專利名稱：用于活化免疫細胞的組合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及活化動物體內(nèi)免疫細胞活性的組合物及其制備方法。
背景技術：
近年來有許多研究發(fā)現(xiàn)蘑菇菌絲體或子實體中含有相當多的生理活性成分，包含多糖體、三萜類、蛋白質(zhì)、核酸、類固醇等，上述成分具有抗腫瘤、增強免疫力、降低高血壓、降血糖、抑制血小板凝集、抗病毒等功效。 已知多糖體具有抗腫瘤的功效，其生理活性可依多糖體的分子量大致區(qū)分為三類(A)分子量在3，000 5，000左右，具有降低血糖的功能，(B)分子量在10，000 100， 000之間，具消炎的作用，(C)分子量為約30， 000以上，則具有抗腫瘤作用，且分子量越大效用越佳。 以往蘑菇多糖體大多萃取自子實體，但是子實體來源有限；近來研究已知約有50%蘑菇類可于液態(tài)培養(yǎng)中產(chǎn)生胞外多糖體，所以可取其培養(yǎng)液進行多糖體純化；相比于子實體培養(yǎng)，液態(tài)培養(yǎng)較為迅速而簡單。 目前市面上蘑菇萃取物的產(chǎn)品眾多，特別是含有蘑菇萃取物的健康食品。因此，增加蘑菇萃取物營養(yǎng)價值的配方、蘑菇萃取物的新應用或新產(chǎn)品等相關需求，仍有其必要性。
在健康食品的領域中，益生菌亦是研究重點之一。人體的腸道內(nèi)所分布的菌相，據(jù)估計有超過100種以上的細菌存在，其中由30 40種細菌構成99%的菌量，且厭氧菌較好氧菌占優(yōu)勢，約多一百到一萬倍。消化道不同區(qū)域存在著不同的菌種及不同的數(shù)量分布。這些腸內(nèi)菌群彼此形成共生、拮抗的關系，而在健康的個體中維持菌叢生態(tài)的平衡。其中，少部分細菌對人體有害，例如產(chǎn)氣莢膜梭菌及金黃葡萄球菌，會因宿主免疫力下降而伺機增生，造成疾病；然而，棲息于健康人體腸道的細菌絕大多個對人體有益，一般稱為有益菌(beneficialbacteria)，其中以乳酸菌(Lactic acid bacteria)或雙歧桿菌(Bifidobacterium)最廣為人知。 已有許多研究報告指出，有益菌具有多種促進人體健康的功能，包括(1)維持腸道正常微生物相通過有益菌代謝所產(chǎn)生的醋酸和乳酸，使腸道有效維持在較低的pH值，使病原性及腐敗性細菌不易生長；(2)活化免疫系統(tǒng)有益菌具有剌激免疫系統(tǒng)、增加抗體或巨噬細胞的活性，其細胞壁含有某些抗原成分，可誘發(fā)宿主免疫系統(tǒng)活化、抑制腫瘤，或使宿主產(chǎn)生抗體以抑制病原菌吸附在腸黏膜表面上；(3)提高營養(yǎng)價值以雙歧桿菌為例，其具有酸化作用及蛋白質(zhì)水解活性，可改變食物中含氮化合物組成而提高蛋白質(zhì)消化率，并可促進鈣及其他營養(yǎng)的吸收，進而預防骨質(zhì)疏松癥，甚至，某些菌株可合成多種維生素與葉酸；(4)促進乳酸代謝；(5)改善腹瀉便秘有益菌產(chǎn)生的有機酸能增進腸道蠕動，提高糞便中的水分含量，以降低腸阻滯；(6)降低血中膽固醇雖然此功能仍具爭議，但由部分體外試驗結(jié)果得知，某些有益菌能使膽固醇與去結(jié)合型膽鹽共沉淀而隨糞便排出人體，也有動物試驗結(jié)果顯示，食用乳酸菌可降低血中膽固醇的濃度；(7)抑制高血壓有益菌的某些代謝物能抑制血管收縮素轉(zhuǎn)化而使血壓降低。
科學家研究有益菌的作用機制而發(fā)現(xiàn)有益菌會生產(chǎn)有益菌益生元(Prebiotics)，對人體健康的促進或維護有最良好的作用。 因此，本發(fā)明根據(jù)上述概念并因應市場需求，開發(fā)出具保健功效的新型組合物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在提供一種活化動物體內(nèi)免疫細胞活性的組合物。 為達到上述及其他目的，本發(fā)明的組合物包括蘑菇成分、有益菌成分及賦形劑。
根據(jù)本發(fā)明，蘑菇成分包含蘑菇菌絲體。本發(fā)明組合物的蘑菇成分包含蘑菇多糖
體，特別是P-葡聚糖。本發(fā)明的蘑燕成分除了蘑燕多糖體之外，還可包含蘑燕代謝產(chǎn)物，
例如蛋白質(zhì)、多肽類、三萜類、多種氨基酸、生物堿、酯類和有機酸等物質(zhì)。本發(fā)明的組合
物，可包含一種蘑菇成分或多種蘑菇成分的混合物。 根據(jù)本發(fā)明，所述蘑菇選自裂褶菌(Schizophyllum commue)、巴西蘑菇(Agarics blaze)、冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis)、靈芝(Ganoderma lucidum)、云芝(Coriolus versicolor)、樟芝(Anthodiacamphorate)、桑黃(Phelli皿s linteus)、珊瑚燕(Pleurotuscitrinopileatus)、香燕(Xenti皿la edodes)、柳松燕(Agrocybe aegerita)、猴頭燕(Hericium erinaceus)、杏鮑燕(Pleurotus eryngiig)、花辧葺(Sparrasiscrispa)、黑木耳(Auricularia auricula)、金針燕(Flammulinavelutipes)或上述蘑燕的組合。 根據(jù)本發(fā)明，有益菌成分包含有益菌菌體，且該有益菌選自嗜酸性乳桿菌
(Lactobacillus acidophilus)、雙歧桿菌(Bif idobacteriumlongum)、靜J干酪乳桿菌
(Lactobacillus paracasei)、腸球菌(Enterococcusfaecium)或其組合。 根據(jù)本發(fā)明，有益菌成分包含有益菌菌種于培養(yǎng)過程中所產(chǎn)生的有益菌益生元。 根據(jù)本發(fā)明，有益菌成分是有益菌菌體、有益菌益生元或其混合物。 根據(jù)本發(fā)明，賦形劑是，例如而非限制，薏仁、乳糖、白糖、D-甘露醇、淀粉、玉米淀
粉、纖維素晶體或無水硅酸；在優(yōu)選實施例中，賦形劑為乳糖；在另一優(yōu)選實施例中，賦形
劑為薏仁。 本發(fā)明的組合物進一步包含添加物，該添加物可為藥學上、食品上或美容上可接受的添加物。 在本發(fā)明的實施例中，添加物為食品；在優(yōu)選實施例中，添加物選自米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻或其混合物；在更優(yōu)選實施例中，添加物為糙米、玉米或兩者的混合物。
本發(fā)明的另一目的是提供包含一種或多種蘑菇成分、一種或多種有益菌成分及賦形劑的組合物。在優(yōu)選實施例中，蘑菇選自裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、黑木耳、金針菇或其組合；有益菌選自嗜酸性乳桿菌、雙歧桿菌、副干酪乳桿菌、腸球菌或其組合；且該賦形劑為乳糖或薏仁。
根據(jù)本發(fā)明，組合物可供直接使用，或可視需要混合載體、藥物、食品、美容產(chǎn)品或其他成分以供后續(xù)使用。 本發(fā)明的另一目的是提供包含一種或多種蘑菇成分、一種或多種有益菌成分及添加物的組合物。在優(yōu)選實施例中，蘑菇選自裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、黑木耳、金針菇或其組合；有益菌選自嗜酸性乳桿菌、雙歧桿菌、副干酪乳桿菌、腸球菌或其組合；添加物選自米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻或其混合物。在更優(yōu)選實施例中，添加物為糙米、玉米或兩者的混合物。
根據(jù)本發(fā)明，組合物可供直接使用，或可視需要混合載體、藥物、食品、美容產(chǎn)品或其他成分以供后續(xù)使用。 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備活化動物體內(nèi)免疫細胞活性的組合物的方法，
包括下列步驟取蘑菇菌絲體進行液態(tài)培養(yǎng)，以獲得蘑菇成分；以適當培養(yǎng)基培養(yǎng)有益菌，
以獲得有益菌成分；及混合蘑菇成分、有益菌成分與賦形劑，以獲得組合物。 根據(jù)本發(fā)明，蘑菇選自裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚
菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、黑木耳、金針菇或其組合。 根據(jù)本發(fā)明，液態(tài)培養(yǎng)所得的蘑菇成分包含蘑菇菌絲體及/或蘑菇多糖體。 根據(jù)本發(fā)明，有益菌選自嗜酸性乳桿菌、雙歧桿菌、副干酪乳桿菌、腸球菌或其組合。 根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)適當培養(yǎng)基所獲得的有益菌成分包含有益菌菌體及/或有益菌益生元。 根據(jù)本發(fā)明，賦形劑是薏仁、乳糖、白糖、D-甘露醇、淀粉、玉米淀粉、纖維素晶體或無水硅酸；在優(yōu)選實施例中，賦形劑為乳糖；在另一優(yōu)選實施例中，該賦形劑為薏仁。
本發(fā)明的方法進一步包含加入添加物以形成組合物，其中添加物選自米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻或其混合物。
圖1為本發(fā)明的蘑菇與有益菌組合物制備流程。 圖2是長條圖，其是根據(jù)本發(fā)明的實施例，顯示本發(fā)明的蘑菇與有益菌組合物對于大白鼠體內(nèi)自然殺傷細胞活性的影響；其中Control為對照組、A與B為喂食益生菌組、C與D為喂食本發(fā)明組合物組。
具體實施例方式
以下是通過特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說
明書所揭示的內(nèi)容了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。
1.蘑菇菌種培養(yǎng) 本發(fā)明可使用的蘑菇菌株如裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、田頭菇屬如柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、黑木耳、金針菇等，但不限于上述菌株。選擇其一進行培養(yǎng)。 將菌種接種于預瓊脂培養(yǎng)基(預瓊脂培養(yǎng)基包含0. 3 % (w/w)酵母菌萃取物、0. 3%麥芽萃取物、0. 5%蛋白胨、1. 0%右旋糖、1. 5%瓊脂等)上，置于2『C培養(yǎng)，其中依菌種不同，菌絲體長滿固體培養(yǎng)基所需培養(yǎng)時間約7天 20天；例如裂褶菌約培養(yǎng)后2-3天可見菌絲體，約5-7天可長滿固體培養(yǎng)基。 將上述固態(tài)培養(yǎng)菌絲體切一小塊植入預培養(yǎng)液50毫升，于80T的T型動物細胞培養(yǎng)盒中，在2『C培養(yǎng)一周，作為液態(tài)前置發(fā)酵的菌種。 于廣口血清瓶中配制800毫升的預培養(yǎng)液，并放入攪拌子后滅菌，將在T型塑料培養(yǎng)盒培養(yǎng)完成的蘑菇菌液接種于血清瓶內(nèi)，接種比例為每10毫升新鮮培養(yǎng)液接種入1毫 升菌液，而后將血清瓶置于磁石攪拌機(轉(zhuǎn)速300rpm)上，于室溫下攪拌，以進行第一次前 置發(fā)酵，培養(yǎng)72至96小時后，胞外多糖體濃度達最高。 以相同步驟，于10公升血清瓶中配制約8公升培養(yǎng)液(1公升培養(yǎng)液中含10克 蛋白胨、10克牛肉萃取物、5克酵母菌萃取物、20克右旋糖、1克Tween 80、2克檸檬酸銨、 5克CH3COONa、0. 1克MgS04C. 7H20、0. 05克MnS04C. H20與2克K2HP04 ;并將酸堿值調(diào)成pH 6. 2-6. 5)，接種第一次前置發(fā)酵完成的菌液，進行第二次前置發(fā)酵。 當然，得視需要進行多次的前置發(fā)酵。接著，將前置發(fā)酵完成的發(fā)酵液進行大量發(fā) 酵。 于20公升聚碳酸酯樹脂(Polycarbonate, PC)培養(yǎng)容器中配制13公升最適化的 生產(chǎn)培養(yǎng)基(包含4%葡萄糖與0. 5%酵母菌萃取物)，攪拌均勻后，蓋上硅膠塞，以高溫高 壓滅菌，其中滅菌條件為12rC、15分鐘，放涼至室溫。而后，將2-3公升上述第二次前置發(fā) 酵完成的菌液接種入聚碳酸酯樹脂培養(yǎng)容器中，放置于搖擺機上，設定轉(zhuǎn)速為80rpm，于常 溫(約25tO下進行發(fā)酵至生長曲線的靜止期(stationaryphase)，此時期的菌絲體細胞 數(shù)與多糖體濃度維持衡定，即停止發(fā)酵。所得培養(yǎng)液體包含蘑菇多糖體、蛋白質(zhì)、多肽類、三 萜類、多種氨基酸、生物堿、酯類和有機酸等物質(zhì)。
2.有益菌培養(yǎng)及有益菌代謝物制備 進行有益菌菌種培養(yǎng)，其中該有益菌為嗜酸性乳桿菌、雙歧桿菌、副干酪乳桿菌， 或腸球菌。 將菌種接種于平面固體培養(yǎng)基(1公升培養(yǎng)液中含10克蛋白胨、10克牛肉萃取 物、5克酵母菌萃取物、20克右旋糖、1克Tween 80、2克檸檬酸銨、5克CH3COONa、0. 1克 MgS04C. 7H20、0. 05克MnS04C. H20、2克K2HP04與15克瓊脂，并將酸堿值調(diào)成pH 6. 2-6. 5)， 置于37t:培養(yǎng)。依菌種不同，約1天 3天可于培養(yǎng)基上長出菌落。 挑單一菌落進行小量液態(tài)培養(yǎng)，接著進行大量培養(yǎng)，利用不同的現(xiàn)有生長培養(yǎng)基 成分可獲得不同的有益菌代謝物與有益菌益生元。培養(yǎng)液可直接用于后續(xù)組合物制備，也 可將菌體與培養(yǎng)液以離心方式分開，而僅以菌體供后續(xù)使用。
3.本發(fā)明組合物的制備
(實施例1) 將由上述方法所得的蘑菇發(fā)酵液與有益菌培養(yǎng)液混合后，利用高速均質(zhì)機以 12， OOOrpm處理10分鐘而得均質(zhì)溶液。而后加入乳糖賦形劑，其中均質(zhì)溶液與賦形劑的比 例為l : l，混合均勻后，經(jīng)冷凍后，以低溫真空干燥(lyophilization)處理，其中低溫真空 干燥的操作條件為-40°C、0. 3MPa，藉以將混合物濃縮至形成含水率低于5%的粉末。
根據(jù)需要將乳糖替換為其他賦形劑，例如薏仁、白糖、D-甘露醇、淀粉、玉米淀
粉、纖維素晶體或無水硅酸。
(實施例2) 將由上述方法所得的蘑菇發(fā)酵液與有益菌培養(yǎng)液混合，經(jīng)由高速均質(zhì)機以 12，000rpm處理10分鐘而得均質(zhì)溶液，再加入預先磨碎的糙米顆粒(發(fā)酵液糙米的比例 為2 : l)，均勻混合后進行冷凍干燥處理。將冷凍干燥后的混合物在1(TC下利用高速均質(zhì) 機磨成粉末，以獲得含有蘑菇成分與有益菌成分的組合物粉末。
6
根據(jù)需要將糙米替換為其他谷類，例如米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻及其混 合物。 4.本發(fā)明組合物用于活化免疫細胞活性的效果
動物模式 選用五周齡的雄性Wistar大白鼠(來源臺灣大學動物中心)，重量為380 450 克。實驗前將大白鼠分別單獨飼養(yǎng)，室溫控制于21±21:、濕度65±5%，光暗循環(huán)時間為 12D:12L，待適應兩星期后開始進行實驗。 以本發(fā)明組合物喂食大白鼠三天，每天0.2毫升。三天后使用LIVE/DEAD Cell-Mediated Cytotoxicity試劑盒(Molecular Probes)測定血液中自然殺傷細胞活性， 實驗步驟如下 將YAC-1細胞濃度調(diào)成1Xl()6細胞/毫升。依比例加入DI0(^(10iiLDI0(^/毫 升YAC-1細胞懸浮液)并混和均勻。于37t:培養(yǎng)20分鐘。將細胞濃度調(diào)成lX106cell/ 以RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone)將淋巴球細胞調(diào)成細胞濃度2X 106cell/毫升。 將染色后的YAC-1細胞20微升加入的脾臟淋巴球懸浮液200微升中，并加入220微升的PI 溶液(40微克/毫升)染色，以1000Xg離心30秒后，再于37t:培養(yǎng)2小時。以流式細胞 儀測量淋巴球活性。 結(jié)果如圖2所顯示，與對照組相比較，本發(fā)明組合物確實可提升自然殺傷細胞的 活性。 本發(fā)明的組合物除可活化免疫細胞活性外，更具有以下所述的優(yōu)點與功效
本發(fā)明的組合物還具有其他保健功效，如抑制有害細菌生長、補充營養(yǎng)、吸附有毒 物質(zhì)、改善膚質(zhì)等，故可增進動物體或人體的健康、減少疾病損害。 本發(fā)明的組合物所包含的有益菌益生元包含有機酸(如乳酸或醋酸)與抗菌因 子，可抑制對動物體或人體有害細菌的生長。 本發(fā)明的組合物可提供豐富營養(yǎng)成分，主要為蘑菇及有益菌在培養(yǎng)過程中所生
成，例如蘑菇多糖體、蛋白質(zhì)、多肽類、三萜類、多種氨基酸、生物堿、酯類、有機酸、維生素
B群及酵素等，可添加至食品或飼料，供動物體或人體所需的營養(yǎng)，做為添加用。 另外，本發(fā)明的組合物可中和與吸附毒素，故可減低人體對硝胺及苯酚類的吸收
而降低致癌風險。本發(fā)明的組合物也可降低膽固醇吸收率、強化單雙糖的應用并降低其體
內(nèi)吸收率，可應用于糖尿病患者的飲食控制與營養(yǎng)補充。 本發(fā)明的組合物可溶于水，取其水溶液涂抹于皮膚，可迅速被皮膚吸收，并活化皮 膚組織中的免疫細胞(如吞噬細胞及制造膠原蛋白的纖維母細胞)，可改善膚質(zhì)并預防皮 膚病。 上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的組合物與制備方法，而非用于限制本發(fā)明。任 何本領域技術人員均可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾與改變。 因此，本發(fā)明的權利保護范圍如權利要求所述。
權利要求
一種活化動物體內(nèi)免疫細胞活性的組合物，包括蘑菇成分；有益菌成分；及賦形劑。
2. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中蘑菇成分包含蘑菇菌絲體。
3. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中蘑菇成分包含蘑菇多糖體及/或蘑菇代謝物。
4. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中有益菌成分包含有益菌菌體。
5. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中有益菌成分包含有益菌益生元。
6. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中蘑菇選自裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、黑木耳、金針菇或上述蘑菇的組合。
7. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中有益菌選自嗜酸性乳桿菌、雙歧桿菌、副干酪乳桿菌、腸球菌或其組合。
8. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中賦形劑為乳糖、薏仁、白糖、D-甘露醇、淀粉、玉米淀粉、纖維素晶體或無水硅酸。
9. 根據(jù)權利要求l所述的組合物，進一步包括谷類。
10. 根據(jù)權利要求8所述的組合物，其中谷類選自米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻或其混合物。
11. 一種制備活化動物體內(nèi)免疫細胞活性的組合物的方法，包括下列步驟取蘑菇菌絲體進行液態(tài)培養(yǎng)，以獲得蘑菇成分；以適當培養(yǎng)基培養(yǎng)有益菌，以獲得有益菌成分；及混合蘑菇成分、有益菌成分與賦形劑，以獲得組合物。
12. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，蘑菇選自裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、黑木耳、金針菇或上述蘑菇的組合。
13. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，有益菌選自嗜酸性乳桿菌、雙歧桿菌、副干酪乳桿菌、腸球菌或上述的組合。
14. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，賦形劑為乳糖或薏仁。
15. 根據(jù)權利要求11所述的方法，進一步包含加入谷類。
16. 根據(jù)權利要求15所述的方法，其中，谷類選自米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻或其混合物。
17. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中蘑菇成分包含蘑菇菌絲體及/或蘑菇多糖體。
18. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中有益菌成分包含有益菌菌體及/或有益菌益生元。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于活化免疫細胞的組合物及其制備方法。特別地，本發(fā)明提供一種活化動物體內(nèi)免疫細胞活性的組合物，該組合物包括蘑菇成分，有益菌成分及賦形劑。本發(fā)明還提供該組合物的制備方法，包括取蘑菇菌絲體進行液態(tài)培養(yǎng)，以獲得蘑菇成分；以適當培養(yǎng)基培養(yǎng)有益菌，以獲得有益菌成分；及混合所得蘑菇成分、有益菌成分與賦形劑，以獲得該組合物。
文檔編號A61P37/02GK101766657SQ20081018774
公開日2010年7月7日 申請日期2008年12月31日 優(yōu)先權日2008年12月31日
發(fā)明者陳秀男 申請人:陳秀男