指直接用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究由病毒引起的疾病及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的一種或多種。本發(fā)明所述的抗腫瘤產(chǎn)品是指直接用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的一種或多種，所述的腫瘤優(yōu)選胃癌細(xì)胞(MKN45)、腸癌細(xì)胞(LOVO)、肝癌細(xì)胞(HepG2)或白血病細(xì)胞(HL-60)等中的一種或多種所導(dǎo)致的腫瘤，進(jìn)一步優(yōu)選胃癌細(xì)胞(MKN45)或肝癌細(xì)胞(HepG2)等中的一種或多種所導(dǎo)致的腫瘤。本發(fā)明所述的抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品均是包括醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域產(chǎn)品中的一種，是包括藥物、試劑或食品等中的一種或多種，優(yōu)選藥物。本發(fā)明所述的發(fā)酵產(chǎn)物是指BrefeldinA(布雷菲爾得菌素A)，供試樣品均是采取常規(guī)的制備方法或是本發(fā)明所述的制備方法獲得，所得到的發(fā)酵產(chǎn)物中的BrefeldinA含量一般<60%;但是通過對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化后的發(fā)酵產(chǎn)物的純度能夠在95%以上，即本發(fā)明所定義的發(fā)酵產(chǎn)物。也就是說，采用發(fā)酵產(chǎn)物的主要成分BrefddinA為原料，或者是直接采用含有BrefeldinA的藥材如BrefeldinA產(chǎn)生菌等為原料，或者直接采用含有BrefeldinA的發(fā)酵產(chǎn)物為原料，都能夠直接或間接用于制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品。BrefeldinA優(yōu)選以基本純的形式使用即本發(fā)明所定義的發(fā)酵產(chǎn)物，如BrefeldinA的純度》95%。本發(fā)明所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌是指被孢霉屬M(fèi)wtz'ew/toCoemans內(nèi)生真菌——單孢被孢霉Mor"'ere//awo"05poraLinnemann。BrefeldinA是預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤的活性成分，其使用方式是包括單獨(dú)使用或與其他化學(xué)物質(zhì)聯(lián)合使用等中的一種，優(yōu)選單獨(dú)使用，均能夠用于制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品。(二)技術(shù)構(gòu)思自主開發(fā)創(chuàng)新藥物是中國目前的一項(xiàng)緊迫任務(wù)，中國醫(yī)藥學(xué)具有悠久的歷史，在疾病預(yù)防和治療方面也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此積極尋找有效的活性成分來源和制備方法或發(fā)現(xiàn)其新的用途均是有效的快捷途徑，也是中國快捷創(chuàng)新藥物研制的優(yōu)勢之所在。鑒于BrefeldinA具有多種生物活性及潛在的藥用價(jià)值，故開發(fā)和研究BrefeldinA的工作己受到人們的廣泛重視，是目前國際上抗癌藥物研究的一個(gè)熱點(diǎn)。世界各國市場上對BrefeldinA需求很大，BrefeldinA作為醫(yī)藥中間體的銷售價(jià)格約為1000元/mg(純度》99.0%)。國際上在BFA的生物活性方面做了大量工作，但是中國對該化合物的研究甚少，特別在微生物發(fā)酵生產(chǎn)BFA方面尚屬空白。本發(fā)明涉及到從園參中分離得到的一種被孢霉屬M(fèi)oW/ew//"Coewcra內(nèi)生真菌——單孢被孢霉Morrierc//flwomwporaLinnemann，是國際上新發(fā)現(xiàn)的布雷菲爾得菌素A(BrefeldinA)產(chǎn)生菌。發(fā)酵后的BrefeldinA產(chǎn)量可達(dá)到380mg/L以上。這是目前已有報(bào)道中BrefeldinA產(chǎn)量較高的菌種。發(fā)明人經(jīng)過研究的最新發(fā)現(xiàn)是一種新的可生產(chǎn)BrefeldinA的菌種，擴(kuò)大藥用資源。并采用該產(chǎn)生菌發(fā)酵法生產(chǎn)BrefeldinA,將該發(fā)酵產(chǎn)物用于制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品o涉及真菌、病毒、腫瘤等方面的疾病特別是腫瘤方面的疾病嚴(yán)重影響中國人口的健康和生存質(zhì)量，研制預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤等方面的產(chǎn)品，特別是藥物、診斷試劑和保健品等，具有顯著的社會效益、經(jīng)濟(jì)效益。(三)真菌菌林及其制備方法與鑒定本發(fā)明的目的是提供一種新的可生產(chǎn)BrefeldinA的菌種，擴(kuò)大藥用資源。由于BrefeldinA結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成法很難實(shí)施，該菌種的制備方法為通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)BrefeldinA開辟了新途徑。本菌株制備方法是(1)挑選原藥材，洗凈晾干，消毒；(2)干燥后，切塊接種于培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(3)待菌絲長出時(shí)，把真菌轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接；(4)待純化后，再轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基斜面試管中，即得到該真菌菌株，對其編號，備用o所述的原藥材優(yōu)選人參等，進(jìn)一步優(yōu)選園參；所述的消毒方法優(yōu)選在無菌操作臺中用乙醇、NaC10溶液漂洗，無菌水沖洗；其中所述的乙醇優(yōu)選75%乙醇，所述的NaClO溶液優(yōu)選5%NaC10溶液；進(jìn)一步優(yōu)選的消毒方法的步驟是-①在無菌操作臺中用75%乙醇漂洗1060秒；②無菌水沖洗26次；5%NaC10溶液漂洗3~10分鐘；④無菌水沖洗2~6次；75%乙醇漂洗1060秒；無菌水沖洗2~6次。最優(yōu)選的消毒方法的具體操作步驟是①在無菌操作臺中用75%乙醇漂洗2030秒；②無菌水沖洗4次；5%NaC10溶液漂洗5分鐘；④無菌水沖洗4次；75%乙醇漂洗2030秒；⑥無菌水沖洗4次。菌株鑒定在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天以后，可見直徑0.51.5cm菌叢，邊緣不整齊，菌絲白色，低矮，絨狀。孢囊梗直立，1080mm不等，不分枝，頂生孢子囊，孢子囊單孢子，球形，無囊軸。接合孢子為一厚層的交織菌絲所包被。經(jīng)鑒定，確認(rèn)為單孢被孢霉Mom'ere〃fl膨"cw/oraLinnemann。本發(fā)明從園參制備得到的該BrefeldinA產(chǎn)生菌菌種MoW/ew//flsp.Yuan-27保藏于第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室，其菌種保藏號為Yuan-27，分類命名為MoW^e/to脂"aypora。(四)發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明制備方法是以單孢被孢霉Mor&re"asp.Yuan-27為發(fā)酵菌種，再先后采用液體發(fā)酵、溶劑萃取和有機(jī)溶劑重結(jié)晶方法，分離得到此種化合物。采用質(zhì)譜、核磁共振氫譜和碳譜等方法，確定了該化合物的結(jié)構(gòu)。所述的發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA的發(fā)酵法制備方法具體操作步驟如下(1)菌種的準(zhǔn)備使用PDA培養(yǎng)基，高溫滅菌，制成斜面試管培養(yǎng)基，置于常溫狀態(tài)下，無雜菌生長時(shí)，接種MoW^e//awoww/wra菌種sp.Yuan-27菌絲體，于常溫下培養(yǎng)，優(yōu)選28°C培養(yǎng)，作為菌種。(2)發(fā)酵種子液制備在多個(gè)錐形瓶中分別裝入PDA液體培養(yǎng)基；于高溫滅菌后，進(jìn)行接種A/oWew//"womwpora菌禾中Jkfort/ew〃flsp.Yuan陽27，常溫下振蕩培養(yǎng)，優(yōu)選28°C、180r'min陽1、培養(yǎng)48h,將該培養(yǎng)物作為發(fā)酵種子。例如，于250ml的錐形瓶中加入80ml的PDA液體培養(yǎng)基，接種Mo"^e//flmomwjrora菌種MoW/ew/&sp.Yuan-27菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)48h，作為發(fā)酵種子。(3)接種準(zhǔn)備發(fā)酵瓶，PDA發(fā)酵培養(yǎng)基裝量適量，PDA培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，高溫滅菌，接種8%發(fā)酵種子液，常溫下振蕩培養(yǎng)，優(yōu)選28。C、180r，min—1，優(yōu)選培養(yǎng)67天，真菌即可發(fā)酵成熟。例如，于250ml的三角瓶中加入80ml的PDA液體培養(yǎng)基，接種8%發(fā)酵種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。(4)制備結(jié)晶待真菌發(fā)酵成熟后，分別收集發(fā)酵液和菌絲體①發(fā)酵液的處理方法待真菌發(fā)酵成熟后，過濾去菌絲體，對發(fā)酵成熟的濾液層進(jìn)行乙酸乙酯部位的萃取，將乙酸乙酯部位合并、濃縮，用乙醇重結(jié)晶，即可得到BrefeldinA單體；優(yōu)選的方法是濾液用乙酸乙酯萃取3次，合并、濃縮，用乙醇重結(jié)晶3次，即可得到BrefeldinA單體純品；②菌絲體的處理方法烘干菌絲體，用乙醇浸泡，再以乙醇為溶劑超聲輔助萃取多次，合并、濃縮乙醇，再用乙醇重結(jié)晶，即可得到BrefeldinA單體純品。優(yōu)選的方法是菌絲體3070。C烘干，優(yōu)選50。C，用乙醇浸泡1248小時(shí)，優(yōu)選24小時(shí)，再以乙醇為溶劑超聲輔助萃取1~5次，優(yōu)選3次，每次10~50分鐘，優(yōu)選30分鐘，合并、濃縮乙醇，再用乙醇重結(jié)晶15次，優(yōu)選3次，即可得到BrefeldinA單體純品。上文所述的內(nèi)生真菌的分離、純化、發(fā)酵方法為本領(lǐng)域公知的常規(guī)使用的方法。上文所述的BrefeldinA的重結(jié)晶制備方法是本領(lǐng)域的常規(guī)重結(jié)品方法。上述方法均是本領(lǐng)域的公知技術(shù)，在需要進(jìn)一步確證的時(shí)候，很容易從有關(guān)的教材和相關(guān)的技術(shù)文獻(xiàn)等査閱到包括技術(shù)細(xì)節(jié)在內(nèi)的所有技術(shù)資料。上文所述的有機(jī)溶劑重結(jié)晶法所使用的有機(jī)溶劑是本領(lǐng)域的常規(guī)有機(jī)溶劑，包括乙醇、乙醇水溶液、甲醇等中的一種或多種，優(yōu)選乙醇或不同濃度的乙醇水溶液等中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選不同濃度的乙醇水溶液。(五)發(fā)酵產(chǎn)物的藥理活性現(xiàn)有研究己經(jīng)證明本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物BrefddiiiA具有抗真菌、抗病毒、抗腫瘤等方面的藥理作用與用途，本發(fā)明對發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA在抗真菌、抗病毒、抗腫瘤等方面的活性也進(jìn)行了多方面的試驗(yàn)。除了現(xiàn)有文獻(xiàn)對發(fā)酵產(chǎn)物BrefddinA的藥理作用與用途發(fā)明的報(bào)道以外，下面還將選擇發(fā)明人的抗真菌、抗腫瘤等方面的部分實(shí)驗(yàn)研究實(shí)例，通過對本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)闡述，以突出和證明本發(fā)明的研究重點(diǎn)、意義與實(shí)用性。一是選擇部分抗真菌的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果進(jìn)行舉例。通過BrefeldinA對白色念珠菌fCa"tfefca/Z'camJ、新生隱球菌fOj^tococcwsweoybnwafwj、紅色毛癬菌(Tn》/zop/^to"n/6ra附J、薰煙曲霉菌645pew7/ws/w;m'gaft/51J的活性測試，發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗真菌活性?？拐婢钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果如下所示(MIC8omg叱")<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>二是選擇部分抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果進(jìn)行舉例。選擇胃癌細(xì)胞(MKN45)、腸癌細(xì)胞(LOVO)、肝癌細(xì)胞(HepG2)及白血病細(xì)胞(HL-60)作為檢測細(xì)胞株，用MTT法測定BrefeldinA抗腫瘤活性?？鼓[瘤實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果如下所示(ICsQmg'L—1):<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結(jié)果顯示，BrefeldinA抗腫瘤活性顯著，其對胃癌細(xì)胞(MKN45)及肝癌細(xì)胞(HepG2)的活性明顯優(yōu)于陽性對照阿霉素。現(xiàn)有的研究文獻(xiàn)(①李海燕，黃容，卿晨，沙濤，李凌飛，趙之偉.法夏內(nèi)生菌株D126產(chǎn)細(xì)胞毒活性物質(zhì)布雷菲德菌素A的研究.天然產(chǎn)物研究與開發(fā).2008，20:24-27;②方美娟，王建鋒，趙玉芬，張永杰，黃耀堅(jiān)，宋思揚(yáng)，蘇金文.用HPLC-MS-MS快速分析和鑒定三尖杉植物內(nèi)生真菌發(fā)酵液中的BrefeldinA.分析測試學(xué)報(bào).2005,1:21-24;③F.W.Wang,R.H.Jiao，A.B.Cheng,.h.Tan,Y.C.Song.AntimicrobialpotentialsofendophyticfungiresisingingwercwswwiaW/kandbrefelsinAobtainedfromC7tfctw/on',sp.WorldJMicrobiolBiotechnol,2007，23:79-83)和本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)研究均表明，BrefeldinA及其組合物能夠用于制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品。(六)發(fā)酵產(chǎn)物的用途1、概述本發(fā)明的目的是提供一種用于臨床和科研的抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品，包括藥物、試劑或食品等中的一種或多種，優(yōu)選藥物。通過藥理活性篩選證明，發(fā)酵產(chǎn)物為其產(chǎn)生菌抗真菌、抗病毒、抗腫瘤的活性部位。發(fā)明人對真菌及其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了理論探索，并經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究特別是長期的藥理學(xué)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所述及的發(fā)酵產(chǎn)物有顯著的抗真菌、抗病毒(抗生、抗濾過性病原體、抗有絲分裂、抑制細(xì)胞生長)、抗腫瘤的活性，并且作為一種重要的分子工具(細(xì)胞因子分泌抑制劑，具有有效、經(jīng)濟(jì)、低毒的特點(diǎn))，廣泛用于研究哺乳動物的信號傳導(dǎo)途徑的研究；國際腫瘤協(xié)會在抗腫瘤體外篩選中還發(fā)現(xiàn)BrefeldinA作為血療法試劑有很大的應(yīng)用前景(方美娟，王建鋒，趙玉芬，張永杰，黃耀堅(jiān)，宋思揚(yáng)，蘇文金.用HPLC-MS-MS快速分析和鑒定三尖杉植物內(nèi)生真菌發(fā)酵液中的BrefeldinA.分析測試學(xué)報(bào).2005(l):21-24.)。因此，發(fā)酵產(chǎn)物及其組合物可用于制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品，優(yōu)選以本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物為原料制備而成的藥物。2、真菌及其發(fā)酵產(chǎn)物及其組合物的使用方法與要求本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物可以單獨(dú)或與其它活性組分聯(lián)合使用，包括用于制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品及科研相關(guān)試劑，包括藥物、試劑或食品等，尤其是藥物。在具體使用方面，本發(fā)明所述的發(fā)酵產(chǎn)物能夠單獨(dú)使用，例如以單體化合物、其衍生物或藥用鹽的形式應(yīng)用，還能夠與其他許多化學(xué)物質(zhì)一起使用。無論這些化學(xué)物質(zhì)是否具有生物活性或具有治療疾病的功能，包括輔助功能如協(xié)同放大作用、拮抗或緩解BrefddinA的副作用等，這些化學(xué)物質(zhì)是包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體、食品、天然產(chǎn)物、化學(xué)合成藥物或人類用藥等中的一種或多種；優(yōu)選包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體或者食品等中的一種或多種；進(jìn)一步優(yōu)選醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。本文使用的"醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和所有的生理適用的溶劑、分散介質(zhì)、胞衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑或吸收延遲劑等中的一種或多種。醫(yī)藥學(xué)上可接受載體的例子包括一種或多種的水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其組合物中的一種或多種。在許多情況下，在該組合物中最好包括等滲劑，例如，糖、諸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化鈉等中的一種或多種。醫(yī)藥學(xué)上可接受載體還可以包含少量的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液等中的一種或多種，它們增強(qiáng)了該發(fā)酵產(chǎn)物的有效期或效力。從具體的分類上看，所說的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體是指醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括潤滑劑，如滑石粉、聚乙二醇或硬脂酸鎂等中的一種或多種；崩解劑，如微晶纖維素等；填充劑，如淀粉、糊精或乳糖等中的一種或多種；粘合劑，如預(yù)膠化淀粉、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮等中的一種或多種；滲透壓調(diào)節(jié)劑，如氯化鈉、葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一種或多種；pH調(diào)節(jié)劑，如鹽酸、氫氧化鈉等酸或堿中的一種或多種；溶劑，如水、緩沖液、乙醇或丙二醇等中的一種或多種等；抗氧劑和絡(luò)合劑，如亞硫酸鈉、EDTA等中的一種或多種；表面活性劑，如季銨化合物、十六烷醇等吸附載體，如高嶺土或皂粘土等中的一種或多種；高分子骨架劑，如環(huán)糊精、聚乙二醇、泊洛沙姆等中的一種或多種；另外，還可以在組合物中加入其它輔劑，如香味劑、防腐劑或甜味劑等中的一種或多種。例如，將活性組分BrefeldinA溶解、混懸或乳化于適宜的水性溶劑中(例如，蒸餾水、生理鹽水或格林溶液等中的一種或多種)或油性溶劑中(例如，植物油例如橄欖油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一種或多種)中，即可制得注射制劑，其中溶劑中可含有增溶劑(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚維酮、環(huán)糊精、泊洛沙姆、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一種或多種)、滲透壓調(diào)節(jié)劑(例如，氯化鈉、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一種或多種)。在這種情況下，如有必要，可加入添加劑，例如穩(wěn)定劑(例如，人血清白蛋白等)、止痛劑(例如，鹽酸普魯卡因或利多卡因等中的一種或多種)等。本發(fā)明所述及的發(fā)酵產(chǎn)物還可以以組合物的形式聯(lián)合使用，特別是與用其它化學(xué)物質(zhì)如藥物對動物尤其是哺乳動物包括人或其他動物進(jìn)行治療所用的組合物或者是類似的組合物。所述哺乳動物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、豬、馬、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、獼猴或恒河猴等中的一種或多種，優(yōu)選人、小鼠、大鼠、猴、豬、兔或犬等中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選人、大鼠或猴等中的一種或多種。例如，可以將本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物加入適于給與受治療者的藥用組合物中。通常，該藥用組合物包含本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物和藥學(xué)上可接受的載體。發(fā)酵產(chǎn)物的組合物特別是藥物組合物可以有各種形式，包括例如液體、半固體和固體等劑量形式中的一種或多種其中所說的藥物組合物包括治療有效量的發(fā)酵產(chǎn)物為活性成分，以及一種或多種醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明所述的BrefeldinA或其藥物組合物能夠可以采用本領(lǐng)域公知的常規(guī)生產(chǎn)方法制成任何一種適合于實(shí)驗(yàn)、研究或臨床上應(yīng)用的劑型，包括固體制劑如膠囊、片劑、顆粒制劑等，液體制劑如口服液或者注射劑等。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。所述的劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑或注射劑等中的一種或多種，采取口服或注射(包括靜脈注射、靜脈滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一種或多種)、粘膜透析等中的一種或多種給藥途徑進(jìn)行抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療或科學(xué)研究。藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.5%99%的活性成分發(fā)酵產(chǎn)物，進(jìn)一步優(yōu)選含有重量比為50%~99°/。的活性成分發(fā)酵產(chǎn)物，最優(yōu)選含有重量比為85%的活性成分發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)物的藥物組合物一般必須無菌且在生產(chǎn)儲存條件下穩(wěn)定?？梢詫⒃摻M合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂質(zhì)體或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。通過將所需量的該發(fā)酵產(chǎn)物與所需上述成分的一種或組合一起加入適當(dāng)?shù)娜軇┲胁⒔又M(jìn)行除菌過濾制備無菌注射液。一般而言，通過將該發(fā)酵產(chǎn)物加入含有基本分散介質(zhì)和所需的上述其它成分的無菌溶媒中制備分散液。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，推薦的制備方法是真空干燥和冷凍干燥劑。例如，通過諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下通過保持所需顆粒大小和通過使用表面活性劑，可以保持溶液的適當(dāng)流動性。該組合物中可包括延遲吸收的藥劑，例如單硬脂酸鹽或明膠，以達(dá)到注射組合物的延長吸收；可包括高分子聚合物載體，如羥丙甲基纖維素或聚氧乙烯，以達(dá)到口服組合物的延長釋放。用于患者時(shí)，本發(fā)明所述的發(fā)酵產(chǎn)物劑量為5~30mg/kgd，可以分一次或多次使用，該劑量或用量通常根據(jù)患者或使用者的年齡和體重以及身體狀況或患者癥狀的狀況來決定。本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物及其藥用組合物可以包括"治療有效量"或"預(yù)防有效量"的本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物。"治療有效量"是指在必要的劑量和時(shí)間下有效達(dá)到所需治療效果的量。發(fā)酵產(chǎn)物的治療有效量可以根據(jù)諸如個(gè)體的病況、年齡、性別和體重以及該發(fā)酵產(chǎn)物在該個(gè)體引起所需反應(yīng)的能力等因素而變化。治療有效量亦指該發(fā)酵產(chǎn)物的有益治療效果超過其任何毒性或有害效果的量。"預(yù)防有效量"是指在必要?jiǎng)┝亢蜁r(shí)間下有效達(dá)到所需預(yù)防效果的量。因?yàn)轭A(yù)防劑量用于患病前或疾病早期的受治療者，預(yù)防有效量通常小于治療有效量。本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物的治療或預(yù)防有效量的典型的非限制性范圍是530mg/kg，更優(yōu)選為10~20mg/kg。應(yīng)注意，劑量值將根據(jù)欲減輕的疾病類型和嚴(yán)重性變化，也就是說用于患者時(shí)，本發(fā)明所述的發(fā)酵產(chǎn)物劑量或用量，通常根據(jù)患者或使用者的年齡和體重以及身體狀況或患者癥狀的狀況來決定。另外，應(yīng)理解，對于任何特定受治療者，應(yīng)隨著時(shí)間根據(jù)個(gè)體需要和給與或監(jiān)督給與所述組合物的人的專業(yè)判斷調(diào)整特定劑量制度，并且本文設(shè)定的劑量范圍僅為例證性的，并不會限制要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵺`。也就是說，需要根據(jù)治療的對象、給藥途徑、所治療疾病和狀況等，變化本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物的每次和/或每日的劑量或用量。例如，經(jīng)靜脈給予哺乳動物，尤其是成年人(如體重60kg)，所述發(fā)酵產(chǎn)物的單劑量約為5180mg，優(yōu)選約10mg，優(yōu)選每日給藥13次。可以調(diào)整劑量單位，以提拱最佳所需反應(yīng)(例如，治療或預(yù)防應(yīng)答)。例如，可以單次大劑量給藥，可以在一段時(shí)間內(nèi)給予幾個(gè)均分量或根據(jù)治療情況的迫切性按比例降低或增加劑量。配制易于給藥和劑量統(tǒng)一的劑量單位形式的非腸道組合物尤其有利。本文使用的劑量單位形式，指適于欲治療的哺乳動物受治療者的單元?jiǎng)┝康奈锢矸蛛x單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的計(jì)算用于與所需藥用載體一同產(chǎn)生所需治療效果的活性物發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格，由以下確定并直接取決于以下(a)該發(fā)酵產(chǎn)物的獨(dú)特特征和欲達(dá)到的特定治療或預(yù)防效果，和(b)在混合這種用于治療個(gè)體敏感性發(fā)酵產(chǎn)物的技術(shù)中的內(nèi)在限制。3、發(fā)酵產(chǎn)物及其組合物的藥物劑型和給藥途徑本發(fā)明所述的發(fā)酵產(chǎn)物及其組合物制備的用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品，其中按照食品
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的要求制備的產(chǎn)品能夠用于預(yù)防、保護(hù)和治療抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾??；按照醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
的要求制備的產(chǎn)品能夠用于患者的治療或保健，既能夠單獨(dú)直接用于制備治療或保健的藥物，也能夠與許多化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行混合或組合，直接或間接用于制備治療或保健的藥物。這里所述的化學(xué)物質(zhì)與本節(jié)上文中所述的相同。在本發(fā)明中，所需物料包括本發(fā)明的原料、上述配套使用的化學(xué)物質(zhì)等，均應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況和需要，采用食品級或藥用級的物料。本發(fā)明所述的發(fā)酵產(chǎn)物及其組合物，可以用本領(lǐng)域已知的各種方法給藥，盡管在許多治療用途中推薦的給藥途徑/給藥方式是噴霧劑或口服給藥。但是，技術(shù)人員會理解給藥途徑/給藥方式隨所需的結(jié)果而變化。在某些具體實(shí)施中，該活性化合物可以與保護(hù)該化合物免于快速釋放的載體一同制備例如空釋制劑，包括移植物傳遞系統(tǒng)、透皮貼傳遞系統(tǒng)或微囊傳遞系統(tǒng)等中的一種或多種。此外，還可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一種或多種。制備這種制劑的許多方法均己申請專利或一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知(例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson編輯，MarcelDekker，Inc.,紐約,1978)。本發(fā)明所述的BrefeldinA或其藥物組合物中，可以含有本領(lǐng)域公知的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體和其它任選成分。載體包括羧甲基淀粉、淀粉、纖維素、明膠、碳酸氫鈉、丙二醇或吐溫80等。任選成分例如是著色劑、甜味劑、抗氧劑等。本發(fā)明所述的發(fā)酵產(chǎn)物及其組合物，通常通過口服、直腸或腸胃外給藥等中的一種或多種方式，施用于需要這種治療的患者。本發(fā)明所述的BrefeldinA、其衍生物或組合物特別是藥物組合物可以制成任何一種適合于臨床上應(yīng)用的劑型，包括固體制劑，如膠囊、片劑、顆粒制劑等，半固體制劑如軟膏等，液體制劑如口服液、混懸劑、乳劑等，或者注射劑。采取口服或注射(包括靜脈注射、靜脈滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一種或多種)、粘膜透析等中的一種或多種給藥途徑進(jìn)行抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療或科學(xué)研究。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑或膠囊等中的一種或多種。在實(shí)施時(shí)，本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物可以與例如惰性稀釋劑或可同化的食用載體一同口服。該發(fā)酵產(chǎn)物(和共它成分，如果需要)亦可以包于硬或軟殼明膠膠囊、壓制成片劑或直接加入受治療者的膳食中。關(guān)于口服治療給藥，可以將所述發(fā)酵產(chǎn)物與賦形劑一起加入并以可食片劑、頰含片劑、錠劑、膠囊、懸液、糖漿或糯米紙囊劑等等中的一種或多種形式使用。為了以非腸道給藥之外給予本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物，可能需要用防止其失活的材料對該發(fā)酵產(chǎn)物包衣或與該發(fā)酵產(chǎn)物一同給予。亦可以將補(bǔ)充的活性化合物加入該組合物中。在具體實(shí)施時(shí)，將本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物與一種或多種可以用于治療疾病的其它治療藥物共配制和/或共給予。這種聯(lián)合使用，可以優(yōu)越地利用較低劑量的該給予的治療藥物，因此避免可能的毒性或與各種單一療法相關(guān)的并發(fā)癥。制成液體制劑如水劑、油懸浮劑或其它液體制劑中的一種或多種，如糖漿、酊劑或酏劑等中的一種或多種；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液劑、水劑或油性懸浮劑等中的一種或多種。以上藥物或藥物組合物能夠使用各種途徑，在所述的使用形式中，優(yōu)選的形式是口服制劑(如片劑、包衣片劑、膠囊、溶液或混懸液等中的一種或多種)、非腸道給予劑型(如注射劑、軟膏或貼劑等中的一種或多種)等中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選片劑、膠囊或注射劑等中的一種或多種，特別優(yōu)選片劑或注射劑中的一種。此外，發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeldinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等在某些情況下也能夠單獨(dú)直接用于制備用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品，也能夠與許多化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行混合或組合，以組合物的形式直接或間接用于制備用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品。這里所述的化學(xué)物質(zhì)與本節(jié)上文中所述的相同。例如，發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefddinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的粉末用于制備用于抗真菌、抗病毒、抗腫瘤的預(yù)防、診斷、保護(hù)和治療產(chǎn)品特別是藥物的各種劑型，或者是發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeldinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的粉末與有關(guān)的輔料用于制備用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品尤其是藥物的各種劑型，或者是發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeldinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的粉末與有關(guān)的制備用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品如藥物的各種劑型，如片劑、膠囊劑或混懸劑等中的一種或多種，優(yōu)選膠囊劑。所述的方法之一是將發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeldinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的粉末灌裝為膠囊劑；所述的方法之二是將發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeldinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的粉末與有關(guān)的制備用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品如藥物一起灌裝為膠囊劑；所述的方法之三是將發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeldinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的粉末與有關(guān)的輔助藥物一起灌裝為膠囊劑；所述的方法之四是將發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeldinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的粉末與有關(guān)的輔料一起按常規(guī)方法直接壓為片劑；所述的方法之五是將發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeldinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的粉末、有關(guān)的制備用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品如藥物一起與有關(guān)的輔料按常規(guī)方法直接壓為片劑；所述的方法之六是將發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeldinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的粉末、有關(guān)的輔助藥物一起與有關(guān)的輔料按常規(guī)方法直接壓為片劑等。除上述的六種基本方法外，還能夠選擇發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeldinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的其他形式或?qū)Πl(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料進(jìn)行本領(lǐng)域公知的方法處理后，制備各種劑型的含有發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料的產(chǎn)品如藥物。但是，需要注意的是，在上述直接使用發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeklinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的時(shí)候，應(yīng)先根據(jù)所使用的發(fā)酵產(chǎn)物的劑量要求，換算得到所需要使用的發(fā)酵產(chǎn)物所使用的藥材原料包括BrefeldinA產(chǎn)生菌及其菌絲體等的用量。綜上所述，本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物及其組合物可用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品，優(yōu)選藥物和食品，進(jìn)一步優(yōu)選藥物。(七)技術(shù)特長本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生BrefeldhiA的菌種選育與保藏容易，成本低廉，工藝簡單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，不使用毒性原料，有機(jī)溶劑使用少，藥源可以充分保障，具有大規(guī)模生產(chǎn)的潛力，并具有良好的經(jīng)濟(jì)效益與社會效益，有利于維持生態(tài)平衡和保護(hù)自然資源。本發(fā)明對以二苯乙烯苷為主要成分的發(fā)酵產(chǎn)物拓展了新的醫(yī)藥用途，也為預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病提供了一種新的藥物來源。本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物安全低毒，藥理作用較強(qiáng)，其原料來源豐富、價(jià)廉，制備工藝簡單，得率高，可用于制備預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品。本發(fā)明有針對性地研究BrefeldinA產(chǎn)生菌及其發(fā)酵產(chǎn)物，藥理作用較強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，使用制備的制劑質(zhì)量穩(wěn)定，且其使用安全，使用范圍特別廣，一物多用，效果明顯，最大限度地發(fā)揮了作用；因此容易推廣應(yīng)用，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益?？傊?，本發(fā)明積極適應(yīng)了現(xiàn)代醫(yī)療和科研領(lǐng)域的工作需要和人性化服務(wù)的需要，本發(fā)明為研究開發(fā)新的抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品提供了新的來源，對開發(fā)利用中國的藥用資源具有重要價(jià)值，是用于制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品的安全原料。具體實(shí)施例方式本發(fā)明研究了現(xiàn)有的真菌及其發(fā)酵產(chǎn)物以及其的藥理作用和用途，提供了一種能夠用于制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品的原料，便于醫(yī)療行業(yè)和相關(guān)行業(yè)如食品、飲料等領(lǐng)域的安全使用。(一)真菌及其發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法為進(jìn)一步闡述上述BrefeldinA產(chǎn)生菌菌株以及其發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA的制備方法，下面通過舉例來說明具體的操作步驟和方法。以園參為例，BrefeldinA產(chǎn)生菌的菌株具體的制備方法如下(1)挑選新鮮、健康園參，去掉參須、蘆頭，將根的表面洗凈、晾干水分，消毒；所述的消毒方法的具體操作步驟是①在無菌操作臺中用75%乙醇漂洗2030秒；②無菌水沖洗4次；5%NaC10溶液漂洗5分鐘；④無菌水沖洗4次；⑤75。/。乙醇漂洗2030秒；⑥無菌水沖洗4次。(2)無菌濾紙片吸干水分，分別切成5mmx5mmxlmm的小塊接種于培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿中接4塊，置28"C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)330天；(3)觀察到培養(yǎng)基上從各植物組織塊內(nèi)部向周圍長出菌絲時(shí)，采用尖端菌絲挑取法把真菌轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接；(4)待純化后，再轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基(最常用的真菌培養(yǎng)基，廣泛用于保存菌種)斜面試管中，即得到該真菌菌株，對其編號，備用。例如，本發(fā)明所述發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法可以為本制備方法是先對單孢被孢霉Mom'ew/tosp.Yuan-27進(jìn)行發(fā)酵，再分別收集發(fā)酵液和菌絲體(1)菌種的準(zhǔn)備使用PDA培養(yǎng)基，高溫滅菌，制成斜面試管培養(yǎng)基，置于常溫狀態(tài)下，無雜菌生長時(shí)，momwjora菌禾中Afom'ere//asp-Yuan-27菌絲體，于28。C培養(yǎng)，作為菌禾中。(2)發(fā)酵種子液制備在250ml的錐形瓶中加入80ml的PDA液體培養(yǎng)基，于高溫滅菌后，進(jìn)行接種MoMew//a附0"05;0;^菌種似0"^6//<33.Yuan-27菌絲體，28。C、180r*mirT1振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)48h，將該培養(yǎng)物作為發(fā)酵種子。(3)接種準(zhǔn)備發(fā)酵瓶，PDA發(fā)酵培養(yǎng)基裝量適量，PDA培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，接種8%發(fā)酵種子液，優(yōu)選培養(yǎng)在250ml的三角瓶中，加入80ml的PDA液體培養(yǎng)基，高溫滅菌，接種8%發(fā)酵種子液，28°C、180"min^振蕩培養(yǎng)67天，真菌即可發(fā)酵成熟。(4)制備結(jié)晶待真菌發(fā)酵成熟后，分別收集發(fā)酵液和菌絲體①發(fā)酵液的處理方法待真菌發(fā)酵成熟后，過濾去菌絲體，對發(fā)酵成熟的濾液層進(jìn)行乙酸乙酯部位的萃取1~5次，將乙酸乙酯部位合并、濃縮，用乙醇重結(jié)晶15次，即可得到BrefeldinA單體純品；②菌絲體的處理方法307(TC烘干菌絲體，用乙醇浸泡1248小時(shí)，再以乙醇為溶劑超聲輔助萃取15次，每次1050分鐘，合并、濃縮乙醇，再用乙醇重結(jié)晶15次，即可得到BrefeldinA單體純品。(二)發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明綜合應(yīng)用質(zhì)譜(簡稱MS)、核磁共振氫譜(簡稱'H-NMR)、核磁共振碳譜(簡稱"C-NMR)以及核磁共振二維譜(簡稱2D-NMR)等分析技術(shù)對發(fā)酵產(chǎn)物中的BrefeldinA進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。BrefeldinA具有如下理化性質(zhì)該化合物為無色結(jié)晶，分子式CwH2404,MW:280.363;易溶于甲醇、乙醇等極性較大的溶劑，微溶于水；mp.204205。C;[a]。=+34.5°;UV:XE=215(si1200):NMR(500MHz,MeOD)S(ppm):7'38(1Hdd，■/=15.6,3.0Hz,H國3),5.76(1Hdd，=15.6，1.8Hz,H-2),4.10(1Hdd，/=5.4，5.4Hz，H-7),5.66(1Hddd，/=15.0,10.2,4.6Hz,H-ll)，5.19(1Hdd,/=15.0,9.6Hz,H-IO),4.75(1Hdd,7=13.0,6.2Hz,H-15),3.92(1H2.0Hz,H-4),2.30(1Hdddd,■/=8.6,8.7Hz，H-9),2.05(1Hddd,>/=13.6,8.7,5.4Hz,H-8'),L89-1.66(6H,H-12',6',13',12",14',6"，5，8"，14")，U8(3Hd，《/=6.24Hz,H-16),0.80(1H，H-13"),;l3CNMR(500MHz,MeOD)S(ppm):168,66(C-1)，155.38(C-3),138.41(C-10),131.69(C-11),118.10(C-2),76.93(C-4),73.49(C-15),73.27(C-7)，53.48(C-5),45.77(C曙9),44.42(C-8),42.16(C-6)，35.31(C-14)，33.26(C-12)，28.28(C-13)，21.36(16);光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致(F.W.Wang,R.H.Jiao,A.B.Cheng，.h.Tan,YC.Song.AntimicrobialpotentialsofendophyticfUngiresisingingwercwsva"'"礎(chǔ)sandbrefelsinAobtainedfromCWos/wr/wwsp.WorldJMicrobiolBiotechnol,2007，23:79-83)。(三)BrefeldinA及其組合物的常用藥物制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明制備粉針劑一般采用常規(guī)的冷凍干燥法，以水作為溶媒，其步驟為取發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA，加入賦形劑，加水溶解，調(diào)節(jié)pH,加入活性炭，過濾除菌，灌裝，半軋塞，冷凍干燥，壓塞軋蓋即可。所用的賦形劑選自甘露醇、水解明膠、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷、白蛋白、pH調(diào)節(jié)劑等中的一種或幾種。每瓶含發(fā)酵產(chǎn)物l~100mg。本發(fā)明制備粉針劑也可采用噴霧干燥法，以水作為溶媒，其步驟為取發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA，加或不加賦形劑(賦形劑同上)，加水溶解，加入活性炭，過濾除菌，噴霧干燥，無菌分裝，壓塞軋蓋即可。每瓶含發(fā)酵產(chǎn)物10~100mg。30本發(fā)明制備小針劑時(shí)，以注射用水作為溶媒配制即可，也可加適量輔料，輔料選自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、環(huán)糊精、抗氧劑、金屬離子絡(luò)合劑、抑菌劑中的一種或幾種。注射劑可以配制成溶液、微乳液、乳液、脂質(zhì)體、微球、微囊或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)，其中可包括延遲吸收的藥劑，例如單硬脂酸鹽、明膠、乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、聚正酯或聚乳酸等，以達(dá)到注射組合物的延長吸收。每支含發(fā)酵產(chǎn)物1100tng。本發(fā)明制備葡萄糖輸液或氯化鈉輸液，以注射用水作為溶媒，加入適量葡萄糖或氯化鈉配制即可，也可加適量輔料，輔料選自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙醜胺、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、抗氧劑、環(huán)糊精、金屬離子絡(luò)合劑、抑菌劑中的一種或幾種。每瓶含發(fā)酵產(chǎn)物l~100mg。本發(fā)明制備片劑、膠囊、顆粒劑、口服液等口服制劑，輔料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸鹽等，按常規(guī)技術(shù)制備?？砂ǜ叻肿泳酆衔镙d體，如羥丙甲基纖維素或聚氧乙烯等，以達(dá)到口服組合物的延長釋放。在本發(fā)明中，以上所述的具體實(shí)施方式和以下所述的實(shí)施例均是為了更好地闡述本發(fā)明，并不是用來限制發(fā)明的范圍。下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。實(shí)施例1、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA的制備方法一使用PDA(葡萄糖1%、蔗糖1%、土豆20%、瓊脂1%、pH自然)斜面培養(yǎng)基，120'C下滅菌30分鐘，制成斜面，置于37'C常溫狀態(tài)下24小時(shí)，無雜菌生長時(shí)，接種Mo/^ewZ/amo"ospora菌種菌絲體，于28。C培養(yǎng)7天。在多個(gè)250ml錐形瓶中分別裝入80ml液體培養(yǎng)基(葡萄糖1%、蔗糖1%、土豆20%、pH自然)。于120。C滅菌30分鐘后，進(jìn)行接種，28'C震蕩培養(yǎng)48小時(shí)，將該培養(yǎng)物作為種子。準(zhǔn)備5000mL發(fā)酵瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為2000mL，培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，12(TC滅菌30分鐘，接種量為8%，28°C、以及180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)7天。分別收集發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液用等量乙酸乙酯萃取3次，合并、濃縮、用乙醇重結(jié)晶3次，即可得到BrefeldhiA單體純品菌絲體50。C烘干，用乙酸乙酯浸泡24小時(shí)，再以乙酸乙酯為溶劑超聲輔助萃取三次，每次30分鐘，合并、濃縮乙酸乙酯，再用乙醉重結(jié)晶3次，即可得到BrefeldinA單體純品。實(shí)施例2、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA的制備方法二使用PDA(葡萄糖1%、蔗糖2%、土豆20%、瓊脂1%、pH自然)斜面培養(yǎng)基，120'C下滅菌30分鐘，制成斜面，置于37'C常溫狀態(tài)下24小時(shí)，無雜菌生長時(shí)，接種Mor"e/Za菌種菌絲體，于28。C培養(yǎng)7天。在多個(gè)250ml錐形瓶中分別裝入80ml液體培養(yǎng)基(蔗糖2%、土豆20%、pH自然)。于12(TC滅菌30分鐘后，進(jìn)行接種，28。C震蕩培養(yǎng)48小時(shí)，將該培養(yǎng)物作為種子。準(zhǔn)備5000mL發(fā)酵瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為2000mL，培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，12(TC滅菌30分鐘，接種量為8%，28°C、以及180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)7天。分別收集發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液用等量乙酸乙酯萃取3次，合并、濃縮、用乙醇重結(jié)晶3次，即可得到BrefeldinA單體純品；菌絲體50。C烘干，用乙酸乙酯浸泡24小時(shí)，再以乙酸乙酯為溶劑超聲輔助萃取三次，每次30分鐘，合并、濃縮乙酸乙酯，再用乙醇重結(jié)晶3次，即可得到BrefeldinA單體純品。實(shí)施例3、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA的制備方法三使用PDA(葡萄糖1%、蔗糖1%、土豆20%、瓊月旨1%、pH自然)斜面培養(yǎng)基，120'C下滅菌30分鐘，制成斜面，置于37'C常溫狀態(tài)下24小時(shí)，無雜菌生長時(shí)，接種A/0Wz'ew//a附o"o^ora菌種菌絲體，于28。C培養(yǎng)7天。在多個(gè)250ml錐形瓶中分別裝入80ml液體培養(yǎng)基(蔗糖2%、蛋白胨0.2%、pH自然)。于12(TC滅菌30分鐘后，進(jìn)行接種，28'C震蕩培養(yǎng)48小時(shí)，將該培養(yǎng)物作為種子。準(zhǔn)備5000mL發(fā)酵瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為2000mL，培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，12(TC滅菌30分鐘'，接種量為8%，28°C、以及180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)7天。分別收集發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液用等量乙酸乙酯萃取3次，合并、濃縮、用乙醇重結(jié)晶3次，即可得到BrefeldinA單體純品；菌絲體5CTC烘干，用乙酸乙酯浸泡24小時(shí)，再以乙酸乙酯為溶劑超聲輔助萃取三次，每次30分鐘，合并、濃縮乙酸乙酯，再用乙醇重結(jié)晶3次，即可得到BrefeldinA單體純品。實(shí)施例4、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA的制備方法四使用PDA(葡萄糖1%、蔗糖1%、土豆20%、瓊脂1%、pH自然)斜面培養(yǎng)基，120X:下滅菌30分鐘，制成斜面，置于37'C常溫狀態(tài)下24小時(shí)，無雜菌生長時(shí)，接種Mortierellamonospora菌種菌絲體，于28。C培養(yǎng)7天。在多個(gè)250ml錐形瓶中分別裝入80ml液體培養(yǎng)基(葡萄糖1%、蔗糖1%、土豆20%、KH2P041%、pH自然)。于12(TC滅菌30分鐘后，進(jìn)行接種，28'C震蕩培養(yǎng)48小時(shí)，將該培養(yǎng)物作為種子。準(zhǔn)備5000mL發(fā)酵瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為2000mL，培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，12(TC滅菌30分鐘，接種量為5%,28'C、以及180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)7天。分別收集發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液用等量乙酸乙酯萃取3次，合并、濃縮、用乙醇重結(jié)晶3次，即可得到BrefeldinA單體純品；菌絲體50'C烘干，用乙醇浸泡24小時(shí)，再以乙醇為溶劑超聲輔助萃取三次，每次30分鐘，合并、濃縮乙醇，再用乙醇重結(jié)晶3次，即可得到BrefeldinA單體純品。實(shí)施例5、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA粉針劑的制備取發(fā)酵產(chǎn)物10g，加入右旋糖苷30g，加1500ml注射用水，調(diào)節(jié)pH至9.0，攪拌使其溶解；加注射用水至2000ml，加3.0g針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；用0.22nm微孔濾膜過濾；分裝，半軋塞；冷凍干燥，再壓塞軋蓋即可。實(shí)施例6、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA粉針劑的制備取發(fā)酵產(chǎn)物50g,加入甘露醇60g，加5000ml注射用水，調(diào)節(jié)pH至8.0，攪拌使其溶解；加注射用水至6000ml，加lg針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；用0.22pm微孔濾膜過濾；分裝，半軋塞；冷凍干燥，再壓塞軋蓋即可。實(shí)施例7、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA粉針劑的制備取發(fā)酵產(chǎn)物lg，加入葡萄糖50g，加900ml注射用水，調(diào)節(jié)pH至8.5，攪拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；用0.22pm微孔濾膜過濾；分裝，半軋塞；冷凍干燥，再壓塞軋蓋即可。實(shí)施例8、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA小針劑的制備取發(fā)酵產(chǎn)物5g，加900ml注射用水，調(diào)節(jié)pH至9.0，攪拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.0g針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；用0.22pm微孔濾膜過濾；分裝灌封，每瓶10ml。實(shí)施例9、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA小針劑的制備取發(fā)酵產(chǎn)物10g，加入乙醇600ml，攪拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加0.5g針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；用0.22^111微孔濾膜過濾分裝灌封，每瓶5ml。實(shí)施例10、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA葡萄糖輸液的制備取發(fā)酵產(chǎn)物2g，加入聚乙二醇10g，加入葡萄糖500g，加4500ml注射用水，攪拌使其溶解；加5g針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；加注射用水至5000ml;用0.22nm微孔濾膜過濾；分裝灌封，每瓶500ml，熱壓滅菌。實(shí)施例11、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA氯化鈉輸液的制備取發(fā)酵產(chǎn)物lg，加入氯化鈉90g，加9000ml注射用水，攪拌使其溶解；加10g針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；加注射用水至10000ml;用0.22nm微孔濾膜過濾；分裝灌封，每瓶250ml，熱壓滅菌即可。實(shí)施例12、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA片劑的制備(1)處方BrefeldinA畫0.0g微晶纖維素U70.0g預(yù)膠化淀粉6卯.0g乳糖125.0g5。/oPVP無水乙醇適量硬脂酸鎂15.0g共制成畫0片—包衣液處方胃溶薄膜衣料85G61235,上?？房蛋录夹g(shù)有限公司(2)制備工藝按以上處方分別稱取處方量的主藥與輔料，按等量遞加法混合均勻，5。/。PVP無水乙醇制軟材、干燥、整粒，加入硬脂酸鎂混勻，測定含量，計(jì)算片重后壓片，控制裸片硬度57kg，共制得片劑9698片，成品率為96.98%。采用常規(guī)高效包衣鍋包衣，工藝如下將裸片(硬度57kg)放入包衣鍋中，啟動攪拌裝置和鼓風(fēng)加熱裝置，待裸片溫度升至40'C時(shí)，開始打開噴槍對準(zhǔn)片床的上1/3處噴入包衣液包衣，控制片床溫度3842'C，氣磅壓力6kg，包衣液流速為50mL/min，包衣膜重占包衣片重的3%。實(shí)施例13、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA片劑的制備(1)處方BrefeldinAlOO.Og乳糖80.0g淀粉60.0g羧甲基淀粉鈉15.0g10%PVP水溶液適量硬脂酸鎂_3.0g共制成1000片(2)制備工藝取原輔料分別過80目篩，混合均勻，用適量10。/QPVP溶液制軟材，干燥，加入硬脂酸鎂3g，整粒，壓片，制成1000片。實(shí)施例14、發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA膠嚢劑的制備(1)處方BrefeldinA腦0.0g微晶纖維素1000g淀粉140g無水乙醇適量滑石粉_80g共制成10000膠囊(2)制備工藝分別取原料藥BrefeldinA及處方中其它輔料分別過100目篩，置60'C烘干，稱取處方量BrefeldinA與微晶纖維素、淀粉等量遞加法混合均勻，用適量無水乙醇制軟材，30目篩制粒，506(TC干燥2小時(shí)，用30目篩整粒，加入處方量的滑石粉混合均勻，填充。權(quán)利要求1、一種BrefeldinA產(chǎn)生菌，其特征在于，所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌是被孢霉屬M(fèi)ortierellaCoemans內(nèi)生真菌——單孢被孢霉MortierellamonosporaLinnemann。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌，其特征在于，所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌菌種是單孢被孢霉sp.Yuan-27。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌，其特征在于，所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌菌種的制備方法具體步驟如下-(1)挑選原藥材，洗凈晾干，消毒；(2)干燥后，切塊接種于培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(3)待菌絲長出時(shí)，把真菌轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接；(4)待純化后，再轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基斜面試管中，即得到該真菌菌株，對其編號，備用o4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌，其特征在于，所述的原藥材是人參，所述的消毒方法是在無菌操作臺中用乙醇、NaC10溶液漂洗，無菌水沖洗。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌，其特征在于，所述的原藥材是園參，所述的乙醇是75%乙醇，所述的NaCIO溶液是5%NaC10溶液；所述的消毒方法具體操作步驟如下①在無菌操作臺中用75%乙醇漂洗1060秒；②無菌水沖洗2~6次；@5%NaC10溶液漂洗3~10分鐘；④無菌水沖洗2~6次；75%乙醇漂洗1060秒；(D無菌水沖洗2~6次。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌，其特征在于，所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌菌種的制備方法的具體步驟如下，(1)挑選新鮮、健康園參，去掉參須、蘆頭，將根的表面洗凈、晾干水分，消毒；所述的消毒方法的具體操作步驟是①在無菌操作臺中用75%乙醇漂洗2030秒；②無菌水沖洗4次；5%NaC10溶液漂洗5分鐘；④無菌水沖洗4次；75%乙醇漂洗2030秒；⑥無菌水沖洗4次；(2)無菌濾紙片吸干水分，分別切成5mmx5mmxlmm的小塊接種于培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿中接4塊，置28'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)330天；(3)觀察到培養(yǎng)基上從各植物組織塊內(nèi)部向周圍長出菌絲時(shí)，采用尖端菌絲挑取法把真菌轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接；(4)待純化后，再轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基斜面試管中，即得到該真菌菌株，對其編號，備用o7、根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于，所述的發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA的發(fā)酵法制備方法如下以單孢被孢霉^/^"^^/^3^￥11011-27為發(fā)酵菌種，再先后采用液體發(fā)酵、溶劑萃取和有機(jī)溶劑重結(jié)晶方法，分離得到此種化合物。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于，所述的發(fā)酵產(chǎn)物BrefddinA的發(fā)酵法制備方法具體操作步驟如下(1)菌種的準(zhǔn)備使用PDA培養(yǎng)基，高溫滅菌，制成斜面試管培養(yǎng)基，置于常溫狀態(tài)下，無雜菌生長時(shí)，接種MoW/we〃awowoypora菌禾中Mw"ew〃asp.Yuan-27菌絲體，常溫下培養(yǎng)，作為菌禾中；(2)發(fā)酵種子液制備在多個(gè)錐形瓶中分別裝入PDA液體培養(yǎng)基；于高溫滅菌后，進(jìn)行接種Mw^AW/a菌種sp.Yuan-27，常溫下振蕩培養(yǎng)，將該培養(yǎng)物作為發(fā)酵種子；(3)接種準(zhǔn)備發(fā)酵瓶，PDA發(fā)酵培養(yǎng)基裝量適量，PDA培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，高溫滅菌，接種8%發(fā)酵種子液，常溫下振蕩培養(yǎng)，真菌即可發(fā)酵成熟；(4)制備結(jié)晶待真菌發(fā)酵成熟后，分別收集發(fā)酵液和菌絲體①發(fā)酵液的處理方法待真菌發(fā)酵成熟后，過濾去菌絲體，對發(fā)酵成熟的濾液層進(jìn)行乙酸乙酯部位的萃取，將乙酸乙酯部位合并、濃縮，用乙醇重結(jié)晶，即可得到BrefeldinA單體；②菌絲體的處理方法烘干菌絲體，用乙醇浸泡，再以乙醇為溶劑超聲輔助萃取多次，合并、濃縮乙醇，再用乙醇重結(jié)晶，即可得到BrefeldinA單體純品。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于，所述的發(fā)酵種子液制備中的常溫下振蕩培養(yǎng)條件是28°C、180r'min—1、培養(yǎng)48h;所述的接種中的常溫下振蕩培養(yǎng)條件是28'C、180r，mirT1，培養(yǎng)67天；所述的發(fā)酵液的處理方法是待真菌發(fā)酵成熟后，過濾去菌絲體，對發(fā)酵成熟的濾液層進(jìn)行乙酸乙酯部位的萃取1~5次，將乙酸乙酯部位合并、濃縮，用乙醇重結(jié)晶15次，即可得到BrefeldinA單體；所述的菌絲體的處理方法是3070。C烘干菌絲體，用乙醇浸泡12~48小時(shí)，再以乙醇為溶劑超聲輔助萃取1~5次，每次1050分鐘，合并、濃縮乙醇，再用乙醇重結(jié)晶15次，即可得到BrefeldinA單體純品。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于，所述的發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA的發(fā)酵法制備方法具體操作步驟如下(1)菌種的準(zhǔn)備使用PDA培養(yǎng)基，高溫滅菌，制成斜面試管培養(yǎng)基，置于常溫狀態(tài)下，無雜菌生長時(shí)，接種Mw"ew〃flwo"cw/ora菌種MoW/e"http://asp.Yuan-27菌絲體，于28。C培養(yǎng)，作為菌種；(2)發(fā)酵種子液制備在多個(gè)250ml錐形瓶中分別加入80ml的PDA液體培養(yǎng)基；于高溫滅菌后，進(jìn)行接種肘0燈/￡"http://0(/770"0^0廣"菌禾中似0"&"〃"5口.Yuan-27，28°C、180r'min-1振蕩培養(yǎng)48h，將該培養(yǎng)物作為發(fā)酵種子；(3)接種在250ml的三角瓶中加入80ml的PDA液體培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，高溫滅菌，接種8%發(fā)酵種子液，28°C、180r*min—'下振蕩培養(yǎng)67天，真菌即可發(fā)酵成熟；(4)制備結(jié)晶待真菌發(fā)酵成熟后，分別收集發(fā)酵液和菌絲體①發(fā)酵液的處理方法待真菌發(fā)酵成熟后，過濾去菌絲體，對發(fā)酵成熟的濾液層進(jìn)行乙酸乙酯部位的萃取3次，將乙酸乙酯部位合并、濃縮，用乙醇重結(jié)晶3次，即可得到BrefeldinA單體；②菌絲體的處理方法5(TC烘干菌絲體，用乙醇浸泡24小時(shí)，再以乙醇為溶劑超聲輔助萃取3次，每次30分鐘，合并、濃縮乙醇，再用乙醇重結(jié)晶3次，即可得到BrefeldinA單體純品。11、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌在制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌在制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品是包括抗真菌產(chǎn)品、抗病毒產(chǎn)品和抗腫瘤產(chǎn)品；所述的抗真菌產(chǎn)品是指直接用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究由真菌引起的疾病及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的一種或多種，所述的真菌是包括白色念珠菌、新生隱球菌、紅色毛癬菌或薰煙曲霉菌中的一種或多種；所述的抗病毒產(chǎn)品是指直接用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究由病毒引起的疾病及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的一種或多種；所述的抗腫瘤產(chǎn)品是指直接用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的一種或多種，所述的腫瘤是包括胃癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞或白血病細(xì)胞中的一種或多種所導(dǎo)致的腫瘤。13、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的BrefddinA產(chǎn)生菌在制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品是包括藥物、試劑或食品中的一種。14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌在制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品是藥物。15、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物在制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物在制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品是包括抗真菌產(chǎn)品、抗病毒產(chǎn)品和抗腫瘤產(chǎn)品；所述的抗真菌產(chǎn)品是指直接用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究由真菌引起的疾病及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的一種或多種，所述的真菌是包括白色念珠菌、新生隱球菌、紅色毛癬菌或薰煙曲霉菌中的一種或多種；所述的抗病毒產(chǎn)品是指直接用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究由病毒引起的疾病及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的一種或多種；所述的抗腫瘤產(chǎn)品是指直接用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的一種或多種，所述的腫瘤是包括胃癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞或白血病細(xì)胞中的一種或多種所導(dǎo)致的腫瘤。17、根據(jù)權(quán)利要求15所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌在制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品是包括藥物、試劑或食品中的一種。18、根據(jù)權(quán)利要求17所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌在制備抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗腫瘤產(chǎn)品是藥物。19.根據(jù)權(quán)利要求7所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于，所述的發(fā)酵產(chǎn)物BrefeldinA的純度》95%。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的BrefeldinA產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于，所述的發(fā)酵產(chǎn)物BrefddinA的使用方式是包括單獨(dú)使用或與其他化學(xué)物質(zhì)聯(lián)合使用中的一種。全文摘要本發(fā)明涉及BrefeldinA產(chǎn)生菌及制備方法，以及BrefeldinA發(fā)酵生產(chǎn)方法與用途。BrefeldinA產(chǎn)生菌的菌種選育與保藏容易，成本低廉，工藝簡單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，不使用毒性原料，有機(jī)溶劑使用少，藥源可以充分保障，具有大規(guī)模生產(chǎn)的潛力，并具有良好的經(jīng)濟(jì)效益與社會效益，有利于維持生態(tài)平衡和保護(hù)自然資源。本發(fā)明對以二苯乙烯苷為主要成分的發(fā)酵產(chǎn)物拓展了新的醫(yī)藥用途，BrefeldinA安全低毒，性質(zhì)穩(wěn)定，藥理作用較強(qiáng)，制備工藝簡單，得率高，使用范圍特別廣，一物多用，能夠?yàn)轭A(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及其直接相關(guān)疾病提供了一種新的藥物來源。文檔編號A61K31/365GK101580805SQ200910048638公開日2009年11月18日申請日期2009年3月31日優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日發(fā)明者徐麗莉,秦路平,婷韓,黃寶康申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)