專利名稱：溶瘤病毒的制作方法
本申請(qǐng)要求美國臨時(shí)申請(qǐng)＿＿＿＿的權(quán)益，在2000年9月8日請(qǐng)求根據(jù)37 CFR 1.53(c)(2)從1999年9月17日提交的美國申請(qǐng)09/397,873獲得的有效提交日為1999年9月17日，在此引入其內(nèi)容作為參考。
本發(fā)明涉及一種新穎的癌癥治療方法。更具體地說，本發(fā)明涉及選擇性感染和抑制腫瘤細(xì)胞生長的病毒。
背景技術(shù)：
溶瘤細(xì)菌或溶瘤細(xì)菌組合物對(duì)攻擊人類和動(dòng)物贅生物的用途是已知的。例如歐洲專利546 121，英國專利1,587,244和美國專利3,192,116公開了用非致病細(xì)菌產(chǎn)生脊椎動(dòng)物腫瘤的液化和溶解。然而在許多情況下，例如使用梭狀芽孢桿菌時(shí)，腫瘤僅部分被破壞，并仍然可能發(fā)生腫瘤再生。為保證控制腫瘤生長，建議給予細(xì)菌，然后給予化療藥物，如5-氟尿嘧啶或烷化劑(如英國專利1,069,144)。
一些病毒也表現(xiàn)出殺腫瘤特性，例如，小核糖核酸病毒H-1(Dupressoir et al.，1996.Cancer Res，49.3203-3208)，新城疫病毒(Reichand et al.，1992.J.Surg.Res，52448-453)或含藥物易受基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Takamiya et al.，1993.J.Neurosurg，79104-110)。WO97/26904和WO96/03997公開了抑制腫瘤細(xì)胞生長的突變單純皰疹病毒(HSV-1761)。給予腫瘤細(xì)胞在長重復(fù)區(qū)(RL)的每個(gè)γ34.5拷貝包含一個(gè)759堿基對(duì)缺失的HSV-1716可以殺滅這些細(xì)胞。然而，此病毒是特異性針對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的，因?yàn)橐阎狧SV選擇性棲居于神經(jīng)系統(tǒng)。另外，常見人病原體作為溶瘤病毒的用途是有限的，因?yàn)槠胀ㄈ巳阂呀?jīng)感染過這些病毒并獲得了對(duì)這些病毒的免疫應(yīng)答。對(duì)癌癥治療中用作治療劑的病毒的相似病毒株預(yù)先存在的免疫應(yīng)答可能減弱病毒作為治療劑的效果。
也報(bào)道過其它病毒株的溶瘤活性。ONYX-015人腺病毒(由ONYX藥物產(chǎn)生)被認(rèn)為優(yōu)選在p53陰性腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。這種病毒在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出治療頭和頸部癌癥患者的希望(Kim，D.，T.et al.，Nat Med，1998.41341-1342)。第3型呼腸孤病毒正在被OncolyticBiotech公司開發(fā)為癌癥治療劑，它優(yōu)選在PKR-/-細(xì)胞中生長(Yin，H.S.，J Virol Methods，1997.6793-101；Strong，J.E and P.W.Lee.，J Virol，1996.70612-616；Strong，J.E.，et al.，Virology，1993.197405411；Minuk，G.Y.，et al.，J Hepatol，1987.58-13；Rozee，K.R.，et al.，Appl Environ Microbiol，1978.35297-300)。第III型呼腸孤病毒在表達(dá)突變r(jià)as癌基因的細(xì)胞中表現(xiàn)出增強(qiáng)的復(fù)制特性(Coffey，M.C.，et al.，Science，1998.2821332-1334；Strong，J.E.，et al.，Embo J，1998.173351-1362)。Mundschau和Faller(Mundschau，L.J.and D.V.Faller，J Biol Chem，1992.26723092-23098)報(bào)道了ras癌基因產(chǎn)物激活PKR的抑制因子，此結(jié)果與PKR化學(xué)抑制因子2-氨基嘌呤增加正常細(xì)胞中第III型呼腸孤病毒生長的發(fā)現(xiàn)相結(jié)合提示PKR是呼腸孤病毒生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
WO 99/04026教導(dǎo)了VSV作為載體在基因治療中用于表達(dá)各種產(chǎn)物包括抗體、免疫原、毒素等對(duì)治療各種疾病的用途。
干擾素是循環(huán)因子，它們與細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，最終導(dǎo)致許多生物應(yīng)答。干擾素信號(hào)傳遞的兩個(gè)結(jié)果是密切聯(lián)系的(1)抗病毒應(yīng)答和(2)誘導(dǎo)生長抑制和/或凋亡信號(hào)。
美國專利4,806,347公開了γ干擾素和INF-γ片段(稱作Δ4α2)抗人腫瘤細(xì)胞的用途。
WO 99/18799報(bào)道了新城疫病毒(NDV)和辛德比斯病毒對(duì)一些人類癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。然而，這兩種細(xì)胞都表明了它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的選擇性。
WO 99/18799公開了加入正常細(xì)胞的干擾素使這些細(xì)胞抗NDV，然而，在干擾素治療的腫瘤細(xì)胞中沒有觀察到這一作用，這些腫瘤細(xì)胞繼續(xù)表現(xiàn)出NDV誘導(dǎo)的敏感性。WO 99/18799也公開了VSV細(xì)胞抗KB細(xì)胞(頭和頸部癌)和HT 1080(纖維肉瘤)的細(xì)胞毒活性，以及在干擾素存在下VSV對(duì)正常和腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞毒性的減少。沒有檢驗(yàn)其它細(xì)胞類型的抗VSV細(xì)胞毒活性。
已經(jīng)報(bào)道了VSV的某些突變株。Stanners，et al.，Virology(1987)160(1)255-8.Francoeur，et al.，Virology(1987)160(1)236-45.Stanners，et al.，J.Gen.Virol.(1975)29(3)281-96.Stanners，et al.，Cell(1977)11(2)273-81。
本發(fā)明涉及在疾病和癌癥，優(yōu)選白血病的治療中有用的病毒配方。這種配方也可以包含溶瘤VSV株和化學(xué)試劑，例如賦予正常細(xì)胞抵抗病毒感染，但使患病或癌細(xì)胞易受病毒感染和溶解的細(xì)胞因子。
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是克服以前領(lǐng)域中的缺點(diǎn)。
上述目標(biāo)通過獨(dú)立權(quán)利要求特點(diǎn)的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。從屬權(quán)利要求公開了本發(fā)明實(shí)施方案進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及新穎的癌癥治療方法。更具體地說，本發(fā)明涉及選擇性感染和抑制腫瘤細(xì)胞生長的病毒。
本發(fā)明提供了一種減低腫瘤細(xì)胞存活力的方法，包含將病毒給予腫瘤細(xì)胞，其中病毒的特征在于它不是常見的人病原體。腫瘤細(xì)胞優(yōu)選缺乏PKR活性，病毒選自棒狀病毒。病毒更優(yōu)選為VSV。
本發(fā)明也定位于減低腫瘤細(xì)胞存活力的方法，包含將病毒給予腫瘤細(xì)胞，其中病毒的特征在于不能滅活宿主細(xì)胞內(nèi)PKR活性。病毒優(yōu)選為皰疹性口腔炎病毒、小核糖核酸病毒、流感病毒和腺病毒。
本發(fā)明也涉及在一群細(xì)胞中減低腫瘤細(xì)胞存活力的方法，包含將病毒給予細(xì)胞群，其中病毒的特征在于可以選擇性感染并殺滅腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選地，病毒的特征進(jìn)一步在于不能滅活宿主細(xì)胞中PKR活性。
本發(fā)明也涉及前面所定義的方法，其中在給予病毒前用干擾素處理細(xì)胞群。
本發(fā)明提供了一種識(shí)別易感于病毒處理的腫瘤的方法，包含(a)將含腫瘤細(xì)胞的樣品分為第一部分和第二部分；(b)用病毒處理第一部分及(c)判斷第一部分中的死亡細(xì)胞百分比是否高于第二部分，其中如果第一部分中的死亡細(xì)胞百分比高于第二部分，則腫瘤易感于用病毒進(jìn)行的處理。
本發(fā)明提供了一種識(shí)別易感于病毒處理的腫瘤的方法，包含(a)將含腫瘤細(xì)胞的樣品分為第一部分和第二部分；(b)用病毒和病毒存在時(shí)足以改善干擾素應(yīng)答細(xì)胞存活的干擾素處理第一部分，并在無干擾素時(shí)用病毒處理第二部分；及(c)判斷第一部分中的死亡細(xì)胞百分比是否高于第二部分，其中如果第一部分中的死亡細(xì)胞百分比高于第二部分，則腫瘤易感于用病毒進(jìn)行的處理。
本發(fā)明定位于突變VSV，其特征在于突變VSV在干擾素應(yīng)答細(xì)胞中生長很差。這里也將這些株稱作VSV的減毒株，或在干擾素應(yīng)答細(xì)胞中生長很差的VSV株?？梢酝ㄟ^它們?cè)趩螌痈蓴_素應(yīng)答細(xì)胞中比在干擾素不應(yīng)答細(xì)胞中產(chǎn)生更小的噬斑而識(shí)別它們，見后面的描述。也可以通過當(dāng)鼻內(nèi)給予PKR+/-小鼠比野生Indiana具有更高的LD50而識(shí)別減毒VSV株，見后面描述的測(cè)定。
本發(fā)明也涉及用親和基質(zhì)分離VSV的方法，包含將VSV加入親和基質(zhì)產(chǎn)生結(jié)合VSV，洗滌結(jié)合VSV，從親和基質(zhì)洗脫VSV。本發(fā)明也包括病毒外表面包含非天然融合蛋白的修飾VSV。非天然蛋白可以是包含親和標(biāo)記和病毒被膜蛋白的融合蛋白，或者它可以源于生產(chǎn)細(xì)胞。
本發(fā)明也定位于分離具有編碼突變VSV蛋白的序列及其互補(bǔ)序列的核酸分子(DNA或RNA)。這種核酸分子可以用于制備重組VSV或作為DNA疫苗。
將這里描述的病毒作為治療病毒比其它病毒具有一些優(yōu)點(diǎn)棒狀病毒不是常見的人病原體。例如，VSV最多見于昆蟲、嚙齒類和飼養(yǎng)動(dòng)物，所以大部分人群不會(huì)感染或?qū)SV感染有免疫力。另一方面，腺病毒或呼腸孤病毒屬是人病原體，而且大多數(shù)普通人群感染過并獲得了對(duì)這些病毒的免疫應(yīng)答。預(yù)先存在的對(duì)類似于一種應(yīng)用于癌癥治療中的治療劑的病毒株的免疫應(yīng)答可以減弱病毒作為治療劑的效果。
● VSV比腺病毒或呼腸孤病毒屬復(fù)制快得多，可以輕易濃集為高滴度。高滴度病毒的產(chǎn)生是其它潛在病毒治療株的重要限制。
● VSV是僅包含5種基因的簡單病毒，容易順從基因操作。目前呼腸孤病毒屬還沒有這種系統(tǒng)。
● 由VSV導(dǎo)致的細(xì)胞感染高度應(yīng)答于額外化學(xué)試劑如干擾素，這種特征增強(qiáng)它的治療價(jià)值。
● VSV具有廣泛的宿主范圍并且可以感染大多數(shù)人細(xì)胞類型，而其它病毒更局限于它們可以感染的細(xì)胞類型。
● VSV是一種RNA病毒并在胞漿中度過其整個(gè)生命周期。所以它更少涉及不希望的整合進(jìn)病人基因組的危險(xiǎn)。
綜上所述，這些VSV特征提供了相對(duì)于其它已知表現(xiàn)溶瘤活性的病毒的顯著優(yōu)點(diǎn)。
此發(fā)明概述并不必要描述本發(fā)明的所有必要特征，但是本發(fā)明也可以立足于描述特征的亞結(jié)合。
附圖簡述通過下面參考附圖的描述，本發(fā)明的這些和其它特征將更明顯

圖1表示干擾素級(jí)聯(lián)的簡圖。
圖2表示在干擾素存在或不存在時(shí)VSV對(duì)正常人成纖維細(xì)胞、人黑色素瘤細(xì)胞系SK-MEL3、前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和卵巢癌細(xì)胞A2780的作用，由改進(jìn)的cpe測(cè)定判斷。在12孔滴定板中以0.1pfu的moi感染單層細(xì)胞。在0和隨后48小時(shí)內(nèi)的每12小時(shí)用0.5mlLeukostat固定劑將一個(gè)加樣孔的感染細(xì)胞固定2分鐘。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用Leukostat染色液染色單層細(xì)胞。
圖3表示VSV在正常成纖維細(xì)胞(圖3(a))，以及腫瘤細(xì)胞系，包括卵巢腫瘤細(xì)胞(圖3(b))和KB腫瘤細(xì)胞(圖3(c))中的細(xì)胞病變作用。
圖4表示VSV對(duì)與293T腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)的正常人成纖維細(xì)胞的作用。在干擾素存在(IFN+)或不存在(IFN-)時(shí)以0.1pfu/細(xì)胞的moi感染共同培養(yǎng)物并且允許感染繼續(xù)進(jìn)行。用大分子T抗原(紅色核)的抗體染色培養(yǎng)物檢測(cè)293T細(xì)胞，用DAPI(藍(lán)色核)染色所有細(xì)胞類型。
圖5表示體內(nèi)VSV對(duì)植入裸鼠的腫瘤的作用。將人黑色素瘤細(xì)胞植入裸鼠并進(jìn)行偽注射(VSV(-))，注射野生型VSV(未提供數(shù)據(jù))，或用注射到腫瘤位點(diǎn)前一小時(shí)體外感染VSV的另外的黑色素瘤細(xì)胞注射(VSV(+))。在7天的時(shí)間段中判斷腫瘤大小。
圖6表示在圖5所描述的裸鼠中產(chǎn)生的腫瘤上形成的潰瘍。
圖7VSV和VSV感染的細(xì)胞抑制裸鼠中人黑色素瘤異種移植物的生長。
圖8A和8BPKR-/-小鼠對(duì)鼻內(nèi)VSV感染非常敏感并表現(xiàn)IFN介導(dǎo)的抵抗力的缺陷。
圖9干擾素在VSV治療中可以保護(hù)攜帶異種移植物的裸鼠。
圖10A和10B感染野生型Indiana和各種突變VSV株的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的病毒產(chǎn)量。
圖11在VSV(WT Indiana)感染后惡性細(xì)胞被迅速殺滅并且不受IFN-α保護(hù)。
圖12在有或無IFN-α?xí)rVSV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變作用在人黑色素瘤細(xì)胞中可見，而在原代人細(xì)胞中不可見。
圖13靜脈內(nèi)單劑量突變VSV在治療裸鼠中人黑色素瘤異種移植物的效力圖14野生型和突變VSVs的N蛋白cDNA序列。
圖15野生型和突變VSVs的N蛋白氨基酸序列。
圖16野生型和突變VSVs的P蛋白cDNA序列。
圖17野生型和突變VSVs的P蛋白氨基酸序列。
圖18野生型和突變VSVs的M蛋白cDNA序列。
圖19野生型和突變VSVs的M蛋白氨基酸序列。
圖20野生型和突變VSVs的G蛋白cDNA序列。
圖21野生型和突變VSVs的G蛋白氨基酸序列。
圖22野生型和突變VSVs的L蛋白cDNA序列。
圖23野生型和突變VSVs的L蛋白氨基酸序列。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及新穎的癌癥治療方法。更具體地說，本發(fā)明涉及選擇性感染和抑制腫瘤細(xì)胞生長的病毒。
以下僅通過實(shí)施例對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，并不限制結(jié)合實(shí)現(xiàn)本發(fā)明作用的必要特征。
癌細(xì)胞通過獲得生長抑制或凋亡途徑中的突變相對(duì)于它們的正常對(duì)應(yīng)物得到生存益處，并且在干擾素存在下，在消耗了關(guān)鍵抗病毒防御機(jī)制時(shí)也會(huì)如此。由于腫瘤細(xì)胞通過干擾素應(yīng)答基因的突變得到顯著生長優(yōu)勢(shì)，它們將更易受病毒感染。
“減低腫瘤細(xì)胞生存力”表示殺滅腫瘤細(xì)胞或在一段時(shí)間限制它的生長。
“非常見人類病原體”表示主要在非人宿主，例如，但不限于昆蟲、嚙齒類和農(nóng)業(yè)飼養(yǎng)動(dòng)物中存在的病毒。這些病毒一般不在人群中存在。
這里用到的突變體I，突變體1，Mut1和M1是指減毒突變株T1026。突變體II，III，IV和V(和類似于突變體I的變異命名法)分別指減毒突變體T1026R，TP3，TP6和G31。
本發(fā)明的新穎癌癥專利法包括使用至少一種選擇性定向于靶腫瘤細(xì)胞并導(dǎo)致其破壞的溶瘤病毒。溶瘤病毒優(yōu)選為皰疹性口腔炎病毒(VSV)，例如Indiana株，或其它株，或其衍生物。VSV的衍生物表示通過在不同生長條件下選擇病毒而獲得的VSV病毒，或經(jīng)過一定范圍選擇壓力的VSV病毒，或通過本領(lǐng)域公知的重組技術(shù)被基因修飾的VSV病毒。例如，不考慮以任何方式限制，VSV衍生物可以包括通過感染這里描述的已經(jīng)干擾素處理過的人細(xì)胞選擇的突變VSV，或表現(xiàn)出對(duì)親和純化有用的親和性標(biāo)記的VSV。
溶瘤病毒抑制腫瘤細(xì)胞生長的效率部分歸于與正常細(xì)胞相比腫瘤細(xì)胞對(duì)病毒感染的差異易感性。盡管沒有理論依據(jù)，差異易感性可以部分歸因于細(xì)胞內(nèi)本應(yīng)該防止細(xì)胞腫瘤生長和病毒感染的因子的下調(diào)或滅活。當(dāng)滅活時(shí)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長，并也參與介導(dǎo)病毒感染的因子的例子包括但不限于PKR(雙鏈RNA依賴性激酶)和PML(早幼粒細(xì)胞白血病基因)，然而，應(yīng)該理解其它因子也可能起作用。
通過各種機(jī)制包括但不限于PKR相關(guān)介質(zhì)，對(duì)PKR的下調(diào)或滅活已知與腫瘤細(xì)胞生長相關(guān)，而正常細(xì)胞表現(xiàn)出有活性的PKR。另外，暴露于病毒感染的野生型細(xì)胞表現(xiàn)PKR表達(dá)升高，這導(dǎo)致病毒復(fù)制的抑制，而表現(xiàn)PKR活性減低或無PKR活性的細(xì)胞易受病毒攻擊并表現(xiàn)癌性生長。同樣，PML基因產(chǎn)物作為腫瘤抑制因子起作用，也已知它抑制病毒復(fù)制。
“差異易感性”表示與導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長和細(xì)胞不能抑制病毒復(fù)制的細(xì)胞相關(guān)的屬性。表現(xiàn)差異易感性的細(xì)胞是使用本發(fā)明的癌癥治療法處理腫瘤細(xì)胞生長的優(yōu)選備選細(xì)胞。通過在處理腫瘤細(xì)胞前或過程中加入一種或更多化學(xué)試劑可以加強(qiáng)差異易感性?；瘜W(xué)試劑優(yōu)選增加野生型細(xì)胞對(duì)病毒感染的抵抗力，但對(duì)腫瘤細(xì)胞對(duì)病毒感染的應(yīng)答作用很小或沒有作用。這種化學(xué)試劑的一個(gè)例子是，但不以任何方式限制于干擾素。
“PKR”表示顯示出多種功能，包括控制mRNA翻譯和基因轉(zhuǎn)錄的絲氨酸/蘇氨酸激酶(1，2)。這種激酶在其氨基末端調(diào)節(jié)部分容納兩個(gè)雙鏈RNA(dsRNA)結(jié)合基序，在其羧基端容納催化激酶域。dsRNA與氨基端的結(jié)合誘導(dǎo)酶的構(gòu)象改變，顯露并激活催化激酶域。PKR的表達(dá)由一些PKR介質(zhì)誘導(dǎo)，包括但不限于干擾素。
“PKR介質(zhì)”表示在基因或蛋白水平直接或間接影響PKR活性的蛋白或化合物，包括PKR激活因子和PKR抑制因子。PKR激活因子的例子包括但不限于STAT1(見圖1)，干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF-1)和干擾素。PKR抑制因子的例子包括但不限于VA RNAs，p58(IPK)，與Ras途徑相關(guān)的因子，核糖體蛋白L18，或降解PKR蛋白的蛋白酶。PKR活性也可以通過編碼PKR的基因的突變，或驅(qū)動(dòng)PKR表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)域的突變而介導(dǎo)。這些突變可以增加或減低PKR活性。減低PKR活性的PKR突變包括但不限于，失去PKR的dsRNA結(jié)合活性，或產(chǎn)生陰性催化突變體的突變。增加PKR活性的突變包括，但不限于PKR的過度表達(dá)，或產(chǎn)生活性更高的PKR蛋白的突變。
PKR通過一種參與蛋白翻譯起始的因子eIF-2α的磷酸化而調(diào)節(jié)翻譯。一旦被磷酸化，eIF-2α-GDP與eIF-2B形成無活性的復(fù)合物，導(dǎo)致迅速抑制蛋白合成。PKR通過激活NFκB間接妨礙基因轉(zhuǎn)錄。這種激活表現(xiàn)為通過IκB激酶(3)的PKR磷酸化而執(zhí)行，這接下來磷酸化的IκB，導(dǎo)致它的定向破壞。
PKR的抗病毒活性許多不同的病毒類型感染細(xì)胞導(dǎo)致形成dsRNA(如作為復(fù)制中間體)，導(dǎo)致PKR和它的后續(xù)下游效應(yīng)物的激活(見圖1)。具體地說，蛋白合成被迅速終止并起始凋亡級(jí)聯(lián)(4，5)。作為PKR激活的結(jié)果，新病毒顆粒的產(chǎn)生減少，病毒通過生物體的傳播受到限制。Der等(12)報(bào)道了在應(yīng)答于對(duì)多種應(yīng)激誘導(dǎo)劑的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)過程中需要PKR。
盡管沒有理論依據(jù)，惡性腫瘤的產(chǎn)生可能是由于控制細(xì)胞增殖和凋亡的基因的多種突變而發(fā)生的。PKR在調(diào)節(jié)蛋白合成中的作用與它的抗增殖和促凋亡特性結(jié)合使其成為致癌突變的目標(biāo)，這直接或間接影響了它的活性。
如實(shí)施例中更具體的描述，用PKR-/-動(dòng)物對(duì)一些病毒的初篩提示PKR缺失的動(dòng)物易受皰疹性口腔炎病毒(VSV)的感染。在體外獲得了相似的結(jié)果，與PKR+/+成纖維細(xì)胞相比，VSV感染在PKR-/-成纖維細(xì)胞中進(jìn)展更快。這些結(jié)果說明哺乳動(dòng)物細(xì)胞需要PKR以抵抗VSV感染。另外，某些細(xì)胞系，例如，但不限于原代人骨髓，抗VSV感染，而白血病細(xì)胞系易受VSV感染。
考慮到了VSV相關(guān)病毒，或其它表現(xiàn)出相似病毒感染機(jī)制的病毒可以被識(shí)別為表現(xiàn)出選擇性感染PKR活性減低或無PKR活性的細(xì)胞的特征。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以輕易用這里描述的方法篩選其它病毒減低細(xì)胞存活力、或殺滅缺乏PKR活性的細(xì)胞、或PKR-/-細(xì)胞、PKR-/-動(dòng)物、或PKR-/-細(xì)胞和動(dòng)物的能力。
如下面的實(shí)施例中所提示的，用干擾素預(yù)處理細(xì)胞使病毒感染性減低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。盡管沒有理論依據(jù)，加入干擾素可以上調(diào)PKR表達(dá)，導(dǎo)致對(duì)病毒感染的抵抗力增加。
由于其有力的抗病毒活性，病毒發(fā)展出防御PKR的策略。例如，HIV和丙肝病毒編碼專門結(jié)合和滅活PKR的蛋白(6，7)。腺病毒編碼與PKR結(jié)合但不激活它的小RNA分子(VA RNAs)(8)。流感病毒占用細(xì)胞蛋白p58(IPK)抑制PKR，而脊髓灰質(zhì)炎病毒起始PKR的蛋白水解(9，10)。SV-40的大分子T抗原甚至在激活PKR存在下仍表現(xiàn)出在eIF-2α下游起作用而促進(jìn)蛋白翻譯(10)。
PKR和腫瘤抑制NIH 3T3細(xì)胞中顯性陰性PKR催化突變體的表達(dá)導(dǎo)致它們的惡性轉(zhuǎn)化并促進(jìn)它們?cè)诼闶竽Ｐ椭猩L為腫瘤(13，14)。使用失去dsRNA結(jié)合活性的PKR突變體觀察到了相似的現(xiàn)象。在啤酒酵母中PKR的誘導(dǎo)表達(dá)導(dǎo)致酵母中生長停止—此現(xiàn)象可以通過eIF-2α的不可磷酸化譯本的共同表達(dá)而逆轉(zhuǎn)。所以，PKR具有抗增殖活性并可以作為腫瘤抑制因子起作用。
有一些證據(jù)表明PKR在范圍很廣的人惡性腫瘤中為無活性的，不存在或表達(dá)減少。
致癌Ras突變存在于約30％的所有人腫瘤中，而上游Ras激活因子的突變甚至更常見(即EGF受體，Neu受體，PDGF受體)。Mundschau和Faller(15，16)描述了致癌Ras誘導(dǎo)的PKR抑制因子。此外，Strong等證明Ras途徑的激活導(dǎo)致PKR活性的下調(diào)。
核糖體蛋白L18在原發(fā)結(jié)腸直腸癌組織中過度表達(dá)，并且最近表明它結(jié)合并滅活PKR(18)。
有5q易位的患者表現(xiàn)出PKR表達(dá)減少(19-21)。干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)是一種有腫瘤抑制因子活性的轉(zhuǎn)錄因子，它位于人染色體5q區(qū)。PKR基因轉(zhuǎn)錄部分由IRF-1調(diào)節(jié)。
人PKR位于2p21-22，最近被識(shí)別為急性髓細(xì)胞白血病的情況下的易位位點(diǎn)。
在低分化、高度惡性的腫瘤活檢中，PKR蛋白以低水平存在或檢測(cè)不到(23-25)。
STAT1STAT1是干擾素途徑的必要介質(zhì)，它的激活導(dǎo)致PKR mRNA和蛋白的上調(diào)(見圖1)。
在抗干擾素黑色素瘤細(xì)胞系和原發(fā)黑色素瘤活檢物質(zhì)(26)，在多種人腫瘤細(xì)胞系包括髓細(xì)胞白血病、宮頸癌、卵巢癌和肺癌(27)，以及在胃腺癌(28，29)中有明顯的STAT1蛋白水平/活性缺陷。此外，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)是一種一般應(yīng)答于干擾素的惡性腫瘤(然而臨床抵抗經(jīng)常出現(xiàn)在病歷的很大部分中)。Sun等(30)報(bào)道了STAT1蛋白不出現(xiàn)在CTCL細(xì)胞系中，表明對(duì)干擾素的臨床抵抗可能是由于STAT1突變而產(chǎn)生的。
PML早幼粒細(xì)胞白血病基因PML是一種通常作為腫瘤抑制因子起作用的干擾素誘導(dǎo)基因以及Fas，TNFα和干擾素誘導(dǎo)的凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。最近，Chelbi-Alix等報(bào)道了PML基因產(chǎn)物的另一種正常功能是抑制病毒復(fù)制。PML-RAR融合蛋白作為干擾素誘導(dǎo)的凋亡的顯性負(fù)抑制因子起作用，我們可以預(yù)測(cè)它也使APL細(xì)胞優(yōu)選易受病毒感染。
PKR蛋白或活性的下調(diào)出現(xiàn)在范圍很廣的人惡性腫瘤中。當(dāng)癌細(xì)胞通過去除PKR或PKR介質(zhì)獲得生長優(yōu)勢(shì)和無約束的蛋白翻譯能力時(shí)，這些細(xì)胞同時(shí)去除了細(xì)胞的主要和有力的抗病毒防御機(jī)制之一。所以，具有降低的PKR活性的腫瘤細(xì)胞與它們的正常對(duì)應(yīng)物相比將更易受感染。如前面所提示的，干擾素途徑的其它成分(如STAT1和PML)在人惡性腫瘤中經(jīng)常突變，它們活性的喪失將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)病毒感染敏感。這種差異易感性形成了本發(fā)明基于病毒的癌癥治療方法用于處理腫瘤細(xì)胞生長的基礎(chǔ)。
用一些不同的病毒篩選PKR缺失小鼠株提示PKR缺失動(dòng)物可以抑制許多病毒包括牛痘病毒、流感病毒和EMCV感染。然而，皰疹性口腔炎病毒(VSV)表現(xiàn)出感染PKR-/-動(dòng)物的能力。觀察到棒狀病毒家族的一員VSV僅通過50個(gè)感染性病毒顆粒(或斑形成單位，pfu)鼻內(nèi)感染后殺滅100％的PKR缺失動(dòng)物。相對(duì)地，殺滅半數(shù)被感染的野生型同窩出生動(dòng)物要求超過20,000倍的VSV顆粒。
VSV是一種有被膜的，有一個(gè)簡單的五個(gè)基因的基因組的負(fù)義RNA病毒。這是一種特征非常突出的病毒家族，有一些血清型不同的實(shí)驗(yàn)室株和許多有特點(diǎn)的突變體。VSV的天然宿主包括昆蟲、嚙齒類和飼養(yǎng)動(dòng)物?？偟恼f來，極少的北美人接觸過此病毒—大多數(shù)人類感染發(fā)生在實(shí)驗(yàn)室人員和農(nóng)民。人類感染為無癥狀或表現(xiàn)為輕度“流感”。在感染人群中沒有報(bào)道嚴(yán)重疾病或死亡的病例。
觀察了VSV在野生型細(xì)胞中選擇性感染腫瘤細(xì)胞的能力。在過夜感染后，腫瘤細(xì)胞系表現(xiàn)出比正常原代成纖維細(xì)胞中檢測(cè)到的高100到1000倍的感染率。而且，在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞病變作用(cpe)是加速的。
由于PKR是一種干擾素可誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物，通過檢驗(yàn)在暴露于VSV之前用干擾素預(yù)處理的細(xì)胞而判斷病毒感染作用。用干擾素預(yù)處理的野生型細(xì)胞培養(yǎng)物抗VSV感染，而腫瘤細(xì)胞系，例如，但不限于纖維肉瘤、黑色素瘤、前列腺癌、白血病和卵巢肉瘤易受病毒感染(見表1，實(shí)施例2；圖2)。在有或無干擾素時(shí)肺癌細(xì)胞(LC80)也易受VSV感染(沒有提供數(shù)據(jù))。然而，在干擾素存在時(shí)一些腫瘤細(xì)胞系抗VSV感染。
卵巢癌細(xì)胞、纖維肉瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌和白血病細(xì)胞是VSV敏感的，并且這種敏感性在干擾素存在下仍保持，所以，這些腫瘤細(xì)胞和由其衍生的癌可能特別順從VSV治療。然而，其它癌也可能順從這里描述的病毒治療。研究VSV敏感性使用的原發(fā)腫瘤物質(zhì)可以輕易從腹水中得到。此外，由于腫瘤包含在腹腔內(nèi)，它可以證明特別適于局部給予基于病毒的治療法。從這一點(diǎn)出發(fā)，從病人腹水得到的活組織可以被用于檢驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞在有或無干擾素存在時(shí)支持VSV感染的能力。
預(yù)計(jì)VSV將具有體內(nèi)治療活性并將具有殺滅遠(yuǎn)處(轉(zhuǎn)移)腫瘤生長的能力。到目前為止還沒有觀察到被治療小鼠的顯著器官病理，然而，應(yīng)該進(jìn)一步研究VSV病毒血癥的動(dòng)力學(xué)。使植入了人黑色素瘤細(xì)胞的裸鼠接受VSV，或另外的體外感染VSV的黑色素瘤細(xì)胞(見實(shí)施例5)，以保證通過注射在幾小時(shí)的時(shí)間段中連續(xù)產(chǎn)生感染性顆粒到腫瘤(圖5)。在偽注射動(dòng)物中(VSV(-)；僅注射載體)，腫瘤在實(shí)驗(yàn)過程中連續(xù)生長。僅接受純病毒的動(dòng)物起初表現(xiàn)為在前四天中腫瘤連續(xù)生長，此后腫瘤開始縮小其大小并在實(shí)驗(yàn)過程中不斷進(jìn)行此過程。注射了感染細(xì)胞的腫瘤停止生長并消退為類似于疤痕組織的小硬結(jié)。在一些接受注射的更大的腫瘤中，1-2天內(nèi)在腫瘤上形成了潰瘍(見圖6)。盡管注射純化病毒和感染的黑色素瘤細(xì)胞都導(dǎo)致顯著消退，被感染的發(fā)生細(xì)胞更有效。
對(duì)免疫活性小鼠腫瘤模型的研究(即Strong等所描述；17)檢驗(yàn)抗體應(yīng)答對(duì)治療性的VSV感染的影響，并判斷VSV感染腫瘤細(xì)胞是否增加它們的免疫原性并促進(jìn)宿主機(jī)體對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別。
原代人骨髓在沒有干擾素預(yù)處理時(shí)也表現(xiàn)為抗VSV感染(見表1，實(shí)施例2)，提示這些細(xì)胞對(duì)VSV感染有天然的抵抗力。相對(duì)的，也檢驗(yàn)了兩種白血病細(xì)胞系(M07E和L1210)并發(fā)現(xiàn)它們易受VSV感染，這是由細(xì)胞致病作用、病毒生長和細(xì)胞存活力的喪失而證實(shí)的。
盡管這里公開的結(jié)果涉及VSV，應(yīng)該理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員依照此文件中概括的方法將很容易篩選其它VSV株、VSV衍生物包括VSV突變體、或相關(guān)病毒選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞的能力?？梢詸z驗(yàn)其他一些血清學(xué)和生物學(xué)不同的VSV株的該特性。這些VSV株包括，但不限于New Jersey，Piry，Coccal和Chandipura。如果要求用連續(xù)VSV注射完全根除腫瘤，識(shí)別其它適當(dāng)?shù)难鍖W(xué)無關(guān)的株可能是有用的。另外，已知小核糖核酸病毒(如鼻病毒)對(duì)人組織相對(duì)無害而在組織培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中生長極佳，也可以使用這些病毒。另外，可以用這些病毒的結(jié)合而增強(qiáng)用VSV所觀察到的細(xì)胞致病作用。
為判斷正常或腫瘤細(xì)胞的存在是否可以影響其它細(xì)胞類型(正?；蚰[瘤細(xì)胞)并改變這些細(xì)胞中任何一種對(duì)VSV感染的抵抗力或易感性，在VSV存在下共同培養(yǎng)正常細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。用moi為0.1pfu/細(xì)胞感染培養(yǎng)物并且允許在有或無干擾素存在下繼續(xù)進(jìn)行。在0，12和24小時(shí)(圖4)將培養(yǎng)物固定并用大分子T抗原的抗體染色(紅色核)而檢測(cè)293T細(xì)胞，用DAPI(藍(lán)色核)染色所有細(xì)胞類型。293T細(xì)胞(紅色核)的數(shù)目在此時(shí)間段中穩(wěn)定下降并表現(xiàn)出由病毒誘導(dǎo)的凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的嚴(yán)重濃縮或成片段細(xì)胞核的特征。這種對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性破壞在干擾素存在或不存在時(shí)都可以觀察到。盡管293T細(xì)胞在共同培養(yǎng)物中產(chǎn)生大量病毒，正常成纖維細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)于VSV感染的核改變，它們的數(shù)目也不減少。這提示可以用VSV處理細(xì)胞群混合物而仍然保持腫瘤細(xì)胞對(duì)VSV的敏感性以及正常細(xì)胞對(duì)VSV的抵抗力。
另外，有許多VSV的突變體，例如，但不限于在宿主蛋白合成停止時(shí)受損，或?qū)Ω蓴_素更敏感或更不敏感，在正常和腫瘤細(xì)胞間可以表現(xiàn)差異感染的突變體。例如，不準(zhǔn)備以任何方式限制，描述了其它已知定向于STAT1或PKR陰性細(xì)胞的病毒突變體，包括不能滅活PKR的流感病毒株(36)。已知缺乏PKR滅活VA基因的腺病毒突變體在沒有PKR時(shí)生長更好。
如這里所描述的，分離出在干擾素應(yīng)答細(xì)胞中生長很差的VSV突變體。這些突變體的選擇取決于它們?cè)趩螌痈蓴_素應(yīng)答細(xì)胞中形成小斑點(diǎn)的能力。在干擾素不應(yīng)答細(xì)胞(即腫瘤細(xì)胞)中，這些突變體形成大的斑。在干擾素應(yīng)答細(xì)胞中通過斑大小選擇突變體允許分離在正常細(xì)胞中生長不佳的病毒。然而，在不同選擇標(biāo)準(zhǔn)下可以獲得其它VSV突變體。擴(kuò)增用干擾素應(yīng)答細(xì)胞分離的突變體并檢驗(yàn)它們殺滅腫瘤和正常細(xì)胞的能力。這里的基本原理是可以誘導(dǎo)靶細(xì)胞中干擾素的VSV突變體在干擾素應(yīng)答細(xì)胞群中將限制它們自身的復(fù)制。然而這些相同的病毒在缺乏干擾素應(yīng)答的腫瘤細(xì)胞中將具有無限制的生長。這些突變體是有價(jià)值的，因?yàn)榕c野生型VSV相比，它們對(duì)正常組織的細(xì)胞致病作用甚至更小并同時(shí)保持溶瘤活性。
根據(jù)它們?cè)趩螌痈蓴_素應(yīng)答細(xì)胞細(xì)胞中形成斑的能力獲得四種突變體(Mut 1-4)。這些突變體和野生型病毒(moi為1.0pfu/細(xì)胞)被用于感染黑色素瘤和正常人包皮成纖維細(xì)胞。所有的突變體都可以有效殺滅腫瘤細(xì)胞但用突變體感染的正常細(xì)胞甚至在感染后很長時(shí)間仍表現(xiàn)出完全未感染。在同樣的moi下，野生型VSV證明了對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞致病作用。這些結(jié)果提示突變病毒具有更強(qiáng)的治療作用，它們更有效殺滅腫瘤細(xì)胞同時(shí)保留正常細(xì)胞，并且它們也具有產(chǎn)生更多病毒顆粒并增加腫瘤中的病毒傳播的能力(見實(shí)施例4)。令人驚訝的是，這些突變體在HCT 116結(jié)腸癌細(xì)胞中比野生型VSV(Indiana)生長更快，而在OSF 7細(xì)胞中則不是(見實(shí)施例21和圖10A和10B)。優(yōu)選在感興趣的腫瘤細(xì)胞而不是正常細(xì)胞中迅速生長的VSV突變體。
早期實(shí)驗(yàn)提示PKR-/-小鼠被通過一些感染途徑感染的VSV殺死，然而，這些小鼠不受靜脈注射病毒的影響。為判斷血漿成分在接觸時(shí)是否滅活病毒，用人血漿(從正常未感染供體得到)孵育從一些來源包括小鼠L細(xì)胞(從正常未感染供體得到)內(nèi)得到的VSV并判斷孵育后的病毒滴度(實(shí)施例6)。L細(xì)胞產(chǎn)生的VSV的病毒滴度降低了400倍，而人黑色素瘤產(chǎn)生的VSV不受血漿孵育的影響。這些結(jié)果提示為產(chǎn)生VSV而選擇細(xì)胞系是關(guān)鍵的。根據(jù)此觀察，可以篩選人細(xì)胞系得到產(chǎn)生最優(yōu)量對(duì)人血漿不敏感的病毒的細(xì)胞系。
盡管沒有理論支持，這兩種病毒制劑的不同反應(yīng)了在產(chǎn)生病毒的細(xì)胞表面的蛋白系列的性質(zhì)。作為它的復(fù)制循環(huán)的一部分，VSV通過漿膜出芽并獲得它的被膜上的細(xì)胞蛋白。當(dāng)L細(xì)胞上的某些蛋白在病毒顆粒的范圍內(nèi)表達(dá)時(shí)可以激活補(bǔ)體。實(shí)際上，以前已經(jīng)表明在某些小鼠細(xì)胞中產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒由血清滅活而在人細(xì)胞系一種亞型中產(chǎn)生的相同病毒不受血漿影響。(Pensiero，M.N.，et al.Hum Gene Ther，1996.71095-1101)。
產(chǎn)生VSV的常規(guī)技術(shù)很難達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的規(guī)模。所以，使用親和基質(zhì)，如親和層析進(jìn)行VSV純化(見實(shí)施例7)。然而也可以用本領(lǐng)域中公知的其它親和純化方案，例如，但不限于批量處理病毒溶液和親和基質(zhì)，通過離心沉淀VSV結(jié)合的基質(zhì)，并分離病毒。為給病毒提供用于病毒純化的親和標(biāo)記，可以用本領(lǐng)域公知的技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行基因修飾，在它的表面表達(dá)一種或更多親和標(biāo)記，優(yōu)選表達(dá)為融合病毒被膜蛋白，或者可以對(duì)生產(chǎn)細(xì)胞系進(jìn)行加工以便在它們的漿膜上表達(dá)一種或更多親和標(biāo)記，這可以在通過膜出芽時(shí)由病毒獲得，然而，也可以使用內(nèi)源性病毒被膜蛋白。一種很有特點(diǎn)的親和標(biāo)記包括使用結(jié)合于固定的鎳柱的組氨酸殘基，然而，應(yīng)當(dāng)理解也可以使用其他親和標(biāo)記。
可以制備作為VSV或其他病毒的普遍生產(chǎn)細(xì)胞系，它們表達(dá)有鎳結(jié)合或其它親和標(biāo)記特性的嵌合VSV蛋白。普遍生產(chǎn)細(xì)胞可以用于使任何有被膜的病毒(包括所有有被膜的RNA和DNA病毒)產(chǎn)生嵌合蛋白(親和標(biāo)記)。為純化通過核膜出芽的病毒(如皰疹病毒)，制造了在核膜中表達(dá)的病毒被膜蛋白上表達(dá)的標(biāo)記。
其它親和標(biāo)記包括抗體，優(yōu)選在低鹽、低溫或關(guān)鍵陽離子/陰離子存在的條件下識(shí)別特定肽的抗體。生理鹽濃度、熱洗脫或螯合作用可以影響洗脫。對(duì)抗二肽或三肽產(chǎn)生的抗體也可以用于純化。以這種方式，單個(gè)病毒顆粒表面的兩種或更多的這些標(biāo)記將允許病毒的連續(xù)親和純化。
為改變其特性以便體內(nèi)使用，可以對(duì)VSV進(jìn)行基因修飾。VSV的基因修飾方法是本領(lǐng)域中明確建立的。例如，為VSV建立的反向遺傳體系使改變病毒的遺傳特性成為可能(Roberts A.and J.K.Rose，Virology，1998.2471-6)。此外，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)VSV進(jìn)行基因修飾并將需要的基因引入VSV基因組，從而產(chǎn)生重組VSVs(如Sambrook et aL.，1989，A LaboratoryManual.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)。
VSV可以體內(nèi)定向于需要位點(diǎn)而增加病毒功效。例如，可以使用產(chǎn)生定向于特定位點(diǎn)的融合的VSV G蛋白修飾來增強(qiáng)VSV的體內(nèi)功效。然而，應(yīng)該理解除VSV G蛋白以外的其它蛋白目標(biāo)也可以被修飾而產(chǎn)生這種融合蛋白。這種融合蛋白可以包含，例如，但不限于對(duì)腫瘤抗原有特異性的單鏈Fv片段(Lorimer，I.A.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1996.9314815-20)。這種可以用于制備VSV G融合蛋白的單鏈Fv片段的一個(gè)例子是定向于出現(xiàn)在約80％的人乳腺腫瘤細(xì)胞中的突變EGF受體的一種Fv片段。
VSV也可以被修飾為表達(dá)一種或更多可以將前體藥物代謝為毒性代謝物的自殺基因從而允許被VSV感染的細(xì)胞通過給予前體藥物而被殺滅。例如，包含皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因或胞嘧啶脫氨酶基因的VSV病毒編碼可以分別將更昔洛韋或5-FC轉(zhuǎn)化為毒性化合物的酶。然而，應(yīng)該理解，也可以使用其它自殺基因。已經(jīng)確定，更昔洛韋不僅殺滅表達(dá)HSV TK的細(xì)胞，也殺滅緊鄰細(xì)胞，包含這些自殺基因的rVSV表現(xiàn)出一些優(yōu)點(diǎn)。例如，由于一個(gè)被感染細(xì)胞殺滅10個(gè)或更多周圍的腫瘤細(xì)胞，病毒的有效殺滅增加，此外，如果需要，包含自殺基因的rVSV允許從感染病毒的個(gè)體清除病毒。這在不清楚VSV如何影響個(gè)體的情況下是重要的。例如，具有免疫力的人可能出乎意料易受VSV感染。所以添加自殺基因?qū)Σ《局委煹陌踩詫⑹且环N改善。
也可以通過引入哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物修飾VSV。這種哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物將限制正常細(xì)胞中VSV生長，但不限制VSV在腫瘤細(xì)胞或病變細(xì)胞中的生長。例如，可以表達(dá)一種或更多p53的反式激活因子的rVSV激活正常細(xì)胞中而不是腫瘤細(xì)胞中的凋亡途徑。所以，這些rVSVs選擇性限制正常組織中的病毒傳播。然而，應(yīng)該理解其它哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物也可以為此目的而在VSV中表達(dá)，另一個(gè)不考慮以任何方式限制的例子是PKR基因。表達(dá)PKR基因的rVSV限制所有正常細(xì)胞中病毒的復(fù)制，然而，在表達(dá)PKR抑制因子的細(xì)胞中病毒編碼的PKR被滅活。表達(dá)一種或更多PKR抑制因子的細(xì)胞的一個(gè)例子是被丙肝病毒慢性感染的細(xì)胞。由于丙肝病毒編碼并表達(dá)兩種已知的PKR抑制因子(即NS5A和E2)，VSV編碼的PKR基因產(chǎn)物被中和，允許VSV自由復(fù)制。
前面的描述不準(zhǔn)備以任何方式限制要求保護(hù)的發(fā)明，此外，所討論的特征結(jié)合可能不是解決本發(fā)明所絕對(duì)必要的。
在下面的實(shí)施例中將進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。然而應(yīng)該理解這些實(shí)施例只是用于說明目的，并不用于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1PKR陰性細(xì)胞易受VSV感染。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步實(shí)驗(yàn)定位于識(shí)別能夠感染PKR-/-動(dòng)物和細(xì)胞的病毒。用同源重組策略產(chǎn)生PKR缺失小鼠株(35，在此引入作為參考)并檢驗(yàn)它們抵抗病毒感染的能力。由于這些小鼠是PKR-/-，它們應(yīng)該易受病毒感染。將一些病毒種以一定范圍的濃度給予PKR缺失動(dòng)物。
PKR缺失小鼠感染用常規(guī)剔除技術(shù)產(chǎn)生PKR缺失小鼠(Abraham，N.，et al.，J BiolChem，1999.2745953-5962)。用不同量的皰疹性口腔炎病毒(Indiana株)鼻內(nèi)感染三月齡或更大的5只一組的各組雌性小鼠。平行感染年齡匹配的野生型動(dòng)物并每日監(jiān)測(cè)兩個(gè)系列動(dòng)物的感染體征。這些包括水合、立毛、活動(dòng)水平、食欲、后肢癱瘓、呼吸頻率、體重和其它提示動(dòng)物處于窘迫的癥狀。
野生型動(dòng)物在VSV感染復(fù)數(shù)高達(dá)105pfu時(shí)表現(xiàn)出很少或僅僅是短暫的癥狀。相對(duì)的，PKR缺失動(dòng)物非常迅速地發(fā)生脫水、立毛、食欲減退、呼吸頻率加快、活動(dòng)減少和斜視。在高劑量VSV感染時(shí)(105pfu)動(dòng)物在24小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出癥狀并通常在48小時(shí)內(nèi)死于感染。在感染劑量低至25pfu時(shí)，100％的PKR缺失動(dòng)物在5天內(nèi)死于VSV感染。在另外的實(shí)驗(yàn)中，在用VSV感染后48小時(shí)處死5只一組的野生型和PKR缺失動(dòng)物，并取出器官評(píng)估病毒滴度。在PKR動(dòng)物中，此時(shí)發(fā)現(xiàn)每毫升肺勻漿超過100萬PFU的滴度，而在野生型動(dòng)物中滴度為每毫升肺勻漿0到100pfu。在野生型和PKR缺失動(dòng)物腦中發(fā)現(xiàn)了相似量的病毒。在感染后的此時(shí)間，兩種小鼠株剩余組織的病毒測(cè)量不到。
棒狀病毒家族的一員皰疹性口腔炎病毒僅通過50個(gè)感染性病毒顆粒(或斑形成單位，pfu)鼻內(nèi)感染就可以殺滅100％的PKR缺失動(dòng)物。相對(duì)地，殺滅半數(shù)被感染的正常同窩出生動(dòng)物要求超過20,000倍的VSV顆粒。這些結(jié)果提示PKR缺失動(dòng)物可以抑制許多病毒包括牛痘病毒、流感病毒和EMCV的感染。然而VSV表現(xiàn)出感染PKR-/-動(dòng)物的能力。這些結(jié)果也提示哺乳動(dòng)物細(xì)胞抵抗VSV感染(Indiana實(shí)驗(yàn)室株)需要PKR。
實(shí)施例2用VSV選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)在渥太華地區(qū)癌癥中心隨機(jī)選擇一些腫瘤細(xì)胞系并檢驗(yàn)它們對(duì)VSV感染的易感性。用健康成人志愿者的原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物或健康供者的原代骨髓樣品作為對(duì)照細(xì)胞。
用VSV感染腫瘤細(xì)胞作為VSV溶瘤特性的第一步檢驗(yàn)，評(píng)估了用VSV過夜孵育后病毒的產(chǎn)量和細(xì)胞致病作用。用感染復(fù)數(shù)(moi)為0.1噬斑形成單位(pfu)的Indiana株VSV孵育單層細(xì)胞。允許病毒在37度下吸附30分鐘后，用磷酸緩沖液(PBS)徹底沖洗培養(yǎng)物并在37度下另外培養(yǎng)18小時(shí)。此時(shí)，在顯微鏡下檢查細(xì)胞致病作用(cpe)并拍照。去掉18小時(shí)的上清液并測(cè)定每毫升培養(yǎng)基中的病毒滴度。在一些實(shí)驗(yàn)中，在感染前用人α干擾素(100單位/ml)將培養(yǎng)物預(yù)孵育12小時(shí)。
為檢驗(yàn)分類細(xì)胞類型的感染動(dòng)力學(xué)，使用了改進(jìn)的cpe測(cè)定(Heise，C.，et al.，Nat Med，1997.3639-645)。基本上，在12孔滴定板上以0.1pfu的moi感染單層細(xì)胞。在0時(shí)間和48小時(shí)內(nèi)的每12小時(shí)將一個(gè)加樣孔的感染細(xì)胞用0.5ml leukostat固定液(Fisher Diagnostics)固定2分鐘。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)按照生產(chǎn)商的說明用Leukostat染色液1和2染色單層細(xì)胞。由于PKR是一種干擾素可誘導(dǎo)基因產(chǎn)物，檢驗(yàn)在感染前12小時(shí)用100單位/ml人α干擾素進(jìn)行的干擾素預(yù)處理，判斷在分類細(xì)胞培養(yǎng)物中干擾素是否可以增強(qiáng)保護(hù)。數(shù)據(jù)見表1和圖2-3。
表1檢驗(yàn)VSV敏感性的細(xì)胞系
1 由前臂活檢得到的ORCC建立。
從表1中的數(shù)據(jù)可以看出，盡管正常人成纖維細(xì)胞可以支持病毒復(fù)制，與腫瘤細(xì)胞相比，產(chǎn)生的病毒量和到細(xì)胞溶解的進(jìn)展被充分延遲。用干擾素預(yù)處理后甚至觀察到病毒產(chǎn)量的更大差異。盡管干擾素完全防止正常人成纖維細(xì)胞單層受VSV溶解細(xì)胞影響，腫瘤細(xì)胞保持敏感，產(chǎn)生大量病毒顆粒和迅速進(jìn)行溶胞。
發(fā)現(xiàn)其它細(xì)胞系，包括肺癌細(xì)胞系(LC 80)和白血病細(xì)胞系、AML5(急性髓細(xì)胞白血病5)細(xì)胞也可以被VSV有效殺滅。對(duì)于AML5，在1.0pfu/ml的moi下，在24小時(shí)內(nèi)細(xì)胞被完全殺滅，而0.0001pfu/ml在72小時(shí)內(nèi)細(xì)胞被殺滅，進(jìn)一步提示了白血病細(xì)胞對(duì)VSV的敏感性。
如圖2中所見，VSV感染對(duì)單層腫瘤細(xì)胞的破壞比對(duì)正常人成纖維細(xì)胞的破壞要迅速得多。人黑色素瘤細(xì)胞系SK-MEL3，LNCaP前列腺癌細(xì)胞系和卵巢癌細(xì)胞A2780早至感染后12小時(shí)都表現(xiàn)出大量cpe。盡管正常人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物被感染并且能夠產(chǎn)生病毒(見表1)，感染動(dòng)力學(xué)比在實(shí)驗(yàn)所檢驗(yàn)的三個(gè)腫瘤細(xì)胞系中要緩慢得多。另外，對(duì)于過夜的病毒生長測(cè)定(見表1，圖2)，α干擾素處理完全保護(hù)了正常人成纖維細(xì)胞，但對(duì)保護(hù)三種腫瘤細(xì)胞系不受VSV細(xì)胞致病作用影響無效。
從表1得到的結(jié)果證明，可以采用用于判斷易被VSV殺滅的腫瘤類型的篩選策略，使用例如，但不限于可以從ATCC獲得的腫瘤細(xì)胞系NIH/NCI標(biāo)準(zhǔn)版。這些細(xì)胞系的篩選是為了用各種初始感染復(fù)數(shù)判斷完成cpe和/或病毒生長的時(shí)間。這些實(shí)驗(yàn)是在干擾素存在和不存在的條件下完成的，從而判斷了VSV敏感及抗干擾素的抗病毒活性的腫瘤的數(shù)目和類型。
白血病的VSV治療VSV并不成功地感染骨髓干細(xì)胞，甚至在10pfu/細(xì)胞的高moi時(shí)也是如此(H-1078；表1)。被處理的培養(yǎng)物保持它們所有的干細(xì)胞特征。在過夜感染后兩種白血病細(xì)胞系(M07E和L1210；表1)被殺滅并產(chǎn)生大量病毒。
為判斷VSV是否可以殺滅癌癥患者的原代白血病細(xì)胞，從AML患者得到外周血樣，收集白細(xì)胞并將其平鋪在加入了10％FBS的RPMI培養(yǎng)基中(在6孔滴定板中107/加樣孔，每種感染雙份)。將細(xì)胞偽感染或以10.0/細(xì)胞的moi感染。VSV選擇性殺滅髓細(xì)胞白血病細(xì)胞，由母細(xì)胞(白血病母細(xì)胞)百分比的減少而提示，而細(xì)胞總數(shù)最低限度受影響(即中性粒細(xì)胞活躍)。白血病樣品在感染后16小時(shí)產(chǎn)生超過107pfu/ml的VSV滴度。樣品中的母細(xì)胞數(shù)目在感染后21小時(shí)后劇減，而正常中性粒細(xì)胞的比例增加。偽感染細(xì)胞(-VSV)在單層中幾乎含70％的母細(xì)胞，而在感染VSV(+VSV)的細(xì)胞中正常細(xì)胞占絕大多數(shù)。這些結(jié)果證明VSV可以優(yōu)選殺滅原代白血病母細(xì)胞而保留正常血細(xì)胞。
實(shí)施例3在混合培養(yǎng)物中殺滅腫瘤細(xì)胞以50∶50的混合共同培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞和293T腫瘤細(xì)胞。由于293T細(xì)胞表達(dá)不存在于正常細(xì)胞中的大分子T抗原，兩種細(xì)胞類型可以通過免疫熒光區(qū)分。
在此實(shí)驗(yàn)中以0.1pfu/細(xì)胞的moi感染培養(yǎng)物并且在干擾素存在或不存在時(shí)允許進(jìn)行感染。在0，18和24小時(shí)(圖4)固定培養(yǎng)物并用大分子T抗原(紅色核)的抗體染色檢測(cè)293T細(xì)胞，用DAPI(藍(lán)色核)染色所有細(xì)胞類型。起初兩種細(xì)胞類型都表現(xiàn)出紡錘形的形態(tài)和大的卵圓形核。18小時(shí)后293T細(xì)胞(紅色核)數(shù)目減少，許多剩余的293T細(xì)胞表現(xiàn)出核形態(tài)改變。在感染后24小時(shí)，檢測(cè)到極少數(shù)的293T細(xì)胞，保留的少數(shù)293T細(xì)胞表現(xiàn)出由病毒誘導(dǎo)凋亡而死亡的細(xì)胞的濃縮或碎片核的特征。
在干擾素存在或不存在時(shí)都觀察到了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性破壞。盡管293T細(xì)胞在共同培養(yǎng)物中產(chǎn)生大量病毒，正常成纖維細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)于VSV的核改變，數(shù)目也不減少。
實(shí)施例4作為溶瘤劑的VSV突變體根據(jù)VSV突變體在單層干擾素應(yīng)答細(xì)胞中形成與在單層干擾素不應(yīng)答細(xì)胞中形成斑的大小相比為小斑的能力分離VSV突變體。選擇在干擾素應(yīng)答細(xì)胞中形成小斑的病毒分離物，擴(kuò)增并再克隆。擴(kuò)增以這種方式分離的突變體并檢驗(yàn)它們殺傷腫瘤和正常細(xì)胞的能力。這里的基本原理是，可以誘導(dǎo)靶細(xì)胞中干擾素的VSV突變體可以在干擾素應(yīng)答細(xì)胞群中限制它們自身的復(fù)制。然而這些相同的病毒將在缺乏干擾素應(yīng)答的腫瘤細(xì)胞中具有無限制的生長。這些突變體將是有價(jià)值的，因?yàn)樗鼈儜?yīng)該對(duì)正常組織具有更少的細(xì)胞致病作用而保持溶瘤活性。
根據(jù)在單層干擾素應(yīng)答細(xì)胞中形成小斑的能力獲得4種突變體(Mut 1-4)。這些突變體最初由Lauren Poliquin博士(魁北克大學(xué)蒙特利爾分校)識(shí)別并提供。在5輪斑純化后，將這些突變體和野生病毒(moi為1.0pfu/細(xì)胞)用于感染黑色素瘤細(xì)胞和正常人包皮成纖維細(xì)胞，在感染后12和24小時(shí)判斷釋放病毒的滴度。
所有突變體都可以有效殺滅腫瘤細(xì)胞，但感染突變體的正常細(xì)胞甚至在長時(shí)間點(diǎn)后仍表現(xiàn)出完全未受感染。在同樣的moi下，野生型VSV表現(xiàn)了對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞致病作用。也觀察到所有突變體在過夜感染黑色素瘤細(xì)胞后產(chǎn)生比野生型VSV多大約10倍的病毒。在正常細(xì)胞中，盡管突變體1-4比野生型VSV有顯著更低的細(xì)胞致病作用，被感染的培養(yǎng)物產(chǎn)生了相似量的病毒。這些結(jié)果提示突變病毒具有更強(qiáng)的治療作用，這在于它們有效殺滅腫瘤細(xì)胞而保留正常細(xì)胞，它們也具有產(chǎn)生更多病毒顆粒及增加腫瘤中病毒傳播的能力。
實(shí)施例5感染具有人腫瘤異種移植物的裸鼠將人黑色素瘤細(xì)胞移植到裸鼠中并分組。一組接受偽注射(VSV(-))，另一組接受野生型VSV注射或?qū)⒆⑸淝?小時(shí)用VSV體外感染的另外的黑色素瘤細(xì)胞注射到腫瘤位點(diǎn)，以便運(yùn)送在幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間段中連續(xù)產(chǎn)生感染性顆粒到腫瘤的細(xì)胞(VSV(+))。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖5，它表示在接受治療和偽注射的動(dòng)物中腫瘤面積的平均值和時(shí)間。
在偽注射動(dòng)物中(VSV(-)；僅用載體注射)，腫瘤在實(shí)驗(yàn)過程中連續(xù)生長。僅接受純病毒的動(dòng)物起初表現(xiàn)為腫瘤的連續(xù)生長，而在感染后4天腫瘤開始縮小并在實(shí)驗(yàn)過程中連續(xù)縮小。接受感染細(xì)胞注射的腫瘤表現(xiàn)最劇烈的消退?；旧?，大多數(shù)腫瘤停止生長并消退為類似于瘢痕組織的小硬結(jié)。
在一些更大的接受注射的腫瘤中，1-2天內(nèi)在腫瘤上形成潰瘍，(見圖6)，然后曾經(jīng)迅速生長的惡性腫瘤連續(xù)縮小。盡管注射純化病毒和感染的黑色素瘤細(xì)胞都導(dǎo)致顯著消退，感染的產(chǎn)生細(xì)胞更有效。
實(shí)施例6產(chǎn)生VSV的細(xì)胞系的選擇影響病毒對(duì)血漿的敏感性早期實(shí)驗(yàn)提示PKR-/-小鼠被VSV通過一些感染途徑殺滅，然而，這些小鼠不受靜脈注射病毒的影響。盡管沒有理論依據(jù)，這可能是因?yàn)镻KR-/-血管內(nèi)皮細(xì)胞提供組織感染的屏障或因?yàn)樵诮佑|時(shí)血漿成分滅活病毒。為檢驗(yàn)后面的概念，將由一些來源，包括小鼠L細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的VSV用人血清(從正常未感染供體得到)孵育并判斷孵育后的病毒滴度。
在人血清中孵育VSV后，L細(xì)胞產(chǎn)生的VSV的病毒滴度降低了400倍。而另一方面，在人黑色素瘤細(xì)胞中產(chǎn)生的VSV不受在血漿中孵育的影響。
這些結(jié)果提示為產(chǎn)生VSV而選擇細(xì)胞系是關(guān)鍵的。根據(jù)此觀察，篩選人細(xì)胞系得到產(chǎn)生最優(yōu)量對(duì)人血清不敏感的病毒的細(xì)胞系是可能的。
實(shí)施例7VSV濃縮和純化的策略VSV生產(chǎn)的常規(guī)技術(shù)包括離心步驟和梯度純化—這兩種方法都很難達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的規(guī)模。所以，研究了純化VSV的其它方案，例如，進(jìn)行病毒顆粒的同步濃縮和純化的親和柱。
為給病毒提供用于純化病毒的親和標(biāo)記，可以使用內(nèi)源性蛋白或?qū)⒉《炯庸樵诒砻姹磉_(dá)一種或更多親和標(biāo)記，或可以將生產(chǎn)細(xì)胞系加工為在它們的漿膜上表達(dá)一種或更多可以在病毒通過膜出芽時(shí)獲得的親和標(biāo)記?？梢杂糜H和層析純化獨(dú)特的病毒被膜蛋白。
這種親和標(biāo)記的一種可以涉及使用與固定鎳柱結(jié)合的組氨酸殘基，然而，應(yīng)該理解，也可以使用其它親和標(biāo)記。用噬菌體M13檢驗(yàn)了這種方法。使用噬菌體肽顯示系統(tǒng)(Koivunen，E.，et al.，J.NucIMed，1999.40883-888)，選擇了與鎳柱結(jié)合，但可以用咪唑洗脫的表達(dá)含組氨酸的肽的病毒顆粒，包括CTTHRHHTSNC(SEQ ID NO1)；CLNAHRTTHHHC(SEQ ID NO2)；CHGLHSNMRHC(SEQ ID NO3)；CHHHHRLNC(SEQ ID NO4)；CHSHHHRGC(SEQ ID NO5)；CWDHHNHHC(SEQ ID NO6)；CDNNHHHHC(SEQ ID NO7)；CHHHRISSHC(SEQ ID NO8)。這些肽在M13噬菌體表面的表達(dá)導(dǎo)致這些病毒在鎳樹脂上的純化濃縮，以及用低濃度咪唑的洗脫。
一個(gè)或更多的這些序列可以被整合到VSV G蛋白而導(dǎo)致鎳殘基上攜帶這些肽的病毒顆粒濃度增加。被洗脫的病毒預(yù)計(jì)將保持它的感染性。
以這種方式生產(chǎn)了可以是VSV或其它表達(dá)具有鎳結(jié)合特性的嵌合VSV蛋白的病毒的通用生產(chǎn)者的細(xì)胞系。這種通用生產(chǎn)者細(xì)胞可以用于為任何有被膜病毒(包括所有有被膜的RNA和DNA病毒)生產(chǎn)這種嵌合蛋白(親和標(biāo)記)。為純化通過核膜出芽的病毒(如皰疹病毒)，制造了在核膜表達(dá)病毒被膜蛋白上表達(dá)的標(biāo)記。
其它親和標(biāo)記包括抗體，優(yōu)選在低鹽、低溫或關(guān)鍵陽離子/陰離子存在條件下識(shí)別特定肽的抗體。生理鹽濃度、熱洗脫或螯合可以影響洗脫。產(chǎn)生的抗二肽或三肽的抗體也可以用于純化。以這種方式，單個(gè)病毒顆粒表面的兩種或更多標(biāo)記將允許病毒的連續(xù)親和純化。
實(shí)施例8用VSV治療慢性感染一些人類疾病是由于慢性病毒感染而產(chǎn)生的，包括潛伏皰疹感染、肝炎、AIDS和宮頸癌。在每種情況下，致病病毒介質(zhì)發(fā)展了滅活干擾素應(yīng)答途徑中的成分的機(jī)制，這些成分包括PKR(如Chelbi-Alix，M.K.and H.De，The Oncogene，1999.18935-941；Gale，M.J.，Jr.，et al.，Virology，1997.230217-227；Gale，M.J.，et al.，Clin Diagn Virol，1998.10157-162；Gale，M.，Jr.andM.G.Katze，Methods，1997.11383-401；Barnard，P.and N.A.McMilIan，Virology，1999.259305-313)。所以，給予有這些疾病的個(gè)體VSV，或誘導(dǎo)VSV突變體的干擾素，或其結(jié)合，選擇性消除慢性感染的細(xì)胞。進(jìn)一步的治療效果可以由通過細(xì)胞和病毒受體僅僅定向于慢性感染細(xì)胞而發(fā)現(xiàn)。
實(shí)施例9VSV的基因修飾為VSV建立了反向基因系統(tǒng)(Roberts A.and J.K.Rose，Virology，1998.2471-6)，使它可以改變病毒的基因特征。
體內(nèi)將VSV定向于需要位點(diǎn)盡管曾在細(xì)胞內(nèi)部的復(fù)制可以受到限制(即通過包括PKR的干擾素應(yīng)答基因產(chǎn)物)，目前VSV可以與大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型結(jié)合。所以可以實(shí)際找到靶細(xì)胞(即腫瘤細(xì)胞)而產(chǎn)生感染的病毒的有效劑量可以僅通過其它正常組織提供的“sink”而受到很大程度的限制。所以，VSV可以被基因修飾而僅僅結(jié)合并感染腫瘤細(xì)胞。
用本領(lǐng)域中熟知的重組DNA技術(shù)(如Sanibrook et al.，1989，A Laboratory Manual.New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress)修飾VSV G蛋白。將對(duì)腫瘤抗原特異性的單鏈Fv片段(Lorimer，I.A.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1996.9314815-20)與VSV G蛋白融合。這種單鏈Fv片段的一個(gè)例子是定向于存在于約80％的人乳腺腫瘤細(xì)胞中突變EGF受體的單鏈Fv片段。
VSV內(nèi)自殺基因的表達(dá)修飾VSV基因組使其包含皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因或胞嘧啶脫氨酶基因。這些基因編碼可以將前體藥物轉(zhuǎn)化為毒性化合物的酶(如更昔洛韋或5-FC)。以這種方式修飾的病毒表達(dá)這些自殺基因，因此允許通過給予前體藥物殺滅被VSV感染的細(xì)胞。這提供了兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)?1)已經(jīng)確定更昔洛韋代謝物不僅殺滅表達(dá)HSV TK的細(xì)胞，也可以殺滅在緊鄰處的細(xì)胞。這種“旁觀者(by-stander)效應(yīng)”可以增加病毒的有效殺滅(即一個(gè)感染細(xì)胞可以導(dǎo)致10個(gè)或更多周圍腫瘤細(xì)胞的殺滅)；及(2)如果需要從感染病毒的個(gè)體中去除病毒，使VSV具有自殺基因可以允許去除病毒。
體內(nèi)控制VSV生長將哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物引入VSV而限制正常細(xì)胞中的VSV生長，但此基因產(chǎn)物不影響腫瘤或患病細(xì)胞中的VSV生長。
重組VSVs(rVSV)包含一種或更多p53的反式激活因子，激活正常細(xì)胞而不是腫瘤細(xì)胞中的凋亡途徑。這些rVSVs限制正常組織中的病毒傳播但允許腫瘤細(xì)胞中的病毒生長。
包含PKR基因的rVSV限制所有正常細(xì)胞中的病毒復(fù)制，然而，在表達(dá)PKR抑制因子的細(xì)胞中，病毒編碼的PKR被滅活。表達(dá)一種或更多PKR抑制因子的細(xì)胞的一個(gè)例子是慢性丙肝感染的細(xì)胞。由于丙肝編碼并表達(dá)兩種已知的PKR抑制因子(即NS5A和E2)，編碼PKR基因產(chǎn)物的VSV被中和，允許VSV自由復(fù)制。
實(shí)施例10隨致癌轉(zhuǎn)化逐漸喪失干擾素應(yīng)答用WT Indiana VSV在0.1pfu/細(xì)胞的MOI下感染用100單位α干擾素預(yù)處理或未處理的處于各種轉(zhuǎn)化階段的鼠成纖維細(xì)胞。在感染后18小時(shí)通過標(biāo)準(zhǔn)斑測(cè)定測(cè)量病毒產(chǎn)量。MEF從Balb/C小鼠胚胎分離的小鼠成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)物。NIH 3T3細(xì)胞永生的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。PVSrc用病毒src基因轉(zhuǎn)化的NIH 3T3細(xì)胞。MOP8用多瘤病毒大分子T抗原轉(zhuǎn)化的NIH 3T3細(xì)胞。結(jié)果見表2。
在此實(shí)施例中，干擾素應(yīng)答的喪失與VSV感染的易感性和惡性表型的進(jìn)展相關(guān)。MEF細(xì)胞為致死的(即在培養(yǎng)物中具有有限的生命周期)和完全干擾素應(yīng)答的。NIH 3T3細(xì)胞盡管不是致癌的卻是永生的，對(duì)干擾素的應(yīng)答比MEFs低一萬倍左右。PVSrc和MOP 8細(xì)胞是完全致癌的，支持強(qiáng)大的VSV復(fù)制并最低程度受干擾素處理的保護(hù)。
表2細(xì)胞系 病毒滴度(pfu/ml)未處理的IFN-αMEF(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)4×106＜10NIH3T3 8×1071×104PVSrc 3×1092×107MOP 8 1×1085×106
實(shí)施例11過夜感染各種未經(jīng)IFN處理或經(jīng)IFN處理的細(xì)胞系的病毒產(chǎn)生以MOI為0.1pfu/ml的野生Indiana VSV感染各種未經(jīng)IFN-α處理或經(jīng)100單位IFN-α預(yù)處理的正常和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系并在37℃下孵育18小時(shí)。滴定每種樣品的培養(yǎng)基測(cè)定VSV產(chǎn)量。結(jié)果見表3。
此樣品表明病毒產(chǎn)生效率在一些腫瘤細(xì)胞類型中比正常原代組織中高10到10,000倍。在α干擾素存在下，正常原代細(xì)胞中的病毒產(chǎn)生基本完全被阻斷，而在腫瘤細(xì)胞中，干擾素對(duì)VSV復(fù)制作用很小或沒有作用。
表3細(xì)胞系 病毒滴度 (pfu/ml)未處理IFN-αOSF7(原代正常人成纖維細(xì)胞) 1×106＜10OSF12(原代正常人成纖維細(xì)胞)2×105＜10OSF16(原代正常人成纖維細(xì)胞)1×105＜10PrEC(原代正常人卵巢表面上皮) 8×106＜10HOSE(原代正常人卵巢表面上皮) 1×107＜1000A2780(人卵巢癌)2×1081×107OVCA 420(人卵巢癌) 1×1083×106C13(人卵巢癌) 1×1081×105LC80(人肺癌) 2×1096×107SK-MEL3(人黑色素瘤)1×1091×109LNCAP(人前列腺癌) 4×1095×109HCT116(人結(jié)腸癌) 1×1092×109293T(用T抗原和Ad病毒E1A轉(zhuǎn)化的HEK細(xì)胞) 1×1088×107實(shí)施例12鼻內(nèi)運(yùn)送到PKR+/-(129×Balb/c)小鼠的野生和突變VSV的LD50麻醉8-10周齡的雌性小鼠并將50μl磷酸緩沖液(PBS)稀釋的病毒加入每只動(dòng)物的鼻孔進(jìn)行鼻內(nèi)感染(PKR+/-129×Balb/c株)。用Korler-Spearman法計(jì)算半數(shù)致死量。結(jié)果見表4。
此實(shí)施例證明，特別是突變體I，II和III與野生型病毒Indiana株相比在129×Balb/c小鼠中的毒性減弱。
表4病毒 鼻內(nèi)LD50(pfu)WT Indiana1×108突變體I 1×1010突變體II ＜1×1010突變體III 3×108突變體IV ＜1×105實(shí)施例13與各種PKR+/+小鼠株相比PKR-/-小鼠對(duì)VSV精確敏感以各種劑量鼻內(nèi)感染PKR-/-和PKR+/+小鼠，隨時(shí)間監(jiān)測(cè)它們的存活。所有PKR-/-小鼠取決于劑量在2到5天之間死亡，而對(duì)照組小鼠在超過此時(shí)間點(diǎn)仍保持存活。結(jié)果見表5。
此實(shí)施例證明PKR基因產(chǎn)物在小鼠對(duì)VSV感染的抵抗力中的重要性。
表5基因背景劑量(pfu)在第5天的存活PKR+/+Balb/c 5×1045/5CD-15×1045/5Balb/c×129 5×1045/5PKR-/-Balb/c×129 5×1040/55×1030/45×1020/35×1010/3實(shí)施例14VSV感染后的凋亡導(dǎo)致AML3細(xì)胞死亡以MOI為3.0pfu/細(xì)胞的VSV感染OCI/AML3(急性髓細(xì)胞白血病)細(xì)胞。在感染后14和20小時(shí)分析未固定樣品。用使用膜聯(lián)蛋白-V-生物素-X/中性親和素-PE紅色熒光蛋白(分子探針)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)有磷脂酰絲氨酸膜易位的凋亡細(xì)胞。用使用JC-1電勢(shì)敏感染料(分子探針)的流式細(xì)胞儀分析早期凋亡細(xì)胞中的線粒體膜去極化。通過極化線粒體的熒光發(fā)射從綠色改變到紅色光譜而聚集JC-1。用乙錠(EthD-1)同二聚體-1紅色熒光活體染料(分子探針)識(shí)別非存活A(yù)ML3細(xì)胞。按照生產(chǎn)商的詳細(xì)說明進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表6。
此實(shí)施例證明VSV至少部分通過病毒誘導(dǎo)的凋亡途徑殺滅AML細(xì)胞表6
實(shí)施例15突變VSV株感染并殺滅AML細(xì)胞以1.0的MOI感染OCI/AML3(急性髓細(xì)胞白血病)細(xì)胞并孵育23小時(shí)。按生產(chǎn)商的說明用EthD-1(乙錠二聚體，分子探針)染色未固定細(xì)胞從而檢測(cè)非存活細(xì)胞。用每10,000個(gè)計(jì)數(shù)的被染色細(xì)胞數(shù)計(jì)算死亡率。結(jié)果見表7。
此實(shí)施例證明使用的突變VSV株與野生Indiana株對(duì)殺滅AML細(xì)胞同樣有效。
表7
實(shí)施例16VSV和VSV感染細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)裸鼠中人黑色素瘤異種移植物的抗腫瘤活性在8-10周齡的雌性Balb/c無胸腺小鼠中培養(yǎng)源于SK-MEL3(黑色素瘤)的腫瘤。在第0天，不處理腫瘤或在培養(yǎng)基中用108pfu的野生Indiana VSV或2.5×106的野生Indiana VSV感染的SK-MEL 3細(xì)胞(產(chǎn)生VSV的細(xì)胞)感染腫瘤。在每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，計(jì)算處理和未處理組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，置信值如下(bp＜0.01；cp＜0.001；dp＝0.007)。結(jié)果見圖7。在第3天，只有用產(chǎn)生VSV的細(xì)胞處理的腫瘤比未處理的腫瘤顯著更小(ap＜0.001)。從第0天到第2天，組間的腫瘤體積沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示多種腫瘤的平均值+/-SEM(未處理組n＝8；產(chǎn)生VSV的細(xì)胞n＝8；單獨(dú)VSV組n＝4)。
此實(shí)施例證明單次將VSV直接注射到實(shí)體腫瘤很大程度影響腫瘤生產(chǎn)，部分導(dǎo)致完全消退。將被感染腫瘤細(xì)胞用作運(yùn)送病毒的載體也是有效的。
實(shí)施例17PKR-/-小鼠對(duì)鼻內(nèi)VSV感染非常敏感并顯示IFN介導(dǎo)的抵抗力的缺陷用5×104pfu的VSV鼻內(nèi)感染(A & B)PKR-/-和對(duì)照小鼠(Balb/c×129)并在14天的階段中監(jiān)測(cè)死亡和存活，認(rèn)為14天后保留的動(dòng)物從感染中存活。結(jié)果見圖8A和8B。PKR-/-小鼠與對(duì)照小鼠(WT)相比表現(xiàn)出存活嚴(yán)重減少，在第3或第4天內(nèi)死亡，而所有對(duì)照小鼠從感染中存活。用2×104IU(圖8A)或2×105IU(圖8B)的IFN-α/β預(yù)處理(感染前18小時(shí))對(duì)PKR-/-動(dòng)物無保護(hù)作用。
此實(shí)施例證明干擾素途徑的單個(gè)缺陷(缺乏PKR基因產(chǎn)物)足以使小鼠不能抗VSV感染。這種缺陷不能被干擾素挽救。
實(shí)施例18干擾素可以在VSV治療中保護(hù)攜帶異種移植的小鼠將SK-MEL 3黑色素瘤細(xì)胞皮內(nèi)注射到CD-1無胸腺裸鼠。在第0天，將活野生Indiana VSV(1×109pfu)或等量UV滅活的VSV注射到腫瘤并每日測(cè)量。結(jié)果見圖9。在提示的時(shí)間(黑箭頭)將干擾素給予動(dòng)物亞組(VSV IFN)。(UV-VSV n＝4；VSV IFN n＝6；VSV n＝6)。在這些實(shí)驗(yàn)中，單次腫瘤內(nèi)注射VSV在所用情況下都是腫瘤抑制性的。所有腫瘤至少部分消退而且在12只被治療的小鼠中有3只的腫瘤完全消退。接受UV滅活病毒的腫瘤繼續(xù)不減弱地生長，直到在第11天處死這些動(dòng)物。不接受干擾素并接受活病毒注射的裸鼠在第10天開始死亡并且到第15天6只中僅有兩只存活。相反地，所有干擾素處理過的感染裸鼠被保護(hù)不受VSV毒性影響并在45天以上保持無癥狀。
此實(shí)施例證明單次腫瘤內(nèi)注射活VSV對(duì)抗腫瘤是有效的。另外干擾素注射可以挽救感染的、攜帶腫瘤的裸鼠，使其不受VSV毒性影響。
實(shí)施例19VSV感染并殺滅白血病和骨髓瘤細(xì)胞用VSV Indiana HR株以每個(gè)細(xì)胞1個(gè)噬斑形式單位的感染復(fù)數(shù)感染提到的細(xì)胞系。在感染后(p.i.)24、48和72小時(shí)將樣品從被感染的培養(yǎng)物中取出并按照生產(chǎn)商的說明直接用碘化丙錠(分子探針)染色。然后用使用FACSsort WinMDI 2.7版程序的流式細(xì)胞儀分析樣品。表8表示在所提到的感染后時(shí)間的每種白血病細(xì)胞類型的細(xì)胞死亡率。
此實(shí)施例表明VSV可以感染并殺滅多種白血病類型。從慢性髓細(xì)胞白血病(CML)患者分離K-562細(xì)胞，而MOLT-4為T細(xì)胞白血病，SR和H929為骨髓瘤。
表8
實(shí)施例20包括野生型Indiana和5種減毒VSV突變體的皰疹性口腔炎病毒(VSV)株顯示與正常人成纖維細(xì)胞相比對(duì)人前列腺癌細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒從魁北克大學(xué)蒙特利爾分校的Lauren Poliquin博士處得到包括野生型Indiana和減毒突變株I(TR1026)，II(TR1026R)，I11(TP3)，IV(TP6)和V(G31)的皰疹性口腔炎病毒株。在用于本實(shí)驗(yàn)前，將這些病毒株的每一種進(jìn)行5次噬斑純化。
使人前列腺癌細(xì)胞(LNCAP)和正常人細(xì)胞(OSF 7前臂成纖維細(xì)胞)在96孔組織培養(yǎng)板上生長到密度為每個(gè)加樣孔約5×104個(gè)細(xì)胞。將從5×105pfu到5pfu的病毒加入10倍稀釋液中。每個(gè)滴定板上包括沒有病毒的對(duì)照加樣孔。在37℃下5％的CO2中孵育滴定板。用檢測(cè)線粒體酶活性的比色MTS((3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-5-[3-羧基甲氧苯基]-2-[4-磺苯基]-2-氫-四唑，內(nèi)鹽)測(cè)定(CellTiter 96 Aqueous，catalog #G 1112，Promega Corporation，Madison WI 53711-5399)對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行定量，在490nm下監(jiān)測(cè)。通過在病毒處理過的加樣孔相對(duì)于未處理的加樣孔中的病毒活力的喪失判斷病毒處理過的加樣孔中的細(xì)胞殺滅量。將數(shù)據(jù)描繪為pfu/細(xì)胞與相對(duì)于對(duì)照組的細(xì)胞殺滅百分比的圖形。將這些細(xì)胞的TC50計(jì)算為以pfu/細(xì)胞表示的導(dǎo)致可存活細(xì)胞量減少50％的病毒量。更低的TC50值反映細(xì)胞對(duì)病毒裂解作用敏感性的增加。每種VSV株的體外治療指數(shù)計(jì)算為OSF7細(xì)胞的TC50與LNCAP細(xì)胞TC50的比值。
結(jié)果見表9。野生型VSV-Indiana和五種突變體的每一種都表現(xiàn)了對(duì)人前列腺癌細(xì)胞的高度細(xì)胞毒性，這是由均低于0.01pfu/細(xì)胞的低TC50所反映的。正常人成纖維細(xì)胞對(duì)所有六種VSV株細(xì)胞毒的抵抗力高1到3個(gè)以上數(shù)量級(jí)。所有5種突變體對(duì)正常OSF7成纖維細(xì)胞的毒性更小并且具有比野生型Indiana VSV更高的體外治療指數(shù)。
表9.VSV株(野生型Indiana和突變體I到V)對(duì)前列腺癌細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒測(cè)定結(jié)果
實(shí)施例21從感染野生型Indiana和各種突變VSV株的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞產(chǎn)生病毒使HCT 116結(jié)腸癌細(xì)胞和OSF 7前臂成纖維細(xì)胞在35mm的組織培養(yǎng)皿中生長至匯合。去除培養(yǎng)基加入體積為30μl，對(duì)HCT 116細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)為0.1pfu/細(xì)胞，對(duì)OSF 7細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)為1.5pfu/細(xì)胞的病毒。在37℃、5％CO2下孵育1小時(shí)后，將1ml組織培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿。結(jié)果見圖10A和B。在指出的時(shí)間點(diǎn)，從培養(yǎng)皿中取出10μl培養(yǎng)基樣品。這些樣品的病毒滴度通過噬斑測(cè)定而判斷。
此實(shí)施例表明了在HCT 116結(jié)腸癌細(xì)胞中野生型和突變VSV株的快速復(fù)制動(dòng)力學(xué)。所有四種突變VSV株在116結(jié)腸癌細(xì)胞中比野生型VSV的生長更迅速。注意在正常OSF-7細(xì)胞培養(yǎng)物中，為獲得相似的復(fù)制動(dòng)力學(xué)要求高10倍的病毒輸入。
實(shí)施例22惡性細(xì)胞在VSV(野生型Indiana)感染后被迅速殺滅并且不受IFN-α保護(hù)不用IFN-α處理或用IFN-α(100單位)預(yù)處理單層正常原代人成纖維細(xì)胞(AG 1522)，然后用VSV以0.1pfu/ml的MOI感染。在12小時(shí)增長后，通過細(xì)胞固定終止感染并染色，從而判斷細(xì)胞殺滅動(dòng)力學(xué)。在實(shí)驗(yàn)過程中使對(duì)照(CNTL)單層繼續(xù)生長，不受感染，因此染色更強(qiáng)。結(jié)果見圖11。LNCAP為人前列腺癌；A2780為人卵巢上皮細(xì)胞癌，Sk MEL3為人黑色素瘤。
此實(shí)施例表明甚至在α干擾素存在下VSV Indiana對(duì)腫瘤細(xì)胞殺滅的快速動(dòng)力學(xué)。盡管正常細(xì)胞也被VSV殺滅，其動(dòng)力學(xué)更緩慢，正常細(xì)胞可以被α干擾素完全保護(hù)。
實(shí)施例23在有或無IFN-α?xí)r人黑色素瘤細(xì)胞中可以見到VSV誘導(dǎo)的細(xì)胞致病作用但在原代人細(xì)胞中不能見到用野生型Indiana VSV以0.1pfu/ml的MOI感染IFN-α(100U/ml)未處理或預(yù)處理過的正常人細(xì)胞和SK-MEL3細(xì)胞的明膠包被的蓋玻片。結(jié)果見圖12。人黑色素瘤細(xì)胞(SK-MEL3)在感染后12小時(shí)甚至在干擾素存在時(shí)也表現(xiàn)出cpe。在感染后24小時(shí)，這些惡性細(xì)胞死亡并將其從蓋玻片取出。人原代細(xì)胞，包括包皮成纖維細(xì)胞(AG1522)，卵巢表面上皮細(xì)胞(HOSE)和前列腺上皮細(xì)胞(PrEC)在沒有干擾素時(shí)直到36小時(shí)還沒有表現(xiàn)出CPE(細(xì)胞致病作用)，并且在干擾素存在時(shí)時(shí)完全保護(hù)作用超過了感染后72小時(shí)。
此實(shí)施例證明即使在α干擾素存在時(shí)VSV Indiana也可以迅速破壞黑色素瘤細(xì)胞，而殺滅正常成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞更慢，它們可以被α干擾素完全保護(hù)。
實(shí)施例24VSV選擇性殺滅與正常成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞將相同數(shù)目的293T細(xì)胞(用腺病毒E1A和大分子T抗原轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞)和正常人包皮成纖維細(xì)胞平鋪在明膠包被的蓋玻片上并且在有或無干擾素時(shí)以0.1的MOI感染(WT Indiana YSV)。在感染后12(未表示)，24和36小時(shí)固定細(xì)胞。用抗TAg抗體和DAPI染色固定細(xì)胞。不管是否有干擾素處理，在感染后早至12小時(shí)紅染的293T細(xì)胞被迅速殺滅，少量剩余細(xì)胞顯示濃縮或成片段的核。在干擾素不存在時(shí)，感染后36小時(shí)正常成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出核改變，但在干擾素存在時(shí)超過此時(shí)間點(diǎn)后被保護(hù)不受病毒侵襲。
此實(shí)施例證明在正常和腫瘤細(xì)胞的混合培養(yǎng)物中，VSV Indiana優(yōu)選復(fù)制并殺滅腫瘤細(xì)胞。被感染共同培養(yǎng)物中的正常細(xì)胞死亡更緩慢并可以完全被干擾素處理挽救。
實(shí)施例25靜脈內(nèi)單劑量突變VSV在治療裸鼠中人黑色素瘤異種移植物的效力在5-6周齡的CD-1無胸腺小鼠中建立SK-Me13人黑色素瘤異種移植物。在第0天，按提示不處理或用5×109pfu的突變VSV靜脈內(nèi)處理腫瘤。結(jié)果見圖13。
此實(shí)施例證明突變體II和III在單次靜脈注射后可以抑制腫瘤生長。因此不需要將病毒給予腫瘤位點(diǎn)而在抑制腫瘤生長中起作用。另外，盡管突變體在正常小鼠組織中生長時(shí)被減毒，它們?nèi)匀豢梢泽w內(nèi)定向于腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例26選擇性殺滅與正常骨髓共同培養(yǎng)的AML細(xì)胞將不依賴于生長因子的細(xì)胞系OCI/AML3以1∶9與正常骨髓混合并且在用野生型Indiana VSV感染24小時(shí)。然后將各種細(xì)胞稀釋液平鋪在有和無生長因子的甲基纖維素中，14天后進(jìn)行集落計(jì)數(shù)。表10表示接受104個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)皿的數(shù)據(jù)。星號(hào)(*)表示在無生長因子培養(yǎng)皿中甚至在每個(gè)培養(yǎng)皿平鋪105個(gè)細(xì)胞時(shí)也沒有檢測(cè)到白血病集落。
此實(shí)施例證明在正常骨髓干細(xì)胞存在時(shí)對(duì)白血病細(xì)胞的迅速和選擇性殺滅。另外，它證明了與多數(shù)其它常規(guī)癌癥治療不同，骨髓不是VSV溶瘤治療的劑量限制目標(biāo)。
表10
實(shí)施例27VSV測(cè)序VSV基因組包含編碼病毒蛋白N，P，M，G和L的基因。判斷從野生型耐熱VSV(HR)和三種突變VSV得到的這些蛋白的開放讀碼框(ORF)的cDNA序列(根據(jù)每種的5次測(cè)序)并與GenBank編號(hào)No.NC001560的序列比較(源于VSV Colorado和San Juan株)。突變體為M2(TR 1026R)，M3(TP3)和M4(TP6)。核酸序列見圖14，16，18，20和22。對(duì)應(yīng)的推斷氨基酸序列分別見圖15，17，19，21和23。它們的差異用突出的字母表示。虛線表示不完整序列。
氨基酸序列間的一些差異見表11，根據(jù)列標(biāo)題使用了符號(hào)(即，對(duì)于列標(biāo)題“GenBank和HR的差異”，符號(hào)K155R表示第155位的氨基酸在GenBank中為K，在HR中為R)。在還沒有HR序列的情況下，只能在GenBank和特定突變體之間進(jìn)行對(duì)比。M3*表示突變體3和HR之間的差異，但在此情況下，此位置的氨基酸與GenBank保藏物匹配(即突變體3和Genbank序列在此位置一致而HR不同)。
此數(shù)據(jù)證明HR株和GenBank保藏物之間的許多序列差異(主要源于San Juan株)。它也證明了突變體和產(chǎn)生這些突變體的HR之間的一些差異。這些基因差異與表型差異相關(guān)。
表11
在此引入所有引用作為參考。
對(duì)本發(fā)明的描述是關(guān)于優(yōu)選實(shí)施方案。然而，對(duì)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)該很明顯的是，可以進(jìn)行許多改變和修飾而不離開這里描述的本發(fā)明的范圍。
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權(quán)利要求
1.一種減低腫瘤細(xì)胞存活力的方法，包含將病毒給予腫瘤細(xì)胞，其中所述病毒不是常見人病原體并且所述腫瘤細(xì)胞為癌、造血腫瘤細(xì)胞、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、肉瘤或神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
2.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤細(xì)胞選自卵巢癌、白血病、肺癌和結(jié)腸癌。
3.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤細(xì)胞為癌。
4.權(quán)利要求3的方法，其中癌為肺癌。
5.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤細(xì)胞為造血癌細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中造血癌細(xì)胞為白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
7.權(quán)利要求6的方法，其中造血癌細(xì)胞為白血病。
8.權(quán)利要求7的方法，其中白血病為急性髓細(xì)胞白血病。
9.權(quán)利要求7的方法，其中白血病為慢性髓細(xì)胞白血病。
10.權(quán)利要求7的方法，其中白血病為早幼粒細(xì)胞白血病。
11.權(quán)利要求7的方法，其中白血病為T細(xì)胞白血病。
12.權(quán)利要求6的方法，其中造血癌細(xì)胞為淋巴瘤。
13.權(quán)利要求6的方法，其中造血癌細(xì)胞為骨髓瘤。
14.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤細(xì)胞為肉瘤。
15.權(quán)利要求14的方法，其中肉瘤為骨肉瘤。
16.權(quán)利要求14的方法，其中肉瘤為纖維肉瘤。
17.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤細(xì)胞為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
18.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤細(xì)胞基本無PKR活性。
19.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤細(xì)胞為PKR-/-；STAT1-/-；或同時(shí)PKR-/-和STAT1-/-。
20.權(quán)利要求1的方法，其中病毒為棒狀病毒或小核糖核酸病毒。
21.權(quán)利要求20的方法，其中病毒為棒狀病毒。
22.權(quán)利要求5的方法，其中棒狀病毒為皰疹性口腔炎病毒。
23.權(quán)利要求22的方法，其中腫瘤細(xì)胞為白血病。
24.權(quán)利要求23的方法，進(jìn)一步包含在給予VSV前將干擾素給予腫瘤細(xì)胞。
25.權(quán)利要求22的方法，其中病毒不能在腫瘤細(xì)胞中滅活PKR活性。
26.權(quán)利要求22的方法，其中病毒為皰疹性口腔炎病毒的減毒株。
27.權(quán)利要求26的方法，其中病毒為皰疹性口腔炎病毒M1株。
28.權(quán)利要求26的方法，其中病毒為皰疹性口腔炎病毒M2株。
29.權(quán)利要求26的方法，其中病毒為皰疹性口腔炎病毒M3株。
30.權(quán)利要求26的方法，其中病毒為皰疹性口腔炎病毒M4株。
31.權(quán)利要求26的方法，其中病毒為皰疹性口腔炎病毒M5株。
32.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤細(xì)胞在哺乳動(dòng)物受試者中并且通過靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)或腫瘤內(nèi)給藥至受試者而將病毒給予腫瘤細(xì)胞。
33.權(quán)利要求32的方法，其中哺乳動(dòng)物受試者為人或非人哺乳動(dòng)物。
34.權(quán)利要求32的方法，其中病毒被包含在病毒感染的細(xì)胞系中，給藥包含通過選自腫瘤內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)的途徑將病毒感染的細(xì)胞系給予受試者。
35.一種在一群腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞中減低病毒存活力的方法，包含將皰疹性口腔炎病毒給予細(xì)胞群，其中病毒能夠選擇性感染并殺滅腫瘤細(xì)胞。
36.權(quán)利要求35的方法，其中病毒不能在腫瘤細(xì)胞中滅活PKR活性。
37.權(quán)利要求36的方法，進(jìn)一步包含在給予病毒前用干擾素處理細(xì)胞群。
38.一種識(shí)別易感于病毒處理的腫瘤的方法，包含(a)將含腫瘤細(xì)胞的樣品分為第一部分和第二部分；(b)用病毒處理第一部分；以及(c)判斷第一部分中的死亡細(xì)胞百分比是否高于第二部分，其中如果第一部分中的死亡細(xì)胞百分比高于第二部分，則腫瘤易感于病毒處理。
39.權(quán)利要求38的方法，其中病毒為棒狀病毒。
40.權(quán)利要求39的方法，其中病毒為皰疹性口腔炎病毒。
41.權(quán)利要求38的方法，其中使用流式細(xì)胞儀判斷死亡細(xì)胞百分比。
42.權(quán)利要求38的方法，其中腫瘤為實(shí)體腫瘤且通過活檢從受試者獲得樣品。
43.權(quán)利要求42的方法，進(jìn)一步包含在步驟(b)之前處理腫瘤樣品以便分離細(xì)胞。
44.權(quán)利要求38的方法，其中腫瘤為白血病，并且通過從血樣中分離白細(xì)胞而獲得樣品，從而獲得含腫瘤細(xì)胞的樣品。
45.一種識(shí)別易感于病毒處理的腫瘤的方法，包含(a)將含腫瘤細(xì)胞的樣品分為第一部分和第二部分；(b)用病毒和一定量的干擾素處理第一部分，干擾素的含量足夠改善病毒存在時(shí)干擾素應(yīng)答細(xì)胞的存活，并在無干擾素存在時(shí)用病毒處理第二部分。(c)判斷第一部分中的死亡細(xì)胞百分比是否高于第二部分，其中如果第一部分中的死亡細(xì)胞百分比高于第二部分，則腫瘤易感于病毒處理。
46.權(quán)利要求45的方法，其中病毒為棒狀病毒。
47.權(quán)利要求46的方法，其中病毒為皰疹性口腔炎病毒。
48.權(quán)利要求45的方法，其中使用流式細(xì)胞儀判斷死亡細(xì)胞百分比。
49.權(quán)利要求45的方法，其中腫瘤為實(shí)體腫瘤且通過活檢從受試者獲得樣品。
50.權(quán)利要求49的方法，進(jìn)一步包含在步驟(b)之前處理腫瘤樣品以便分離細(xì)胞。
51.權(quán)利要求45的方法，其中腫瘤為白血病，并且通過從血樣中分離白細(xì)胞而獲得樣品，從而獲得含腫瘤細(xì)胞的樣品。
52.一種純化皰疹性口腔炎病毒的方法，包含將含病毒的樣品加入親和基質(zhì)從而產(chǎn)生與親和基質(zhì)結(jié)合的病毒；洗滌結(jié)合的病毒；從親和基質(zhì)洗脫結(jié)合的病毒。
53.權(quán)利要求52的方法，其中親和基質(zhì)定位于在VSV被膜上表達(dá)的蛋白。
54.權(quán)利要求53的方法，其中在VSV被膜上表達(dá)的蛋白為嵌合蛋白。
55.權(quán)利要求53的方法，其中嵌合蛋白包含組氨酸標(biāo)記，并且親和基質(zhì)為鎳樹脂。
56.一種在表面表達(dá)非天然蛋白的修飾皰疹性口腔炎病毒。
57.權(quán)利要求56的修飾皰疹性口腔炎病毒，其中非天然蛋白為包含親和標(biāo)記和病毒被膜蛋白的融合蛋白。
58.權(quán)利要求56的修飾病毒，其中非天然蛋白來源于生產(chǎn)細(xì)胞。
59.一種分離核酸分子，具有的序列包含(a)一種編碼包含選自圖15所示HR和M3的VSV株的N蛋白的氨基酸序列的蛋白的序列；或(b)選自圖14所示HR，M2和M3的VSV株的N基因cDNA序列；或(c)與(b)對(duì)應(yīng)的RNA序列；或(d)與(a)，(b)或(c)互補(bǔ)的序列。
60.一種分離核酸分子，具有的序列包含(a)一種編碼包含選自圖17所示HR，M3和M4的VSV株的P蛋白的氨基酸序列的蛋白的序列；或(b)選自圖16所示HR，M3和M4的VSV株的P基因cDNA序列；或(c)與(b)對(duì)應(yīng)的RNA序列；或(d)與(a)，(b)或(c)互補(bǔ)的序列。
61.一種分離核酸分子，具有的序列包含(a)一種編碼包含選自圖19所示HR，M3和M4的VSV株的M蛋白的氨基酸序列的蛋白的序列；或(b)選自圖18所示HR，M3和M4的VSV株的M基因cDNA序列；或(c)與(b)對(duì)應(yīng)的RNA序列；或(d)與(a)，(b)或(c)互補(bǔ)的序列。
62.一種分離核酸分子，具有的序列包含(a)一種編碼包含圖21所示VSV M3株的G蛋白的氨基酸序列的蛋白的序列；或(b)圖20所示VSV M3株的G基因cDNA序列；或(c)與(b)對(duì)應(yīng)的RNA序列；或(d)與(a)，(b)或(c)互補(bǔ)的序列。
63.一種分離核酸分子，具有的序列包含(a)一種編碼包含圖23所示VSV M4株的L蛋白的氨基酸序列的蛋白的序列；或(b)圖16所示VSV M4株的L基因cDNA序列；或(c)與(b)對(duì)應(yīng)的RNA序列；或(d)與(a)，(b)或(c)互補(bǔ)的序列。
64.一種病毒在生產(chǎn)減低腫瘤細(xì)胞存活力的藥物中的用途，該病毒不是常見的人病原體，腫瘤細(xì)胞選自癌、造血腫瘤細(xì)胞、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、肉瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
65.權(quán)利要求64的用途，其中腫瘤細(xì)胞選自卵巢癌、白血病、肺癌和結(jié)腸癌。
66.權(quán)利要求64的用途，其中腫瘤細(xì)胞為癌，例如肺癌。
67.權(quán)利要求64的用途，其中腫瘤細(xì)胞為造血癌細(xì)胞，例如白血病，如急性髓細(xì)胞白血病，慢性髓細(xì)胞白血病，早幼粒細(xì)胞白血病，或T細(xì)胞白血??；淋巴瘤；或骨髓瘤。
68.權(quán)利要求64的用途，其中腫瘤細(xì)胞為肉瘤，如骨肉瘤或纖維肉瘤。
69.權(quán)利要求64的用途，其中腫瘤細(xì)胞為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
70.權(quán)利要求64到69的任意一項(xiàng)的用途，其中腫瘤細(xì)胞基本無PKR活性。
71.權(quán)利要求64到69的任意一項(xiàng)的用途，其中腫瘤細(xì)胞為PKR-/-；STAT1-/-；或同時(shí)PKR-/-和STAT1-/-。
72.權(quán)利要求64到71的任意一項(xiàng)的用途，其中病毒選自棒狀病毒和小核糖核酸病毒。
73.權(quán)利要求72的用途，其中病毒為棒狀病毒。
74.權(quán)利要求73的用途，其中棒狀病毒為皰疹性口腔炎病毒。
75.權(quán)利要求74的用途，其中腫瘤細(xì)胞為白血病，其中在給予VSV前將干擾素給予腫瘤細(xì)胞。
76.權(quán)利要求74或75的用途，其中病毒為皰疹性口腔炎病毒的減毒株，例如M1，M2，M3，M4或M5。
77.權(quán)利要求74到76的任意一項(xiàng)的用途，其中腫瘤細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞組成的一群細(xì)胞中并將病毒給予細(xì)胞群。
78.權(quán)利要求64到77的任意一項(xiàng)的用途，其中腫瘤細(xì)胞在哺乳動(dòng)物受試者中，通過靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)或腫瘤內(nèi)給藥至受試者將病毒給予腫瘤細(xì)胞。
79.權(quán)利要求64到78的任意一項(xiàng)的用途，其中哺乳動(dòng)物受試者為人或非人哺乳動(dòng)物。
80.權(quán)利要求64到79的任意一項(xiàng)的用途，其中病毒被包含在病毒感染的細(xì)胞系中，給藥包含通過選自腫瘤內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)的途徑將病毒感染的細(xì)胞系給予受試者。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種減少腫瘤細(xì)胞存活力的方法，包含給予腫瘤細(xì)胞不是常見人病原體的病毒。病毒優(yōu)選表現(xiàn)出差異易感性，其中正常細(xì)胞不受病毒影響。在干擾素存在時(shí)差異易感性更明顯。腫瘤特征在于具有低水平的或無PKR活性，或者為PKR－/－，STAT1－/－或同時(shí)為PKR－/－和STAT1－/－。病毒選自棒狀病毒和小核糖核酸病毒，優(yōu)選為皰疹性口腔炎病毒(VSV)或其衍生物。
文檔編號(hào)A61P35/02GK1496268SQ00815898
公開日2004年5月12日 申請(qǐng)日期2000年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月17日
發(fā)明者J·C·貝爾, J C 貝爾, N·索寧貝格, 錘, D·F·斯托德爾, 斯托德爾, E·G·布朗, 布朗, H·L·阿特金斯, 阿特金斯, R·M·馬里烏斯, 馬里烏斯, B·D·利克蒂, 利克蒂, S·B·諾勒斯, 諾勒斯 申請(qǐng)人:威爾斯塔生物公司