專利名稱：用于治療代謝性骨疾病的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療代謝性骨疾病的復(fù)合藥物組合物及其制備方法，其中所述的組合物被制成一種含有骨化三醇、阿侖特羅和適量其他添加劑的復(fù)合藥劑。按照本發(fā)明的藥物組合物，可以抑制當(dāng)單獨(dú)給予骨化三醇時(shí)引起的血鈣過多，由于骨化三醇的存在可以補(bǔ)償由阿侖特羅引起的對(duì)骨質(zhì)重建活性的抑制，并且還可以改善藥物的依從性。因此，有效地預(yù)防了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。
相關(guān)領(lǐng)域的說明骨質(zhì)疏松癥是一種全身性代謝性骨疾病，其特征是在不影響骨本身化學(xué)組成的情況下發(fā)生骨質(zhì)量減少和骨中微結(jié)構(gòu)改變，它導(dǎo)致骨折的易感性增加。特別是，已知老年患者更易受骨折的傷害，這通常發(fā)生于甚至是較小的身體震動(dòng)；事實(shí)上，已知在美國兩千五百萬骨質(zhì)疏松癥患者中，每年有將近一百三十萬的患者經(jīng)受骨折的痛苦，此數(shù)量幾乎占美國人口總數(shù)的10％。
骨質(zhì)疏松癥可以分成I型和II型。I型骨質(zhì)疏松癥更頻繁地發(fā)生于絕經(jīng)后的婦女中，并且特點(diǎn)是由于雌激素的缺乏而導(dǎo)致骨吸收顯著增加。由于雌激素缺乏導(dǎo)致的骨吸收增加是非常顯著的?？梢院芙?jīng)常地觀察到I型骨質(zhì)疏松癥的患者丟失骨小梁并由此導(dǎo)致脊柱或腕的頻繁骨折。同時(shí)，II型骨質(zhì)疏松癥通常發(fā)生于老年人或男性，并且以骨質(zhì)重建能力急劇下降而不是骨吸收增加為特點(diǎn)。但是，已知由破骨細(xì)胞所致的骨吸收增加以及鈣吸收下降，是兩種類型的骨質(zhì)疏松癥所共同的。
在臨床領(lǐng)域中治療骨質(zhì)疏松癥所用的治療劑通常被分為兩組；一組能夠促進(jìn)骨質(zhì)重建，而另一組能夠防止骨吸收。能夠促進(jìn)快速骨質(zhì)重建的活性治療劑的實(shí)例包括合成代謝的類固醇、氟化物、維生素D和甲狀旁腺激素。隨著目前骨生成機(jī)理的引入，由于維生素D衍生物在調(diào)節(jié)骨質(zhì)平衡方面的作用，它已經(jīng)成為公眾關(guān)注的對(duì)象。骨化三醇，用1，25-(OH)2-D3表示的活性維生素D3之一，是一種上述的骨質(zhì)重建激活劑，并且還是一種能夠預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的激素，原因是它不僅能夠增加鈣從腸道中的吸收，而且還能夠抑制骨質(zhì)量的下降。但是，骨化三醇還顯示當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)引起血鈣過多。血鈣過多，是一種代謝性疾病，它的特點(diǎn)是血中血漿鈣的濃度為11.0mg/dL或者更高，是最常見的與致死性疾病例如腫瘤緊密相關(guān)的威脅生命的疾病之一。事實(shí)上，骨化三醇通過骨代謝導(dǎo)致血鈣濃度的增加以及非正常的鈣濃度調(diào)節(jié)，因而產(chǎn)生血鈣過多。由于骨化三醇的副作用和維生素D的過量所致的血鈣過多或鈣成癮(長時(shí)間血鈣過多的嚴(yán)重情況)的癥狀，與血鈣過多中所顯示的癥狀非常相似。血鈣過多偶而會(huì)出現(xiàn)例如食欲不振、頭痛、嘔吐、便秘的急性癥狀和包括營養(yǎng)不良、感覺異常、發(fā)熱口渴、多尿癥(hyperurisis)、脫水、倦怠、生長遲緩，尿路感染等的血鈣過多的慢性癥狀。血鈣過多的患者經(jīng)常出現(xiàn)并發(fā)癥，這增加了治療疾病例如骨質(zhì)疏松癥的困難。
在治療骨質(zhì)疏松癥中作為骨吸收抑制劑使用的常規(guī)藥劑包括雌激素、降鈣素、二膦酸鹽和異丙氧黃酮。日本專利公開說明書No.7-330613公開了一種骨質(zhì)重建激活劑，它含有阿侖特羅(一種二膦酸鹽)作為一種活性劑，在二羥基維生素D3的存在下，它可以激活成骨細(xì)胞的鈣化以及骨基質(zhì)的形成。
歐洲專利公開說明書No.88-4628公開了一種用于口服給藥的藥劑，此藥劑用二膦酸鹽作為一種基質(zhì)，并且含有適量的十二烷基硫酸鈉。
美國專利No.125,372公開了含有二膦酸鹽的腸溶片。
但是，上述骨吸收抑制劑還沒有成功地足以提高已經(jīng)患有骨質(zhì)疏松癥患者的骨質(zhì)量，因此，開發(fā)非常有效的骨質(zhì)重建激活劑一直是長期企盼的需要。
一篇近來的意大利報(bào)道公開了一種聯(lián)合給予阿侖特羅和骨化三醇的方法[Clinical Drug Investigation(臨床藥物研究)(1988)3月，15(3)，235-244]。在此報(bào)道中，阿侖特羅和骨化三醇不是作為一種復(fù)合片給藥，只是單獨(dú)給藥。例如，阿侖特羅一天給藥一次，而骨化三醇一天給藥兩次，在每次給藥之間有一定的時(shí)間間隔。而且，阿侖特羅必須在餐前給藥，原因是當(dāng)餐后給藥時(shí)吸收不好，導(dǎo)致藥效顯著下降?？紤]到大多數(shù)骨質(zhì)疏松癥患者是老年人，而且它們中的大多數(shù)還每天服用多種藥物，因此，由于上述藥物具有相當(dāng)復(fù)雜的給藥特點(diǎn)，患者經(jīng)常忘記服用一種或兩種計(jì)劃服用的藥物也是情有可原，所以上述給藥的效果還存在疑問。
阿侖特羅還引起上消化道粘膜的局部刺激，這常常導(dǎo)致食道中為數(shù)不多的副作用，例如食道炎、食道潰瘍、食道糜爛。因此，對(duì)于患者來說，當(dāng)服用一種含有阿侖特羅的藥物時(shí)，必須飲用足夠量的水，以便使他們正服用的藥物可以盡可能快地經(jīng)過食道并使食道刺激保持在最低水平。而且對(duì)于藥物依從性較低的患者，這已經(jīng)成為一種負(fù)擔(dān)。
在1997年1月加拿大溫哥華舉行的“日本和美國青光眼協(xié)會(huì)”會(huì)議中，宣布開發(fā)復(fù)合藥劑的最終目的是提高藥物的依從性。在1998年2月4日在芝加哥舉行的“關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒和機(jī)會(huì)致病菌感染的第5次會(huì)議”中，展示了Combivir(一種含有藥物機(jī)理彼此不同的拉米夫定和齊多夫定的復(fù)合藥劑)具有96％的療效，與當(dāng)拉米夫定和齊多夫定作為一種獨(dú)立的藥物分別單獨(dú)給藥時(shí)所獲得的72％的療效相比，有所提高。并且推測這種治療效果提高的原因是患者對(duì)復(fù)合藥劑藥物依從性的提高。
在關(guān)于制備含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥片治療骨質(zhì)疏松癥方面還沒有進(jìn)行過研究，相反，有許多研究思路集中在阿侖特羅作為一種治療劑治療由維生素D攝入引起的血鈣過多的效果上。因此，非常需要開發(fā)具有先進(jìn)的配制技術(shù)的用于治療骨質(zhì)疏松癥的復(fù)合藥劑，它不僅能將例如血鈣過多(當(dāng)單獨(dú)給予骨化三醇引起)的副作用降至最小，而且還能用小劑量預(yù)防/治療骨質(zhì)疏松癥，并且通過改善相當(dāng)復(fù)雜的給藥途徑和防止食道副作用的發(fā)生，提高了藥物的依從性，此藥物的依從性在常規(guī)的藥物中通常是較低的。
本發(fā)明的總結(jié)本發(fā)明涉及一種用于治療代謝性骨疾病的藥物組合物及其制備方法，特別涉及一種用于治療代謝性疾病的改良的藥物組合物及其制備方法，其中所述的組合物被制成一種復(fù)合藥劑，該藥劑含有(a)骨化三醇，它能夠減少脊柱骨折率和增加骨密度；(b)阿侖特羅，一種骨吸收抑制劑，作為以能夠產(chǎn)生最大治療作用的最佳混合比例混合的活性成分，以及(c)適量的其他添加劑，例如阿侖特羅的吸收增強(qiáng)劑。因此，所得的藥物組合物可以減少由骨化三醇引起的血鈣過多，由于骨化三醇的存在可以補(bǔ)償由阿侖特羅引起的對(duì)骨質(zhì)重建活性的抑制，可以提高通常與由于給藥困難和通常的食道中的副作用伴隨的藥物的依從性。因此，有效地預(yù)防了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。
附圖的簡要說明附

圖1顯示了卵巢摘除術(shù)后給予阿侖特羅和骨化三醇兩個(gè)月后脛骨骨小梁的顯微鏡視像(x40)，阿侖特羅和骨化三醇或者單獨(dú)給藥或者作為兩種成份聯(lián)合給藥。
附圖2的圖顯示了通過使用圖像分析儀觀察到的骨小梁區(qū)域。
附圖3的圖顯示了通過使用Technicon自動(dòng)分析儀觀察到的鈣的濃度。
附圖4的圖顯示了通過使用鈣試劑盒(Youngdong藥物有限公司，韓國)觀察到的尿中鈣/肌酸酐的濃度。
附圖5的圖顯示了通過一個(gè)使用RIA方法的試劑盒觀察到的血清中骨鈣蛋白的濃度。
附圖6的圖顯示了通過使用Technicon自動(dòng)分析儀觀察到的堿性磷酸酶的活性。
附圖7的圖顯示了通過使用Technicon自動(dòng)分析儀觀察到的尿中I型膠原端肽(NTx)的濃度，I型膠原端肽(NTx)被用作骨吸收率的一個(gè)指數(shù)。
對(duì)于附圖1-7來說，A-F代表進(jìn)行如下治療的Sprague-Dawley白色大鼠的實(shí)驗(yàn)組。A沒有治療B單用賦形劑治療C單用骨化三醇(0.1μg/kg)治療D單用阿侖特羅(1.0mg/kg)治療E復(fù)合治療1[骨化三醇(0.1μg/kg)+阿侖特羅(0.5mg/kg)]F復(fù)合治療2[骨化三醇(0.1μg/kg)+阿侖特羅(1.0mg/kg)]G復(fù)合治療3[骨化三醇(0.1μg/kg)+阿侖特羅(2.0mg/kg)]附圖8的圖顯示了觀察兩周的用一種含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑口服治療的Sprague-Dawley白色大鼠的體重變化。
附圖9的圖顯示了觀察兩周的用一種含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑口服治療的Sprague-Dawley白色大鼠的飲食攝入。
對(duì)于附圖8-9來說，1-8代表進(jìn)行如下治療的Sprague-Dawley白色大鼠的實(shí)驗(yàn)組。1骨化三醇(125μg/kg)+阿侖特羅(1250mg/kg)2骨化三醇(100μg/kg)+阿侖特羅(1000mg/kg)3骨化三醇(75μg/kg)+阿侖特羅(700mg/kg)4骨化三醇(50μg/kg)+阿侖特羅(500mg/kg)5骨化三醇(25μg/kg)+阿侖特羅(250mg/kg)6骨化三醇(5μg/kg)+阿侖特羅(50mg/kg)7骨化三醇(1μg/kg)+阿侖特羅(10mg/kg)8骨化三醇(0.2μg/kg)+阿侖特羅(2.0mg/kg)附圖10的顯微鏡視像(H & E x100)顯示了用一種含有100μg/kg骨化三醇和1000mg/kg阿侖特羅的復(fù)合藥劑口服治療的Sprague-Dawley白色大鼠的脾組織發(fā)現(xiàn)物的結(jié)果。
附圖11的圖顯示了觀察7周的用一種含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑口服治療的Sprague-Dawley白色大鼠的體重變化。
附圖12的圖顯示了觀察7周的用一種含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑口服治療的Sprague-Dawley白色大鼠的飲食攝入。
對(duì)于附圖11-12來說，1-4代表進(jìn)行如下治療的試驗(yàn)Sprague-Dawley白色大鼠的組。1骨化三醇(25μg/kg)+阿侖特羅(250mg/kg)2骨化三醇(5μg/kg)+阿侖特羅(50mg/kg)3骨化三醇(1μg/kg)+阿侖特羅(10mg/kg)4骨化三醇(0.2μg/kg)+阿侖特羅(2mg/kg)本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及一種用于治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其特征是含有骨化三醇和阿侖特羅作為兩種活性成分，其中所述的組合物中每1重量份的骨化三醇含有1,000-50,000重量份的阿侖特羅。
本發(fā)明還涉及一種制備上述含有骨化三醇和阿侖特羅作為活性成分的藥物組合物的方法，該方法包括a)一種獲得骨化三醇顆粒的方法；通過向骨化三醇和乙醇的混合物中添加甘露糖醇，然后向上述的混合物中添加乙醇、抗氧化劑和粘合劑，將上述混合物粉碎成14-35目大小并干燥上述的粉碎混合物完成；b)一種獲得阿侖特羅顆粒的方法；
通過混合甘露糖醇、吸收增強(qiáng)劑和阿侖特羅，然后向上述的混合物中添加乙醇和粘合劑，將上述混合物粉碎成14-35目大小并干燥上述的粉碎混合物完成；c)一種制備藥片的方法；通過按1∶1重量份的混合比例混合從步驟a)中獲得的骨化三醇顆粒和從步驟b)中獲得的阿侖特羅顆粒，然后向上述的混合物中添加一種崩解劑和一種潤滑劑并將所得的混合物壓片完成。
通過下列的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)地說明，但是這些實(shí)施例不應(yīng)該被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
本發(fā)明涉及一種含有以最佳的混合比例混合的骨化三醇和阿侖特羅作為兩種活性成分的藥物組合物的制備方法，此藥物組合物中的前一種成分已知在減少脊柱骨折和增加骨密度方面有效，而在加入了吸收增強(qiáng)劑之后，后一種成分在抑制骨吸收方面有效。
下面對(duì)上述兩種活性成分進(jìn)行進(jìn)一步闡述。
首先，骨化三醇，用1，25-(OH)2-D3表示的活性維生素D3衍生物之一，它與鈣在腸道的運(yùn)輸有關(guān)，而且已知它能夠激活腸道內(nèi)的鈣的吸收，而且它能夠減少甲狀旁腺激素的分泌，因此減輕了患有骨質(zhì)疏松癥的絕經(jīng)婦女的骨丟失[Aloia J.F.，Am J Med(美國醫(yī)學(xué)雜志)(1988)，84，401-8]。另外，還已知骨化三醇能夠激活骨鈣蛋白的產(chǎn)生，骨鈣蛋白是一種涉及與成骨細(xì)胞有關(guān)的骨礦化的骨特異性蛋白[Price P.A.，Calcif Tissue Int(1990)4月，46(4)，270-9]。但是，骨化三醇作為一種藥劑，還存在一個(gè)問題，那就是當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)經(jīng)常引起血鈣過多，并因此為了克服這種缺點(diǎn)進(jìn)行了許多這方面的研究。
其次，用4-氨基-羥基亞丁基-1，1-二膦酸鹽表示的阿侖特羅是一種被開發(fā)用作治療質(zhì)疏松癥治療劑的二膦酸鹽，而且已知它能夠通過抑制破骨細(xì)胞的活性預(yù)防骨丟失，并因此有助于提高骨密度。事實(shí)上，臨床研究表明可以增加大約2-3％的骨密度。例如，一個(gè)對(duì)來自16個(gè)不同國家的994名絕經(jīng)后婦女進(jìn)行的臨床研究表明脊柱骨和下肢骨的礦物質(zhì)密度逐漸增加。而且，在用阿侖特羅藥物治療的組中新的脊柱骨折的發(fā)生率，與安慰組相比，下降了大約48％。
一般地，骨的礦物質(zhì)密度與骨密度緊密相關(guān)，因此當(dāng)?shù)V物質(zhì)的密度變高時(shí)，骨折的發(fā)生率急劇下降。當(dāng)阿侖特羅以10mg/日的量持續(xù)給藥3年(10mg/日的阿侖特羅被認(rèn)為具有最好的治療效果[Liberman，N.Engl.J.Med.(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志)(1995)，333，1437-1443]，脊柱骨和下肢骨的礦物質(zhì)密度分別增加8.2％和7.2％，但是在相同的給藥時(shí)間內(nèi)，安慰組中的礦物質(zhì)密度下降了0.7％。但是，阿侖特羅卻顯示出對(duì)正常骨代謝周期的負(fù)面影響，這種負(fù)面影響是通過降低骨質(zhì)重建率導(dǎo)致的。因此，需要一種必需能夠解決這個(gè)問題的復(fù)合藥劑。
由于阿侖特羅能夠預(yù)防血鈣過多，已知血鈣過多是由骨化三醇引起的最嚴(yán)重的副作用，因此，我們假設(shè)聯(lián)合給予阿侖特羅和骨化三醇將能夠解決血鈣過多，并且還可以給予最佳劑量的骨化三醇，由于骨化三醇的安全界限狹窄，其每日劑量一直被限制。而且，阿侖特羅對(duì)骨質(zhì)重建的拮抗活性還將由于骨化三醇的存在而得到補(bǔ)償。
作為一種開發(fā)用于治療絕經(jīng)后婦女的最有效的復(fù)合藥劑的方法，首先，在本發(fā)明中誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物患有骨質(zhì)疏松癥，然后將它們置于給予不同濃度的骨化三醇和阿侖特羅的混合物的大量試驗(yàn)中，這些不同濃度的骨化三醇和阿侖特羅的混合物是由于骨化三醇和阿侖特羅的混合比例不同所產(chǎn)生的，并且其最佳混合比例最后被定在不僅能在不減慢骨質(zhì)重建率的情況下有效地預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，而且還可以將血液中的鈣濃度控制在正常水平的比例。此結(jié)果表明藥劑中兩種成分之間的最佳濃度比例為1重量份的骨化三醇含有1,000-50,000重量份的阿侖特羅。如果上述藥劑中1重量份的骨化三醇所含的阿侖特羅的數(shù)量小于1,000重量份，所得的血漿鈣濃度將會(huì)增加，并且當(dāng)給予此藥劑時(shí)，將會(huì)冒很高的引起血鈣過多的危險(xiǎn)。另一方面，上述藥劑中1重量份的骨化三醇所含的阿侖特羅的數(shù)量大于50,000重量份時(shí)，它將會(huì)對(duì)正常的骨代謝周期產(chǎn)生負(fù)面影響，這種負(fù)面影響是由降低骨質(zhì)重建率所致的。
按照本發(fā)明的藥劑可以制備成不同的劑型，例如裸片、腸溶片、顆粒劑、腸溶顆粒劑、膠囊和腸溶膠囊。而且，每個(gè)劑量單位中建議使用的每種成分的范圍為骨化三醇為0.1-5.0μg，阿侖特羅為1-50mg。
進(jìn)行一系列顯示制備藥劑效力的試驗(yàn)后，選擇添加劑。然后將適量的所選添加劑分別加入上述兩種活性成分中的每一種活性成分中，以制備兩種初步的制劑，然后將它們混合在一起最后形成一種復(fù)合藥劑。如此獲得的復(fù)合藥劑，與那些主要由于給藥困難以及在食道中的副作用而導(dǎo)致具有較低的藥物依從性的常規(guī)藥物相比，顯示出改進(jìn)很多的藥物依從性，因此，它有效地預(yù)防了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。
本發(fā)明所用制備方法的特征如下。
方法A在本發(fā)明中，將甘露糖醇加入骨化三醇和乙醇的混合物中，并混合，然后將乙醇、抗氧化劑和一種粘合劑加入此混合物中，并混合，然后將所得混合物粉碎成14-35目大小并在30-50℃下干燥，得到骨化三醇顆粒。如果混合物的大小小于14目，所得的骨化三醇顆粒變得不均勻，而如果混合物的大小大于35目，產(chǎn)率變低并且壓片的操作性變差。
方法B在一個(gè)與上述方法A分開的獨(dú)立步驟中，將阿侖特羅、甘露糖醇和一種吸收增強(qiáng)劑混合在一起，并添加乙醇和一種粘合劑。然后，將所得的混合物粉碎成14-35目大小并在30-50℃下干燥，得到阿侖特羅顆粒。如果混合物的大小小于14目，所得的阿侖特羅顆粒變得不均勻，而如果混合物的大小大于35目，產(chǎn)率變低并且壓片的操作性變差。
方法C
將分別從方法A和B中獲得的骨化三醇顆粒和阿侖特羅顆?；旌显谝黄穑砑颖澜鈩┖蜐櫥瑒?，并將所得的混合物壓片以最終得到本發(fā)明的復(fù)合藥劑。
下面描述本發(fā)明中所使用的添加劑。
首先，在上述方法A和B中使用甘露糖醇作為一種賦形劑，在方法A和B中所使用的甘露糖醇的量分別限制在占最終藥物組合物中所含甘露糖醇總量的50-60重量％和40-60重量％。
限制甘露糖醇數(shù)量的理由如下。骨化三醇和阿侖特羅之間的可混性試驗(yàn)表明兩種成分的混合物導(dǎo)致骨化三醇的穩(wěn)定性下降。但是，在一個(gè)相容性試驗(yàn)中，當(dāng)骨化三醇在與阿侖特羅混合之前先于其他的賦形劑混合時(shí)，骨化三醇在所得的混合物中保持穩(wěn)定。因此，為了避免骨化三醇和阿侖特羅直接接觸，本發(fā)明的發(fā)明人首先用甘露糖醇將骨化三醇和阿侖特羅分別稀釋以產(chǎn)生它們的顆粒，然后將它們混合。關(guān)于在制備上述顆粒中所用甘露糖醇的數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)甘露糖醇的數(shù)量對(duì)于保持上述顆粒的均勻性是很重要的。當(dāng)分別使用50％總甘露糖醇制備骨化三醇顆粒和阿侖特羅顆粒時(shí)，可以觀察到所得顆粒在比容上存在差別，而且隨后(在將上述顆?；旌喜浩?獲得的藥片在上述成分的數(shù)量上是不均勻的。因此，進(jìn)行了大量試驗(yàn)以發(fā)現(xiàn)甘露糖醇的一個(gè)最佳數(shù)量，在此數(shù)量下可以產(chǎn)生均勻顆粒并且使每一種所給成分均含有相同的數(shù)量；結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用大約50-60％的總甘露糖醇制備骨化三醇顆粒是適宜的，并且優(yōu)選52％。同時(shí)，制備阿侖特羅顆粒建議使用大約40-60％的總甘露糖醇，并且優(yōu)選48％。然后，在上述兩種顆?；旌锨?，對(duì)他們進(jìn)行調(diào)整以使其具有相同的數(shù)量。
在本發(fā)明中可以使用的賦形劑的實(shí)例包括白糖、纖維素和乳糖以及甘露糖醇，優(yōu)選右旋甘露糖醇。這些賦形劑建議使用10-98重量％，優(yōu)選70-97重量％。如果所加甘露糖醇的數(shù)量不在上述范圍內(nèi)，之后壓片的可操作性變差。
本發(fā)明中可以使用的抗氧化劑是一種或多種選自丁基化羥基甲苯(BHT)、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、DL-α-生育酚和卵磷脂的抗氧化劑，優(yōu)選丁基化羥基甲苯(BHT)和丁基化羥基苯甲醚(BHA)。這些抗氧化劑可以使用占總組合物重量的0.001-10重量％，優(yōu)選0.01-1.0重量％。如果抗氧化劑的量不在上述范圍內(nèi)，之后將會(huì)出現(xiàn)骨化三醇穩(wěn)定性方面的問題。
粘合劑可以選自吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素和羧甲基纖微素鈉。這種作為添加劑的粘合劑的建議使用量為占總組合物重量的0.1-20重量％，優(yōu)選1-10重量％％。如果粘合劑的數(shù)量不在上述范圍內(nèi)，由于不均勻的顆粒分布，之后壓片的可操作性將變差。
崩解劑可以選自交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低級(jí)取代的羥丙基纖維素、和羧甲基纖維素鈣。這種作為添加劑的崩解劑的建議使用量為占總組合物重量的0.1-20重量％，優(yōu)選1-10重量％。如果崩解劑的數(shù)量不在上述范圍內(nèi)，之后將會(huì)出現(xiàn)藥片崩解方面的問題。
潤滑劑的實(shí)例包括硬脂酸鈣、硬脂酸鎂和滑石。它的建議使用量為占總組合物重量的0.1-20重量％，優(yōu)選1-10重量％。如果崩解劑的數(shù)量不在上述范圍內(nèi)，之后將會(huì)出現(xiàn)壓片可操作性方面的問題以及活性成分測定方面的問題。
十二烷基硫酸鈉可以作為一種吸收增強(qiáng)劑使用，它的建議使用量為占總組合物重量的0.01-10重量％，優(yōu)選0.1-1重量％。
另外，用于緩釋的添加劑可以選自羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素和乙基纖維素。
按照本發(fā)明的藥物成分，可以通過用一種腸溶包衣溶液包覆制成腸溶片，而且，還可以通過將一定的藥物組合物裝入常規(guī)的膠囊制成膠囊。此腸溶包衣溶液由腸溶包衣成分、增塑劑和溶劑組成。腸內(nèi)吸收劑的實(shí)例是羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、甲基丙烯酸聚合物和鄰苯二甲酸醋酸纖維素，增塑劑的實(shí)例包括檸檬酸三乙酯、聚乙二醇和丙二醇。本發(fā)明中所用的溶劑是兩種或多種選自二氯甲烷、乙醇、丙酮和蒸餾水的溶劑。
如此制備的藥劑，在治療代謝性骨疾病例如骨質(zhì)疏松癥、佩吉特病、脊柱炎、骨軟化癥、腎衰竭患者的腎性骨營養(yǎng)不良、甲狀旁腺機(jī)能低下和甲狀旁腺功能亢進(jìn)方面，已經(jīng)顯示出的良好的治療效果。
通過下列的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。但是，這些實(shí)施例無論如何不應(yīng)該被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。參考實(shí)施例在不僅能有效地預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展，而且能使血漿鈣濃度以及鈣的尿排泄量保持在一個(gè)正常水平，同時(shí)又不抑制骨質(zhì)重建率的情況下，計(jì)算出最佳濃度比。1)骨質(zhì)疏松癥的誘導(dǎo)從Daehan Biolink有限公司(漢城，韓國)中購買十二周齡的成熟雌性Sprgue-Dawley白色大鼠，并在漢城大學(xué)藥物學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)室的一間干凈房間中飼養(yǎng)。通過用普通的飼料(Purina，chow diet)喂養(yǎng)，使這些白色大鼠適應(yīng)一周，并將它們分為6個(gè)不同的組，其中每組由具有相似體重分布的10只白色大鼠組成，對(duì)它們中的所有白色大鼠實(shí)行卵巢切除術(shù)(ovariostereses)?？梢栽试S這些白色大鼠自由地飲水，在22℃、50％濕度、12h暗/明周期的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)食。2)藥物治療卵巢切除術(shù)后，這些白色大鼠靜養(yǎng)2天，然后在2月的時(shí)間內(nèi)，每周5天早晨口服給予一種藥物，此藥物含有一定劑量的單一的骨化三醇或阿侖特羅或它們的組合，它們分別獨(dú)立地溶于0.5mL精制棕櫚油和生理鹽水中。每組中給予藥物的劑量顯示于表1中，對(duì)照組僅僅給予相同數(shù)量的實(shí)驗(yàn)組中所用的棕櫚油和生理鹽水。
表1.
3)收集樣本和預(yù)處理在開始上述藥物給藥2個(gè)月后，通過使用一個(gè)代謝籠收集白色大鼠24h的尿樣，將其離心，然后在-70℃下貯存。將試驗(yàn)白色大鼠禁食過夜，將其斷頭，并收集它們的血樣。然后通過離心那些血樣獲得白色大鼠的血清，然后收集血清，并在-70℃下貯存。通過分離術(shù)分離脛骨，并用pH7.4的4％福爾馬林固定。4)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)和評(píng)價(jià)每個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其顯著性通過P＜0.05水平下的ANOVA、Duncan多范圍檢驗(yàn)確定。實(shí)驗(yàn)例1骨組織形態(tài)測定為了對(duì)上述參考實(shí)施例中固定的脛骨進(jìn)行脫鈣作用，將每個(gè)脛骨置于10％硝酸溶液中6小時(shí)，然后經(jīng)過濃度范圍在80％至100％的10種不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行脫水。然后，分別在二甲苯和石蠟中將它包埋2次，用一種切骨微鋸將脛骨近端切成4cm厚的骨片，并用蘇木精-伊紅染色。
在40倍放大率的顯微鏡下觀察上述脛骨近端，應(yīng)用定量圖象分析系統(tǒng)測定骨小梁的面積后，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)面積2×106μm2內(nèi)的骨小梁面積與此標(biāo)準(zhǔn)面積的比率。骨組織形態(tài)測定的結(jié)果如下。
人的骨皮質(zhì)每年更新大約2-3％；相比而言，骨小梁的更新速度較快，每年為25％。因此骨小梁的發(fā)育速度可用作一種辨別骨健康狀況的直接而精確的方法，而且它已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物試驗(yàn)中。在本試驗(yàn)中，在卵巢摘除術(shù)后，將阿侖特羅和骨化三醇單獨(dú)給藥或者聯(lián)合給藥2個(gè)月，脛骨骨小梁顯微鏡觀察結(jié)果顯示骨小梁的面積與正常組相比明顯減少(見附圖1)。應(yīng)用圖像分析儀的實(shí)驗(yàn)組的觀察結(jié)果顯示在單用阿侖特羅治療的組、用一種復(fù)合藥物治療的組1、2和3中，骨小梁的面積顯著增加，而在單用骨化三醇治療的組中沒有增加(見附圖2)。例如就骨小梁的面積而言，用一種含有阿侖特羅和骨化三醇的復(fù)合藥物治療的組顯示了與單用阿侖特羅治療的組相同的結(jié)果，而且在分別用一種復(fù)合藥物治療的組1、2和3之間沒有差異。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2生化試驗(yàn)所用的試劑是從上述參考實(shí)施例中所獲得的那些。1)血清鈣濃度的測定應(yīng)用Technicon自動(dòng)分析儀測定血清鈣濃度，結(jié)果顯示如下。
單用骨化三醇治療的組中的血清鈣濃度顯著升高，而單用阿侖特羅治療的組中的血清鈣濃度明顯下降。這是因?yàn)楣腔荚黾恿蒜}在腸中的吸收，而阿侖特羅通過減少甲狀旁腺激素抑制了骨吸收，然后阻止骨中鈣釋放至血流中，并抑制骨化三醇[1，25-(OH)2-D3]在腎中的合成，因此減少了腸中鈣的吸收。因此，用復(fù)合藥物給藥的組1、2和3中血清鈣的濃度保持在單用骨化三醇組和單用阿侖特羅組的濃度的中間水平，此與所期望的一致(見附圖3)。2)尿中鈣排泄的測定為了研究藥物對(duì)血清鈣濃度和所得尿鈣排泄之間關(guān)系的影響，用一種鈣試劑盒(Yeongdong藥物有限公司，韓國)測定24小時(shí)尿樣的鈣/肌酸濃度比，結(jié)果顯示于附圖4中。按照附圖4，用骨化三醇給藥時(shí)鈣排泄明顯升高，而用阿侖特羅給藥時(shí)未觀察到差異。在用含有骨化三醇和阿侖特羅二者的復(fù)合藥物的組1和組3中，鈣排泄量升高，而組2的鈣排泄量保持在與對(duì)照組類似的水平上(附圖4)。3)骨質(zhì)重建指數(shù)的測定用Technicon自動(dòng)分析儀測定血清堿性磷酸酶的活性水平，并應(yīng)用RIA方法，用一種試劑盒(OSCA test，Brahams，柏林，德國)測定骨鈣蛋白的濃度。
測定血清骨鈣蛋白的濃度和堿性磷酸酶的活性，作為骨質(zhì)重建率的指數(shù)。當(dāng)單用骨化三醇給藥時(shí)骨鈣蛋白濃度和堿性磷酸酶的活性均有輕度升高，而用阿侖特羅給藥時(shí)，它們下降，盡管下降水平不明顯(附圖5和6)。在用復(fù)合藥物治療的所有組中的骨鈣蛋白濃度未觀察到變化。在用復(fù)合藥物治療的組3中堿性磷酸酶的活性明顯降低，但組1和組2中堿性磷酸酶的活性沒有顯著的變化，因此提示組1和組2中骨質(zhì)重建率沒有下降。4)骨吸收指數(shù)的測定通過應(yīng)用一種試劑盒(Osteomark，Ostex，USA)測定24小時(shí)尿樣N-端肽(NTx)的濃度，計(jì)算尿中NTx/肌酸的比值。N-端肽是I型膠原的副產(chǎn)品。結(jié)果顯示由給藥引起的骨吸收的比率沒有明顯的變化(見附圖7)。
從上面實(shí)驗(yàn)例1和2中，復(fù)合給藥(0.1μg/kg骨化三醇+1.0mg/kg阿侖特羅)的組2顯示作為一種復(fù)合藥劑，它具有最佳的濃度比，這是因?yàn)樵跊]有抑制骨質(zhì)重建率的情況下，有效地阻止骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展，而且血清鈣濃度和尿鈣排泄保持在正常的水平。因此如在下面實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3和4所述，按照1998年4月29日發(fā)布的韓國食品藥品管理局98-56中所述的標(biāo)準(zhǔn)急性毒性試驗(yàn)和亞急性毒性試驗(yàn)，對(duì)所得復(fù)合藥劑的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，其安全性均得到證實(shí)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑的急性毒性試驗(yàn)測定經(jīng)口服給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的含有骨化三醇和阿侖特羅的單劑量復(fù)合藥劑的毒性，以評(píng)價(jià)上述復(fù)合藥劑的安全性。在此試驗(yàn)中，將上述復(fù)合藥劑給予Sprague-Dawley白色大鼠，通過LD50、一般狀況、體重和飲食攝入量研究其急性口服毒性，并通過尸體解剖做進(jìn)一步的測定。喂養(yǎng)條件在由意大利Techniplast公司設(shè)計(jì)的、位于附屬于韓國Choong-Ang大學(xué)藥理學(xué)系的動(dòng)物護(hù)理中心的SPF房間中，在23±2℃、相對(duì)濕度60±2％、每小時(shí)通風(fēng)13-15次、每天照明12小時(shí)(上午7時(shí)-下午7時(shí))的條件下，飼養(yǎng)180只4-5周齡的Sprague-Dawley白色大鼠(90只雄性和90只雌性)。將上面的試驗(yàn)白色大鼠置于籠中，讓其自由地?cái)z入用X線照射消毒的固體飼料(Hanil FeedGreenpia有限公司，韓國)和飲料(高溫消毒的自來水)。樣品試劑的制備稱取貯存于-20℃冰箱內(nèi)避光容器中的骨化三醇1.0mg，并將其加入一個(gè)褐色燒瓶中。當(dāng)需要時(shí)，通過加入一種溶劑(100％乙醇∶MCT＝5∶95)新近制備1.0μg/mL和10μg/mL的溶液，并與已經(jīng)懸浮了阿侖特羅一鈉的0.5％的CMC-Na水溶液混合。藥量的確定根據(jù)人的給藥量，將骨化三醇和阿侖特羅給藥量之間的混合比例確定為0.5μg∶5mg。根據(jù)LD50值將動(dòng)物按比例分為8個(gè)不同的組，按照表2所示測定全部9個(gè)組，其中包括1個(gè)對(duì)照組。在確定容積總數(shù)為1ml后，進(jìn)行口服給藥。根據(jù)人的體重和白色大鼠的給藥量之間的關(guān)系，將骨化三醇和阿侖特羅的最小劑量分別定為0.2μg/kg和2.0mg/kg。
表2.
實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目1)LD50的測定為了測定雄性和雌性白色大鼠的LD50值，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為8個(gè)藥物治療組和一個(gè)對(duì)照組，每個(gè)組中有10個(gè)白色大鼠，并對(duì)其進(jìn)行口服給藥。然后計(jì)算給藥后2周內(nèi)死亡的動(dòng)物數(shù)，應(yīng)用Brehrens-Karber法計(jì)算藥物的LD50值。
用含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥物給藥的白色大鼠的LD50如下。
雄性和雌性白色大鼠的死亡率顯示在下面表3中，這些白色大鼠是用含有骨化三醇和阿侖特羅(1μg/kg∶10mg/kg)的復(fù)合藥物單次口服給藥的。
表3.
按照Brehrens-Karber方法計(jì)算骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥物的LD50值。結(jié)果顯示雄鼠骨化三醇的LD50為77.5μg/kg，阿侖特羅的LD50為775mg/kg，雌鼠骨化三醇的LD50為75.0μg/kg，阿侖特羅的LD50為750mg/kg。2)正常狀態(tài)的觀察對(duì)全部試驗(yàn)白色大鼠每天均進(jìn)行觀察，觀察期為2周。在給藥后的最初6小時(shí)每30分鐘觀察1次，然后從第2天起每天在預(yù)定的時(shí)間觀察1次。下面是正常狀態(tài)下白色大鼠的觀察結(jié)果。
在給藥后的最初6小時(shí)，給藥大于LD50的雌性白色大鼠組表現(xiàn)出一種特別的行為，即它們用腿搔抓它們的頭，這種行為原來是因?yàn)槭彻芪复碳ひ鸬陌Y狀。然后，那些白色大鼠在給藥后的1小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出抽搐和呼吸困難。在給藥后的2小時(shí)內(nèi)自發(fā)病下降，輕度的活動(dòng)屈曲，保持昏睡狀態(tài)，并有呼吸緊張。幾乎所有的骨化三醇和阿侖特羅給藥量分別不少于100μg/kg和1000mg/kg的白色大鼠在給藥后的24小時(shí)內(nèi)死亡。在給藥量為75μg/kg骨化三醇和750mg/kg阿侖特羅的白色大鼠組中，60％的雌鼠和50％的雄鼠死亡，而在給藥量為50μg/kg骨化三醇和500mg/kg阿侖特羅的白色大鼠組中，所有白色大鼠均存活。在給藥量為50μg/kg骨化三醇和500mg/kg阿侖特羅的白色大鼠組中，每10個(gè)中有3個(gè)表現(xiàn)出上述食管胃刺激癥狀，但它們?cè)诨謴?fù)期的第一天即恢復(fù)過來。3)體重和食物攝入量的測定在給藥前和給藥后兩周時(shí)間內(nèi)每天的預(yù)定時(shí)間測定所有實(shí)驗(yàn)白色大鼠的體重和食物攝入量。結(jié)果顯示除了死亡的白色大鼠，在雄鼠和雌鼠的食物攝入量和體重均無顯著性的變化(附圖8-9)。4)尸體解剖從死亡的白色大鼠以及存活白色大鼠用乙醚麻醉處死后獲得肉眼結(jié)果。用10％中性福爾馬林固定裸眼發(fā)現(xiàn)的異常器官或組織，然后將它們做成標(biāo)準(zhǔn)組織樣本。然后用蘇木精和伊紅染色而獲得組織結(jié)果，所得結(jié)果如下。
除了脾臟凝血(hemostasis)外，用含有不少于75μg/kg的骨化三醇和750mg/kg的阿侖特羅的復(fù)合藥物治療的白色大鼠尸體解剖沒有異常的發(fā)現(xiàn)物。對(duì)對(duì)照白色大鼠和用含骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥物治療后14天恢復(fù)期完成后的存活白色大鼠進(jìn)行尸體解剖，除了脾臟輕度腫大外，沒有異常的發(fā)現(xiàn)物。用100μg/kg骨化三醇和1000mg/kg阿侖特羅治療后發(fā)現(xiàn)死亡的白色大鼠的組織解剖顯示，存在嚴(yán)重的脾臟凝血和出血(附圖10)。實(shí)驗(yàn)例4含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑的亞急性毒性試驗(yàn)將5周重復(fù)劑量的含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑對(duì)實(shí)驗(yàn)白色大鼠進(jìn)行口服給藥，進(jìn)行亞急性毒性試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)上述復(fù)合藥劑的安全性。在5周重復(fù)口服給藥期和2周恢復(fù)期，每天對(duì)實(shí)驗(yàn)白色大鼠檢測一次。為了評(píng)價(jià)復(fù)合藥劑的亞急性毒性，在用所給的藥物治療后進(jìn)行諸如正常狀態(tài)、體重變化、飲食攝入量、眼科檢查、聽力檢測、尿液試驗(yàn)、血液學(xué)試驗(yàn)、血液生化試驗(yàn)和病理學(xué)試驗(yàn)等檢查。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和喂養(yǎng)條件在實(shí)驗(yàn)例3急性毒性試驗(yàn)中上述的相同條件下喂養(yǎng)Sprague-Dawley白色大鼠，除了在完成試驗(yàn)前的頭一天將它們放置于代謝籠中。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組由20個(gè)雄鼠和20個(gè)雌鼠組成，并對(duì)它們治療5周。在2周的恢復(fù)期后，從每個(gè)組中選擇10個(gè)雄鼠和10個(gè)雌鼠進(jìn)行檢查。樣品藥劑的制備和藥量的測定按照實(shí)驗(yàn)例3急性毒性試驗(yàn)中所述的相同方法制備樣品藥劑。按照人的給藥量、已經(jīng)報(bào)道的LD50值和已知的在臨床治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥中有效的給藥量，測定骨化三醇和阿侖特羅藥量的混合比例為0.5μg∶5mg。通過azetropy 5選擇5個(gè)組，其中4個(gè)不同的治療組和1個(gè)對(duì)照組，如表4中所示。
表4.
實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目1)死亡檢查沒有觀察到死亡，接受含骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥物治療的雄鼠和雌鼠均全部存活，不論是在給藥完成時(shí)，還是恢復(fù)期完成時(shí)均存活。2)正常狀態(tài)的觀察觀察白色大鼠的正常狀態(tài)，(a)在治療期每天3次給藥前、給藥后的即刻以及給藥后2小時(shí)；(b)在假期每天2次給藥前、給藥后的即刻，以及(c)在恢復(fù)期每天1次。
直到給藥后的第3天才觀察到食管胃刺激癥狀和昏睡狀態(tài)，但這些癥狀在第5天后均消失。其它實(shí)驗(yàn)組的所有動(dòng)物的正常狀態(tài)沒有似乎與給藥相關(guān)的特別的變化。3)體重和水?dāng)z入量的變化在給藥期和恢復(fù)期的每3天測定1次體重。測定7天的累計(jì)水?dāng)z入量，每周1次；通過這樣估計(jì)每個(gè)白色大鼠每天的攝入量。結(jié)果顯示直到治療期和恢復(fù)期結(jié)束，在用含骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑治療的所有實(shí)驗(yàn)組中，在體重(附圖11)和水?dāng)z入量(附圖10)上沒有明顯變化。4)眼科學(xué)尸體解剖在檢查期間對(duì)所有實(shí)驗(yàn)白色大鼠進(jìn)行眼科學(xué)尸體解剖，并在試驗(yàn)的第5周僅對(duì)每個(gè)組中的5個(gè)雄鼠和5個(gè)雌鼠進(jìn)行檢查。當(dāng)觀察眼外部狀態(tài)時(shí)，用阿托品滴眼，檢查眼的前房、眼的中間傳導(dǎo)體和眼底。當(dāng)在第5周沒有觀察到任何與所用藥物有關(guān)的變化時(shí)，則省略隨后恢復(fù)期的檢查。結(jié)果顯示在治療期和恢復(fù)期結(jié)束后，在用骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑治療的所有實(shí)驗(yàn)組中沒有任何明顯的眼科學(xué)變化。5)聽力檢測在治療期的第5周對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的10個(gè)雄鼠和10個(gè)雌鼠，通過Gaidan Boizuru機(jī)(大約600Hz)進(jìn)行Outreflex檢查。當(dāng)在第5周沒有觀察到任何與所用藥物有關(guān)的變化時(shí)，則省略隨后恢復(fù)期的檢查。結(jié)果顯示在治療期和恢復(fù)期結(jié)束后，在用骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑治療的所有實(shí)驗(yàn)組中沒有任何明顯的聽力改變。6)尿液檢測在治療期的第5周和恢復(fù)期的第2周，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中選擇10個(gè)雄鼠和10個(gè)雌鼠，令其禁食，但允許飲水，然后在禁食4小時(shí)后收集它們的尿樣。然后讓它們自由地?cái)z食和飲水，并在自由進(jìn)食20小時(shí)后收集它們的尿樣。分析首份4小時(shí)所采集尿樣的白細(xì)胞、亞硝酸鹽、尿膽原、pH值、蛋白、酮體、尿糖、潛血、比重、尿膽紅素(AMES尿檢試紙，N-Nultistix SG-LJapan Bayer，Samkong有限公司)、顏色和尿沉淀。20小時(shí)獲得的尿樣用于檢測Na、K和Cl(總量測定)。結(jié)果顯示在治療期和恢復(fù)期結(jié)束后，在用骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑治療的所有實(shí)驗(yàn)組中沒有任何有意義的尿液方面的變化，而且它們均在正常值范圍內(nèi)。7)血液檢測在處死白色大鼠前將它們禁食過夜大約16小時(shí)，然后用乙醚麻醉后，沿正中線解剖它們。從腹動(dòng)脈采集血樣，并將它們貯存在含有抗凝劑(7.5％EDTA-2K)的真空試管中(Bechon Dickinson VacutainerSystems，歐洲英格蘭)。然后分析血樣的紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)(電阻中變化的檢測法)、血紅蛋白量(氰化正鐵血紅蛋白法)、紅細(xì)胞壓積(估計(jì)RBC計(jì)數(shù)和平均紅細(xì)胞體積)、細(xì)胞平均體積、細(xì)胞平均血紅蛋白(從血紅蛋白量和紅細(xì)胞壓積估計(jì))、血小板計(jì)數(shù)(電阻中變化的檢測法)(異常自動(dòng)分析儀Cell-Dyne 3000，Abbot Co.)、網(wǎng)織紅細(xì)胞(Brecher法)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)(May-Giemsa法)。在此，將3.8％枸櫞酸鈉處理的血樣離心(在3,000rpm下離心10分鐘)所得血漿，通過凝血酶原時(shí)間(Quick法)，估計(jì)上述檢測，所得結(jié)果如下。治療期結(jié)束時(shí)在用骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑治療的所有實(shí)驗(yàn)組中沒有觀察到任何有意義的變化。恢復(fù)期結(jié)束時(shí)在用骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥劑治療的所有實(shí)驗(yàn)組中沒有觀察到任何有意義的變化。8)血生化檢測按照血液檢測中相同的方法從腹靜脈中采集血樣，并用肝素處理。將血樣離心(在3,000rpm下離心10分鐘)獲得血清，然后分析GPT和GOT(異常UV比率法，異常自動(dòng)分析儀，CH16，Texas國際公司)、ALP(Bessey-Lowry法)、總膽固醇(CEH-COD-POD法)、總膽紅素、血糖(己糖激酶PD法)、尿素氮(Urea-GL PC法)、無機(jī)亞磷(六價(jià)鉬酸法)和總蛋白(Biuret法)(異常UV比率法，異常自動(dòng)分析儀，Monach儀器研究室)?？蓮腟tanbio Laboratory Inc.(Texas，USA)購得上述試驗(yàn)所用的試劑，其結(jié)果如下。治療期結(jié)束時(shí)用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅治療的雄性白色大鼠與用5μg/kg骨化三醇和50mg/kg阿侖特羅治療的雄性白色大鼠的GPT活性輕度升高。所有實(shí)驗(yàn)白色大鼠的GPT活性均升高。但是，沒有任何有意義的劑量-依賴性的變化，而且甚至用溶劑治療的對(duì)照組的GTP活性水平相對(duì)較高，因此提示這種GTP活性的輕度升高與采集血樣時(shí)造成的輕度溶血有關(guān)。所有雄性和雌性實(shí)驗(yàn)白色大鼠的血糖均輕度升高，但在量上沒有觀察到有意義的依賴性。用溶劑治療的對(duì)照組也輕度升高，并且尿液中沒有檢測到尿糖，因此提示血糖輕度升高與飲食無關(guān)，而是壓力引起的一過性升高。因此，可從上面的結(jié)果得出除了GOT活性和血糖水平的輕度升高外，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中均沒有任何與藥物治療相關(guān)的有意義的劑量依賴性的改變?；謴?fù)期結(jié)束時(shí)用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅治療的雄性白色大鼠與用5μg/kg骨化三醇和50mg/kg阿侖特羅治療的雄性白色大鼠的GPT活性在恢復(fù)期結(jié)束時(shí)正常。所有實(shí)驗(yàn)白色大鼠的GOT活性比治療期結(jié)束時(shí)降低。但是，沒有任何有意義的劑量-依賴性的變化，而且甚至用溶劑治療的對(duì)照組的GTP活性水平相對(duì)較高，因此提示這種GTP活性的輕度升高與采集血樣時(shí)造成的輕度溶血有關(guān)。因此，可從上面的結(jié)果得出除了與治療期結(jié)束時(shí)相比，GOT活性和血糖水平輕度升高外，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中均沒有任何與藥物治療相關(guān)的有意義的劑量依賴性的改變。9)尸體解剖從死亡白色大鼠和所有存活白色大鼠用乙醚麻醉處死后獲得肉眼觀察資料。用10％中性福爾馬林固定通過肉眼發(fā)現(xiàn)的異常器官或組織，然后將它們制備成標(biāo)準(zhǔn)組織樣品。然后用蘇木精染色以獲得組織結(jié)果，所得結(jié)果如下。在治療期結(jié)束時(shí)用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅的復(fù)合藥物治療的白色大鼠的尸體解剖顯示，存在脾臟的顯著增生，但用低于上述劑量治療的白色大鼠沒有任何異常的結(jié)果。除了脾臟以外，其它組織結(jié)果均未表現(xiàn)出與藥物有關(guān)的顯著變化?；謴?fù)期結(jié)束時(shí)用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅的復(fù)合藥物治療的白色大鼠的尸體解剖顯示，存在脾臟的顯著增生，但用低于上述劑量治療的白色大鼠沒有任何異常的結(jié)果。除了脾臟以外，其它組織結(jié)果均未表現(xiàn)出與藥物有關(guān)的顯著變化。10)病理檢查一采集好血樣，就通過驅(qū)血法將所有實(shí)驗(yàn)白色大鼠處死。通過裸眼觀察所有器官的異常后，切除腦、下丘腦、甲狀腺包括甲狀旁腺、唾液腺(頜下腺和舌下腺)、胸腺、心臟、肺包括支氣管、肝臟、脾臟、腎臟、睪丸、腎上腺、卵巢、前列腺、精囊、子宮和胸骨，并分別稱重。在尸體解剖當(dāng)天讓實(shí)驗(yàn)白色大鼠禁食，并分別將上述每個(gè)器官的相對(duì)重量估算為體重的100g。同樣，將脊髓、坐骨神經(jīng)、胸主動(dòng)脈、氣管、舌、食管、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、胰腺和腸系膜的異常部分切除，并用含磷酸鹽緩沖劑的10％福爾馬林固定，用Bouin’s溶液固定腦和脊髓(胸骨和股骨)，并用石蠟包埋。用蘇木精和伊紅將所有實(shí)驗(yàn)組和溶劑對(duì)照組的治療期和恢復(fù)期白色大鼠的所有組織和器官的標(biāo)本進(jìn)行染色，并在顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示沒有任何明顯的與治療藥物有關(guān)的變化。實(shí)驗(yàn)例3-4的結(jié)論將含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥物口服給予雄性和雌性Sprague-Dawley白色大鼠，骨化三醇和阿侖特羅的混合比為1∶10000，在5周的急性或亞急性毒性試驗(yàn)期間，或者給藥一次，或者重復(fù)給藥。其結(jié)果如下。
首先，上述復(fù)合藥物的急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果如下。
用Brehrens-Karber法計(jì)算骨化三醇和阿侖特羅復(fù)合藥物的口服給藥的LD50值。結(jié)果顯示雄性白色大鼠骨化三醇的LD50為77.5μg/kg，阿侖特羅的LD50為775mg/kg，而雌性白色大鼠骨化三醇的LD50為75.0μg/kg，阿侖特羅的LD50為750mg/kg。當(dāng)用50μg/kg骨化三醇和500mg/kg阿侖特羅的復(fù)合藥物口服治療一次時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)白色大鼠均存活，并且除了食管胃刺激癥狀和昏睡外，沒有觀察到正常狀態(tài)的任何異常改變。體重、飲食攝入量和尿檢結(jié)果均顯示正常。
口服不少于75μg/kg的骨化三醇和不少于750mg/kg的阿侖特羅的復(fù)合藥物而處死的白色大鼠，其尸體解剖顯示，存在嚴(yán)重的脾臟凝血和出血，但沒有觀察到其它與藥物治療有關(guān)的特殊損害。
其次，上述復(fù)合藥物的亞急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果如下。在重復(fù)藥物治療結(jié)束時(shí)用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅的復(fù)合藥物重復(fù)口服治療5周后，所有實(shí)驗(yàn)白色大鼠均存活，并且其正常狀態(tài)、飲食攝入量、眼科檢查、聽力檢查、血液檢查和血液生化檢查均沒有觀察到任何異常改變。
上述白色大鼠尸體解剖顯示，除了脾臟肥大外，其每個(gè)器官的重量沒有異常發(fā)現(xiàn)，但也觀察到中等水平的局限性肺間隔和輕度脾臟、肝臟、腎臟凝血，以及食管胃粘膜水腫和炎細(xì)胞浸潤。但是，在用骨化三醇低于5μg/kg和阿侖特羅低于50mg/kg的低劑量復(fù)合藥物治療的實(shí)驗(yàn)組中，以及對(duì)照組中，也可觀察到這些損害。因此認(rèn)為這些損害與治療藥物不相關(guān)。在腦、骨髓、性腺和消化腺中沒有任何異常發(fā)現(xiàn)。在恢復(fù)期結(jié)束時(shí)用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅的復(fù)合藥物重復(fù)口服給藥5周后，在2周恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)白色大鼠均存活，而且其正常狀態(tài)、飲食攝入量、眼科檢查、聽力檢查、血液檢查和血液生化檢查均沒有觀察到任何異常改變。
上述白色大鼠尸體解剖顯示，除了脾臟肥大外，其每個(gè)器官的重量沒有異常發(fā)現(xiàn)，但也觀察到中等水平的局限性肺間隔和脾臟、肝臟、腎臟中輕度的止血，以及食管胃粘膜水腫和炎細(xì)胞浸潤。但是，在用骨化三醇低于5μg/kg和阿侖特羅低于50mg/kg的低劑量的復(fù)合藥物治療的實(shí)驗(yàn)組中，以及對(duì)照組中，均可觀察到這些損害。因此認(rèn)為這些損害與治療藥物不相關(guān)。觀察到的輕度食管胃炎癥不是一種特殊的改變，而被認(rèn)為是在評(píng)價(jià)所給治療藥物的毒性試驗(yàn)中嚙齒動(dòng)物表現(xiàn)的一種可逆的損傷。在腦、骨髓、性腺和消化腺中沒有任何異常發(fā)現(xiàn)。
如上所述，將具有混合比例為1∶10000的骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥物單次口服給藥，其結(jié)果顯示骨化三醇和阿侖特羅的LD50分別大于75μg/kg和750mg/kg。因此證明這種藥物是一種毒性低的藥物。用含有25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅的復(fù)合藥物重復(fù)口服給藥5周，在恢復(fù)期以及治療期結(jié)束時(shí)，也沒有造成任何顯著的亞急性毒性，并且考慮到推測的人的劑量(按照人平均體重60kg)僅相當(dāng)于白色大鼠給藥劑量(即0.5μg/kg骨化三醇和5mg/kg阿侖特羅)的1/3000，因此認(rèn)為本發(fā)明的含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥物是安全的。實(shí)驗(yàn)例5對(duì)具有不同的骨化三醇和阿侖特羅混合比例的含有骨化三醇和阿侖特羅的復(fù)合藥物進(jìn)行的試驗(yàn)1)一種骨化三醇和阿侖特羅的混合物與添加劑例如一種賦形劑的可混性。以某種顯示于下列表5和6中的比例，將賦形劑加入上述骨化三醇和阿侖特羅的混合物(5μg∶50mg)中。
2)然后向1)中所得的混合物中加入5％的水，并在40℃下儲(chǔ)存14天。
通過HPLC(高效液體色譜)對(duì)上述混合物的穩(wěn)定性進(jìn)行測定，結(jié)果顯示于下列表5和6中。
表5.
表6.
上面表5和6結(jié)果表明甘露糖醇作為一種賦形劑，聚乙烯吡咯酮作為一種粘合劑，硬脂酸鈣或硬脂酸鎂作為一種潤滑劑，分別在其指定的領(lǐng)域中具有優(yōu)良的性能。起先，作為抗氧化劑的丁基化羥基甲苯和丁基化羥基苯甲醚，被認(rèn)為影響骨化三醇的穩(wěn)定性，但是另外的實(shí)驗(yàn)證實(shí)它們只是在分析水平影響骨化三醇，并且考慮到它們僅僅是微量，不會(huì)引起任何問題。結(jié)果，被加入藥劑中的添加劑選擇如下甘露糖醇作為一種賦形劑，聚乙烯吡咯酮作為一種粘合劑，硬脂酸鈣作為一種潤滑劑，丁基化羥基甲苯和丁基化羥基苯甲醚作為抗氧化劑，十二烷基硫酸鈉作為一種吸收增強(qiáng)劑。制劑實(shí)施例將按照本發(fā)明的藥劑制備成裸片、腸溶片、顆粒劑、腸溶顆粒劑、膠囊和腸溶膠囊的形式。制劑實(shí)施例1-3裸片的制備按照下面表7中所示的組成和含量制備裸片。
首先，將D-甘露糖醇加入由骨化三醇和乙醇組成的混合物中，然后加入乙醇、抗氧化劑和粘合劑。
與制備骨化三醇的步驟分開，將其他成分阿侖特羅、甘露糖醇、吸收增強(qiáng)劑混合，然后向其中加入乙醇和粘合劑。然后，將骨化三醇和阿侖特羅混合，并加入崩解劑和潤滑劑，然后壓片。
表7.
制劑實(shí)施例4-6腸溶片的制備除了用腸溶包衣溶液包覆制劑實(shí)施例1-3中制備的裸片外，按照與上述制劑實(shí)施例1-3中相同的方法制備腸溶片，其組份和含量顯示在下表8中。
表8.
制劑實(shí)施例7-9顆粒劑的制備如下列表9所示制備顆粒劑。
首先，將D-甘露糖醇加入一種由骨化三醇和乙醇組成的混合物中，然后加入乙醇、抗氧化劑和一種粘合劑。然后用一種常規(guī)的粉碎機(jī)將整個(gè)混合物粉碎成14-35目大小并在40℃下干燥以獲得骨化三醇顆粒。
與制備骨化三醇的步驟分開，將其它成分阿侖特羅、甘露糖醇、吸收增強(qiáng)劑混合，然后向上述混合物中再加入乙醇和一種粘合劑。然后用一種常規(guī)的粉碎機(jī)粉碎成14-35目大小并在40℃下干燥以獲得阿侖特羅顆粒。然后，將骨化三醇顆粒和阿侖特羅顆?；旌希⒓尤胍环N崩解劑和一種潤滑劑，然后壓片。
表9.
制劑實(shí)施例10-12腸溶顆粒劑的制備除了用腸溶包衣溶液包覆制劑實(shí)施例7-9中制備的顆粒外，按照與上述制劑實(shí)施例7-9中相同的方法制備腸溶片，其組份和含量顯示在下表10中。
表10.
制劑實(shí)施例13-15膠囊的制備如下列表11所示制備膠囊。
首先，將D-甘露糖醇加入由骨化三醇和乙醇組成的混合物中，然后加入乙醇、抗氧化劑和粘合劑。然后用一種常規(guī)的粉碎機(jī)將整個(gè)混合物粉碎成14-35目大小并在40℃下干燥以獲得骨化三醇顆粒。
與制備骨化三醇的步驟分開，將其它成分阿侖特羅、甘露糖醇、吸收增強(qiáng)劑混合，然后向上述混合物中再加入乙醇和粘合劑。然后用一種常規(guī)的粉碎機(jī)粉碎成14-35目大小并在40℃下干燥以獲得阿侖特羅顆粒。然后，將骨化三醇顆粒和阿侖特羅顆粒混合，并加入一種崩解劑和一種潤滑劑，然后裝入膠囊。
表11.
制劑實(shí)施例16-18腸溶膠囊的制備除了用腸溶包衣溶液包覆組份外，按照與上述制劑實(shí)施例13-15中相同的方法制備腸溶顆粒劑并最后裝入膠囊，其組份和含量顯示在下表12中。
表12.
實(shí)驗(yàn)例6腸溶片的穩(wěn)定性試驗(yàn)將按照制劑實(shí)施例5制備的腸溶片，在一種加速條件下(40℃，相對(duì)濕度75％)貯存兩個(gè)月，并對(duì)片劑的穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)三次，結(jié)果顯示于下表13中。
在片劑穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)中，性質(zhì)通過裸視觀察評(píng)價(jià)，通過HPLC驗(yàn)證。骨化三醇和阿侖特羅的含量也通過HPLC測定。
表13.
顯示于表13的結(jié)果表明在室溫和加速條件下，該藥片在持續(xù)兩個(gè)月的穩(wěn)定性試驗(yàn)中均保持穩(wěn)定。
權(quán)利要求
1.一種含有骨化三醇和阿侖特羅作為活性成分的用于治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其中所述的組合物中每1重量份的骨化三醇含有1,000-50,000重量份的阿侖特羅。
2.按照權(quán)利要求1的用于治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其中所述的代謝性骨疾病包括骨質(zhì)疏松癥、佩吉特病、脊柱炎、骨軟化癥、腎性骨營養(yǎng)不良、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)和甲狀旁腺功能減退。
3.按照權(quán)利要求1的用于治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其中所述的組合物可以制備成裸片、腸溶片、顆粒劑、腸溶顆粒劑、膠囊和腸溶膠囊的形式。
4.按照權(quán)利要求1的用于治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其中所述的組合物每劑量單位含有0.1-5.0μg骨化三醇和1-50mg阿侖特羅。
5.按照權(quán)利要求1的用于治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其中作為一種吸收增強(qiáng)劑使用的添加劑為十二烷基硫酸鈉，它占藥物組合物總重量的0.01～10重量％。
6.一種含有骨化三醇和阿侖特羅作為活性成分的用于治療代謝性骨疾病的藥物組合物的制備方法，其中所述的方法包括a)一種通過一系列步驟獲得骨化三醇顆粒的方法，該步驟由向骨化三醇和乙醇的混合物中添加甘露糖醇；向上述的混合物中添加乙醇、抗氧化劑和一種粘合劑；將上述混合物粉碎成14-35目大小并干燥上述的粉碎混合物組成；b)一種通過一系列步驟獲得阿侖特羅顆粒的方法，該步驟由將甘露g糖醇、一種吸收增強(qiáng)劑和阿侖特羅混合；向上述的混合物中添加乙醇和一種粘合劑；將上述混合物粉碎成14-35目大小并干燥上述的粉碎混合物組成；c)一種按1∶1重量份的混合比例混合從步驟a)中獲得的骨化三醇顆粒和從步驟b)中獲得的阿侖特羅顆粒，然后向上述的混合物中添加一種崩解劑和一種潤滑劑，最后將所得的混合物壓片的方法。
7.按照權(quán)利要求6的用于治療代謝性骨疾病藥物組合物的制備方法，其中所述的藥物組合物中每1重量份的骨化三醇含有1,000-50,000重量份的阿侖特羅。
8.按照權(quán)利要求6的用于治療代謝性骨疾病藥物組合物的制備方法，其中所述的骨化三醇和所述的阿侖特羅用甘露糖醇作為一種賦形劑，比例分別為50-60∶40-60，以使甘露糖醇占藥物組合物總重量的10-98重量％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療代謝性骨疾病的藥物組合物及其制備方法，特別涉及一種用于治療代謝性疾病的改良的藥物組合物及其制備方法，其中所述的組合物被制成一種復(fù)合藥劑，該藥劑含有作為兩種主要活性成分的以能夠產(chǎn)生最大協(xié)同治療作用的最佳混合比例混合的骨化三醇(它能夠減少脊柱骨折率和增加骨密度)和阿侖特羅(一種骨吸收抑制劑)，以及適量的其他添加劑，例如一種阿侖特羅的吸收增強(qiáng)劑。因此，按照本發(fā)明的藥物組合物，可以抑制當(dāng)單獨(dú)給予骨化三醇時(shí)引起的血鈣過多，由于骨化三醇的存在可以補(bǔ)償由阿侖特羅引起的對(duì)骨質(zhì)重建活性的抑制，并且可以改善與通常的給藥困難以及食道中的副作用有關(guān)的藥物依從性。因此，有效地預(yù)防了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。
文檔編號(hào)A61K47/10GK1420777SQ00815823
公開日2003年5月28日 申請(qǐng)日期2000年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月20日
發(fā)明者姜?jiǎng)侔? 李京姬, 郭忠實(shí), 金昌種, 李龍五 申請(qǐng)人:柳柳產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社