專利名稱：痘病毒溶瘤載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
溶瘤病毒是一類用于治療癌癥，具有腫瘤依賴性自我永續(xù)獨(dú)特性質(zhì)的新型治療 因子(HERMISTON. A demand for next-generation oncolyticadenoviruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006，8 卷，4 號，322-30 頁.)。溶瘤病毒能夠 在惡性細(xì)胞中選擇性復(fù)制，并因此提供可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過癌癥常規(guī)治療的效力和特異性的水 平(FISHER. Striking out atdisseminated metastases the systemic delivery of oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006,8 卷，4 號， 301-13頁.)。使用這些病毒的好處是，當(dāng)他們復(fù)制時，他們?nèi)芙馄渌拗骷?xì)胞。癌細(xì)胞是多種 病毒的理想寄主，因為它們的抗病毒的干擾素途徑滅活或者具有突變的腫瘤抑制基因，這 能使病毒復(fù)制不受阻礙地繼續(xù)下去(CHERNAJ0VSKY，等Fighting cancer with oncolytic viruses. British medical journal. 2006，332 卷，7534 號，170-2 頁·)。一些病毒天然地可以在腫瘤細(xì)胞中選擇性地復(fù)制，但也可以通過修飾天然存 在的病毒而獲得溶瘤病毒。為了這一目的，目前使用的修飾病毒的主要策略包括主要 病毒基因中的功能性缺失；控制這些病毒基因的表達(dá)的腫瘤或組織特異性啟動子；向 性修飾將腺病毒重定向至癌細(xì)胞表面。在不久的將來，溶瘤腺病毒需要被優(yōu)化，以充分 發(fā)揮其作為重要的抗癌工具的潛力，并且從而改善惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后(JIANG， 等 Oncolyticadenoviruses as antiglioma agents.Expert review of anticancer therapy. 2006,6 卷，5 號，697-708 頁·)。例如，腺病毒0NYX-015，被選擇性的修飾從而在具有p53突變的細(xì)胞中復(fù)制并殺 死細(xì)胞，其正由Onyx Pharmaceuticals開發(fā)，用于各種實(shí)體瘤，包括頭部和頸部、胃腸和胰 腺腫瘤的潛在治療。它是一個重組腺病毒，它在ElB座位載有功能缺失性突變，其產(chǎn)物是結(jié) 合于P53腫瘤抑制蛋白并使其滅活的55kDa的蛋白質(zhì)。因此，認(rèn)為0NYX-015腺病毒應(yīng)使 正常細(xì)胞不受影響。P53腫瘤抑制基因突變是癌癥遺傳異常中最常見的類型，存在于一半 以上的所有主要癌癥類型中。因此，這些細(xì)胞對能很容易的復(fù)制并導(dǎo)致細(xì)胞死亡的病毒敏 感。0NYX-015正處于用于治療復(fù)發(fā)性頭部和頸部癌癥的III期臨床試驗，結(jié)直腸、卵巢、胰 腺和口腔腫瘤的II期臨床試驗，以及消化疾病、食道和肝臟腫瘤的I期臨床試驗(C0HEN，等 ONYX-015. Onyx Pharmaceuticals. Current opinion in investigational drugs. 2001, 2 卷，12 號，1770-5 頁.)。天然的溶瘤病毒是具有復(fù)制能力的病毒，其具有選擇性感染并殺死腫瘤細(xì)胞的先 天能力。盡管50年前被用于使用活病毒治療癌癥的最初嘗試，但對天然溶瘤病毒作為癌 癥療法的關(guān)注已經(jīng)滯后于支持改造的腺病毒和皰疹病毒作為癌癥療法。然而，最近已經(jīng)對 這些天然存在的物質(zhì)的高效能和選擇性重新關(guān)注了(ROBERTS，等Naturally oncolytic viruses. Currentopinion in molecular therapeutics. 2006，8 卷，4 號，314—21 頁·)。在天然溶瘤病毒中，痘苗病毒(痘病毒科)具有很多用于溶瘤病毒療法的理想病 毒主鏈所必需的關(guān)鍵屬性。這些包括生命周期短、和快速的細(xì)胞間播散、裂解能力強(qiáng)、巨 大的克隆能力和明確的分子生物學(xué)。此外，盡管它們能夠在人類細(xì)胞中復(fù)制，但并不考慮為天然的健康問題，且它們特別好地得到表征，在消滅天花的戰(zhàn)爭中已經(jīng)被遞送給數(shù)百萬人。使用疫苗株或基因修飾的牛痘株的早期臨床結(jié)果已經(jīng)證明了抗癌效果(THORNE，等 Vaccinia virus and oncolytic virotherapy of cancer. Current opinion inmolecular therapeutics. 2005，7 卷，4 號，359—65 頁·)。相比之下，痘病毒粘液瘤病毒是一種新型的溶瘤候選者，其沒有直接用于人類的 歷史，因為它對兔類(兔子)有特殊的和絕對的宿主種類向性。最近已證明粘液瘤病毒也 能夠選擇性的感染并殺死人類腫瘤細(xì)胞，該特有的向性聯(lián)系在大多數(shù)人類癌癥中所見的失 調(diào)的細(xì)胞內(nèi)信號途徑。這篇綜述概述了關(guān)于粘液瘤病毒對人類癌細(xì)胞向性的現(xiàn)有知識，以 及展示其在癌癥的動物模型中感染和清除腫瘤能力的臨床前期數(shù)據(jù)(STANFORD，等Myxoma virus and oncolytic virotherapy :a new biologic weapon in thewar against cancer. Expert opinion on biological therapy. 2007,7 卷，9 號，1415-25 頁·)。技術(shù)問題注射達(dá)到抗腫瘤效果所需的高劑量的痘病毒引發(fā)了毒性的問題。不利的事件大 多不嚴(yán)重，通常與痘苗病毒有關(guān)的不良反應(yīng)是自限性的，包括發(fā)燒、頭痛、疲勞、肌痛、寒戰(zhàn)、 局部皮膚反應(yīng)、非特異性疹、多形性紅斑、淋巴結(jié)病、和種痘位置疼痛。其他反應(yīng)可能需要 另外的治療方法(例如，首要的治療VIG，第二線治療西多福韋)。不良反應(yīng)可能需要進(jìn)一 步的評估或治療，包括非故意接種、全身性牛痘(GV)、牛痘性濕疹(EV)、進(jìn)行性牛痘(PV)、 種痘后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、和胎兒牛痘(C0N0，等Smallpox vaccination and adverse reactions. Guidance for clinicians. MMWR. Recommendations and reports-Morbidity and mortality weeklyreport. Recommendations and reports/Centers for Disease Control. 2003，52 卷，RR-4 號，1-28 頁.)。因此，需要更安全的、具有與對于其天然相應(yīng)物一樣好的溶瘤活性的痘病毒。
背景技術(shù)：
1994 年 11 月 15 日的美國 5364773 (VIR0GENETICS 公司(TR0Y，紐約))描述了 改造的重組痘病毒，更特別是有滅活的非必要的病毒編碼遺傳功能的痘苗病毒，使重組痘 病毒具有減弱的毒力和增強(qiáng)的安全性。特別地，通過缺失編碼毒力因子的開放閱讀框，或 通過編碼毒力因子的開放閱讀框的插入失活，滅活遺傳功能。更特別的是，這項專利描述 了痘苗病毒，其中J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1L和I4L的開放閱讀框已被滅活。 這種病毒(NYVAC)可以被改造為用于外源核酸的載體，并用作疫苗誘導(dǎo)宿主動物中的免 疫應(yīng)答。但是，NYVAC不能在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中有效地復(fù)制，且不能被用作溶瘤病毒 (XIANGZHI,等Vaccinia virus KlL protein supports viral replication in human and rabbitcells through a cell-type-specific set of its ankyrin repeat residues that aredistinct from its binding site for ACAP2. Journal of Virology. 2006,353 卷，1 號，220-233 頁.)。2004年2月19日的WO 2004/014314(KIRN DAVID(美國))描述了在其病毒基因 組中包含了一個或更多突變的改變的痘苗病毒。所描述的突變是以下多肽種類中的一種或 多種1)干擾素調(diào)節(jié)多肽；2)補(bǔ)體控制多肽；3) TNF或趨化因子調(diào)節(jié)多肽；4)絲氨酸蛋白酶 抑制劑；5) IL-Ip調(diào)節(jié)多肽；6)非感染性EEV形式的多肽；和7)用作抑制傳染性病毒從細(xì)胞中釋放的病毒多肽(抗傳染病毒形式的多肽)。此外，還公開了痘苗病毒A41L或CllR中 的突變。在這一申請中更特別描述了牛痘基因組區(qū)域，如A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、 B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、CUR、E3L、K2L、NIL、vC12L,和 vCKBP。本發(fā)明的方法涉 及使用任何本文中討論的痘病毒。本發(fā)明的發(fā)明人還公開了通過給予癌細(xì)胞或患者有效量 的這一改變的痘苗病毒來治療癌癥的方法。發(fā)明公開本發(fā)明的發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)，包含缺損F2L基因的痘病毒具有改善的安全性，但是保持了相同的溶瘤活性(與其天然相應(yīng)物相比)。本發(fā)明涉及一種包括缺損F2L基因的痘病毒。在整個申請中所使用的術(shù)語“一個”和“一種”是用意為表示所引用的成分或步驟 中的“至少一個”、“至少第一個”、“一個或多個”或“多種”，除非上下文清楚規(guī)定了其它的意 思。例如，術(shù)語“一個細(xì)胞”包括多個細(xì)胞，包含其混合物。本文所用的術(shù)語“和/或”包括，“和”、“或”和“全部或任何其它由該詞連接的成 分的組合”的含義。本文所用的術(shù)語“大約”或“約”表示在給定值或范圍的20%以內(nèi)，優(yōu)選在10%以 內(nèi)，且更優(yōu)選在5%以內(nèi)。本文所用的術(shù)語“包含”和“包括”意在表示產(chǎn)物、組成物和方法包括所提及的成 分或步驟，但不排除其它的。當(dāng)“基本上由...組成”被用于定義產(chǎn)物、組成物和方法時，表 示不包括其他任何具顯著性的成分和步驟。因此，基本上由所述的成分組成的組合物將不 排除微量污染物和可藥用的載體?！坝?..組成”意味著排除其它不止是微量成分的成分或步驟。本文所用的術(shù)語“包括缺損基因的痘病毒”指的是痘病毒，其在所述缺損基因的 一個或多個核酸中包含缺失、取代或添加，或這些可能的任何組合，其中所述修飾導(dǎo)致該 病毒無法產(chǎn)生這樣的蛋白質(zhì)，即具有未修改的基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。在 本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含基因缺損的痘病毒，是指其中整個基因序列已被刪除 的痘病毒?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的許多方法，利用重組技術(shù)進(jìn)行突變。本 領(lǐng)域內(nèi)有修飾痘病毒基因組的方法。例如，MCCART，等Systemic cancertherapy with a tumor selective vaccinia virus mutant lacking thymidinekinase and vaccinia growth factor genes. . Cancer res. . 2001,61 號，8751-57 頁.,KIM,等.Systemic armed oncolytic ans immunologic therapy forcancer with JX—594, a targeted poxvirus expressing GM-CSF. MolecularTherapeutic. 2006,14 號，361-70 頁.，2004 年 2 月 9 日 的 WO 2004/014314 (KIRN DAVID (US))禾口 1994 年 11 月 15 日的 US 5364773 (VIR0GENETICS CORPORATION (TROY, NY))所公開的方法，可以被用來生產(chǎn)本發(fā)明的痘病毒。在本申請的實(shí) 施例中公開的方法與生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的痘病毒特別相關(guān)。本領(lǐng)域內(nèi)可得到各種痘病毒的基 因組序列，例如，痘苗病毒(vaccinia virus)、痘苗病毒(cowpox virus)、金絲雀痘病毒、 鼠痘病毒、粘液瘤病毒基因組可在Genbank中得到(登錄號分別是NC_006998、NC_003663、 NC_005309、NC_004105、NC_001132)。 本發(fā)明中所使用的術(shù)語“痘病毒”是指屬于痘病毒科(Poxviridaefami Iy)的病毒。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的痘病毒屬于脊椎動物痘病毒亞科 (Chordopoxvirinae subfamily)，更優(yōu)選地屬于正痕病毒屬(Orthopoxvirus genus)，更力口 優(yōu)選地屬于痘苗病毒種(Vaccinia virusspecie)。例如，可以利用痘苗病毒株Dairen I、IHD-J、L-IPV、LC16M8、LC16M0、Lister、 LIVP、Tashkent，、WR 65-16,ffyeth, Ankara,Copenhagen,Tian Tan 禾Π WR。根據(jù)特別優(yōu)選的 實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的痘病毒是痘苗病毒株Copenhagen。痘病毒牛痘包含大的雙鏈DNA基因組(187千堿基對)，并且是僅知的在受感染細(xì) 胞的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行復(fù)制的DNA病毒家族成員。由于被感染的細(xì)胞必須向細(xì)胞質(zhì)的復(fù)制位點(diǎn) 遞送大量的DNA前體，該病毒編碼并表達(dá)DNA代謝與合成所需的許多酶的活性，包括脫氧尿 嘧啶核苷5’ -三磷酸核苷酸水解酶(脫氧尿苷三磷酸酶，dUTPase)。 脫氧尿嘧啶核苷5，-三磷酸核苷酸水解酶(dUTPase，EC 3. 6. 1. 23)在Mg離子 (2+)存在下催化dUTP水解為dUMP和焦磷酸鹽。在將dUTP從dNTP池中除去并產(chǎn)生dUMP時， dUTPase參與維持DNA復(fù)制的保真度并參與為通過胸苷酸合酶生產(chǎn)TMP提供前體。牛痘脫 氧尿苷三磷酸酶(dUTPase)是由F2L基因編碼的15kDa的蛋白質(zhì)(MCGE0GH. . NucleicAcids Research. 1990，18 號，4105-10 頁· ；BR0YLES. · Virology. 1993，195 號，863-5 頁.)。痘苗 病毒F2L基因的序列可以通過登錄號M25392從GenBank中得到，不同痘病毒類基因組中 F2L基因的序列和位點(diǎn)也可以從GenBank中獲得，例如，通過登錄號NC_006998、DQ121394、 NC_001611、AY689436、AY689437、NC_008291、DQ437594、DQ437593、AY313847、AY313848、 NC_006966、NC_005309、NC_003391、NC_003389、NC_001132、NC_003310、NC_002188、M35027、 AY243312、AF170726、DQ011157、DQ011156、DQ011155、DQ011154、DQ011153、X94355、Y16780、 AY318871、U94848、AF198100 和 M34368。本文所使用的基因命名是Copenhagen牛痘株的基因命名，除非另有注明，其也被 用于其他痘病毒科的同源基因。然而，基因命名可能根據(jù)痘株而不同。作為信息，Copenhage 和MVA基因的對應(yīng)關(guān)系可以在ΑΝΤ0ΙΝΕ. . Virology. 1998，244號，365-396頁.的表中找到。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的痘病毒還包含缺損的J2R基因。J2R基因編碼一種胸苷激酶(TK)，其形成嘧啶脫氧核苷酸合成補(bǔ)救途徑的一部 分。TK催化的反應(yīng)涉及將Y -磷酰基部分從ATP轉(zhuǎn)移至2’脫氧-胸苷(dThd)，以產(chǎn)生胸 苷5’-單磷酸(dTMP)。痘苗病毒的TK是2型TK。2型TK相對于1型具有較小的多肽鏈， 具有約25KDa，但形成同源四聚體。它們對反饋抑制劑dTDP或dTTP敏感，其在代謝途徑的 最終生成。2型TK相對于1型TK具有窄得多的底物特異性，并且只能使2’脫氧尿苷(dU) 禾口 / 或 dThd 磷酸化(EL 0MARI,等· Structure of vacciniavirus thymidine kinase in complex with dTTP insights for drug design. BMC structural biology. 2006,6號，22 頁)。本領(lǐng)域內(nèi)已知J2R區(qū)域缺損的痘病毒和獲得它們的方法。例如MCCART，等 Systemic cancer therapy with a tumor-selective vacciniavirus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes, cancer research· 2001，61卷，24 號，8751-7 頁·、PUHLMANN，等 Vacciniaas a vector for tumor-directed gene therapy biodistribution of a thymidinekinase-deleted mutant. Cancer gene therapy. 2000， 7 卷，1 號，66_73 頁·、GNANT，等 Systemic administration of a recombinant vacciniavirusexpressing the cytosine deaminase gene and subsequent treatment with5-fluorocytosine leads to tumor-specific gene expression and prolongationof survival in mice. Cancer Research. 1999，59 卷，14 號，3396-403 頁.的教導(dǎo)可用于產(chǎn)生 J2R區(qū)域缺失的痘病毒。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的痘病毒還包含目的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，目的核酸包含至少一種目的序列，其編碼作為治療性分子 的基因產(chǎn)物(即治療的基因)?！爸委熜苑肿印笔沁@樣的分子，其在適當(dāng)?shù)厥┯糜诨颊?，尤?是患疾病或病癥的患者，或者應(yīng)受保護(hù)以避免該疾病或病癥者，具有藥理學(xué)的或保護(hù)性的 活性。該藥理學(xué)或保護(hù)性活性預(yù)期與對所述疾病或所述病癥的病程或癥狀產(chǎn)生有利的影響 相關(guān)。當(dāng)技術(shù)人員按本發(fā)明選擇編碼治療性分子的基因時，他通常將他的選擇與先前獲得 的結(jié)果聯(lián)系起來，并可以合理地預(yù)期得到這樣的藥理學(xué)特性，而無需實(shí)施本發(fā)明所主張以 外的過多實(shí)驗。根據(jù)本發(fā)明，目的序列與其被轉(zhuǎn)入其中的靶細(xì)胞可以是同源的或者異源的。 有利地，所述目的序列編碼全部或部分的多肽，尤其是給出治療或預(yù)防特性的治療性或預(yù) 防性多肽。多肽被理解為多核苷酸的任何翻譯產(chǎn)物，不論其大小、糖基化與否，且包括肽和 蛋白質(zhì)。作為一個首要的實(shí)例，治療性多肽包括那些可以在動物或人類有機(jī)體中補(bǔ)償缺損 或缺陷蛋白質(zhì)的多肽，或者那些通過毒性作用從機(jī)體中限制或除去有害細(xì)胞的多肽。它們 也可以是賦予免疫性的多肽，其作為內(nèi)源性抗原激起體液或細(xì)胞反應(yīng)，或兩者兼有。由治療性基因編碼的多肽的實(shí)例包括，編碼細(xì)胞因子(α、β或Y干擾素，白細(xì) 胞介素，特別是IL-2、IL-6、IL-IO或IL-12，腫瘤壞死因子(TNF)，集落刺激因子GM-CSF、 C-CSF, M-CSF....)、免疫刺激多肽(Β7. 1、Β7. 2等)、凝結(jié)因子(FVIII、FIX...)、生長因子 (轉(zhuǎn)化生長因子TGF、成纖維細(xì)胞生長因子FGF等)、酶(脲酶、腎素、凝血酶、金屬蛋白酶、 一氧化氮合酶N0S、S0D，過氧化氫酶...)、酶抑制劑(α 1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、病毒 蛋白酶抑制劑、纖溶酶原激活物抑制劑ΡΑΙ-1)、CFTR(囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子)蛋 白質(zhì)、胰島素、肌營養(yǎng)不良蛋白、I或II類MHC抗原、可以調(diào)節(jié)/調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)的多肽、 能夠抑制細(xì)菌、寄生蟲或病毒感染或其發(fā)展的多肽(抗原多肽、抗原表位、通過競爭抑制天 然蛋白質(zhì)作用的轉(zhuǎn)顯性(transdominant)變體....)、凋亡誘導(dǎo)劑或抑制劑(Bax、Bcl2、 BclX. · ·)、細(xì)胞生長抑制劑(p21、pl6、Rb. · ·)、載脂蛋白(ApoAI、ApoAIV、ApoE. · ·)，血管生 成抑制劑(血管生成抑制素、內(nèi)皮他丁(endostatin)...)、血管生成多肽(血管內(nèi)皮細(xì)胞生 長因子VEGF家族、FGF家族、CCN家族，包括CTGF、Cyr61和Nov)、氧自由基scaveyer、具有 抗腫瘤作用的多肽、抗體、毒素，免疫毒素和標(biāo)記(β_半乳糖苷酶、熒光素酶....)的基因 或本領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)為可以被用于臨床癥狀的治療或預(yù)防的任何其它目的基因。適當(dāng)?shù)目鼓[瘤基因包括但不限于，那些編碼腫瘤抑制基因(如Rb、p53、DCC、NF_l、 腎母細(xì)胞瘤、匪23、BRUSH-l、pl6、p21、p56、p73以及它們各自的突變體)、自殺基因產(chǎn)物、抗 體、抑制細(xì)胞分裂或轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的多肽的基因。根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的痘病毒還包含自殺基因。自殺基因是指能將藥物前體轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性化合物的蛋白質(zhì)的編碼基因。自殺基因包括但不限于，編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性、胸苷激酶活性、尿嘧啶磷酸 核糖轉(zhuǎn)移酶活性、嘌呤核苷磷酸化酶活性和/或胸苷激酶活性的蛋白質(zhì)的基因。下表中公開了包含一個核堿基(nucleobase)部分的自殺基因和相應(yīng)的藥物前體的例子表 1 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，自殺基因編碼具有至少一種CDase活性的蛋白 質(zhì)。CDase參與嘧啶代謝途徑，通過該途徑，外源胞嘧啶利用水解脫氨作用被轉(zhuǎn)化為尿嘧 啶。雖然已經(jīng)在原核生物和低等真核生物中證明了 OTase活性(JUND，等.Journal of Bacteriology. 1970,102 號，607-15.頁；BECK，等.Journal of Bacteriology. 1972, 110 號，219-28.頁；H0EPRICH，等.Journal of Infectious Diseases. 1974，130 號， 112-18.頁；ESDERS,等· J. biol. chem. · 1985,260 號，3915-22.頁)，但它們不存在于哺 乳動物中(K0ECHLIN，等.Biochemical pharmacology. 1966，15 號，435-46.頁；P0LAK， 等· Chemotherapy. 1976, 22 號，137-53.頁)。OTase也使胞嘧啶類似物，即5_氟胞嘧啶(5_FC)脫去氨基，從而形成5_氟尿嘧 啶(5-FU)，5-FU是一種化合物，當(dāng)其被轉(zhuǎn)化成5-氟UMP (5-FUMP)時，有高細(xì)胞毒性。無論 是因為突變而使編碼酶的基因失活還是因為其天然地缺少這種酶(就像哺乳動物細(xì)胞一 樣)，缺少 CDase 活性的細(xì)胞對 5-FC 有抗性(JUND,等· Journal of Bacteriology. 1970， 102 號，607-15 頁· ；KILLSTRUP,等.Journal of Bacteriology. 1989，171 號，2124-2127 頁.)。相比之下，被轉(zhuǎn)化了編碼CDase活性的序列的哺乳動物細(xì)胞變得對5_FC敏感 ((HUBER,等· Cancer Research. 1993, 53 號，46I9-4626 頁.；MULLEN，等· Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America. 1992,89 號，33-37頁.；W093/01281(US HEALTH))。此外，鄰近的，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞也變得對5-FC敏感 (HUBER,等· Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 1994，91號，8302-6頁.)。這種被稱為旁觀者效應(yīng)的現(xiàn)象，是由于表達(dá)⑶ase 活性的細(xì)胞分泌5-FU，然后其通過穿越質(zhì)膜的直接擴(kuò)散使鄰近的細(xì)胞中毒。5-FU的這一被 動擴(kuò)散性質(zhì)與tk/GCV參照系統(tǒng)相比，表現(xiàn)出優(yōu)勢，后者中旁觀者效應(yīng)需要與表達(dá)tk的細(xì)胞 接角蟲(MESNIL,等· Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 1996，93號，1831-35頁.)。因此可以很容易地理解CDase在基因治療 中，尤其是抗癌基因治療中所提供的所有優(yōu)勢。分別編碼這兩種生物的CDase的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae， S. cerevisiae)FCYl、白色念珠菌(Candida Albicans) FCAl和大腸桿菌codA基因是已知的 且它們的序列已被公布(分別是SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6)。在這方面，根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，編碼具有CDase活性的蛋白質(zhì)的基因是FCY1、FCAl或CodA或其類似物。這些基因的類似物是指這樣的基因，其具有的核酸序 列與親本基因的核酸序列，至少具有程度大于70%的同一性，最好大于80%，優(yōu)選地大于 90 %，和最優(yōu)選地大于95 %。專利WO 2005/007857公開了一種基因，其編碼具有改善的OTase活性的蛋白質(zhì)。 這種多肽來源于天然CDase加上一氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案，該具 有CDase活性的蛋白質(zhì)是WO 2005/007857公開的多肽，更優(yōu)選的是序列號SEQ ID NO :2中 描述的FCU1-8多肽及其類似物。在原核生物和低等的真核細(xì)胞中，尿嘧啶在尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(UPRTase)的 作用下被轉(zhuǎn)化成UMP。這種酶將5-FU轉(zhuǎn)化為5-FUMP。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案， 自殺基因編碼具有UPRTase活性的蛋白質(zhì)。正在談?wù)摰腢PRTase可以是任何來源的，特別是原核的、真菌的或酵母菌來源的。 以舉例的方式，在本發(fā)明的情況下可以使用的核酸序列編碼源自大腸桿菌(ANDERSEN，等 Characterization of the upp geneencoding uracil phosphoribosyltransferase of Escherichia coli K12. European Journal of Biochemistry. 1992，204 號，51-56 頁·)， 源自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) (MARTINUSSEN，等 Cloning andcharacterization of upp, a gene encoding uracil phosphoribosyltransferasefrom Lactococcus lactis. Journal of Bacteriology. 1994,176 卷，21 號，6457-63 頁.)，源 自牛 分枝桿菌(Mycobacterium bovis) (KIM,等 Completesequence of the UPP gene encoding uracil phosphoribosyltransferase fromMycobacterium bovis BCG. Biochemistry and molecular biologyinternational. 1997,41 卷，6 號，1117-24 頁.) 和源自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) (MARTINUSSEN,等 Two genes encoding uracilphosphoribosyltransferase are present in Bacillus subtilis. Journal 0亡8肌切1^01叫7.1995，177卷，1號，271-4頁·)的UPRTase。不過，最特別優(yōu)選地使用酵 母 UPRTase 且尤其是其序列在 KERN，等 The FURl gene ofSaccharomyces cerevisiae cloning，structure and expression of wild-typeand mutant alleles. Gene. 1990,88 卷，2號，149-57頁.中公幵的釀酒酵母(S. cerevisiae) FURl基因所編碼的UPRTase，其在 此通過引用作為參考。作為指導(dǎo)，該基因序列和相應(yīng)的UPRTase序列可以在文獻(xiàn)和專門數(shù)據(jù)庫(SWISSraOT、EMBL、Genbank、Medline 等)中找到。專利申請EP 0998568A描述了 FURl基因，其在編碼部分5，端缺少105個核苷酸， 使得由其開始的UPRTase的合成，其在天然的蛋白質(zhì)中開始的35個殘基已在N端的位置缺 失，且開始于在36位置的蛋氨酸。該突變基因的表達(dá)產(chǎn)物，命名為FURl Δ 105，其能夠補(bǔ)充 釀酒酵母的furl突變。此外，截短的突變體表現(xiàn)出比天然酶高的UPRTase活性。因此，根 據(jù)本發(fā)明的特別有利的實(shí)施方案，自殺基因編碼天然UPRTase的缺失突變。該缺失優(yōu)選地 位于原UPRTase N端的區(qū)域。其可以是完全的(影響所述N端的區(qū)域的所有殘基)或部分 的(影響一級結(jié)構(gòu)中一個或多個連續(xù)或非連續(xù)殘基)。一般而言，多肽由N端、中心和C端 部分組成，每一部分約占分子的三分之一。例如，由于釀酒酵母UPRTase有251個氨基酸， 其N端部分由前83個殘基組成，開始于位于天然形式第一個位點(diǎn)的所謂的起始蛋氨酸。至 于大腸桿菌UPRTase，其N端部分涵蓋位點(diǎn)1至69。優(yōu)選的具有UPRTase活性的蛋白質(zhì)包含，基本上如E P 0998568A的序列號SEQ ID NO 1中所描述的氨基酸序列，開始于位于位點(diǎn)1的Met殘基并結(jié)束于位于位點(diǎn)216的 Val殘基。術(shù)語“基本上”指的是與所述的EP 0998568A的SEQ ID NO :1序列的同一程度 大于70 %，最好大于80 %，優(yōu)選大于90 %，和最優(yōu)選大于95 %。但更優(yōu)選的是，其包含EP 0998568A的序列號SEQ ID NO 1中所描述的氨基酸序列。如上所述，它可能包括額外的突 變?？梢蕴貏e提及位于位點(diǎn)2的絲氨酸殘基(在天然UPRTase中的位點(diǎn)37)被丙氨酸殘基 取代。根據(jù)本發(fā)明另一項優(yōu)選的實(shí)施方案，自殺基因編碼具有至少一種⑶ase和一種 UPRTase活性的蛋白質(zhì)。專利申請WO 96/16183和EP0998568A描述了一種融合蛋白的用途， 其編碼的酶包含具有CDase和UPRTase活性的兩個結(jié)構(gòu)域，和展示了由表達(dá)質(zhì)粒攜帶的融 合基因codA upp或FCYl FURl或FCYl FURl Δ 105 (即FCU1)的轉(zhuǎn)移提高了被轉(zhuǎn)化的 Β16細(xì)胞對5-FC的敏感性。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，自殺基因編碼的多肽包含的氨 基酸序列基本上如序列號 SEQ ID NO :3(coda upp)、SEQ ID NO :1 (FCUl)或 FCYl FURl 中所述。術(shù)語“基本上”是指與所述序列的同一程度大于70%，最好大于80%，優(yōu)選大于 90%，和最優(yōu)選大于95%。但更優(yōu)選的是，其包含如序列號SEQ ID NO 3 (coda upp) ,SEQ ID NO :l(rcUl)或FCYl FURl中所述的氨基酸序列。如上所述，它可包含額外的突變。根據(jù)目前使用的常用技術(shù)，可以容易地通過克隆、通過PCR、或通過化學(xué)合成獲得 核酸序列。它們可以是天然基因或源自其通過突變、缺失、取代和/或添加一個或多個核苷 酸的基因。此外，它們的序列被廣泛地描述于本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠查閱的文獻(xiàn)中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠從公開的數(shù)據(jù)克隆CDase或UPRTase序列并能夠進(jìn)行可能 的突變體，能夠根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)方法或者基于申請EP 0998568A中所示的方案在非細(xì)胞或者 細(xì)胞體系中檢測突變體形式的酶活性，并能夠，尤其是同相地融合具有CDase和UPRTase活 性的多肽，從而融合全部或部分相應(yīng)基因。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的痘病毒還包括核酸序列，其包含編碼透性酶 (permease)的基因。透性酶是指跨膜的蛋白質(zhì)，其參與包含一個核堿基(nucleobase)部分的藥物，或 其前體通過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移。透性酶包括但不限于嘌呤透性酶、胞嘧啶透性酶和核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，透性酶是釀酒酵母的嘌呤或胞嘧啶透性酶。釀酒 酵母的核堿基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由嘌呤_胞嘧啶透性酶(稱為FCY2)和尿嘧啶透性酶(稱為FUR4) 組成。嘌呤-胞嘧啶透性酶FCY2介導(dǎo)質(zhì)子和腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和胞嘧啶穿越酵母質(zhì) 膜的同向轉(zhuǎn)運(yùn)(Grensonl969，Jund 和 Lacroute 1970，Polak 和 Grenson 1973,Chevallier 等1975，HopkinS等1988)。FCY2蛋白質(zhì)也介導(dǎo)5氟胞嘧啶的轉(zhuǎn)運(yùn)，5氟胞嘧啶是胞嘧啶的 類似物(Grenson 1969，Jund 和 Lacroute 1970)。FCY2 基因編碼 533 個氨基酸(58kDa)的 蛋白質(zhì)，最初預(yù)計有10-12個跨膜區(qū)(Weber等1990)，現(xiàn)在傾向認(rèn)為有9個(Ferreira等 1999)。FCY2對嘌呤核堿基和胞嘧啶表現(xiàn)出相似的親和力(Brethes等1992)。尿嘧啶是 由尿嘧啶透性酶FUR4介導(dǎo)而攝取到釀酒酵母中(Jund和Lacroute 1970，Jund等1977)。 FUR4是尿嘧啶-質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Hopkins等1988)，預(yù)測是633個氨基酸(71. 7kDa)的蛋 白質(zhì)，具有10個跨膜結(jié)構(gòu)域和長的細(xì)胞質(zhì)親水N-和C-端尾巴(Jimd等1988，Garnier等 1996)。FUR4蛋白質(zhì)還可以介導(dǎo)5氟尿嘧啶的轉(zhuǎn)運(yùn)，5氟尿嘧啶是尿嘧啶的類似物(Jimd和 Lacroute 1970)。
swissprot數(shù)據(jù)庫中特別提供FCY2和Fur4的氨基酸序列(登錄號分別為P17064 和P05316)。優(yōu)選地，透性酶具有選自于，如在專利申請WO 2006/048768中所公開的氨基酸 序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的氨基酸序列。在這方面，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，透性酶選自于FCY2和Fur4和其類似 物。Fur4和FCY2的類似物是指多肽，該多肽具有的氨基酸序列與本文上述親本蛋白質(zhì)的氨 基酸序列的同一程度，至少大于70 %，最好大于80 %，優(yōu)選大于90 %，優(yōu)選大于95 %，并且 該多肽保留了轉(zhuǎn)運(yùn)含有一個核堿基部分的藥物穿過細(xì)胞膜的能力。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇，將與包含一個核堿基部分的藥物或藥物前體關(guān)聯(lián)的 透性酶。例如，F(xiàn)CY2和Fur4優(yōu)選地與5氟胞嘧啶(5-FC)關(guān)聯(lián)。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的痘病毒還可包含表達(dá)目的核酸所必需的元件。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的痘病毒可還包含表達(dá)包括編碼透性酶的基因的 核酸序列所必需的元件。這些表達(dá)目的核酸和/或包含編碼透性酶的基因的核酸序列所必需的元件包括， 所述DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA以及(如果需要的話)mRNA翻譯成多肽所必需的元件。文獻(xiàn)中廣泛地 描述了適合在各種脊椎動物體系中使用的轉(zhuǎn)錄啟動子。舉例來說，適合的啟動子包括病毒 啟動子，諸如RSV、MPSV、SV40、CMV或7. 5k，牛痘啟動子，誘導(dǎo)型啟動子，等。優(yōu)選的啟動子是 由痘病毒分離，例如痘苗病毒的7. 5K、H5R、TK、p28、pll或K1L。另外，可以使用合成啟動子， 例如那些在 CHAKRABARTI. Biotechniques. 1997,23 號，1094-97 頁.，HAMMOND，等.Journal ofVirological Methods. 1997,66 號，135-38 頁.和 KUMAR. Virology. 1990，179 號，151-8 頁.中所描述的啟動子，以及早期和晚期痘病毒啟動子之間的嵌合啟動子。目的核酸序列和包含編碼透性酶基因的核酸序列還可以包括額外的功能元件，如 內(nèi)含子序列、定向序列、轉(zhuǎn)運(yùn)序列、分泌信號、核定位信號、IRES、多聚A轉(zhuǎn)錄終止序列、三聯(lián) 前導(dǎo)序列、參與復(fù)制或整合的序列。所述序列已在文獻(xiàn)中報道并可很容易地由本領(lǐng)域的技 術(shù)人員獲得。本發(fā)明還涉及制備根據(jù)本發(fā)明的痘病毒的方法，在其中(i)將根據(jù)本發(fā)明的痘病毒引入到細(xì)胞中；
(ii)將所述細(xì)胞培養(yǎng)在適合于能使所述痘病毒產(chǎn)生的條件下和；(iii)從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述痘病毒。當(dāng)然可以從培養(yǎng)上清液回收痘病毒，同時也可以從細(xì)胞中回收它。普遍采用的方 法之一在于通過反復(fù)凍融循環(huán)的方法裂解細(xì)胞，以從裂解上清中收集病毒顆粒。然后可以 使用本領(lǐng)域中的技術(shù)(色譜法、超速離心法、特別是通過氯化銫密度梯度，等)擴(kuò)增和純化 病毒顆粒。本發(fā)明還涉及一種組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的痘病毒，與可藥用的賦形劑組合。根據(jù)本發(fā)明的組合物更具體地被用于，通過基因治療方法預(yù)防或治療疾病，和更 具體地針對增殖性疾病(癌癥、腫瘤、再狹窄，等)，或針對與破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)相關(guān)的疾病 (如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥)。 可按照慣例，以局部、腸胃外或消化途徑給藥為目的，制成根據(jù)本發(fā)明的組合物。 特別是，治療有效量的本發(fā)明的重組載體或痘病毒與可藥用的賦形劑組合?？梢栽O(shè)想大量 的給藥途徑?？杀惶峒暗膶?shí)例是胃內(nèi)的、皮下的、心內(nèi)的、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)的、腹腔內(nèi)的、腫瘤 內(nèi)的、鼻內(nèi)的、肺內(nèi)的和氣管內(nèi)的途徑。對于后三個實(shí)施方案，通過氣霧劑或通過滴注法進(jìn) 行給藥更有利。可以以單劑量進(jìn)行給藥，或者在特定的時間間隔后，按照一次或多次重復(fù)的 劑量進(jìn)行給藥。適合的給藥途徑和劑量取決于各種因素，例如個體、將被治療的疾病或?qū)⒈?轉(zhuǎn)化的目的基因?？梢园碔O4至IO14Pfu (空斑形成單位)，最好IO5至IO13Pfu,優(yōu)選地IO6 至IO12Pfu,更優(yōu)選地IO6至IO7之間劑量的形式配制基于本發(fā)明的病毒顆粒的制劑。該組合物還可以包含可藥用的稀釋劑、佐劑或賦形劑，以及增溶、穩(wěn)定和防腐劑。 在可注射給藥的情況下，優(yōu)選制劑是水溶液，非水溶液或等滲溶液。它可以以單一劑量或多 劑量、液體或干燥(粉末、凍干物，等)的形式存在，該干燥形式可在使用的時候用適當(dāng)?shù)南?釋劑重構(gòu)。本發(fā)明還涉及，將根據(jù)本發(fā)明的痘病毒或組合物用于制備藥物的用途，該藥物被 用于通過基因療法治療人體或動物體。該藥物可直接體內(nèi)施用(例如，通過靜脈注射、進(jìn)入 可進(jìn)入的腫瘤、通過氣霧劑方法進(jìn)入肺部，使用適當(dāng)?shù)膶?dǎo)管進(jìn)入血管系統(tǒng)，等)。優(yōu)選的用途 在于，治療或預(yù)防有害細(xì)胞增殖導(dǎo)致的癌癥、腫瘤和疾病?？商峒暗目梢韵氲降挠猛臼侨橄?癌、子宮癌(特別是乳頭瘤病毒引起的)、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃 癌、食道癌、喉癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌(如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)和血癌(淋巴瘤、白血病，等)。另 一個優(yōu)選的用途在于治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和與增加破骨細(xì)胞活性相關(guān) 的其他疾病。其也可以用在心血管疾病方面，例如，為了抑制或延緩血管壁平滑肌細(xì)胞增殖 (再狹窄)。最后，在傳染病的情況下，可以設(shè)想該藥物被應(yīng)用于艾滋病。當(dāng)本發(fā)明的痘病毒、組合物或方法被用于治療癌癥時，優(yōu)選的施用途徑是全身途 徑，因為根據(jù)本發(fā)明的痘病毒能夠特異地靶向腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明還涉及治療疾病的方法，其特征是，向需要這種治療的宿主生物體或細(xì)胞 施用根據(jù)本發(fā)明的痘病毒、組合物。根據(jù)有利的實(shí)施方案，該治療應(yīng)用或治療方法還包含另外的步驟，其中向宿主生 物體或細(xì)胞施用可藥用數(shù)量的前藥，最好是胞嘧啶類似物，特別是5-FC。舉例而言，可以使 用劑量為50到500mg/kg/天，優(yōu)選劑量是200mg/kg/天，或者100mg/kg/天。在本發(fā)明的 情況下，依照標(biāo)準(zhǔn)方法施用前藥(例如，口服，系統(tǒng)施用)。
優(yōu)選地，在施用根據(jù)本發(fā)明的痘病毒、組合物之后進(jìn)行給藥，優(yōu)選地在施用根據(jù)本 發(fā)明的痘病毒、組合物至少3天，更優(yōu)選地至少4天，甚至更優(yōu)選地至少5天之后。據(jù)本發(fā) 明甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，在施用治療劑7天之后進(jìn)行施用前藥。優(yōu)選的是口服途徑。可 以施用單劑量的前藥，或者是在能使宿主生物體或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物的足夠長時間 段內(nèi)重復(fù)施用的劑量。
此外，根據(jù)本發(fā)明的組合物或方法可以與一種或多種使5-FU的細(xì)胞毒作用增強(qiáng) 的物質(zhì)組合?？商貏e提到的藥物是，抑制嘧啶從頭生物合成途徑中酶的藥物(例如下文 所述)，藥物如甲酰四氫葉酸(Waxman 等，1982，Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18，685-692)， 其在存在5-FU(5-FdUMP)的代謝產(chǎn)物的情況下，增加胸苷酸合酶的抑制作用，導(dǎo)致dTMP 池減少，dTMP是復(fù)制所必需的，最后是藥物如甲氨蝶呤(Cadman等，1979，Science 250， 1135-1137)，其通過抑制二氫葉酸還原酶和提高PRPP(磷酸核糖焦磷酸)池，使得增加5-FU 整合入細(xì)胞RNA。根據(jù)本發(fā)明，抑制嘧啶從頭生物合成途徑的酶的藥物，優(yōu)選地選自于PALA (N-(膦 酰乙?；?-L-天冬氨酸；Moore 等，1982，Biochem. Pharmacol. 31,3317-3321)、來氟米 特、A771726(來氟米特活性代謝產(chǎn)物，Davis等，1996，Biochem. 35，1270-1273)和布喹那 (Brequinar) (Chen 等，1992，Cancer Res. 52,3251-3257)。根據(jù)本發(fā)明的組合物或方法，可以與一種或多種在抗癌治療中有效的物質(zhì)組合。 在抗癌治療中有效的制藥物質(zhì)中，能提到的可以與根據(jù)本發(fā)明的組合物聯(lián)合或組合使用的 是，烷化劑例如，如絲裂霉素C、環(huán)磷酰胺、白消安、異環(huán)磷酰胺、isosfamide、美法侖、六甲三 聚氰胺、塞替派、苯丁酸氮芥、或氮烯唑胺；抗代謝藥物，例如吉西他濱、卡培他濱、5-氟尿 嘧啶、阿糖胞苷、2-氟脫氧胞苷、甲氨蝶呤、idatrexate、拓優(yōu)得或三甲曲沙；拓?fù)洚悩?gòu)酶II 抑制劑，例如，阿霉素、表柔比星、依托泊苷、替尼泊苷或米托蒽醌；拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，如 依立替康(CPT-11)、7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)或托泊替康；抗有絲分裂的藥物，例 如，帕尼特西、多西他賽、長春堿、長春新堿或長春瑞濱；和鉬衍生物，如順鉬、奧沙利鉬、順 螺鉬或 carboplatinum。根據(jù)本發(fā)明的組合物或方法也可以與放射療法組合使用。根據(jù)本發(fā)明的組合物或方法也可以與一種或多種這樣的物質(zhì)組合使用，包含但不 限于免疫調(diào)節(jié)劑，例如，如α，β和γ干擾素、白細(xì)胞介素(特別是IL-2、IL-6、IL-IO或 IL-12)或腫瘤壞死因子；影響細(xì)胞表面受體調(diào)控的試劑，例如，如表皮生長因子受體抑制 齊Ll (特另1J是西妥昔單抗，Panitumumabλ zalutumumab、nimotuzumab、matuzumab、吉非替尼、 埃羅替尼或拉帕替尼)或人表皮生長因子受體-2抑制劑(特別是曲妥珠單抗)；以及影響 血管生成的試劑，如血管內(nèi)皮生長因子抑制劑(特別是貝伐單抗或雷珠單抗)。附圖中圖表簡述

圖1.對感染痘苗病毒的人結(jié)肓腸腫瘤細(xì)胞(LoVo) 5-FC的體外敏感性。以 0. 0001 的 MOI 感染了指示病毒的 LoVo 細(xì)胞，(模擬(· ) VVTK-/FCU1 ( ■)或 VVTK-F2L-/ FCUl(O))接觸不同濃度的5-FC。感染五天后測定細(xì)胞存活。以在存在或不存在藥物下 的細(xì)胞存活率百分比表達(dá)結(jié)果。3個單獨(dú)測定的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(無由于病毒復(fù)制導(dǎo)致的 細(xì)胞死亡)來表示數(shù)值。M2.以0.0001的MOI感染了指示病毒的LoVo中，感染后第五天病毒的體外復(fù)制效率。以3個單獨(dú)測定的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差來表示數(shù)值。瑞士裸鼠靜脈注射病毒后，皮下LoVo的平均腫瘤體積士 SEM。接種腫瘤七 天后(可觸知的腫瘤)，用107pfu的緩沖液+鹽水( )、緩沖液+5-FC( )、VVTK-F2L-/ rcUl+鹽水(口)或VVTK-F2L-/rcUl+5-FC( ■)處理小鼠。注射病毒第7天后的三周中， 通過口服強(qiáng)飼用鹽水或100mg/kg/j的5-FC處理動物，每天兩次。每周測定腫瘤體積兩次。Mi^靜脈注射病毒后，瑞士裸鼠內(nèi)皮下H印G2腫瘤的平均體積士SEM。接種腫瘤 14天后(可觸知的腫瘤)，用緩沖液+水( )、或緩沖液+5-FC(^)、或IO6Pfu的VVTK-/ FCUl+ 水(〇)、或 106pfu 的 VVTK-/FCUl+5-FC( · ) (A)；或緩沖液 + 水( )、或緩沖液 +5-FC ( )或 IO6Pfu 的 WTK-F2L-/FCU1+水( )、或 106pfu 的 WTK-F2L-/FCU1+5-FC ( ) (B)處理小鼠。注射病毒7天之后的3個星期，每天以100mg/kg通過口服強(qiáng)飼5-FC兩次來 治療這些動物。每周測定腫瘤體積兩次。M^分裂細(xì)胞對比融合細(xì)胞中病毒產(chǎn)量比率。用IOOpfu的(■ )VVTK_/F⑶1或 (□ ) VVTK-F2L-/FCU1感染PANCl (人類胰腺腫瘤)、H1299 (人類肺腫瘤)或U118MG (人神 經(jīng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤)細(xì)胞。感染48小時后，測定病毒滴度。值是分裂細(xì)胞對融合細(xì)胞中病毒產(chǎn)
量的比率。圖6.用 IxlO6Pfu 的 VVTK-/FCU1 ( ■)或 VVTK-F2L-/FCU1 ( □)靜脈注射攜帶人 類皮下腫瘤的瑞士裸鼠后第6天及第21天，器官或腫瘤中病毒滴度(pfu/mg組織)。圖 7.通過靜脈注射 IxlO8Pfu 的 VVTK-/FCU1 ( ■)或 VVTK-F2L-/FCU1 ( O )處理 后，瑞士裸鼠的生存率。圖8.通過靜脈注射 IxlO7Pfu(A)或者 lxl08pfu(B)的 VVTK-/FCU1 ( ■)或 VVTK-F2L-/FCU1 ( O )處理后，免疫活性B6D2小鼠生存率。圖9.向瑞士裸鼠靜脈注射IxlO6Pfu的VVTK-/FCU1或VVTK-F2L-/FCU1后，在感 染后第13天和第34天，尾巴上的平均痘皰數(shù)。圖10.向瑞士裸鼠靜脈注射 IxlO7Pfu 的 VVTK-/FCU1 或 VVTK-F2L-/FCU1 后，在感 染后第15天和第31天，尾巴上的平均痘皰數(shù)。本發(fā)明的實(shí)施方式
實(shí)施例質(zhì)粒載體的構(gòu)建利用痘苗病毒菌株Copenhagen (登錄號M35027)的DNA構(gòu)建F2L缺失的穿梭質(zhì)粒。利用PCR擴(kuò)增F2L的DNA側(cè)翼區(qū)。F2L上游側(cè)翼區(qū)的引物是5，-CGC GGA TCC GAA AGC GAT GAA CTA AAT GTT C_3，(SEQ ID NO 7 ；下劃線為 BamHI 位點(diǎn))和 5，_TCC CCC GGG GTT AGTTTC CTT AAC AAA TCT AAC-3，(SEQ ID NO 8 ；下劃線為 SmaI 位點(diǎn))。下游區(qū)域的引物 為 5，-GCC TGG CCA ACA AAT AGA GGA GAT CAAGGG T-3，(SEQ ID NO 9 ；下劃線為 MscI 位 點(diǎn))和 5，-GCC CAG CTGACC ACT ACA TCA ATT TTA CAA AAG-3，(SEQ ID NO 10 ；下劃線為 PvuII位點(diǎn))。用限制性內(nèi)切酶Smal/BamHI或MscI/PvuII消化被擴(kuò)增的DNA片段并將其連 接到PpolyIII質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)。通過PCR利用引物5，-GCC GCA TGC TCC AGA ATT GAT CAT AGT GGA TA-3，(SEQID NO 11 ；下劃線為 SphI 位點(diǎn))禾口 5，-GCT CTA GAG TTA GTT TCCTTA ACA AAT CTA AC-3，(SEQ ID NO 12 ；下劃線為XbaI位點(diǎn))擴(kuò)增F2L下游側(cè)翼區(qū)的重復(fù)區(qū)域并將其插入PpolyIII質(zhì)粒。在生產(chǎn)缺失的病毒的過程中，重復(fù)區(qū)域被用于消除選擇盒。 該選擇盒對應(yīng)于在PH5R牛痘啟動子控制下的GFP/GPT融合基因，被插入到PpolyIII質(zhì)粒 的Smal/SphI位點(diǎn)。所獲得的質(zhì)粒即該重組穿梭質(zhì)粒，因為缺失F2L基因而命名為ρ Δ F2L。重組痘苗病毒的產(chǎn)生 用VVTK-rcUl (痘苗病毒，缺損J2R基因，在合成啟動子pllk7. 5控制下表達(dá)TOUl 基因)Copenhagen株按0. 1的MOI感染CEF細(xì)胞并在37°C下孵育2小時，然后用重組穿梭 質(zhì)粒(0.2 μ g)的氯化鈣共沉淀物轉(zhuǎn)染。將該細(xì)胞在37°C孵育48小時。然后用新產(chǎn)生病 毒的稀釋物在選擇培養(yǎng)基中感染CEF細(xì)胞，該選擇培養(yǎng)基含有終濃度為15μ g/ml的次黃嘌 呤，終濃度為250 μ g/ml的黃嘌呤和終濃度為250 μ g/ml的霉酚酸。分離熒光的(GFP)和陽 性的(GPT選擇)斑，并在存在GPT選擇培養(yǎng)基的CEF細(xì)胞中進(jìn)行數(shù)輪篩選。利用使用缺失 區(qū)域內(nèi)的引物進(jìn)行40個PCR循環(huán)測定VVTk-FCUl是否存在。消除親本病毒后，用雙重缺失 病毒來感染無GPT選擇培養(yǎng)基的CEF，以消除選擇盒。分離非熒光斑并在CEF中篩選2輪。 在CEF中擴(kuò)增最終的重組VV病毒，純化并通過空斑測定在CEF上滴定病毒儲液。細(xì)胞對5-FC的體外敏感性。用各重組VV在0.0001的MOI下轉(zhuǎn)導(dǎo)人類腫瘤細(xì)胞。將總數(shù)為3 X IO5個細(xì)胞/孔 鋪板于含有不同濃度5-FC的2毫升培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)皿中。然后將細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)5 天，利用臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)活細(xì)胞。在圖1和圖2中描繪的結(jié)果表明，T2R某因缺損的病毒 中的FCUl活性與F2L基因和J2R基因缺損的病毒中的FCUl活性相等。培養(yǎng)細(xì)胞的體外復(fù)制。用100PFU的病毒(約0. 0005M0I)在6孔板中感染分裂細(xì)胞或融合細(xì)胞。對于分 裂細(xì)胞使用添加10% FCS的2mL培養(yǎng)基，對于融合細(xì)胞使用不添加補(bǔ)劑的培養(yǎng)基。感染后 48小時收獲細(xì)胞。將細(xì)胞保存在_20°C并超聲處理以釋放病毒，也通過CEF細(xì)胞的蝕斑滴 定定量病毒。在所有細(xì)胞中，分裂細(xì)胞和融合細(xì)胞之間復(fù)制的比率相似。病毒VVTK-/FCU1 和VVTK-F2L-/FCU1在分裂細(xì)胞中的復(fù)制都比在融合細(xì)胞中的多。作為一個測定復(fù)制病毒的特異性的間接方法，測定分裂相對于融合腫瘤細(xì)胞(人 類胰腺腫瘤PANCl ；人類肺腫瘤H1299;人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤U118MG)中產(chǎn)生病毒的產(chǎn)量。以 IxlO6細(xì)胞/孔鋪板融合細(xì)胞并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，然后在感染前1天洗滌細(xì)胞并將 其培養(yǎng)在無血清的培養(yǎng)基中。感染之前一天以3xl05細(xì)胞/孔鋪板分裂細(xì)胞。為了評估細(xì) 胞分裂水平，在鋪板細(xì)胞后的5小時、24小時和48小時測定滴定過的胸苷摻入核酸的量。 在此期間，在融合細(xì)胞中的胸苷摻入相對穩(wěn)定而在分裂細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)摻入隨時間而增長。然 后用IOOpfu病毒感染這些細(xì)胞，并在感染48小時后利用對CEF的噬斑滴定，測定分裂腫瘤 細(xì)胞和融合腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的病毒產(chǎn)量之間的比率。在圖5中所描述的結(jié)果表明，兩種病毒 νντκ-/κ:υι和vvTK-F2L-/rcui在分裂細(xì)胞中的復(fù)制都比在融合細(xì)胞中的多。皮下腫瘤模型雌性瑞士裸鼠是從Charles River Laboratories獲得的。在研究中使用的動物 年齡一致(6周)且體重范圍從20至23克。以5X106LoVo細(xì)胞/100 μ L向瑞士裸鼠側(cè)腹 內(nèi)進(jìn)行皮下注射(S. C.)。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到50-70mm3，將小鼠盲式隨機(jī)化，并用指示載體處 理進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗。病毒的生物分布。
通過在腫瘤和器官樣本中的病毒滴定評估vv-rcui和WTK-F2L-/rcui的存在。利 用尾部靜脈注射將IxlO6PFU病毒靜脈(i. V.)注射到荷有確立的皮下LoVo腫瘤的裸鼠中。 在感染14天后處死小鼠，并采集和稱重腫瘤和其它器官。在PBS中均質(zhì)化腫瘤和器官，并 如前所述地用CEF測定滴度。病毒滴度標(biāo)準(zhǔn)化至每毫克組織。表2和3中描沭的結(jié)果(病 毒滴度范圍以pfu/mg組織表示)顯示，14天后本發(fā)明的病毒多數(shù)在腫瘤中。按照如上所述 的相同條件的另一套實(shí)驗中，在感染后的6天和21天處死小鼠。Ml中描述的結(jié)果顯示， 除了 VVTK-/TOU1在尾巴中的情況以外，病毒VVTK-/TOU1和VVTK-F2L-/rcUl以在腫瘤中比 在被分析的其他器官中的多大約1000至10000倍的病毒來靶向腫瘤。第6天在肺、脾臟、 腎臟和淋巴結(jié)中檢測到少量的VVTK-/FCU1 (少于10pfU/mg)，在皮膚、尾巴和骨髓中發(fā)現(xiàn)更 多，第21天在皮膚和尾巴中發(fā)現(xiàn)。相比之下，VVTK-F2L-/rcUl具有更高的腫瘤特異性，第6 天在肺、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)中和皮膚中，第21天在皮膚和尾巴中只含有少量。表2
表3 本發(fā)明的痘病毒在皮下腫瘤模型中的抗腫瘤活性。分別用1. IO4PFUU. IO6或1. IO7PFU劑量的指示載體一次瘤內(nèi)或兩次靜脈注射(通 過尾巴靜脈)處理荷有已確立的皮下LoVo腫瘤(50-70mm3)的裸鼠。注射病毒后第7天開 始，持續(xù)3周每天兩次以100mg/kg(0. 5ml5-FC 0. 5%水溶液)口服強(qiáng)飼5-FC。每周用卡尺 測量腫瘤大小2次。使用公式(ρ/6)以mm3(長χ寬2)計算腫瘤體積。如圖3所示的結(jié)果 表明，兩種病毒具有相似的功效(P < 0. 05)，其溶瘤活性能夠控制腫瘤生長，并具有與施用 5-FC的組合活性(病毒的溶瘤活性和FCUl基因的治療活性)，施用5-FC可以進(jìn)一步改進(jìn) 腫瘤生長的控制(ρ <0.01)。用1. IO6PFU劑量的指示載體，靜脈注射(通過尾巴靜脈)處理荷有確立的皮下 H印G2(人類肝細(xì)胞癌細(xì)胞)的裸鼠，按照如下進(jìn)行接種腫瘤14天后(可觸知的腫瘤)，用 緩沖液 + 水、或緩沖液 +5-FC、或 IO6Pfu 的 VVTK-/FCU1+ 水、或 106pfu 的 VVTK-/FCU1+5-FC、 或 IO6Pfu 的 VVTK-F2L-/FCU1+ 水、或 106pfu F2L-/FCU1+5-FC 處理小鼠。病毒注射 7 天之 后的3周期間，通過口服強(qiáng)飼用100mg/kg的5-FC每天處理這些動物兩次。用卡尺每周測定腫瘤大小2次。使用公式(π /6)(長χ寬2)以mm3計算腫瘤體積。如Mi所示的結(jié)果顯 示，與注射緩沖液相比較，注射VVTK-/TOU1和VVTK-F2L-/rcUl后，腫瘤的發(fā)展受到控制(ρ
<0.0005)。施用5-FC沒有增強(qiáng)活性。僅注射IxlO6Pfu病毒，單看病毒溶瘤活性非常強(qiáng)。病毒的致病性 用對瑞士裸鼠(圖7)和免疫活性的B6D2小鼠(源自Charles Rivers公司， 6周齡)進(jìn)行存活研究以評估病毒的致病性。用100 μ L每鼠緩沖液中的1. IO7或 1. IO8PFU所有病毒靜脈注射小鼠。在整個實(shí)驗過程中每天觀察小鼠。瑞士裸鼠中(Μ1)，注 射IxlO8PFU的VVTK-/TOU1導(dǎo)致40%的動物在感染3天后死亡。其余的老鼠在感染后第50 至第80天死亡。施用VVTK-F2L-/rcUl致病性較低，大部分動物在第65至第115天死亡(ρ
<0. 05)。兩種病毒在IO7Pfu沒有觀察到毒性的跡象。所有小鼠在靜脈注射IO8Pfu VVTK-/ rcui后死亡。用vvTK-F2L-/rcui處理的組，與用νντκ-/κ:υι感染的小鼠相比，具有顯著的 延長存活達(dá)92% (P < 0.00005)。因此，這一結(jié)果表明了，雙重缺失的病毒VVTK-F2L-/rcUl 的毒性降低。痘皰尾巴損害模型對瑞士裸鼠靜脈注射1. IO6(SQ)或1. IO7PFU(圖10)的每種病毒。每周數(shù)一次 尾巴損害。如圖9(A)所示,在感染后第13天，用1. IO6PFU的VVTK_F2L_/rcUl注射的小鼠， 具有的痘皰/小鼠少于1，相比于注射VVTK-/FCU1的小鼠，平均各鼠8個痘皰。在注射后 的第34天結(jié)果類似，VVTK-/TOU1平均痘皰為4，相對比于注射VVTK_F2L_/rcUl的約為1 (ρ
<0. 0001),如圖9(B)所示。在感染后15天，用1. IO7PFU的VVTK-F2L-/FCU1注射的小鼠， 各鼠分別平均有3. 5個痘皰，相對比于，注射1. IO7PFU的VVTK-/TOU1，各鼠平均有10個痘 皰(圖10(A))。在感染后第31天，用1. IO7PFU的VVTK-F2L-/FCU1注射的小鼠，分別平均有 3. 5個痘皰/鼠，相對比于，注射VVTK-/F⑶1的，平均有7個痘皰/鼠(圖10(B))。VVTK-/ rcui和VVTK-F2L-/rcUl之間痘皰數(shù)量的差異是統(tǒng)計上顯著的(P < 0. 05)。該痘皰的形成 與尾巴中病毒的復(fù)制相關(guān)，也與毒性和毒力相關(guān)。靜脈注射VVTK-F2L-/FCU1的毒性比單一 缺失的TK病毒低。統(tǒng)計分析。采用非參數(shù)Mann-Whitney U 檢驗和 STAT ISTICA 7. 1 軟件(StatSoft，公司)進(jìn)行 統(tǒng)計分析。P <0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計上顯著的。參考文獻(xiàn)·美國 5364773 (VIR0GENETICS 公司(TROY, NY)) 1994 年 11 月 15 日.TO 2004/014314 (KIRN DAVID (美國))2004 年 2 月 19 日.TO 2004/014314 (KIRN DAVID (美國))2004 年 2 月 19 日·美國 5364773 (VIR0GENETICS 公司(TROY, NY)) 1994 年 11 月 15 日‘ WO 93/01281 (US HEALTH)· WO 2005/007857· WO 2005/007857· EP 0998568A· EP 0998568A· EP 0998568A
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權(quán)利要求
包含缺損F2L基因的痘病毒。
2.權(quán)利要求1的痘病毒，其中所述痘病毒還包含缺損J2R基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的痘病毒，其中所述痘病毒屬于脊椎動物痘病毒亞科。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的痘病毒，其中所述痘病毒屬于痘苗病毒種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的痘病毒，其中所述痘病毒是痘苗病毒Copenhagen株。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一所述的痘病毒，其中所述痘病毒還包含目的核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的痘病毒，其中所述目的核酸包含編碼治療性分子的至少一種 目的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的痘病毒，其中所述目的核酸包含自殺基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的痘病毒，其中所述自殺基因編碼的蛋白質(zhì)至少具有胞嘧啶脫 氨酶活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的痘病毒，其中所述自殺基因是FCY1、FCA1或CodA或其類似物。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的痘病毒，其中所述至少具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質(zhì)是 在序列編號SEQ ID NO 2中描述的rcUl-8多肽及其類似物。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的痘病毒，其中所述自殺基因編碼的蛋白質(zhì)具有至少一種胞 嘧啶脫氨酶和一種尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的痘病毒，其中所述自殺基因編碼的多肽包含基本上如序列 編號 SEQ ID NO :3(coda:聊)、SEQID NO :1 (FCUl)中所描述的氨基酸序列或 FCYl FURl 的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一所述的痘病毒，其中所述痘病毒還包含核酸序列，所述 核酸序列包含編碼透性酶的基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的痘病毒，其中透性酶是釀酒酵母的嘌呤或胞嘧啶透性酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的痘病毒，其中透性酶選自于FCY2、Fur4及其類似物。
17.根據(jù)權(quán)利要求6至13中任一所述的痘病毒，其中所述痘病毒還包含表達(dá)目的核酸 所必需的元件。
18.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任一所述的痘病毒，其中所述痘病毒還包含表達(dá)核酸序列 所必需的元件，所述核酸序列包含編碼透性酶的基因。
19.制備根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一所述的痘病毒的方法，其中 (i)將根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一所述的痘病毒引入到細(xì)胞中； ( )將所述細(xì)胞培養(yǎng)在適合于使所述痘病毒能夠產(chǎn)生的條件下；和 (iii)從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述痘病毒。
20.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一所述的痘病毒，與可藥用的賦形劑組合 O
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，與一種或多種物質(zhì)組合，所述物質(zhì)增強(qiáng)5-氟胞嘧 啶的細(xì)胞毒性效應(yīng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述增強(qiáng)5-氟胞嘧啶的細(xì)胞毒性效應(yīng)的物 質(zhì)，是抑制嘧啶從頭生物合成途徑的酶的藥物，優(yōu)選地選自PALA、來氟米特和A771726。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述增強(qiáng)5-氟胞嘧啶的細(xì)胞毒性效應(yīng)的物質(zhì)是甲氨蝶呤。
24.將根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一所述的痘病毒或者根據(jù)權(quán)利要求20至23中任一所 述的組合物用于制備藥物的用途。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的用途，用于制備治療癌癥的藥物。
26.治療疾病的方法，其特征在于，將根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一所述的痘病毒或者根 據(jù)權(quán)利要求20至23中任一所述的組合物施用于需要該治療的宿主有機(jī)體或細(xì)胞中。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中通過全身途徑施用所述痘病毒或組合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的方法，還包含另外的步驟，其中向所述的宿主有機(jī)體 或細(xì)胞施用可藥用數(shù)量的前藥。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中在施用所述痘病毒或組合物優(yōu)選地至少3天，更 優(yōu)選地至少4天，和甚至更優(yōu)選地至少5天之后進(jìn)行施用所述前藥。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中在施用所述痘病毒或組合物7天之后進(jìn)行施用 所述前藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含F(xiàn)2L基因缺損的痘病毒，涉及包含該痘病毒的組合物，以及將該組合物和痘病毒用于治療目的、更具體地用于治療癌癥的方法和用途。
文檔編號A61K35/76GK101868546SQ200880116833
公開日2010年10月20日 申請日期2008年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月19日
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