專利名稱：一種疫苗佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗佐劑，尤其涉及化學(xué)式為Zn(OH)2，化學(xué)式量為 99.4046道爾頓的氫氧化鋅化合物，在制備疫苗佐劑方面的應(yīng)用，屬于免疫 學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鋅是所有生物體必需的微量元素，尤其是人體的生長發(fā)育離不開鋅。體 內(nèi)鋅水平的高低會對神經(jīng)、生殖和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響。鋅和機體免疫 系統(tǒng)之間的關(guān)系較為復(fù)雜，主要體現(xiàn)在以下四個方面①每日鋅的攝入與 吸收的量取決于食物的組分、個體年齡和健康狀況；②鋅作為300多種具 有生物活性的酶的輔助因子，能夠間接影響免疫系統(tǒng)；③鋅對淋巴細(xì)胞的 產(chǎn)生、成熟和功能都能產(chǎn)生直接影響；④鋅能夠影響免疫促進劑的功能。
利用以上鋅的特性，人們在某些疾病的治療中采用了鋅制劑輔助療法， 即在普通治療的同時給予患者一定劑量的鋅制劑，取得了良好的治療效果。 目前，已在感染性疾病、自身免疫病等多項臨床實驗中觀察到了鋅的積極 作用。
疫苗佐劑是當(dāng)今疫苗研究開發(fā)的熱點，理想疫苗佐劑需要具備安全、有 效、耙向和經(jīng)濟的特點。當(dāng)前，鋁佐劑是歷史最長的且應(yīng)用最為廣泛的被 批準(zhǔn)用于人體的疫苗佐劑，它主要依靠儲存庫效應(yīng)和免疫刺激效應(yīng)兩種機 制，顯著提高機體的免疫應(yīng)答。但作為佐劑，它在安全性和靶向性方面還 存在缺陷。而其他一些正在研究或已證實有佐劑作用的物質(zhì)，由于安全性、 有效性或經(jīng)濟方面問題，未能被批準(zhǔn)用于人體。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有疫苗佐劑在安全性等方面的缺陷，本發(fā)明經(jīng)過大量實驗和創(chuàng) 造性勞動，提供了一種安全、有效、穩(wěn)定、價廉的新型疫苗佐劑。
氫氧化鋅在等電點、水溶性等方面與氫氧化鋁具有較高的相似性，而且 制備工藝簡單、成本低廉。為此，我們將這種含鋅的化合物作為免疫佐劑， 應(yīng)用于疫苗制備，并在動物實驗中檢驗其免疫增強作用，結(jié)果顯示氫氧化 鋅作為佐劑與疫苗聯(lián)合應(yīng)用能夠有效增強疫苗的體液免疫應(yīng)答，其免疫增 強效果優(yōu)于鋁佐劑，并且其致敏性和安全性均優(yōu)于鋁佐劑。
3本發(fā)明的技術(shù)方案是化合物氫氧化鋅在制備疫苗的佐劑方面的應(yīng)用。 尤其是化合物氫氧化鋅在制備甲肝疫苗的佐劑方面的應(yīng)用?；衔餁溲趸?鋅與滅活的甲肝病毒抗原混合后免疫動物，能夠顯著增強抗原特異性的體 液免疫應(yīng)答。
所述化合物氫氧化鋅，其化學(xué)式為Zn(OH)2，化學(xué)式量為99.4046道爾頓。
所述化合物氫氧化鋅作為疫苗佐劑應(yīng)用于人體的推薦劑量為0.25 5mg。
本發(fā)明所述化合物氫氧化鋅和滅活甲肝病毒抗原混合物在動物實驗中 的應(yīng)用劑量為每只小鼠0.25 1.5mg氫氧化鋅和12.8EU滅活甲肝病毒抗 原。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點和效果①氫氧化鋅安全、無毒。 ②氫氧化鋅制備工藝簡單、成本低廉。③氫氧化鋅能夠高效刺激機體免疫 應(yīng)答，免疫增強效果優(yōu)于鋁佐劑。④氫氧化鋅致敏性和安全性優(yōu)于鋁佐劑。


圖l : 28周內(nèi)，使用不同劑量的氫氧化鋅對小鼠血清IgG水平的影響， 與滅活HAV抗原(無佐劑)組相比，P<0.05，與鋁佐劑組相比，P<0.05 圖2: A， HAVA1組腦病理，箭頭所示位置存在小膠質(zhì)細(xì)胞小結(jié)(40x); B， HAVA1免疫組的肝臟病理，未見異常(40x); C， HAVA1免疫組的腎臟 病理，未見異常(100x); E-F， HAVZn3免疫組的腦、肝、腎臟病理均未見 異常(40x)
圖3為G-I，' HAVZn4免疫組的腦、肝、腎臟病理，均未見異常(40x) 圖4為35天內(nèi)，氫氧化鋅對小鼠血清特異性IgE水平的影響，與OVA (無佐劑)組相比，P》0.05，與OVA鋁佐劑組相比，P<0.05，與OVA(無 佐劑)組相比，P<0.05。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施對本發(fā)明做進一步描述，但發(fā)明之內(nèi)容并不局限于此。 實施例1
1.氫氧化鋅的制備和定性定量分析
A、氫氧化鋅佐劑的制備將濃度為7mol/L的氨水溶液在6(TC持續(xù)攪 拌的條件下逐滴緩慢加入到濃度為0.6mol/L的醋酸鋅溶液中，至pH值達(dá) 到5.5并維持穩(wěn)定時，停止加入，然后持續(xù)加熱l小時，在容器壁上有白色膏狀物生成，將此白色膏狀物移入離心管中，14000rpm離心1分鐘，吸出 上清，所余白色沉淀用適量純水洗滌三次后，用純水混懸收集，得氫氧化 鋅懸濁液，將該氫氧化鋅懸濁液12rC下高壓滅菌20分鐘，備用。該化學(xué) 反應(yīng)的反應(yīng)方程式如下
(CH3COO)2Zn +2NH3 H20—Zn(OH)2+2CH3COONH4 B、氫氧化鋅的定性與定量分析
① 氫氧化鋅的定性分析鑒于Zn(OH)2是兩性化合物，分別取少量氫 氧化鋅懸濁液置于兩支中管內(nèi)，向兩支中管分別滴加稀鹽酸和氮水。觀察 白色懸濁液是否變澄清。反應(yīng)方程式如下
Zn(OH)2+2HCl — ZnCl2+2H20 Zn(OH)2+4NH3 — 〔Zn(NH3)4〕 2++20H-
② 氫氧化鋅的定量分析取一定量Zn(OH)2懸濁液，置于己精密稱重 的平皿上，于6(TC烘烤至重量不再減輕為止，再次精密稱重。即可通過計 算得出所取Zn(OH)2重量以及所制備Zn(OH)2懸濁液中Zn(OH)2的精確含
2.氫氧化鋅作為佐劑的免疫效果觀察
A、 動物免疫
將36只ICR小鼠分為六組、每組6只進行分組免疫，方案如下①滅 活甲肝病毒抗原組，在圖表中表示為HAV，每只小鼠應(yīng)用滅活甲肝病毒抗 原12.8EU腹腔注射;②滅活甲肝病毒抗原+鋁佐劑組，在圖表中表示為HAV Al,，每只小鼠應(yīng)用滅活甲肝病毒抗原12.8EU與lmg鋁佐劑混合物，腹腔 注射；③滅活甲肝病毒抗原+鋅1組，在圖表中表示為HAV Znl，每只小 鼠應(yīng)用滅活甲肝病毒抗原12.8EU與質(zhì)量為0.25mg的氫氧化鋅的混合物， 腹腔注射； 滅活甲肝病毒抗原+鋅2組，在圖表中表示為HAVZn2,每只 小鼠應(yīng)用滅活甲肝病毒抗原12.8EU與質(zhì)量為0.5mg的氫氧化鋅的混合物， 腹腔注射；(D滅活甲肝病毒抗原+鋅3組，在圖表中表示為HAVZn3，每只 小鼠應(yīng)用滅活甲肝病毒抗原12.8EU與質(zhì)量為l.Omg的氫氧化鋅的混合物， 腹腔注射； 滅活甲肝病毒抗原+鋅4組,在圖表中表示為HAVZn4,每只小 鼠應(yīng)用滅活甲肝病毒抗原12.8EU與質(zhì)量為1.5mg氫氧化鋅的混合 物，腹腔注射；
B、 小鼠血清的采集
分別于步驟2乂中所述分組免疫后第4、 8、 12、 16、 20、 24、 28周采取小鼠尾靜脈血，每只采取全血約IOO!U置于高壓滅菌過的Eppendorf管 中，37。C靜置1小時后4。C靜置過夜。次日離心后取上層血清，置于高壓滅 菌過的Eppendorf管中_ 20 °C中保存待檢。
C、 ELISA法測定步驟2.B中所取小鼠血清中抗-HAV IgG的抗體滴度 用通用的ELISA商品試劑盒按說明書所述方法測定上一步驟中所取小鼠血 清中抗-HAV IgG的抗體滴度。其中包被96孔酶標(biāo)板的抗原為純化的滅活 甲肝病毒抗原，待測樣品為步驟2，B中所取小鼠血清。方法中的陽性參照 品為小鼠抗-HAVIgG陽性的血清，陰性參照為未接觸過甲肝病毒抗原的小 鼠的抗-HAVIgG為陰性的血清。
D、 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析
對所獲得的實驗數(shù)據(jù)以X±SD表示均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差,SPSS11.5統(tǒng)計軟件進 行單因素方差分析，P < 0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
表l 28周內(nèi)，使用滅活HAV抗原與不同劑量氫氧化鋅免疫獲得的小鼠血清IgG水平
檢測組別
時間 (周)HAVHAVZnlHAVZn2HAVZn3HAVZn4HAVA1
430.43±6.14112.64±2.0880.00±3.12227.35±3.7092.04±4.167.97±11.62
8225.09±3.39645.65±1.55528.32±2.171288.25±4.301122.02±4.901288.25±2.4
1263.10±1.76575.44±1.68477.09±2.431278.50±8.59630.96±2.00285.10±3.86
1630.20±1.46489.78±1.46478.63±3.07734.51±6.04368.13±3.15141.25±5.61
203.3U5.15489.78±1.86195.00±1.70451.86±7.76320.63±4.7389.80±5.31
240489.78±1.46262.18±4.66483.06±8.80369.83±2.1418.55±14.75
280120.78±2.2188.25士4.36183.65±8.2369.50±2.8121.54±5.08
通過數(shù)據(jù)分析可以看出，從第四周開始，各實驗組都能產(chǎn)生抗-HAV抗 體，并普遍于第8周達(dá)到峰值。其中HAVZn3組所取得的免疫效果最佳， 28周之內(nèi)其抗體滴度水平都顯著高于HAV組，P<0.05，且能夠在檢測期 間維持較高的水平。且除第8周外，該組小鼠產(chǎn)生的抗體滴度都高于鋁佐 劑組，P<0.05。第12周之后，其它實驗組也都產(chǎn)生了顯著高于HAV組的 抗體水平。且在第4、 24、 28周時，大多數(shù)Zn佐劑組的抗體水平都高于鋁
6佐劑組，P<0.05。提示氫氧化鋅具有能夠增強HAV抗原的免疫效果的作 用。另見圖1。
E、小鼠腦、肝臟、腎臟病理切片觀察實驗
選取滅活甲肝病毒抗原+鋁佐劑組，在圖表中表示為HAVA1;滅活甲肝 病毒抗原+鋅3組在圖表中表示為HAVZn3以及滅活甲肝病毒抗原+鋅4 組,在圖表中表示為HAVZn4三組小鼠進行腦、肝臟、腎臟病理切片觀察實 驗。方法如下①甲醛固定液的配制取市售含量為36%-40%的甲醛液10ml, 加純水稀釋定容至100ml;②組織樣本的固定拉頸處死小鼠，取出肝臟、 腎臟和腦，于甲醛固定液中固定1周；(D組織切片的制備將經(jīng)甲醛固定 液固定后的組織塊切取平整，修掉一些不規(guī)則的部位，然后用一定流速的 自來水沖洗組織塊去除甲醛固定液，再對組織塊用不同濃度的乙醇溶液進 行脫水處理，所用酒精濃度由最初的70%逐步遞增直至過渡到使用無水乙 醇進行脫水。經(jīng)過脫水劑脫水后的組織塊浸入二甲苯中進行透明化，至光 線基本能透過組織，組織呈透明或半透明狀則將組織塊從透明劑中取出， 二甲苯作為透明劑把脫水劑置換出來。將經(jīng)過透明后的組織塊從二甲苯中 取出進行浸蠟處理將組織塊直接投進已于6(TC的恒溫中熔化的"52-54°C 切片石蠟"中浸泡60分鐘后，再順序浸入已于6(TC的恒溫中熔化的"54-56 。C切片石蠟"和"56-58'C切片石蠟"內(nèi)，各2小時。將經(jīng)過固定、脫水、 透明、浸蠟處理的組織塊用加熱融化的包埋蠟選用用合適大小的包埋框進 行包埋。之后利用切片機對石蠟包埋的組織塊進行切片。切片用HE染色后， 在顯微鏡下觀察，對比各實驗組動物各組織切片的病理差別。從病理切片 中可以看出，HAVA1組可見大腦皮質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)數(shù)個膠質(zhì)細(xì)胞小結(jié)，證明鋁佐 劑對神經(jīng)系統(tǒng)有損傷，這與文獻報道相同；而HAVZn3免疫組的腦、肝、 腎臟病理均未見異常，可初步判斷氫氧化鋅的安全性要高于鋁佐劑。此外， 增加氫氧化鋅用量至1.5mg，即HAVZn4組，病理切片仍未呈現(xiàn)病變狀況。 這就進一步證明了較理想劑量更高的氫氧化鋁對機體也是安全的，見圖2、 圖3。
3.氫氧化鋅引起卵清蛋白即OVA特異性IgE的效果分析 A、從步驟2的實驗中優(yōu)選并確定作為佐劑取得的免疫效果的最佳氫氧 化鋅劑量為lmg，以BALB/c小鼠為實驗動物，使用V級的卵清蛋白即OVA 作為誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性IgE的抗原，與氫氧化鋅混合，檢測氫氧化鋅誘 導(dǎo)機體IgE的效果。具體方法如下取BALB/c小鼠18只，，每組6只，分為3組，①單純免疫OVA組，在圖表中表示為OVA,每只鼠分別于第0和 第7天腹腔注射OVA 100昭;②OVA鋁佐劑組,在圖表中表示為OVA+Al，每 只鼠分別于第0和第7天腹腔注射OVA 100嗎與Al(OH)3lmg的混合物;③ OVA鋅佐劑組，在圖表中表示為OVA+Zn，每只鼠分別于第0和第7天腹 腔注射OVA 100嗎與lmgZn(OH)2lmg的混合物。
B、 小鼠血清的采集
分別于步驟3.A所述方法的首次免疫后第8、 14、 21和35天采取小鼠尾靜 脈血，方法與步驟23相同。
C、 ELISA法測定上步驟3.B中所取小鼠血清中抗OVA-IgE的滴度 用通用的ELISA商品試劑盒按說明書所述方法測定上一步驟中所取小鼠血 清中抗-OVA IgE的抗體滴度。其中包被96孔酶標(biāo)板的抗原為OVA，待測 樣品為步驟33中所取小鼠血清，方法中的陽性參照品為小鼠抗OVA-IgE 為陽性的血清，陰性參照為未接觸過OVA抗原的小鼠的OVA-IgE為陰性 的血清。
D、 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析
對所獲得的實驗數(shù)據(jù)以X士SD表示均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差,SPSS11.5統(tǒng)計軟件進 行單因素方差分析，P < 0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
通過數(shù)據(jù)分析可得到如下結(jié)果在初次致敏后第8、 14、 35天時， OVA+Zn組小鼠的抗-OVA IgE水平與OVA組基本持平，PX).05;且在第8、 14天顯著低于OVA+A1組,P〈0.05;說明氫氧化鋅致敏性低于鋁佐劑。見圖 4。
表2卵清蛋白(OVA)與不同劑量氫氧化鋅免疫獲得的小鼠血清IgE水平
檢測時間 -^~~^-
__OVA+Zn_OVA+A1
第8天 0 2.15±3.55 44.67±2.76
第14天 3.41±6.70 3.04±6.32 142.89±3.86
第21天 2.88±6.01 22.39±1.97 63.58±5.08
第35天 0 1.65±3.39 5.01±6.60
權(quán)利要求
1、化學(xué)式為Zn(OH)2，化學(xué)式量為99.4046道爾頓的化合物氫氧化鋅在制備疫苗的佐劑方面的應(yīng)用。
2、 如權(quán)利要求1 ，化學(xué)式為Zn(OH)2，化學(xué)式量為99.4046道爾頓的 化合物氫氧化鋅在制備甲肝疫苗的佐劑方面的應(yīng)用。
3、 如權(quán)利要求1所述的化學(xué)式為Zn(OH)2，化學(xué)式量為99.4046道爾 頓的化合物氫氧化鋅在制備疫苗的佐劑方面的應(yīng)用，所述由化合物氫氧化 鋅制備的佐劑能夠誘導(dǎo)增強機體的體液免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疫苗佐劑，即化學(xué)式為Zn(OH)₂，化學(xué)式量為99.4046道爾頓的化合物氫氧化鋅在制備疫苗的佐劑方面的應(yīng)用。進一步是在制備甲肝疫苗的佐劑方面的應(yīng)用。所述氫氧化鋅作為佐劑與疫苗聯(lián)合應(yīng)用能夠有效增強疫苗的體液免疫應(yīng)答，其免疫增強效果優(yōu)于鋁佐劑，并且動物試驗結(jié)果顯示，氫氧化鋅作為新型的疫苗佐劑其致敏性和安全性均優(yōu)于鋁佐劑。
文檔編號A61K39/39GK101444623SQ20081023376
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日
發(fā)明者烏美妮, 王海漩, 胡云章, 胡凝珠 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所