用于疫苗的減毒病毒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種減毒病毒，其包含改良的病毒基因組，所述改良的病毒基因組含有在基因組的多個位置加工的核苷酸置換，其中所述置換向基因組引入同義的去優(yōu)化密碼子。本發(fā)明的減毒病毒可用于疫苗組合物，以誘導(dǎo)受治療者中的保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供合成本發(fā)明的減毒病毒的方法。此外，本發(fā)明還提供用于防止受治療者患上病毒相關(guān)疾病的方法，所述方法包括向受治療者施用預(yù)防有效劑量的包含本發(fā)明的減毒病毒的疫苗組合物。
【專利說明】用于疫苗的減毒病毒
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2007年3月30日遞交的美國申請第60/909，389號和2008年3月7日遞交的美國申請第61/068，666號的優(yōu)先權(quán)，其通過引用以其整體并入本文。
[0002]聯(lián)邦資助
[0003]本發(fā)明是以來自美國國立衛(wèi)生研究院的批準(zhǔn)號AI15122、來自美國國家自然科學(xué)基金會的批準(zhǔn)號EIA0325123和來自美國國家癌癥研究所的批準(zhǔn)號T32-CA009176在美國政府支持下進(jìn)行的。因此，美國政府在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。
[0004]版權(quán)聲明
[0005]本專利文檔的部分公開內(nèi)容含有受到版權(quán)保護(hù)的材料。當(dāng)專利文檔或?qū)＠_內(nèi)容出現(xiàn)在專利和商標(biāo)局的專利文件或記錄中時，版權(quán)所有人對任何人對其進(jìn)行傳真復(fù)制無異議，否則則保留所有版權(quán)權(quán)利。
發(fā)明領(lǐng)域
[0006]本發(fā)明涉及包含含有多個核苷酸置換的改良的病毒基因組的減毒病毒的生成。所述核苷酸置換造成與其他的同義密碼子的密碼子交換和/或密碼子重排和密碼子對偏倚(codon pair bias)的變化。
[0007]發(fā)明背景
[0008]DNA合成技術(shù)的快速進(jìn) 步保證了病毒學(xué)中采用的傳統(tǒng)方法的變革。傳統(tǒng)用于消除病毒基因組的不同區(qū)域的功能的方法之一是利用大量但費(fèi)力的位點(diǎn)定向誘變，以探索病毒株系基因組中小的序列變異的影響。然而，病毒基因組尤其是RNA病毒的病毒基因組相對較短，通常低于10，000堿基長度，使得它們易于使用目前可用的技術(shù)進(jìn)行全基因組合成。最近開發(fā)的基于微流體芯片的技術(shù)可執(zhí)行根據(jù)規(guī)格設(shè)計的(designed to specification)新基因組的從頭合成，每個基因組僅用數(shù)百美元。這允許產(chǎn)生完全新穎的編碼序列，或?qū)F(xiàn)有序列調(diào)節(jié)至傳統(tǒng)克隆方法不可能實(shí)現(xiàn)的程度。
[0009]此設(shè)計自由提供極大的力量來執(zhí)行DNA/RNA編碼序列的大規(guī)模重新設(shè)計以:(I)研究參數(shù)諸如密碼子偏倚、密碼子對偏倚和RNA 二級結(jié)構(gòu)的變化對病毒翻譯和復(fù)制效率的影響；(2)執(zhí)行有效的全基因組掃描，以獲得未知的調(diào)節(jié)元件和成功的病毒繁殖必需的其他信號；和(3)開發(fā)用于病毒株系的遺傳工程和抗病毒疫苗的設(shè)計的新的生物技術(shù)。
[0010]由于遺傳密碼的簡并性，除兩種氨基酸外，蛋白質(zhì)編碼序列中的所有氨基酸可被多于一個密碼子編碼。此類同義密碼子的使用頻率是不相等的，并與細(xì)胞翻譯機(jī)器共同進(jìn)化，以避免過多使用通常對應(yīng)于稀有或另外不利的tRNA的次優(yōu)的(SUboptimal)密碼子(Gustafsson等人，2004)。這造成了一種稱為“同義密碼子偏倚”的現(xiàn)象，該現(xiàn)象在進(jìn)化關(guān)系遠(yuǎn)的物種之間存在很大差異，甚至在相同物種的不同組織之間可能存在差異(Plotkin等人，2004)。
[0011]通過重組方法的密碼子優(yōu)化(即，使基因的同義密碼子使用與宿主細(xì)胞的密碼子偏倚一致)已廣泛用于改善跨物種表達(dá)(參見，如Gustafsson等人,2004)。雖然通過特意引入次優(yōu)的同義密碼子降低表達(dá)的相反目標(biāo)尚未被廣泛研究，但是獨(dú)立的報道表明用稀有(rare)密碼子取代天然密碼子可在不同生物體中降低基因表達(dá)水平。參見,如Robinson等人，1984 ；Hoekema 等人，1987 ；Carlini 和 Stephan, 2003 ；Zhou 等人，1999。因此，向病毒基因組中引入去優(yōu)化的同義密碼子可不利地影響蛋白質(zhì)翻譯，并從而提供用于產(chǎn)生減毒病毒的方法，所述減毒病毒將對制備針對病毒疾病的疫苗有用。
[0012]病毒性疾病和疫苗
[0013]病毒始終是人類中死亡和疾病的主要原因之一。與細(xì)菌性疾病不同，病毒性疾病不易受抗生素影響并因而難以治療。因此，疫苗接種已成為人類對病毒的主要和最有力的防御?，F(xiàn)今，一些最古老和最嚴(yán)重的病毒性疾病諸如天花和脊髓灰質(zhì)炎(脊髓灰質(zhì)炎(polio))已被世界范圍內(nèi)的免疫接種計劃根除(或接近如此)。然而，許多其他古老病毒諸如鼻病毒和流感病毒控制不良，并仍造成實(shí)質(zhì)的問題，雖然這些問題隨年份和國家而不同。此外，新的病毒諸如人類免疫缺陷病毒(HIV)和重癥急性呼吸綜合征(SARS)病毒，定期出現(xiàn)在人類群體中并通常造成致死大流行。還可能存在有意引入作為戰(zhàn)爭或恐怖主義手段的致死的人造病毒或人類改變的病毒。
[0014]疫苗的有效生產(chǎn)仍是一項不可預(yù)知的事業(yè)。有三大類疫苗:亞單位疫苗、滅活(死)疫苗和減毒活疫苗。對于亞單位疫苗，來自病毒的一種或幾種蛋白質(zhì)(如，使用重組DNA技術(shù)制備的衣殼蛋白)用作疫苗。大腸桿菌(Escherichia coli)或酵母中生產(chǎn)的亞單位疫苗是非常安全的，并且不會引起病毒性疾病威脅。然而，它們的功效可能是低的，因為不是所有的免疫原性病毒蛋白都存在，并且存在的那些可能不是以其天然構(gòu)象存在。
[0015]滅活(死)疫苗通過培養(yǎng)或多或少的野生型(Wt)病毒和然后將其滅活，例如用甲醛(如在Salk脊髓灰質(zhì)炎疫苗中)來制備。需要進(jìn)行大量的實(shí)驗來找到殺死所有病毒但又不損害微粒的免疫原性的滅活處理。此外，剩余的安全問題在于培養(yǎng)病毒的設(shè)施可能允許強(qiáng)毒病毒逃逸，或滅活可能失敗。
[0016]減毒活疫苗包含已經(jīng)受 突變使其毒性降低并可用于免疫接種的病毒?；畹臏p毒病毒作為疫苗具有許多優(yōu)點(diǎn):它們通常生產(chǎn)簡便、快速和廉價；它們通常易于施用(例如，Sabin脊髓灰質(zhì)炎疫苗以方糖口服施用)；并且有時所述減毒病毒的殘余生長允許“群體”免疫接種(免疫接種與初始患者密切接觸的人們)。這些優(yōu)點(diǎn)在緊急情況下當(dāng)很快需要疫苗時特別重要。減毒疫苗的主要缺點(diǎn)是它具有一些顯著的回復(fù)突變?yōu)閃t毒力的頻率。為此，美國已不再使用Sabin疫苗。
[0017]因此，仍有對產(chǎn)生實(shí)際上沒有回復(fù)突變的可能性的減毒活病毒的系統(tǒng)性方法的需要，并因此提供快速、有效和安全的疫苗生產(chǎn)方法。本發(fā)明通過提供產(chǎn)生減毒活病毒的系統(tǒng)性方法合成減毒病毒工程(SyntheticAttenuated Virus Engineering, SAVE)滿足了這一需要，所述減毒活病毒基本上沒有回復(fù)突變的可能性，因為它們含有數(shù)百或數(shù)千個小缺陷。這一方法廣泛適用于大范圍內(nèi)的病毒，并提供生產(chǎn)大范圍的抗病毒疫苗的有效方法。
[0018]發(fā)明概述
[0019]本發(fā)明提供了一種減毒病毒，其包含改良的病毒基因組，所述病毒基因組含有在基因組的多個位置加工的核苷酸置換，其中所述置換向所述基因組引入多個同義密碼子。同義密碼子的這一置換改變基因組中的各種參數(shù)，包括密碼子偏倚、密碼子對偏倚、去優(yōu)化密碼子和去優(yōu)化密碼子對的密度、RNA 二級結(jié)構(gòu)、CpG 二核苷酸含量、C+G含量、翻譯移碼位點(diǎn)、翻譯暫停位點(diǎn)、組織特異性微RNA識別序列的存在或不存在、或其任何組合。由于包括了大量的缺陷，本發(fā)明的減毒病毒提供產(chǎn)生針對多種多樣的病毒性疾病的穩(wěn)定地減毒的活疫苗的手段。
[0020]在一個實(shí)施方案中，提供包含與母體病毒的對應(yīng)序列相同的編碼病毒蛋白或其部分的核酸序列的減毒病毒，其中所述減毒病毒的核苷酸序列含有它所衍生自的母體序列的密碼子，并且其中所述核苷酸序列與母體病毒的核苷酸序列具有低于90%的同一性。在另一實(shí)施方案中，所述核苷酸序列與母體病毒的序列具有低于80%的同一'丨生。提供減毒的置換核苷酸序列是至少100核苷酸長度、或至少250核苷酸長度、或至少500核苷酸長度、或至少1000核苷酸長度。減毒序列的密碼子對偏倚低于母體病毒的密碼子對偏倚，且降低至少約0.05、或至少約0.1、或至少約0.2。
[0021]被減毒的病毒可以是動物病毒或植物病毒。在某些實(shí)施方案中，所述病毒是人類病毒。在另一實(shí)施方案中，所述病毒感染多個物種。特定的實(shí)施方案包括但不限于，脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒、登革病毒、HIV、輪狀病毒和SARS。
[0022]本發(fā)明還提供用于誘導(dǎo)受治療者中的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含本發(fā)明的減毒病毒和藥學(xué)可接受的載運(yùn)體(carrier)。本發(fā)明還提供改良的宿主細(xì)胞系，其特別地加工為允許在野生型宿主細(xì)胞中不能生存的減毒病毒。
[0023]此外，本發(fā)明提供合成本發(fā)明的減毒病毒的方法，所述方法包括(a)鑒別病毒基因組的至少一個非調(diào)節(jié) 部分內(nèi)的多個位置中的密碼子，所述密碼子可被同義密碼子取代；(b)為每個鑒別的密碼子選擇待置換的同義密碼子；和(c)將每個鑒別的密碼子置換為同義密碼子。
[0024]再者，本發(fā)明提供合成本發(fā)明的減毒病毒的方法，所述方法包括改變編碼相同氨基酸的現(xiàn)有密碼子在編碼區(qū)內(nèi)的順序，以調(diào)節(jié)密碼子對偏倚。
[0025]更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供合成本發(fā)明的減毒病毒的方法，所述方法合并了前兩種方法。
[0026]根據(jù)本發(fā)明，減毒病毒微粒通過將病毒基因組轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞制備，借以產(chǎn)生減毒病毒微粒。本發(fā)明還提供包含適于免疫接種的減毒病毒的藥物組合物。
[0027]本發(fā)明還提供用于引起受治療者中的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法、用于防止受治療者患上病毒相關(guān)疾病的方法和用于在感染病毒的受治療者中延遲病毒相關(guān)疾病的發(fā)作或減緩所述疾病的進(jìn)展速率的方法，所述方法包括向受治療者施用預(yù)防或治療有效劑量的本發(fā)明的疫苗組合物。
[0028]本發(fā)明還提供包含改良的病毒基因組的減毒病毒，所述改良的病毒基因組含有在基因組的多個位置加工的核苷酸置換，其中所述置換向基因組引入多個同義密碼子，其中所述核苷酸置換是通過包含如下步驟的過程選擇的:最初通過在各自的氨基酸允許位置隨機(jī)指定同義密碼子生成編碼序列，計算所述隨機(jī)選擇的編碼序列的密碼子對得分，并交換(a)編碼相同氨基酸的密碼子對或(b)根據(jù)模擬的退火優(yōu)化函數(shù)置換同義密碼子，并重復(fù)前一步驟直至對特定或充足次數(shù)的迭代不能觀察到進(jìn)一步的改進(jìn)(對得分或偏倚沒有變化)，直至所述解決方案收斂于優(yōu)化或接近優(yōu)化的值。
[0029]附圖簡述
[0030]圖1.合成的Pl衣殼設(shè)計中的密碼子使用統(tǒng)計。與Wt相比，PV-SD保持幾乎相同的密碼子頻率，而同時使序列內(nèi)的密碼子位置變化最大化。在PV-AB衣殼中，非優(yōu)選密碼子的使用被最大化。條的長度和每個條后面的數(shù)字指示每種密碼子在序列中的發(fā)生。作為參考，每種氨基酸的正常的人類同義密碼子頻率(“頻率”表示為百分比)在第三列中給出。
[0031]圖2.PV (M)、PV-AB 和 PV-SD 衣殼編碼區(qū)的序列比對。PV (M) (SEQ IDNO:1)、PV-AB (SEQ ID NO:2)和PV-SD (SEQ ID NO:3)的核苷酸序列使用MultAlin在線軟件工具(Corpet,1988)比對。序列上方的數(shù)字指在衣殼序列內(nèi)的位置。核苷酸I對應(yīng)于PV(M)病毒基因組中的核苷酸743。在共有序列中，同一核苷酸在所有三種序列中的發(fā)生通過大寫字母指示，同一核苷酸在三種序列中的兩種的發(fā)生通過小寫字母指示；而三種不同核苷酸在三種序列中的發(fā)生通過句點(diǎn)指示。
[0032]圖3.密碼子去優(yōu)化的病毒表型。(A)本研究中使用的病毒構(gòu)建體的概述。(B)在HeLa細(xì)胞單層中的一步生長動力學(xué)。(C至H)密碼子去優(yōu)化的病毒孵育48h(C至F)或72h(G和H)后的噬斑表型；用抗-3DP<)1抗體染色以顯現(xiàn)被感染的細(xì)胞。(C)PV(M)，(D)PV-SD, (E)PV-AB, (F)PV-AB755_1513，(G和H) PV-AB247ch2954。清除的噬斑區(qū)的輪廓是一圈受感染的細(xì)胞(C和D)。(H)對版塊G中顯示的孔進(jìn)行隨后的結(jié)晶紫染色后，PV-AB2470-2954沒有明顯的噬斑。(I和J)感染48小時后，免疫染色的PV(M)產(chǎn)生的噬斑(I)或PV-AB247ch2954產(chǎn)生的感染病灶(J)的邊緣的顯微照片。
[0033]圖4.密碼子去優(yōu)化導(dǎo)致比感染件降低。㈧從PV(M)(泳道I) ,PV-AB755-1513 (泳道
2)和PV-AB247ch2954 (泳道3)的純化的病毒微粒分離的病毒粒子基因組RNA的瓊脂糖凝膠電泳。(B)純化的PV(M)(泳道I)、PV-AB755_1513(泳道2)和PV-AB247ch2954 (泳道3)病毒微粒的銀染色的SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠。顯示了四個衣殼蛋白中較大的三個(VP1、VP2和VP3)，證明了病毒制品的純度和相對量。(C)使用脊髓灰質(zhì)炎病毒受體堿性磷酸酶(CD155-AP)融合蛋白探針的病毒捕獲ELISA的開發(fā)。使用病毒特異性抗體包被ELISA板，并施加含有未知病毒濃度的樣品，然后用CD155-AP檢測。病毒濃度使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，標(biāo)準(zhǔn)曲線用已知量的純化的wt病毒(E)平行制備。 (D)純化的病毒和提取的病毒粒子RNA的量使用分光光度方法定量，并計算微?；蚧蚪M等同物(I基因組=I病毒粒子)的數(shù)量。此外，病毒粒子濃度通過ELISA確定。每種病毒的感染滴度通過噬斑/感染病灶測定來確定，并且比感染性計算為PFU/微粒或FFU/微粒。
[0034]圖5.密碼子去優(yōu)化的和野生型病毒的體外翻譯。在基因組翻譯水平確定PV-AB表型。(A)在HeLa SlO提取物中、在外源添加氨基酸和tRNA存在下的標(biāo)準(zhǔn)體外翻譯揭示密碼子去優(yōu)化的基因組的翻譯能力與PV(M)Wt相比沒有差異。顯示的是在12.5% SDS-PAGE凝膠上分離的[35S]甲硫氨酸標(biāo)記的翻譯產(chǎn)物的放射自顯影圖。異常條帶(*)的身分是未知的。(B)未添加外源氨基酸和tRNA并存在競爭性細(xì)胞mRNA下未透析的HeLa SlO提取物中的體外翻譯揭示密碼子去優(yōu)化的PV基因組的翻譯能力的缺陷。顯示的是在10% SDS-PAGE凝膠上分離的脊髓灰質(zhì)炎病毒2C反應(yīng)性翻譯產(chǎn)物和P2)的蛋白質(zhì)印跡。2BC翻譯產(chǎn)物的相對量在每個泳道下面以wt條帶的百分比表示。
[0035]圖6.使用雙順反子報告基因復(fù)制子的體內(nèi)翻譯的分析確認(rèn)密碼子去優(yōu)化對PV翻譯的有害效應(yīng)。(A)雙順反子復(fù)制子的示意圖。各種Pl衣殼編碼序列插入螢火蟲熒光素酶基因(F-Luc)的上游。確定F-Luc表達(dá)相對于內(nèi)部對照(R-Luc)的變化水平允許定量轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)過Pl衣殼區(qū)的核糖體。(B)復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞并在2mM鹽酸胍存在下孵育7h以阻斷RNA復(fù)制。經(jīng)過Pl區(qū)的相對翻譯速率與密碼子去優(yōu)化的程度成反比。雖然兩種可生存的病毒構(gòu)建體PV-AB247ch2954和PV-AB2954_3386的衣殼編碼序列允許介于60%和80%之間的wt翻譯，低于20%的翻譯效率與PV-AB、PV-AB2470-3386和pv_AB1513_247°基因組中觀察到的致死表型有關(guān)。值代表3次獨(dú)立實(shí)驗的6個測定的平均。
[0036]圖7.確定人類和病毒ORF的密碼子對偏移。點(diǎn)代表針對一個ORF的長度繪圖的該ORF的每密碼子對的平均密碼子對得分。計算了 14，795個注釋的人類基因的密碼子對偏倚(CPB)。低表現(xiàn)的密碼子對產(chǎn)生負(fù)分。標(biāo)不了各種脊髓灰質(zhì)炎病毒Pl構(gòu)建體的CPB,通過帶箭頭的符號表示。該圖說明大量人類基因在0.1附近聚集。顯示了 PV(M)-Wt(標(biāo)記為“WT”)(-0.02)、定制的合成脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼PV-Max (+0.25)、PV-Min (-0.48)和PV (M) -wt =PV-Min 嵌合體衣殼 PV-Min755-247。( = “PV-MinXY”)(-0.31)和 PV_Min247CH3386 (=“PV-MinZ”)(-0.20)的CPB。病毒PV-SD和PV-AB是改變密碼子偏倚而不是改變密碼子對偏倚的結(jié)果。
[0037]圖8.密碼子對去優(yōu)化的脊髓灰質(zhì)炎病毒的特性。一步生長動力學(xué)揭示PV-Min755^2470和PV-Min247°_3385的PFU產(chǎn)生與PV (M) -wt相比降低2.5個數(shù)量級級別。然而，所有病毒產(chǎn)生相似數(shù)量的病毒微粒(未顯示于此圖)。結(jié)果，PFU/微粒比值被降低，這與密碼子去優(yōu)化的病毒PV-AB755_1513和pv-AB247°_2954類似(參見圖3B) (PFU是“噬斑形成單位”)。
[0038]圖9.嵌合病毒基因組的裝配。為了“掃描”經(jīng)過靶基因組(紅色)，通過重疊PCR擴(kuò)增或合成小的區(qū)段并將其引入wt基因組(黑色)。
[0039]圖10.用于產(chǎn)生甲型流感病毒的八質(zhì)粒poll-polll系統(tǒng)。將含有插入到人類polI啟動子和pol II啟動子之間的八種病毒CDNA的八種表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞。因為每種質(zhì)粒含有兩種不同的啟動子，細(xì)胞的pol I和polll 二者都將轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒模板(推測在不同的核區(qū)隔)，這將造成病毒mRNA和vRNA的合成。合成病毒聚合酶復(fù)合體蛋白質(zhì)(PB1、PB2、PA、核蛋白質(zhì))之后，病毒復(fù)制周期即啟動。最終，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器直接(polll轉(zhuǎn)錄)或間接(poll轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制)衍生的所有病毒分子的裝配，造成所有合成分子(vRNP和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)撤、嫩^2、吧2/肥?)的相互作用以產(chǎn)生感染性甲型流感病毒。(從Neumann等人，2000中復(fù)制。)(注意:存在從頭合成流感病毒的其他途徑)。
[0040]圖11.脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組和合成病毒構(gòu)建體。脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組和嵌合病毒構(gòu)建體的開放讀碼框。上，全長PV(M)-Wt基因組RNA的示意圖。下，PV(M)-wt、CPB定制的合成病毒PV-Max、PV-Min和PV (M)-wt:PV_Min嵌合體病毒的開放讀碼框。黑色對應(yīng)于PV(M)-wt序列，灰色對應(yīng)于PV-Min合成序列，而陰影(Thatched)對應(yīng)于PV-Max。突出顯示的病毒構(gòu)建體PV_Min755_247°(PV-MinXY)和PV_Min247°_3385 (PV-MinZ)由于突出的減毒表型而被進(jìn)一步表征。
[0041]圖12.—步生長曲線顯示相似動力學(xué)，產(chǎn)生具有降低的感染性的相似暈的微粒。(A)使用2 MOI感染HeLa R19細(xì)胞的單層，給定時間點(diǎn)(0、2、4、7、10、24、48hr)的PFU通過噬斑測定來測量。對應(yīng)的符號:(□ )PV(M)-wt，(.)PV-Max, ( O )PV-Min755-1513, (x)PV-Minl513-2470, ()PV-MinXY, ( Δ )PV-MinZ0 (B)顯示計算的每個時間點(diǎn)的 PFU/ml向微粒/ml的轉(zhuǎn)換。這是通過將PFU/ml乘以相應(yīng)的病毒比感染性實(shí)現(xiàn)的。對應(yīng)的符號和(A)中一樣。
[0042]圖13.通過改變CPB在體內(nèi)調(diào)節(jié)翻譯。㈧使用雙順反子RNA構(gòu)建體定量CPB對翻譯的體內(nèi)效應(yīng)。第一順反子利用丙型肝炎病毒(HCV)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)誘導(dǎo)Renilla熒光素酶(R-Luc)的翻譯。此第一順反子是用于歸一化輸入RNA的量的內(nèi)部對照。PV(M)-wt IRES控制的第二順反子誘導(dǎo)螢火蟲熒光素酶(F-Luc)的翻譯。構(gòu)建體中標(biāo)記“P1”的區(qū)域被各個相應(yīng)病毒Pl的cDNA取代。(B)將各個相應(yīng)的RNA構(gòu)建體在2mM鹽酸胍存在下轉(zhuǎn)染入HeLa R19細(xì)胞，并在6小時后測量R-Luc和F_Luc。相對于PV (M)-wt翻譯(100% )將 F-Luc/R-Luc 值歸一化。
[0043]圖14.合成病毒的熱滅活譜不發(fā)生變化。為了排除大規(guī)模密碼子對偏倚改良改變病毒粒子的總體形態(tài)學(xué)(如技術(shù)人員可預(yù)期的，如果衣殼蛋白被錯誤折疊的話)，測試了PVMinXY和PV-MinZ的熱穩(wěn)定性。等量的微粒在50°C下孵育，并經(jīng)由噬斑測定定量在給定時間段后剩余的感染性。如果合成病毒的衣殼被去穩(wěn)定，我們將預(yù)期與wt PV(M)相比在50°C下增加的生存力損失。情形不是這樣。兩種合成病毒的熱滅活動力學(xué)與wt相同。相比之下，Sabin-1病毒在編碼衣殼的基因組區(qū)中攜帶大量突變，這相稱地賦予此病毒與wtPVl (M)相比較低的熱穩(wěn)定性。
[0044]圖15.疫苗接種后的中和抗體滴度。一組八只CD155 tg小鼠(其中的七只完成了方案)各自通過以每周間隔的三次腹膜內(nèi)注射接種PV-MinZ (.)和PV-MinXY ( ?)的IO8個微粒,最后一次疫苗接種后10天測量血清轉(zhuǎn)換(serum conversion) 0橫跨每個數(shù)據(jù)集的水平線標(biāo)識每種病毒構(gòu)建體的平均中和抗體滴度。抗脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體滴度經(jīng)由微中和測定測量。(*)在最低測試的1: 8下未檢測到模擬疫苗接種的動物的病毒中和。
[0045]圖16.攜帶密碼子對去優(yōu)化的NP區(qū)段的流感病毒。(A) A/PR8_NPMin病毒是可生存的，并且與A/PR8 wt相比 在MDCK細(xì)胞上產(chǎn)生更小的噬斑。(B)A/PR8_NPMin病毒顯示延遲的生長動力學(xué)和低于野生型A/PR8 3-5倍的最終滴度。
[0046]圖17.檇帶密碼子對去優(yōu)化的PBl或HA和NP區(qū)段的流感病毒。㈧A/PR8-PBlMin_KK和A/PR8-HAMin/NPMin病毒是可生存的，并且與A/PR8野生型相比在MDCK細(xì)胞上產(chǎn)生更小的噬斑。(B)A/PR8-PBlMin_KK和A/PR8-HAMin/NPMin病毒顯示延遲的生長動力學(xué)和低于野生型A/PR8約10倍的最終滴度。
[0047]圖 18.BALB/c 小鼠樽型中 A/PRS-NP^11 的減毒。(A) A/PR8_NPMin病毒與野生型 A/PR8病毒相比具有降低的致病性，如通過疫苗接種后的體重下降所確定的。(B)用A/PR8-NPMin病毒疫苗接種的所有小鼠(八只中的八只)均存活，而在疫苗接種后13天，用A/PR8感染的小鼠僅有25% (八只中的兩只)存活。(C)用A/PR8-NPMin病毒疫苗接種的小鼠被保護(hù)不受IOOxLD5tl的A/PR8野生型病毒的攻擊。
[0048]發(fā)明詳述
[0049]本發(fā)明涉及可用作防止病毒感染和疾病的疫苗的減毒病毒的生產(chǎn)。因此，本發(fā)明提供一種減毒病毒，其包含改良的病毒基因組，所述改良的病毒基因組含有在基因組的多個位置加工的核苷酸置換，其中所述置換向基因組引入多個同義密碼子和/或引入同一氨基酸的現(xiàn)有密碼子的順序的變化(密碼子對利用的變化)。在兩種情形中，病毒基因產(chǎn)物的原始野生型氨基酸序列得到保留。
[0050]大多數(shù)氨基酸由多于一種密碼子編碼。參見表1中的遺傳密碼。例如，丙氨酸由G⑶、GCC、GCA和GCG編碼。三種氨基酸(Leu、Ser和Arg)都是由六種不同密碼子編碼的，而只有Trp和Met具有唯一密碼子?！巴x”密碼子是編碼同一氨基酸的密碼子。因此，例如，CUU、CUC、CUA、CUG、UUA和UUG是編碼Leu的同義密碼子。同義密碼子不是以均等的頻率使用的。一般而言，特定生物體中最頻繁使用的密碼子是相關(guān)的tRNA豐富的那些，并且這些密碼子的使用增加蛋白質(zhì)翻譯的速率和/或準(zhǔn)確度。相反，罕用密碼子的tRNA被發(fā)現(xiàn)處于相對較低的水平，并且認(rèn)為稀有密碼子的使用降低翻譯速率和/或準(zhǔn)確度。因此，用同義但是以更低頻率使用的密碼子取代核酸中的給定密碼子是將“去優(yōu)化的”密碼子置換入核酸。
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種減毒病毒，其包含病毒基因組，所述病毒基因組含有改良的蛋白質(zhì)編碼序列，所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列具有低于它所衍生自的母體蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對偏倚的密碼子對偏倚。
2.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列具有比所述母體蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對偏倚低至少約0.05的密碼子對偏倚。
3.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列具有比所述母體蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對偏倚低至少約0.1的密碼子對偏倚。
4.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列具有比所述母體蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對偏倚低至少約0.2的密碼子對偏倚。
5.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列具有約-0.05或更低的密碼子對偏倚。
6.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列具有約-0.1或更低的密碼子對偏倚。
7.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列具有約-0.3或更低的密碼子對偏倚。
8.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列具有約-0.4或更低的密碼子對偏倚。
9.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列與母體病毒的蛋白質(zhì)編碼序列具有低于90%的同一'丨生。
10.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列與母體病毒的蛋白質(zhì)編碼序列具有低于80%的同一'丨生。
11.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列和所述母體蛋白質(zhì)編碼序列編碼同一蛋白質(zhì)。
12.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列編碼與天然分離物具有約10氨基酸或更少差異的蛋白質(zhì)。
13.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列編碼與天然分離物具有約20氨基酸或更少差異的蛋白質(zhì)。
14.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列在至少約100核苷酸的長度上被改良。
15.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列在至少約500核苷酸的長度上被改良。
16.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列在至少約1000核苷酸的長度上被改良。
17.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述病毒感染動物或植物。
18.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述動物是人類。
19.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述病毒誘導(dǎo)動物宿主中的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
20.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列的回復(fù)突變于宿主中生長時被充分抑制。
21.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述病毒是DNA、RNA、雙鏈或單鏈病毒。
22.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述蛋白質(zhì)編碼序列編碼多蛋白。
23.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述核苷酸序列編碼衣殼蛋白。
24.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述病毒是脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、流感病毒、重癥急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、傳染性支氣管炎病毒、依波拉病毒、馬爾堡病毒、登革熱病毒、西尼羅病病毒、埃巴病毒(EBV)或黃熱病毒。
25.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述病毒是痘病毒、皰疹病毒、乳頭瘤病毒或腺病毒。
26.如權(quán)利要求24所述的減毒病毒，其中所述減毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒衍生自脊髓灰質(zhì)炎病毒I型(Mahoney)、脊髓灰質(zhì)炎病毒2型(Lansing)、脊髓灰質(zhì)炎病毒3型(Leon)、單價口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(OPV)病毒或三價OPV病毒。
27.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中核苷酸置換分布遍及所述改良的蛋白質(zhì)編碼序列。
28.如權(quán)利要求碼序列的一部分。
29.如權(quán)利要求27所述的減毒病毒，其中所述部分編碼衣殼的一種或多種蛋白質(zhì)。
30.如權(quán)利要求I至29的任一項所述的減毒病毒，其中所述病毒是小RNA病毒。
31.如權(quán)利要求30所述的減毒病毒，其中所述小RNA病毒是脊髓灰質(zhì)炎病毒。
32.如權(quán)利要求31所述的減毒病毒，其中所述病毒基因組的核苷酸序列包含SEQ IDNO:4或其部分。
33.如權(quán)利要求31所述的減毒病毒，其中所述病毒基因組的核苷酸序列包含SEQ IDNO:6。
34.如權(quán)利要求30所述的減毒病毒，其中所述小RNA病毒是鼻病毒。
35.如權(quán)利要求1所述的減毒病毒，其中所述核苷酸置換限制于所述改良的蛋白質(zhì)編34所述的減毒病毒，其中所述病毒基因組的核苷酸序列包含SEQ IDNO:30 或 SEQ ID NO:32 或其部分。
36.如權(quán)利要求1至29的任一項所述的減毒病毒，其中所述病毒是正黏病毒。
37.如權(quán)利要求36所述的減毒病毒，其中所述正黏病毒是流感病毒。
38.如權(quán)利要求37所述的減毒病毒，其中所述病毒基因組的核苷酸序列包含SEQIDNO:14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17,SEQ IDNO: 19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:25, SEQ ID NO:28和其部分中的一種或多種。
39.如權(quán)利要求37所述的減毒病毒，其中所述病毒基因組的核苷酸序列包含SEQIDNO:23o
40.如權(quán)利要求37所述的減毒病毒，其中所述病毒基因組的核苷酸序列包含SEQIDNO:15 和 SEQ ID NO:21。
41.如權(quán)利要求1至29的任一項所述的減毒病毒，其中所述病毒是黃病毒。
42.如權(quán)利要求41所述的減毒病毒，其中所述黃病毒是登革病毒。
43.如權(quán)利要求42所述的減毒病毒，其中所述病毒基因組的核苷酸序列包含SEQIDNO:34ο
44.如權(quán)利要求1至29的任一項所述的減毒病毒，其中所述病毒是反轉(zhuǎn)錄病毒。
45.如權(quán)利要求44所述的減毒病毒，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒是人類免疫缺陷病毒(HIV)。
46.如權(quán)利要求45所述的減毒病毒，其中所述病毒基因組的核苷酸序列包含SEQIDNO:36o
47.如權(quán)利要求1至29的任一項所述的減毒病毒，其中所述病毒是呼腸孤病毒。
48.如權(quán)利要求47所述的減毒病毒，其中所述呼腸孤病毒是輪狀病毒。
49.如權(quán)利要求48所述的減毒病毒，其中所述病毒基因組的核苷酸序列包含SEQIDNO:38 和 / 或 SEQ ID NO:40。
50.如權(quán)利要求1至29的任一項所述的減毒病毒，其中所述病毒是冠狀病毒。
51.如權(quán)利要求50所述的減毒病毒，其中所述冠狀病毒是重癥急性呼吸綜合征(SARS)病毒。
52.如權(quán)利要求51所述的減毒病毒，其中所述病毒基因組的核苷酸序列包含SEQIDNO:42ο
53.—種制備減毒病毒基因組的方法，所述方法包括:a)獲得母體病毒蛋白質(zhì)編碼區(qū)的核苷酸序列；b)重排所述核苷酸序列的密碼子以獲得如下的突變的核苷酸序列i)與所述母體病毒的編碼區(qū)編碼相同氨基酸序列，和.?)與所述母體病毒的編碼區(qū)相比具有降低的密碼子對偏倚；和c)將所述突變的核苷酸序列的全部或部分置換入所述母體病毒的核苷酸序列。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中重排密碼子包括隨機(jī)地選擇并交換編碼相同氨基酸的密碼子對和確定密碼子對偏倚是否被所述交換降低的步驟。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中重復(fù)所述步驟至密碼子對偏倚被降低期望的量。
56.如權(quán)利要求54所述的方法，其中重復(fù)所述步驟至密碼子對偏倚收斂于或接近優(yōu)化值。
57.如權(quán)利要求53至56的任一項所述的方法，其中步驟(a)和(b)在計算機(jī)上執(zhí)行。
58.如權(quán)利要求53所述的方法，其中步驟(c)通過從頭合成所述突變的核苷酸序列實(shí)現(xiàn)。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中用合成的DNA置換所述完整基因組。
60.如權(quán)利要求58所述的方法，其中用合成的DNA置換所述病毒基因組的一部分。
61.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述母體病毒是天然分離物。
62.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述母體病毒是天然分離物的突變體。
63.—種制備減毒病毒的方法，所述方法包括將通過如權(quán)利要求53所述的方法制備的減毒病毒基因組插入宿主生物體，借以生產(chǎn)減毒病毒。
64.一種用于誘導(dǎo)受治療者中的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其包含如權(quán)利要求1至52的任一項所述的減毒病毒和藥學(xué)可接受的載運(yùn)體。
65.如權(quán)利要求64所述的疫苗組合物，其中所述減毒病毒(i)不顯著改變病毒蛋白質(zhì)在受感染細(xì)胞中的合成和加工；(ii)在每個受感染細(xì)胞中產(chǎn)生與野生型病毒相似量的病毒粒子；和/或(iii)展示顯著低于野生型病毒的病毒粒子比感染性。
66.如權(quán)利要求64所述的疫苗組合物，其中所述減毒病毒在宿主動物中誘導(dǎo)與對應(yīng)的野生型病毒大致相似的免疫應(yīng)答。
67.一種用于引起受治療者中的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向受治療者施用預(yù)防或治療有效劑量的如權(quán)利要求64所述的疫苗組合物。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中所述受治療者已暴露于致病性病毒。
69.一種用于防止受治療者患上病毒相關(guān)疾病的方法，所述方法包括向受治療者施用預(yù)防有效劑量的如權(quán)利要求64所述的疫苗組合物。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其中所述受治療者已暴露于致病性病毒。
71.一種用于在感染病毒的受治療者中延遲病毒相關(guān)疾病的發(fā)作或減緩病毒相關(guān)疾病的進(jìn)展速率的方法，所述方法包括向受治療者施用治療有效劑量的如權(quán)利要求64所述的疫苗組合物。
72.如權(quán)利要求67至71的任一項所述的方法，其還包括向所述受治療者施用至少一種佐劑。
73.如權(quán)利要求73至71的任一項所述的方法，其中所述受治療者是哺乳動物或鳥。
74.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述哺乳動物是人類。
75.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述鳥是馴養(yǎng)的家禽物種。
76.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述哺乳動物是馴養(yǎng)的牲畜物種。
77.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述哺乳動物是牛。
78.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述哺乳動物是豬。
79.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述 哺乳動物是綿羊。
80.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述哺乳動物是馬。
81.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述哺乳動物是外來的動物園動物。
【文檔編號】A61K39/13GK103476425SQ200880018001
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2008年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2007年3月30日
【發(fā)明者】E·維默, S·斯基納, S·米勒, B·富歇爾, D·帕帕米謝爾, J·R·科爾曼, J·塞洛 申請人:紐約州州立大學(xué)研究基金會