專利名稱：治療間皮瘤的藥物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及旨在治療癌癥(如惡性間皮瘤)的方法和藥物。
背景技術：
惡性間皮瘤(MM)是一種相對罕見并具有高侵染性的腫瘤，源于襯于漿膜腔的間 皮細胞的失控增生，所述間皮細胞最常襯于胸膜(惡性胸膜間皮瘤或MPM) (Robinson等 人，(2005)Lancet 366:397-408)。在工業(yè)化國家流行病學的研究已經確定暴露于石棉是 引起MPM 的一個最重要的病因(Gruber (2005) Lung Cancer 49S1 :S21_S23 ；Bartrip (2004) Postgrad Med. J. 80 :72_76)。盡管在世界各地，石棉的使用已顯著減少，但在未來20年中， 間皮瘤的發(fā)病率仍預計上升，因為從暴露于石棉到表現(xiàn)臨床癥狀之間有很長的潛伏期(20 年 40年)。今天，癌癥診斷通常在疾病的晚期階段得以確定，因為在疾病的早期階段缺乏明 顯的癥狀，因此很難對間皮瘤患者進行預斷。因此，事實上MPM被認為是一種用所有傳統(tǒng)治 療方法都相對難以治療的癌癥。因此迫切需要研發(fā)新的治療方法。在過去的十年間，對病毒治療法的興趣日益增加，部分涉及在人類基因治療中重 組病毒載體生產上增加的認識。現(xiàn)在許多RNA復制病毒被認為是潛在的癌癥治療物。同樣， 已有人建議用改造的可復制型單純皰疹病毒(HSV)治療MPM，基于對MPM小鼠模型體外研究 和所得結果(Adusumilli等人.(2006) J. Gene Med. 8 :603_615)。然而，這些改造的病毒載 體在人體內的長期安全性仍未知，需要進行大量的臨床實驗來論證HSV這方面的應用。因此，需要具有受認可的安全性(可靠地用于間皮瘤治療)的病毒載體。MV(麻疹病毒)是一種有包膜的，負鏈單鏈RNA病毒，屬于副粘液病毒科、麻疹 病毒屬。已開發(fā)出用于生產抗麻疹疫苗的各種可復制的MV活減毒株。舉例來說，施瓦茨 (Schwartz)株、Moraten株或Zagreb株(這些源于從埃德蒙頓(Edmonston)患者分離的MV 樣品)是安全且充分驗證的MV疫苗株。最近已表明，體內施用可復制型埃德蒙頓MV株，可導致建立的淋巴瘤和骨髓瘤 動物模型中腫瘤生長緩慢或有時消退(Grote等人.(2001)Blood 97 =3746-3754 ；Peng等 人· (2001) Blood 98 :2002_2007)。另外，Anderson 等人(2004) Cancer Res. 64 :4919_4926， 已在體外實驗中顯示，腫瘤細胞大量表達CD46是用減毒的埃德蒙頓MV活株感染和殺死 這些細胞所必需的。然而，已知人類癌癥已不同程度表達⑶46(Niehans等人.(1996) American J. Pathol. 149 129-142)，因而令人懷疑用減毒的MV活株治療癌癥的普遍適用 性。發(fā)明概述本發(fā)明源于本發(fā)明人的意外發(fā)現(xiàn)，即減毒的麻疹病毒可有效感染和殺死間皮瘤細 胞。此外，本發(fā)明人已經證明，與來自減毒的麻疹病毒感染的間皮瘤細胞裂解物相接觸的樹 突細胞可激活抗間皮瘤CD8T細胞。因此，本發(fā)明涉及減毒的麻疹病毒，其用于治療個體的惡性間皮瘤。
本發(fā)明也涉及至少一種減毒的麻疹病毒用于生產旨在治療個體惡性間皮瘤的藥物的用途。本發(fā)明也涉及治療個體惡性間皮瘤的方法，其中給所述個體施用治療有效量的至 少一種減毒的麻疹病毒。本發(fā)明還涉及制備用于治療個體癌癥的疫苗性樹突細胞的方法，包括下列步驟_用減毒的麻疹株體外感染優(yōu)選取自所述個體的癌細胞，以產生細胞裂解物；-使樹突細胞與所述細胞裂解物接觸，以產生疫苗性樹突細胞。本發(fā)明也涉及能根據(jù)上述制備方法得到的疫苗性樹突細胞，涉及含所述疫苗性樹 突細胞作為活性成分及藥學可接受載體的藥物組合物，涉及所述用于治療個體癌癥的疫苗 性樹突細胞，并涉及所述疫苗性樹突細胞用于生產旨在治療個體癌癥的藥物的用途。本發(fā)明還涉及治療個體癌癥的方法，其中將治療有效量的根據(jù)上述制備方法獲得 疫苗性樹突細胞施用于所述個體。發(fā)明詳述正如本文所預期的，所述個體優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人。也優(yōu)選已經暴露于石 棉的個體。正如本文所預期的，表述“減毒的麻疹病毒”是指任何源于麻疹致病病毒并且和所 述麻疹致病病毒相比呈現(xiàn)毒性減弱的病毒。正如本文所預期，所述減毒的麻疹病毒可用本 領域技術人員所知的任何技術由麻疹致病病毒得到，所述技術例如在培養(yǎng)的細胞上連續(xù)傳 代和/或基因工程。減毒的麻疹病毒具體可為重組病毒，任選表達其他基因。減毒的麻疹 病毒更具體可為其中一種或多種蛋白(優(yōu)選為輔助C蛋白)的表達被廢除的麻疹病毒。當 施用給人時，減毒的麻疹病毒優(yōu)選不實質引起麻疹癥狀。此外，減毒的麻疹病毒優(yōu)選為活的 且可復制。所述減毒的麻疹病毒優(yōu)選為埃德蒙頓(Edmonston)株。減毒的麻疹病毒的埃德 蒙頓株為本領域技術人員所熟知，并特別報道于Griffin(2001)Field' s Virology 4th Edition vol. 2 Knipe 禾口 Howley(ed. )Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1401-1441 ；Hilleman(2002)Vaccine 20:651-665)。所述減毒的麻疹病毒更優(yōu)選選自施 瓦茨株和Moraten株。這些株(它們的基因組被證明相同)為本領域技術人員所熟知，并 且廣泛用于抗麻疹疫苗的生產。它們特別描述于在Schwarz (1962) Am. J. Dis. Child 103 216-219 ；Parks 等人· (2001) J. Virol. 75 :921_933 和 Parks 等人· (2001) J. Virol. 75 910-920。所述減毒的麻疹病毒最優(yōu)選用pTM-MVSchw質粒(SEQ ID NO 1)生產，報道于 Combredet 等人· (2003) J. Virol. 77 11546-11554。在本發(fā)明框架內待治療的癌癥優(yōu)選為惡性間皮瘤，更優(yōu)選為惡性胸膜間皮瘤或 腹膜間皮瘤，最優(yōu)選為惡性胸膜間皮瘤。這些癌癥特別報道于Kazan-Allen(2005)Limg cancer 49S1 :S3_S8 和 Robinson 等人.(2005) Lancet 366:397-408。將減毒的麻疹病毒施用給個體，可通過胸膜內腔或鼻內、肌肉、靜脈或皮下途徑施 用。將減毒的麻疹病毒通過胸膜內腔施用給個體，優(yōu)選施用于比鄰待處理腫瘤處，或直接施 用于待處理腫瘤。如有必要，減毒的麻疹病毒可與任何合適的藥學可接受的載體組合。施 用的減毒的麻疹病毒的治療有效量優(yōu)選在IO3 IO6的50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。 TCID50測定為本領域技術人員所熟知，并特別報道于Karber (1931)在Arch. Exp. Path.Pharmak. 162:840_483ο 從待用疫苗性樹突細胞治療的個體中提取癌癥細胞的步驟優(yōu)選不包括于上述制 備疫苗性樹突細胞的方法中。所述步驟可根據(jù)本領域技術人員知道的提取細胞的任何技術 來進行，例如活組織檢查和滲漏/積液術(effusions)(例如，胸膜積液)。在被提取后，癌 細胞可根據(jù)經典技術培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，或者例如冷凍(例如在-80°C)保存。當癌細胞不是 來自待用疫苗性樹突細胞處理的個體，它們可主要來自同種異體的人類間皮瘤細胞系。在上述的制備方法中，癌細胞可通過和病毒直接接觸(例如以1的感染復數(shù) (Μ0Ι)，在37°C溫育2小時)而被減毒的麻疹病毒感染。在感染后，由于病毒作用感染的細 胞自發(fā)死亡。在細胞裂解后通常首先形成合胞體。這一現(xiàn)象能通過直接顯微鏡觀測感染的 細胞證明。本文所預期的“細胞裂解物”包含整個(或總)細胞裂解物，或部分細胞裂解物， 例如膜部分(例如胞漿包涵體或凋亡小體)。將被本領域技術人員所充分理解的是，在上述 制備方法第一步中獲得的細胞裂解物相當于病毒感染的癌細胞裂解物。樹突細胞可通過本領域技術人員熟知的許多方法得到。樹突細胞優(yōu)選來自待治療 個體。目前優(yōu)選的樹突細胞是單核細胞衍生的樹突細胞。單核細胞衍生細胞的獲取為本領 域技術人員所特別熟知。單核細胞衍生的細胞優(yōu)選用實施例4中報道的一般方法獲得，或 根據(jù) Spisek 等人.(2001) Cancer Immunology Immunotherapy 50 :417_427 獲得，或根據(jù) Royer等人.(2006) Scand. J. Immunol. 63 401-409獲得。單核細胞衍生的樹突細胞源于待 治療個體，這些單核細胞可從所述個體的白細胞采集物中獲得。本領域技術人員所應明晰的是，應維持樹突細胞和細胞裂解物接觸足夠長的時 間，以確保所述樹突細胞被細胞裂解物中存在的抗原有效裝載。一旦裝載(或負載的 (pulsed))，便獲得了本發(fā)明的疫苗性樹突細胞。裝載可用下文中實施例4描述的一般方法 來進行。足以確保樹突細胞有效裝載的樹突細胞和細胞裂解物之間的例示接觸時間大約是 24小時。接觸時間具體要保持到所述樹突細胞變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。激活狀態(tài)通常在樹突細胞裝 載完成后出現(xiàn)。樹突細胞的激活狀態(tài)(或成熟狀態(tài))可被本領域內技術人員熟知的許多標 記物證實，例如膜或細胞因子標記物。這些激活的樹突細胞的標記物特別列于實施例5中。因此，根據(jù)本發(fā)明的制備方法獲得的疫苗性樹突細胞有著特別的優(yōu)勢，因為它們 是抗癌CD8T細胞的有效刺激物。同樣有優(yōu)勢的是，本發(fā)明的制備方法可允許制備處于激活 狀態(tài)的疫苗性樹突細胞。附圖簡述

圖1、2、3、4和5 間皮瘤對減毒的麻瘡病毒(MV)的易感性圖1 =Schwarz MV疫苗株的選擇性溶瘤活性。用非重組的MV(Μ0Ι 1.0)感染一組 人上皮樣間皮瘤細胞系(M11、M13、M47、M56*M61)和永生的正常間皮細胞系(Met5A)，并 在72小時后進行感染的培養(yǎng)物形態(tài)的顯微鏡觀測。圖2 3 和正常細胞相比，腫瘤細胞的⑶46受體的更高表面表達。細胞用綴合 FITC的CD46特異性抗體(灰色柱狀圖)或相關的同種異型Ig對照(白色柱狀圖)染色 (圖2)。數(shù)量表示平均熒光指數(shù)，柱狀圖表示得到的間皮細胞(白色柱)和間皮瘤細胞系 (陰影線柱)的CD46表達的平均值(圖3)。圖4 5 =Schwarz MV疫苗株優(yōu)先感染轉化的腫瘤細胞。分別培養(yǎng)(圖4)或共 培養(yǎng)(圖5)相同數(shù)量的M13和Met5A細胞過夜，使細胞粘附，并以1. 0的MOI用eGFP-重組MV進行感染。在分別培養(yǎng)中，用流式細胞儀進行在感染后不同時間(24、48和72小時) 的eGFP表達分析(圖4)。在共培養(yǎng)模式中，用HLA-A2染色進行相同的實驗，因為HLA等位 基因的差異表達使可辨別兩種細胞系。柱狀圖表示共培養(yǎng)中Met5A(白色柱)和M13(黑色 柱)的％ eGFP-陽性細胞(圖5)。圖6 =MV-感染的間皮瘤細胞系的免疫原件 圖6 :MV-和UV-處理誘導的細胞死亡。在指示的時刻(Dl = 24h，D2 = 48h，D3 = 72h，及D4 = 96h)由UV暴露(5kJ/cm2)或MV感染(Μ0Ι = 1. 0)引起的M13腫瘤細胞凋亡 (陰影線柱)對比未處理的對照細胞(白色條快)的流式細胞儀分析。圖7和8 單核細胞衍牛的DC對抗體的吞噬作用圖7 =UV-或MV-處理的M13腫瘤細胞用PKH-26標記，并和未成熟的DC共培養(yǎng)24 小時。隨后對獲取的樹突細胞用綴合FITC的抗HLA-DR抗體染色，并用流式細胞儀分析。顯 示了三個具有相似結果的實驗中具有代表性的一個實驗。雙陽性DC數(shù)是基于HLA-DR表達 選通的PKH-26陽性DC的百分率(綴合FITC的抗體，克隆B8. 12. 2，Immunotech)，表示凋 亡細胞的吞噬效率。圖8 柱狀圖表示來自所測試各裝載條件得到的吞噬作用產量的平均值。B 9、10和11 誦i寸與MV-感染的間皮瘤細胞,共培IfH秀導的DC成孰圖9和10 以指定組合培養(yǎng)未成熟的DC和M13腫瘤細胞(1/1的比例)24小時。 作為對照，將DC和TLR3配體、聚肌苷酸聚胞苷酸(50μ g/ml ；Sigma)共溫育，或將DC直接 用MV感染(Μ0Ι = 1.0)。隨后提取DC，并用特異于指定的細胞表面分子的綴合PE的抗體 平板染色(圖9-HLA分子；圖10-成熟標記物)。根據(jù)DC的形態(tài)特征對它們選通，其中死 細胞基于T0PR0-3染色(分子探針)被去除。用三色流式細胞儀分析DC表面顯型。柱狀 圖表示來自4種獨立供體的平均值。圖 11 通過 CBA (針對 IL-6、IL-I β ,TNFa、IL—12 和 IL—10)禾口 ELISA (針對 IFN a ) 測定來研究24小時共培養(yǎng)上清上的DC細胞因子分泌模式。圖12 裝載MV-感染的間皮瘤細胞的DC誘導MSLN特異性⑶8T細胞致敏圖12 :MSLN特異性⑶8 T細胞數(shù)通過流式細胞儀進行分析，所述⑶8 T細胞源于和 未負載或者負載UV-M13或MV-M13的DC致敏一周的共培養(yǎng)物。柱狀圖表示基于人CD8表達 選通的T細胞中的PE-四聚物陽性細胞(綴合PE_Cy5的抗體，克隆RPA-T8，BDBiosciences) 的百分率。顯示的是一個有代表性的實驗。
實施例實施例1 間皮瘤對MV感染和溶瘤活性的易感性為了比較MV-涉及的對腫瘤和非腫瘤細胞的細胞病變效應，一組五種上皮樣間皮 瘤細胞系(Mil、M13、M47、M56、和M61)和一種間皮細胞(Met5A)用Schwarz疫苗株以1. 0 的感染復數(shù)(MOI)感染。間皮瘤細胞系(Mil、M13、M47、M56、和M61)來自對癌癥患者進行胸腔穿刺術收 集的胸膜積液。上皮樣間皮瘤的診斷用活組織切片免疫組化染色來確定。對照間皮細胞 系(Met5A)分離自無癌癥的病人的胸膜液，并通過轉染編碼SV40 T-抗原的pRSV質粒 (ATCC-LGC Promochem, Molsheim, France)使其永生。將細胞系維持在添加10%的熱滅活的小牛胎兒血清(FCS來自Biowest, Nuaille, France)、1 %的L-谷氨酰胺和青霉素/ 鏈霉素抗生素(都購自Sigma，St Quentin Fallavier, France)的RPMI-IMO培養(yǎng)基中。 用Hoechst33258染色(Sigma)常規(guī)檢測細胞培養(yǎng)物的支原體污染。減毒的 MVSchwarz 疫苗株獲自 F. Tangy (Pasteur Institut，F(xiàn)rance)。Schwarz MV從pTM-MVSchw (SEQ ID NO 1) cDNA,通過使用基于輔助細胞的營救系統(tǒng)(報道 于 Radecke 等人(1995)EMBO J. 14 :5773_5784，并被 Parks 等人(1999)J. Virol. 73 3560-3566 改進)營救。簡而言之，用 5 μ g pTM-MVSchw 和 0. 02 μ g 表達 SchwarzMV-L 基 因的 pEMC-Lschw(Combredet 等人.(2003) J. Virol. 77 11546-11554) (SEQ ID NO 2)轉然 293-3-46輔助細胞。37°C過夜溫育后，于43°C熱激2小時，并將轉染的細胞轉移到Vero細 胞單層上。將共培養(yǎng)15天后出現(xiàn)的合胞體轉移到35mm孔中，然后在75cm2和150cm2 Vero 細胞培養(yǎng)瓶中擴展，所述Vero細胞在5% FCS DMEM中培養(yǎng)。當合胞體達到80 90%匯合 時，將細胞刮到小體積的OptiMEM中，并立即凍結。在低速離心成片狀細胞殘骸后，-80°C保 存含有病毒的上清液。通過對Vero細胞的端點有限稀釋測定來測定重組MV儲存液的滴度。 用KSrber方法計算出 TCID50 (Karber (1931) Arch. Exp. Path. Pharmak. 162 480-483)。以MOI = 1. 0、37°C溫育2小時來進行間皮瘤細胞系的病毒感染。MV感染三天后， 觀測到MV感染的細胞有典型的形態(tài)學變化，和非癌Met5A細胞相比，這是對大部分腫瘤MPM 細胞系(4/5)的重要的細胞病變效應(CPE)的發(fā)生(圖1)。通過發(fā)生或多或少重要的合 胞體證實了 CPE，這最終導致死腫瘤細胞的胞漿包含體流入培養(yǎng)上清液中(圖1)。這些多 核巨合胞體的發(fā)生是麻疹感染的特征，產生于HA+感染的細胞和鄰近的CD46+培養(yǎng)細胞的融合 O可證實間皮瘤細胞上MV的減毒活株的受體⑶46有顯著的上調表達(圖2 3)。為了量化MV感染的敏感性，Met5A和M13細胞系被eGFP-重組的MV儲存液感染 (Combredet 等人.(2003) J. Virol. 77 :11546_11554)。將該 GFP-轉基因的表達作為病毒 感染的標記，因此允許用流式細胞儀檢測感染細胞的百分率。兩種培養(yǎng)細胞中的MV感染量 都是劑量依賴的(Μ0Ι為0. 01 5. 0)，表示eGFP信號的特異性。然而Met5A被MV株感染 (Μ0Ι為0.5 )，M13也明顯被MV感染，但總是以最低的MOI (Μ0Ι為0. 1 )。也觀測到和 正常細胞相比(Μ0Ι 1.0)，感染后48小時，在兩種細胞分別培養(yǎng)(圖4)和共培養(yǎng)(圖5)系 統(tǒng)(1 3的比例)中，腫瘤細胞顯著增加的感染量。此外，病毒感染也可通過觀測到感染 的細胞培養(yǎng)物中CD46表面表達的下調來證實。因此，根據(jù)這些體外研究結果，和間皮組織相比，間皮瘤表現(xiàn)出對MV-介導的感染 和MV-相關的細胞裂解活性有更明顯的易感性。因此，MPM看起來是和基于麻疹病毒施用 的病毒治療法有關的候選物。實施例2 =MV和UV治療誘導的腫瘤細胞死亡在證明MV能夠感染間皮瘤細胞之后，本發(fā)明人證明是否病毒感染也可導致凋亡 介導的細胞死亡。亞匯合單層M13細胞培養(yǎng)物或者經MV-感染(Μ0Ι 1.0)，或者用UV Stratalinker2400(Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands)進 行 UV-B-照 身寸 (312nm 5kJ/m2)，作為凋亡的陽性對照。在處理后的不同時間收集細胞，根據(jù)伴隨 物磷脂酰絲氨酸和膜聯(lián)蛋白-V染色定量細胞的死亡，這報道于Ebstein等人.(2004)Am. J. Respir. Crit. Care Med. 169 :1322-1330。如圖6所示，暴露于UV-B照射24小時的M13細胞和經MV感染72小時的M13細 胞表現(xiàn)出相等的腫瘤細胞死亡率(含有70% 80%之間的膜聯(lián)蛋白-V陽性細胞)，這表示 MV誘導感染的腫瘤細胞凋亡。由此定義的M13細胞死亡誘導的條件被用于下列實驗中。此外，通過觀測到明顯的細胞病變效應也證實了病毒涉及的細胞殺死，導致感染 后72 96小時M13細胞層完全錯位(圖1)。_仿丨丨3 :MV趣_中_胞輔_雜瞧為了跟蹤病毒在感染的M13細胞培養(yǎng)物中的生長動力學(Μ0Ι = 1. 0)，進行特異于 病毒dsRNA潛在受體(Mda-5、TLR-3、RIG-I和PKR)的RT-PCR。β -肌動蛋白基因的特異引 物作為內部實驗對照。簡而言之，Μ13細胞或者與聚肌苷酸聚胞苷酸配體(10yg/ml)溫育，或者 與MV(M0I = 1.0)溫育，并在不同時間收集細胞沉淀。然后用RNeasy試劑盒(Qiagen， Courtaboeuf，F(xiàn)rance)根據(jù)產品說明提取細胞的總細胞RNA，并用RTase (Invitrogen， Paisley, UK)進行逆轉錄。產生的cDNA作為PCR擴增的模版，該PCR使用特異于Mda_5、 TLR-3、RIG-I、PKR、IFN3，和β-激動蛋白的引物。PCR引物序列列在表1中。PCR產物通
過瓊脂糖凝膠電泳觀察。 表1:引物序列因此這可證明病毒復制峰出現(xiàn)在感染間皮瘤Μ13細胞后的第一天到第四天之間。 另外，也可證實相應于病毒dsRNA潛在受體(Mda-5、TLR-3、RIG-I和PKR)的PCR產物。
t施徹丨4 未成孰DC對凋亡件間皮瘤細胞效攝入然后研究樹突細胞(DC)對MV-感染(72小時)所致的凋亡小體的攝入，并與其對 UV-照射(24小時)的M13腫瘤細胞的攝入進行比較。
樹突細胞來源于單核細胞，在獲得知情同意后，從HLA-A0201健康供體(EFS， Nantes, France)的白細胞采集收獲物產生所述單核細胞。富含單核細胞的級分(>85% ^iS ) Ficoll WiS^iSi^^^ (PAA Laboratories, Les Mureaux, France)
離。然后單核細胞通過用Beckman Avanti J20離心機(配備有JE5. O轉子)和40ml淘洗 室進行淘洗(逆流離心)來富集。如基于CD14標記物檢測的流式細胞儀檢測所評估，經淘 洗的單核細胞的純度通常超過80%。用500IU/ml GM-CSF和200IU/ml IL-4 (Cell Genix Technology, Freiburg, Germany)以2 X IO8細胞/ml培養(yǎng)單核細胞。然后使細胞分化6天。在第6天，從培養(yǎng)物上清液中收集單核細胞衍生的DC，并接種于用于隨后裝載的 培養(yǎng)物中。使未成熟的DC和2X IO8細胞/ml的凋亡物(來自UV-處理的或MV-感染的同 種異體M13腫瘤細胞)溫育共培養(yǎng)(比列1 1)另外的24小時。DC吞噬量的分析通過用 流式細胞儀檢測和激光共聚焦顯微鏡檢測來評估，如先前報道(Mass6等人.(2002) Cancer Research 32 1050-1056)。簡而言之，使用PKH-26膜染料著色劑，根據(jù)產品說明(Sigma，St Quentin FalIavier，F(xiàn)rance)標記經UV-或MV-處理的M13細胞。共溫育24小時后，用綴 合 FITC 的抗 HLA-DR 抗體(Immunotech，Marseilles，F(xiàn)rance)染色 DC。用 PBS 洗滌后，收獲 細胞，并用 FACSCalibur (BD Biosciences, Grenoble, France)或者用 TCS NT 顯微鏡(Leica Instruments, Heidelberg, Germany)分析。已攝入凋亡細胞的 DC 被鑒定為 HLA-DR/PKH-26 雙陽性細胞(圖7)。如圖8所示，能夠證明DC以相同的速率有效吞入經UV-和MV-處理的間皮瘤細 胞，如基于HLA-DR表達選通的PKH26-陽性DC的相似百分率所示(對于分別裝載經UV-或 MV-處理的M13細胞的DC分別為65%和74% )。激光共聚焦掃描顯微鏡實驗進一步證實凋亡的M13細胞在共培養(yǎng)24小時內被未 成熟的DC有效攝入，無關于所使用的死亡誘導策略(MV-感染或UV-照射)。實施例5 相比用UV照射誘導的凋亡性M13細胞，MV感染的腫瘤細胞誘導DC自發(fā) 成熟接下來本發(fā)明人檢驗了是否來自MV感染的M13腫瘤細胞的細胞物質可有效刺激 DC成熟。在被暴露于照射或病毒介導的細胞裂解活性殺死的腫瘤細胞攝入后的24小時內 評估DC成熟狀態(tài)?；頓C(基于T0PR0-3陽性染色排除選通)的表型用Class I和II MHC分子(圖 9)和成熟標記物⑶80、⑶86、⑶83和⑶40(圖10)的表面表達來研究，通過對共培養(yǎng)上清 液進行細胞因子分泌模式分析來完成(圖11)。作為對照，DC未經處理，或者組合TLR3配 體和一種促炎癥細胞因子(聚肌苷酸聚胞苷酸/IFNα，作為病毒感染的模擬物)而成熟， 或者直接通過接觸麻疹病毒(MV)來致敏。簡而言之，用特異于HLA-ABC (克隆 Β9. 12. 1)、HLA-DR(克隆 Β8. 12. 2)、CD80 (克 隆 ΜΑΒ104)、CD83 (克隆 HB15a)、CD86 (克隆 ΗΑ5· 2B7)、和 CD40 (克隆 MAB89)的單克隆抗體 (均購自Immunotech，Marseilles，F(xiàn)rance)進行免疫染色。在進行流式細胞儀檢測前，DC與上述各抗體α μ g/ml)在4°C溫育30分鐘。測定吞入后24小時收集的上清液中的細胞 因子的分泌模式。用可商購的Cytometric Beads Array試劑盒(BD Biosciences, Le Pont de Claix,France)根據(jù)產品說明測定了 IL-10、IL-12、IL-6、IL-1 β 和 TNF α 濃度。IFNa 的定量用 ELISA 檢測(Biosource，Camarillo, USA)進行。自發(fā)成熟程序只在裝載有來自MV感染的間皮瘤細胞的凋亡小體的DC中觀測到， 以與實驗中所用的陽性對照的成熟混合物(聚I:C/IFNa)基本相等的水平。通過共刺激 分子(⑶80、⑶83、⑶86、⑶40和HLA-ABC)表達的顯著上調和許多促炎細胞因子(IL-6、 IL-I β、TNF α、和IFNa)的生成證實了自發(fā)成熟。 然而，與先前的報道一致，用經UV-照射的凋亡性腫瘤細胞負載DC，和用麻疹病毒 (MV)直接感染DC不能誘發(fā)此效果。所有這些數(shù)據(jù)都強烈證實，與UV-照射的腫瘤細胞相比，MV感染的腫瘤細胞的免 疫原性升高。實施例6 :MSLN特異件⑶8 T細胞應答的交叉致敏最后，本發(fā)明人檢測是否裝載有來自MV感染的間皮瘤細胞的凋亡小體的DC可刺 激特異于MPM-相關的腫瘤抗原(例如間皮素(MSLN))的效應子CD8應答。為了評估這個問題，對⑶8 T-淋巴細胞進行四聚物免疫染色，所述⑶8T-淋巴 細胞與裝載來自經UV-或MV-處理的M13細胞的凋亡物質的自身DC致敏一周。作為對 照，類似的實驗用Jurkat淋巴瘤T細胞系進行，基于其對MV的易感性和其MSLN-陰性表 達特征來選擇(圖12)。作為內部實驗對照，完成了 MelanA/Mart-Ι-特異性四聚物染色 (MelanA26-35L)，以補充特異于兩個選定的MSLN-衍生的CTL表位的那些。這些肽(MSLN 531 539和MSLN 541 550)通過使用兩種計算算法BIMAS和SYFPEITHI掃描匹配對于 HLA-A0201結合共有的基序的MSLN氨基酸序列(GenP印t NP005814)來鑒定(表2)
HLA-A0201結合分值
四聚物名稱 位置序列SYFPEITHI BIMAS
531 ~VLPLTVAEV
HLA-A2 VLP929/30 272/285
539 ( SEQ ID NO: 13 )
541 ~ KLLGPHVEGL HLA-A2 KLL1030/31 312/312
550 (SEQ ID NO: 14)表2:四聚物特征簡而言之，通過使用CD8多重分選試劑盒(Miltenyi Biotec, Paris, France)用 MACS柱系統(tǒng)陽性篩選來從HLA-A0201健康供體的PBMC制備⑶8 T淋巴細胞。純化的幼稚 ⑶8 T細胞(> 90%純度)用裝載有各凋亡制劑的自身DC或未裝載的DC(作為對照)刺 激。在圓底的96孔平板(BD Falcon)中，通過將2X IO4成熟的DC與2X IO5應答T細胞 在 200μ1 8%人血清 RPMI 1640 培養(yǎng)基(頭三天補加 10ng/ml IL_12(AbCys SA, Paris,France)，以后補加 10U/ml IL-2 (Proleukin, Chiron Therapeutics, USA))中混和(比列 1 10)來進行共培養(yǎng)。每三天加一次IL-2，允許常規(guī)的培養(yǎng)基更新。在培養(yǎng)7 8天后， 收獲T細胞，并如下用MSLN-特異性四聚物染色。 將所選定的CD8表位肽(由Eurogentec，Liege, Belgium合成)用于如先前報道 于(LabarriSre等人.(2002) Int. J. CancerlOl 280-286)的單體生產(重組蛋白生產平 臺，U601-IFR26，Nantes, France)。HLA-A2 VLP9 和 HLA-A2 KLLlO 單體用 PE-標記的鏈霉 親和素(BD Biosciences)寡聚化。染色和洗滌在0. 1 % BSA-PBS中進行。隨后將T細胞在 4°C下用10 μ g/ml的PE-標記的pMHC多聚體染色30分鐘，然后再于4°C下用1 μ g/ml稀釋 的綴合PE_Cy5的抗-CD8抗體(克隆RPA-T8，BD Biosciences)染色30分鐘。洗滌細胞， 并立即在FACSCalibur上分析。有趣的是，觀測發(fā)現(xiàn)，與和裝載有來自UV-處理的M13細胞的凋亡物質的DC的共 培養(yǎng)物相比，與裝載有來自MV-處理的M13細胞的凋亡物質的DC的共培養(yǎng)物中，CD8-陽性 選通群中MSLN特異性T細胞的百分率顯著增加。
權利要求
減毒的麻疹病毒，其用于治療個體的惡性間皮瘤。
2.權利要求1的減毒的麻疹病毒，其中所述減毒的麻疹病毒是埃德蒙頓(Edmonston)株。
3.權利要求1或2的減毒的麻疹病毒，其中所述減毒的麻疹病毒選自施瓦茨 (Schwartz)株禾口 Moraten 株。
4.權利要求1 3中任一項的減毒的麻疹病毒，其中所述惡性間皮瘤是惡性胸膜間皮瘤。
5.權利要求1 4中任一項的減毒的麻疹病毒，其中所述個體已暴露于石棉。
6.制備用于治療個體癌癥的疫苗性樹突細胞的方法，包括下列步驟 用減毒的麻疹株體外感染取自所述個體的癌細胞，以產生細胞裂解物； 使樹突細胞與所述細胞裂解物接觸，以產生疫苗性樹突細胞。
7.權利要求6的方法，其中所述樹突細胞源于所述個體。
8.權利要求6或7的方法，其中所述樹突細胞是單核細胞衍生的樹突細胞。
9.權利要求6 8中任一項的方法，其中所述癌是惡性間皮瘤。
10.權利要求6 9中任一項的方法，其中所述癌是惡性胸膜間皮瘤。
11.權利要求6 10中任一項的方法，其中所述減毒的麻疹病毒是埃德蒙頓株。
12.權利要求6 11中任一項的方法，其中所述減毒的麻疹病毒選自施瓦茨株和 Moraten ^0
13.疫苗性樹突細胞，其能根據(jù)權利要求6 12中任一項的方法得到。
14.藥物組合物，其包含 能根據(jù)權利要求6 12中任一項的方法得到的疫苗性樹突細胞作為活性成分；及 藥學可接受的載體。
15.疫苗性樹突細胞，其能根據(jù)權利要求6 12中任一項的方法得到，其用于治療個體的癌。
16.權利要求15的疫苗性樹突細胞，其中所述癌是惡性間皮瘤。
17.權利要求15或16的疫苗性樹突細胞，其中所述癌是惡性胸膜間皮瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用至少一種減毒的麻疹病毒來制備旨在治療個體的惡性間皮瘤的藥物。
文檔編號A61K39/165GK101868249SQ200880116771
公開日2010年10月20日 申請日期2008年10月10日 優(yōu)先權日2007年10月10日
發(fā)明者A·高弗里特, F·唐吉, M·格利高里 申請人:巴斯德研究所