專利名稱：：新型溶纖維蛋白酶、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型溶纖維蛋白酶、其制備方法及用途。
背景技術(shù)：
：當(dāng)血管受損時(shí)，通過凝血作用于傷口處形成"血液凝塊"，以作為暫時(shí)性的屏障，阻止血液自傷口流出，并抵抗血管內(nèi)壓力而使傷口得以復(fù)原。血液凝塊主要是由稱為"纖維蛋白(fibrin)"的初級(jí)蛋白所構(gòu)成，纖維蛋白是由其前體"纖維蛋白原(fibrinogen)"在凝血酶(thrombin)作用下轉(zhuǎn)變成的(Voet和Voet，1990)。在健康的人體中，血液凝塊的穩(wěn)定性，包括血塊收縮性(bloodclotretraction)及溶纖性(fibrinolyticproperties)等，受到血液凝塊形成過程中所具有的結(jié)構(gòu)性、生物性、生理性及化學(xué)性特征的影響(Weisel，2007)。在生理平衡的環(huán)境下，血液凝塊最終會(huì)被溶纖維蛋白酶(plasmin)分解，以避免在血管中形成栓塞(thrombosis)。若血液凝塊未正常分解，將會(huì)阻礙血液運(yùn)送養(yǎng)分到各組織而造成疾病，例如心臟血管疾病、高血壓等(Haines和Bussey，1995)。目前用于治療血栓相關(guān)疾病的藥物包括抗凝血?jiǎng)?、抗血小板凝集劑及血栓溶解?thrombolyticagent)。血栓溶解劑依其作用機(jī)制又可以分為下述二種類型第I型_經(jīng)活化溶纖維蛋白酶原(plasminogen)，促使溶纖維蛋白酶原轉(zhuǎn)變成溶纖維蛋白酶而達(dá)到溶解纖維蛋白的效果，如組織型溶纖維蛋白酶原活化劑(tissue-typeplasminogenactivator,t_PA)(Collen和Lijnen等人，2004)、尿素激酶(urokinase)(Duffy，2002)、鏈激酶(str印tokinase)等；第II型-可直接溶解纖維蛋白，如人類溶纖維蛋白酶、蚯頓激酶(lumbrokinase)(Banerijee等人，2004;Park等人，1998)等。許多血栓溶解劑萃取自動(dòng)物，如蛇(Gir6n等人，2008;Leonardi等人，2007)及蚯蚓(Ge等人，2005;Park等人，1998);細(xì)菌，如枯草桿菌(Bacillisubtilis)(0mura等人，2005;Ko等人，2004;Choi等人，2004)及纟連毒菌(Str印tomycesmegasporus)(Chitte禾口Dey2000);真菌(Kim禾口Kim，1999;Choi和Sa，2000;Kim和Kim，2001;Lee等人，2005;Hattori等人，2005;Park等人，2007;Li等人，2007);以及海藻類(Matsubara等人，1999)等。如上所述，第I型血栓溶解劑是經(jīng)溶纖維蛋白酶原轉(zhuǎn)換成溶纖維蛋白酶而達(dá)到血栓溶解的效果，因此在治療血栓引起的疾病時(shí)有產(chǎn)生過量溶纖維蛋白酶而導(dǎo)致出血的危險(xiǎn)。再者，屬于第II型血栓溶解劑的蚯蚓激酶實(shí)質(zhì)上為一種混合物，其除了具有可直接溶解纖維蛋白的成分外，還具有活化纖維蛋白酶原的成分，因此也有產(chǎn)生過量溶纖維蛋白酶的危險(xiǎn)。因此，臨床上需要一種可直接溶解纖維蛋白、不會(huì)活化溶纖維蛋白酶原，以致不會(huì)因產(chǎn)生過量溶纖維蛋白酶而導(dǎo)致出血的血栓溶解劑。另一方面，無論在亞洲或西方國家，菇蕈常被作為食材或藥材(Sullivan等人，2006)。已知菇蕈含有多種活性蛋白或勝肽，這些活性蛋白或勝肽在人體中的效用目前正被積極研究(Ng，2004)。再者，裂褶菌(Schizophyllumcommune)為一種傳統(tǒng)的藥用菇蕈。目前已知從裂褶菌的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)液中分離出一種長鏈狀大分子多糖分子，即裂褶多糖(schizophyllan)(Rau等人，1992)。裂褶多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以預(yù)防腫瘤及對(duì)抗病毒(Kumari等人，2008)。但至今尚無人從裂褶菌等菇蕈中分離出具有血纖維蛋白溶解作用，且不具有剌激溶纖維蛋白酶原轉(zhuǎn)化為溶纖維蛋白酶作用的蛋白酶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種新型溶纖維蛋白酶，其特征為(a)N末端序列為ASYNGXSS;其中，A代表丙氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，N代表天冬酰胺殘基，G代表甘氨酸殘基及X代表未測出；(b)具有如圖4A所示的LC/MSMS圖譜；及(c)分子量為20-23kD。本發(fā)明的溶纖維蛋白酶來自液態(tài)培養(yǎng)的菇蕈，優(yōu)選為來自相同方式培養(yǎng)的可食用或藥用的菇蕈，更優(yōu)選為來自裂褶菌。根據(jù)本發(fā)明，來自裂褶菌的溶纖維蛋白酶為單體(monomer)，分子量為20_23kD。本發(fā)明的溶纖維蛋白酶具有分解纖維蛋白的能力，也具有分解纖維蛋白原的能力，但不會(huì)活化溶纖維蛋白酶原。因此，本發(fā)明的溶纖維蛋白酶可用于治療血栓相關(guān)性疾病，且可避免現(xiàn)有血栓溶解劑因剌激溶纖維蛋白酶原，導(dǎo)致過量溶纖維蛋白酶產(chǎn)生所造成的出血副作用。本發(fā)明亦提供一種制備溶纖維蛋白酶的方法，其包括(a)將可產(chǎn)生溶纖維蛋白酶的菇蕈進(jìn)行液體培養(yǎng)；(b)將步驟(a)得到的培養(yǎng)液中的菇蕈菌絲體濾除；(c)將步驟(b)得到的培養(yǎng)液以尺寸排阻型分離膜分級(jí)(fractionation)，得到第一濾液及第二濾液，其中第一濾液包含可通過分離膜的相對(duì)較小的分子，而第二濾液包含不可通過分離膜的相對(duì)較大的分子；(d)將步驟(c)得到的第一濾液中的蛋白質(zhì)沉淀，得到粗蛋白質(zhì)；及(e)將步驟(d)得到的粗蛋白質(zhì)純化，得到溶纖維蛋白酶。本方法使用的菇蕈優(yōu)選為以相同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的可食用或藥用的菇蕈，更優(yōu)選為裂褶菌。用于本發(fā)明方法的步驟(c)的尺寸排阻型分離膜可為本領(lǐng)域現(xiàn)有的尺寸排阻型分離膜，優(yōu)選為陶瓷濾膜優(yōu)選，更優(yōu)選為掃流式陶瓷濾膜(cross-flowceramicfiltrationmembrane)。分離膜的尺寸(分子量)排阻限值通常為10至150kDa，優(yōu)選為50至120kDa，更優(yōu)選為100kDa。在進(jìn)行步驟(d)之前，視需要，可將從步驟(c)得到的第一濾液進(jìn)一步濃縮。在本發(fā)明的方法的步驟(d)中，第一濾液通過添加硫酸銨等本領(lǐng)域現(xiàn)有的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，而得到粗蛋白質(zhì)。在進(jìn)行步驟(e)之前，可將步驟(d)中得到的粗蛋白質(zhì)通過透析除去鹽類。在本發(fā)明的方法的步驟(e)中，可將粗蛋白質(zhì)依序進(jìn)行疏水交互作用層析(hydrophobicinteractionchromatopgr即hy)、陰離子交換層析(anion-exchangechromatography)及膠體過濾層析(gelfiltrationchromatopgr即hy)，且在每次層析后檢測各提出份的溶纖維蛋白酶活性，并選取及合并顯示溶纖維蛋白酶活性的提出份。相比于現(xiàn)有的加熱萃取法或有機(jī)溶劑萃取法，本發(fā)明的方法未加熱，亦未使用有機(jī)溶劑，而是采用過濾及層析等方法，因此更能保持溶纖維蛋白酶的活性。本發(fā)明亦提供一種組成物，其包含新型溶纖維蛋白酶及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還提供新型溶纖維蛋白酶或包含新型溶纖維蛋白酶的藥物組合物在制備治療血栓相關(guān)疾病的藥物中的用途。以下通過特定的具體實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭示的內(nèi)容了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。圖1A顯示由裂褶菌培養(yǎng)液的粗蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水交互作用層析(使用phenylS印haroseTMHighPerformance凝膠)而得的提出份(fractions)No.427以纖維蛋白瓊脂盤檢測的結(jié)果，其中，"+"代表陽性對(duì)照組(10yg人類溶纖維蛋白酶)；圖IB顯示上述粗蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水交互作用層析而得的各提出份的蛋白質(zhì)濃度(△)及蛋白酶活性();圖1C顯示上述疏水交互作用層析后依據(jù)纖維蛋白瓊脂盤檢測結(jié)果所收集得的蛋白酶溶液(A)進(jìn)行陰離子交換層析(使用MonoQ5/50GL管柱)而得的各提出份的蛋白質(zhì)濃度(△)及蛋白酶活性();圖ID顯示上述陰離子交換層析后依據(jù)纖維蛋白瓊脂盤檢測結(jié)果所收集得的蛋白酶溶液(B)進(jìn)行膠體過濾層析(使用Superdex7510/300GL管柱)而得的各提出份的蛋白質(zhì)濃度(△)及蛋白酶活性()。圖2A顯示本發(fā)明的溶纖維蛋白酶的樣本，以及標(biāo)準(zhǔn)品核糖核酸酶A(ribo皿cleaseA)(13.5kDa)、碳酸酐酶(carbonicanhydrase)(29kDa)、脫鐵蛋白(即oferritin)(44.3kDa)及牛血清蛋白(67kDa)進(jìn)行膠體過濾層析的結(jié)果。圖2B顯示制備本發(fā)明溶纖維蛋白酶的各個(gè)階段的產(chǎn)物的SDS-PEGE分析圖譜，其中，M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；1:澄清培養(yǎng)液；2:第一濾液；3:蛋白酶溶液(A);4:蛋白酶溶液(B);5:蛋白酶溶液(C)(A280nm:40mAU);及6:蛋白酶溶液(C)(A280nm:80mAU)。圖3A顯示蛋白酶溶液(C)進(jìn)行SDS-PEGE的結(jié)果，圖3B為其經(jīng)糖蛋白染色后結(jié)果的對(duì)照?qǐng)D。其中，M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；1:糖蛋白電泳陽性反應(yīng)組；2:糖蛋白電泳陰性反應(yīng)組；3:蛋白酶溶液(A);4:經(jīng)純化的本發(fā)明蛋白酶。圖4A為MS/MS圖譜，圖4B為以MS/MS圖譜進(jìn)行資料庫分析比對(duì)的結(jié)果。圖5顯示人類溶纖維蛋白酶及本發(fā)明溶纖維蛋白酶在人工纖維蛋白瓊脂盤上形成溶解圈的情形。A、B、C、D分別為0.2、0.5、0.8、1yg的人類溶纖維蛋白酶處理組；E、F、G、H分別為0.1、0.25、0.5、liig本法分離純化的蛋白酶。圖6顯示以SDS-PEGE測定本發(fā)明溶纖維蛋白酶的纖維蛋白原分解作用的結(jié)果。其中，M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；17:分別為反應(yīng)第0、0.5、2、6、12、22及30小時(shí)的樣本；a、P、y分別表示纖維蛋白原的a鏈、|3鏈及y鏈。圖7顯示本發(fā)明溶纖維蛋白酶對(duì)人類溶纖維蛋白酶原的活化作用的測定結(jié)果。其中，Scfz+PLG:本發(fā)明溶纖維蛋白酶及溶纖維蛋白酶原；UK+PLG:現(xiàn)有人類尿素激酶及溶纖維蛋白酶原；Scfz:本發(fā)明溶纖維蛋白酶；PL:現(xiàn)有人類溶纖維蛋白酶；PLG:溶纖維蛋白酶原；20ilgUK;20ilg的人類尿素激酶。具體實(shí)施例方式—、溶纖維蛋白酶的分離純化(1)菌種的液體培養(yǎng)及分離將裂褶菌接種于預(yù)培養(yǎng)液(Acumedia)(預(yù)培養(yǎng)基包含0.3%(w/w)酵母菌萃取物、0.3%麥芽抽出物、0.5%蛋白胨(p印tone)、1.0%葡萄糖)中，在253(TC及持續(xù)供氣下進(jìn)行攪拌培養(yǎng)410天。于fC下以8.23X1000g離心30分鐘以移除菌絲體，將培養(yǎng)液再依序以11iim、2.5iim濾紙及0.45iim濾膜(Millipore)過濾，以除去所有的菌絲體，得到澄清培養(yǎng)液。(2)培養(yǎng)液的分級(jí)(fractionation)由于菇蕈培養(yǎng)液中含有復(fù)雜成分，必須先經(jīng)過"劃分"的步驟，才可進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)分離步驟。因此，以掃流式陶瓷濾膜(cross-flowceramicfiltrationmembrane)(邁先生物技術(shù)公司)過濾所得澄清培養(yǎng)液。陶瓷過濾膜的分子量排阻限值視目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量而定；在本發(fā)明中為10至150kDa，優(yōu)選為50至120kDa，最優(yōu)選為100kDa。操作時(shí)，以循環(huán)輔助澄清培養(yǎng)液在系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)，以適當(dāng)?shù)乃俣攘鹘?jīng)膜面，并且在膜面造成掃流作用，以緩和易堵塞物質(zhì)在膜面上的堆積。當(dāng)循環(huán)液流經(jīng)膜面時(shí)，小分子物質(zhì)與水分子會(huì)穿透分離膜而成為第一濾液；而無法穿透膜面的大分子物質(zhì)等，則留在循環(huán)液，稱為第二濾液。第一濾液為含有小分子物質(zhì)(包括目標(biāo)溶纖維蛋白酶)的濾出液，其通常為經(jīng)稀釋的液體；而第二濾液為含有高濃度大分子物質(zhì)的循環(huán)液。如果需要，第一濾液可再以第二分離膜(例如，分子量排阻限值為3kDa的陶瓷濾膜)進(jìn)行過濾，由此除去部分水而將第一濾液濃縮，并除去過小的分子。(3)蛋白質(zhì)的分離在經(jīng)濃縮的第一濾液中添加硫酸銨至濃度達(dá)80%以進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，其中，硫酸銨需先經(jīng)烘干并磨成粉末，以避免局部濃度過高而造成沉淀不完全或沉淀不均。接著以HITACHI05PR-22遠(yuǎn)心分離機(jī)以3000rpm進(jìn)行離心，除去上層液體取得沉淀物。以二次水(secondarywater)溶角牟沉淀物，使用透析膜(Spectrumspectra/pordialysismembrane麗C0:6_8，000)并以20mMTris溶液作為透析液進(jìn)行透析，以除去鹽類并將其溶液置換為20mMTris溶液，接著以0.22ym濾膜濾除雜質(zhì)后而得粗蛋白質(zhì)。(4)溶纖維蛋白酶的分離及純化(4)_1.將粗蛋白質(zhì)在AKTAPurifier10(AmershamPharmaciaBiotech)上進(jìn)行疏水交互作用層析(使用phenylSepharoseTMhighperformancegelcolumn,由GEHealthcareLifeScience出品)，其中層析管柱以含有1M(NH4)2S04的50mM磷酸溶液(pH7)平衡，洗脫溶液為含有梯度(100-0%)1M(NH4)2S04的50mM磷酸溶液，洗脫溶液流速設(shè)定為1ml/分鐘。測定各提出份(fraction)的蛋白質(zhì)濃度及蛋白酶活性(測定方法詳述于下文)，其結(jié)果示于圖1B中。用纖維蛋白瓊脂盤檢測各提出份的溶纖維蛋白酶活性，結(jié)果如圖1A所示。選取具有高溶纖維蛋白酶活性的提出份并加以合并，得到蛋白酶溶液(A)。由圖1A及圖1B可知，提出份25至28號(hào)展現(xiàn)高溶纖維蛋白酶活性，亦展現(xiàn)對(duì)應(yīng)程度的高蛋白酶活性，這表示提出份的溶纖維蛋白酶活性與其蛋白酶活性成正比。因此，在以下步驟中，通過測定提出份的蛋白酶活性來判定其溶纖維蛋白酶活性并據(jù)此進(jìn)行收集。(4)_2.將蛋白酶溶液(A)進(jìn)行強(qiáng)陰離子交換層析(使用MonoQ5/50GL管柱，由7GEHealthcareLifeScience出品)，其中洗脫溶液為含有梯度(0-30%)1MNaCl的20mMTris，洗脫溶液流速設(shè)定為lml/分鐘，洗脫時(shí)間為28分鐘。測定各提出份的蛋白質(zhì)濃度及蛋白酶活性，其結(jié)果示于圖1C中。選取具有高蛋白酶活性(表示具有高溶纖維蛋白酶活性)的提出份并加以合并，得到蛋白酶溶液(B)。(4)-3.將蛋白酶溶液(B)進(jìn)行膠體過濾層析(使用Superdex7510/300GL管柱，由GEHealthcareLifeScience出品)，其中洗脫溶液為含1.5MNaCl的50mM磷酸鹽緩沖溶液。測定各提出份的蛋白質(zhì)濃度及蛋白酶活性，其結(jié)果示于圖1D中。選取具有高蛋白酶活性(表示具有高溶纖維蛋白酶活性)的提出份并加以合并，得到蛋白酶溶液(C)。另一選擇為將粗蛋白質(zhì)依序以陰離子交換層析(使用，例如，DEAE-s印haroseTMFastFlow凝膠管柱，流動(dòng)相為20mMTris溶液，洗脫液為含梯度1MNaCl的20mMTris溶液)、疏水交互作用層析(使用，例如，phenylS印haroseTM管柱)、強(qiáng)陰離子交換層析(使用，例如，MonoQ5/50GL管柱)及膠體過濾層析(使用，例如，Superdex7510/300GL管柱)按照上述方式進(jìn)行純化。在上述步驟(4)_1至(4)-3中，溶纖維蛋白酶活性、蛋白質(zhì)濃度及蛋白酶活性的測定方法說明如下。(5)蛋白酶溶液測定溶纖維蛋白酶活性的測定溶纖維蛋白酶活性通?？赏ㄟ^使用纖維蛋白瓊脂盤，按照Astrup及Mullertz(1952)所教示的方法檢測。即，將1.5%瓊脂、0.2%人類纖維蛋白原與10U人類凝血酶混合，于室溫靜置15分鐘以使人類纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成人類纖維蛋白，然后以空氣吸取器于瓊脂盤上小心地打出小洞。將20iU的各待測樣本及作為陽性對(duì)照組的市售人類溶纖維蛋白酶(humanplasmin)分別加入洞中，并讓其于2(TC作用24小時(shí)。觀察纖維蛋白瓊脂盤上是否形成肉眼可見的溶解圈(clearzone)，并與陽性對(duì)照組比較。溶解圈的直徑與其溶纖活性成正比。纖維蛋白瓊脂盤檢測法的優(yōu)點(diǎn)為操作較容易，結(jié)果可以肉眼直接觀察，但具有檢測需要的時(shí)間較長(通常大于5小時(shí)，甚至數(shù)天)且溶解圈的大小會(huì)隨著時(shí)間經(jīng)過人工纖維蛋白自然分解，導(dǎo)致不易判定，而有誤差較大的缺點(diǎn)。溶纖維蛋白酶的活性亦可通過使用溶纖維蛋白酶專一性底物(plasmin-specificsubstrate)，即人工合成的H-Val-Leu-Lys-pNA(SigmaS2251)來檢驗(yàn)。當(dāng)待測樣本具有溶纖維蛋白酶活性時(shí)，會(huì)分解底物而釋放pNA，pNA可于波長405nm來檢測。待測樣本的溶纖維蛋白酶活性與測得的吸光值呈正相關(guān)性。蛋白質(zhì)濃度的測定使用Bio-RadProteinAssaykit(Bio-Rad)測定各樣本在波長595nm的吸光度(單位mAU)。以牛血清蛋白(bovineserumalbumin,Sigma)標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，而換算得各樣本的蛋白質(zhì)濃度。蛋白酶活性的測定各樣本的蛋白酶活性通過檢測其與偶氮酪蛋白(azocasein，Sigma)反應(yīng)后所產(chǎn)生的可溶于酸性溶液的物質(zhì)的量來判定。將各待測樣本100ill加入100ill的0.5%(W/V)偶氮酪蛋白溶液中，在37t:下反應(yīng)15分鐘，再加入350ia的10%(W/V)冰三氯乙酸(trichloroaceticacid)?；旌暇鶆蚝箪o置5分鐘，于4°C以12XlOOOg離心15分鐘，取上層澄清液500ii1并與等量的0.5NNaOH混合。檢測混合物于波長440nm的吸光度。將同樣的樣本經(jīng)高溫煮沸，使蛋白酶活性喪失，以作為對(duì)照組。以上述同樣方法測定對(duì)照組于波長440nm的吸光度。在37t:反應(yīng)15分鐘的條件下，偶氮酪蛋白分解所產(chǎn)生的溶于酸性溶液的物質(zhì)于440nm的吸光度與對(duì)照組相比增加0.001時(shí)，即定義酶活性為1單位(U)。[OO59]⑥結(jié)果依照上述方法測定各階段產(chǎn)物-澄清培養(yǎng)液、第一濾液、以及蛋白酶溶液(A)至(C)的各個(gè)樣本中的蛋白質(zhì)濃度及蛋白酶活性，并由此計(jì)算出各階段產(chǎn)物的總蛋白質(zhì)含量(mg)、總蛋白酶活性、蛋白酶單位活性(U/mg)、純化倍率(purificationfold)及回收率(yield)。將其結(jié)果總結(jié)于表1中，其中蛋白酶單位活性、純化倍率及回收率通過下述公式計(jì)算而得蛋白酶單位活性(U/mg)=總蛋白酶活性(U)/總蛋白質(zhì)含量(mg)純化倍率=各階段產(chǎn)物的蛋白酶單位活性/澄清培養(yǎng)液的蛋白酶單位活性回收率=各階段產(chǎn)物的總蛋白質(zhì)含量/澄清培養(yǎng)液的總蛋白質(zhì)含量表l、<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>二、新型溶纖維蛋白酶的結(jié)構(gòu)及活性特征的鑒定(1)分子量的測定將得到的含溶纖維蛋白酶的蛋白酶溶液(C)的樣本與標(biāo)準(zhǔn)品核糖核酸酶A(ribo皿cleaseA)(13.5kDa)、碳酸酐酶(carbonicanhydrase)(29kDa)、脫鐵蛋白(即oferritin)(44.3kDa)及牛血清蛋白(67kDa)—起進(jìn)行膠體過濾層析(使用Superdex7510/300GL管柱，GEHealthcare)，其結(jié)果示于圖2A。由圖2A可知溶纖維蛋白酶在流出體積(flowthroughvol咖n)達(dá)到大約14ml時(shí)被洗脫，由此可以判定溶纖維蛋白酶在非變性態(tài)(皿denaturatedstate)的分子量為約21.33kDa。另外，將澄清培養(yǎng)液、第一濾液以及蛋白酶溶液(A)至(C)進(jìn)行SDS-PAGE(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide(10%)gelelectrophoresis)，并用考馬斯亮藍(lán)(CoomassieBrilliantBlue)R-250染色，以測定溶纖維蛋白酶在變性態(tài)(經(jīng)SDS變性而成為單體狀態(tài))的分子量。結(jié)果如圖2B所示。在圖2B中，M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(marker);1:澄清培養(yǎng)液；2:第一濾液；3:蛋白酶溶液(A);4:蛋白酶溶液(B);5:蛋白酶溶液(C)(波長280nm:吸光值40mAU)及6:蛋白酶溶液(C)(波長280nm:吸光值80mAU)。由圖2B可知溶纖維蛋白酶在還原態(tài)的分子量為約21.33kDa，與在非變性態(tài)的分子量相同。由此可以判定溶纖維蛋白酶為單體(monomer)，而非多體(polymer)。(2)糖蛋白染色檢驗(yàn)將蛋白酶溶液(C)進(jìn)行SDS-PAGE并以糖蛋白染色試劑盒(GelCodeGlycoproteinStainingKit)染色。結(jié)果未觀察到陽性反應(yīng)，由此證明所得到的溶纖維蛋白酶未與糖基結(jié)合，不屬于糖蛋白。結(jié)果示于圖3。(3)蛋白質(zhì)鑒定將上述經(jīng)SDS-PAGE分離純化的溶纖維蛋白酶以MicromassQ-T0FESI/MS/MS質(zhì)譜儀分析，并將分析結(jié)果與MASCOT資料庫比對(duì)，以鑒定是否有近似本發(fā)明蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)。質(zhì)譜儀分析圖譜與比對(duì)結(jié)果如圖4所示。根據(jù)MASCOT資料庫的比對(duì)結(jié)果顯示，本發(fā)明蛋白質(zhì)中僅有一個(gè)MS/MS片段SGGGGGGGLGSGGSIR與已知片段編號(hào)gi|81175178的角蛋白，即第I型細(xì)胞骨架蛋白_9(Keratin,typeIcytoskeletal9(Cytokeratin-9)(CK-9)(Keratin-9)(K9))的一個(gè)片段相似；但本發(fā)明蛋白質(zhì)的其他部分則未比對(duì)到相似片段(誤差分?jǐn)?shù)皆>50)，證實(shí)以MS/MS圖譜分析結(jié)果而言，本發(fā)明蛋白質(zhì)為一新型蛋白質(zhì)。(4)N末端定序?qū)⒔?jīng)上述SDS-PAGE分離純化的溶纖維蛋白酶轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，再依埃德曼(Edman)降解法的原理進(jìn)行蛋白質(zhì)N末端序列分析(儀器為AppliedBiosystems，Procise494)，得到N末端胺基酸序列為ASYNGXSS(丙氨酸_絲氨酸_酪氨酸_天冬酰胺_甘氨酸_未測出_絲氨酸_絲氨酸)。將所得N末端序列以BLASTBLAST軟件(http:〃blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與已知的溶纖維蛋白酶進(jìn)行比對(duì)，但并未比對(duì)到類似的N末端序列；由此可知此溶纖維蛋白酶與現(xiàn)有的溶纖維蛋白酶在N末端序列不相同，確實(shí)為新型的溶纖維蛋白酶。(5)纖維蛋白溶解活性(fibrinolyticactivity)的檢測參照溶纖維蛋白酶活性的測定，結(jié)果如圖5所示。A、B、C、D分別為0.2、0.5、0.8、IPg的市售人類溶纖維蛋白酶(humanplasmin)處理組；E、F、G、H分別為0.1、0.25、0.5、lPg本發(fā)明的蛋白酶。并測定溶解圈的大小以估計(jì)蛋白酶活性，結(jié)果如表2所示。表2、<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表2的結(jié)果可知，由本發(fā)明的方法所分離純化的溶纖維蛋白酶的活性約為市售人類溶血纖維蛋白酶的活性的兩倍。(6)纖維蛋白原(fibrinogen)降解活性的檢測在225iU的lX纖維蛋白原溶液中加入25ii1的0.05mg/ml的本發(fā)明裂褶菌溶纖維蛋白酶溶液，于37t:下反應(yīng)，于反應(yīng)期間，每隔一段時(shí)間采樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)果如圖6所示，標(biāo)號(hào)17分別為反應(yīng)后第0、0.5、2、6、12、22及30小時(shí)所采集的樣本。結(jié)果顯示，反應(yīng)后22小時(shí)，纖維蛋白原的a鏈、|3鏈及Y鏈均消失，證實(shí)本發(fā)明的裂褶菌溶纖維蛋白酶具有直接降解纖維蛋白原的活性，因此，可阻斷纖維蛋白的形成。(7)溶纖維蛋白酶原(plasminogen)活化的檢測在O.1M磷酸鈉緩沖溶液(Sodiumphosphatebuffer)中，混合40ii1的濃度10mM的S2251底物，并視實(shí)驗(yàn)條件加入0.1UN的人類溶纖維蛋白酶原(PLG)及1yg的人類溶纖維蛋白酶(PU、人類尿素激酶(UK)、本發(fā)明溶纖維蛋白酶(Scfz)，并調(diào)整總體積為1ml進(jìn)行反應(yīng)，在反應(yīng)期間第0、5、10、20、40、60、90、120、180、240、480分鐘測量波長405nm的吸光值，結(jié)果如圖7所示。其中，以現(xiàn)有尿素激酶(urokinase,UK)及以現(xiàn)有人類溶纖維蛋白酶(PL)作為對(duì)照組。由圖7可知，若于反應(yīng)中僅加入尿素激酶(UK)、或溶血纖維酶原(PLG)、或本發(fā)明溶纖維蛋白酶(Scfz)，皆不產(chǎn)生吸光值的改變，顯示對(duì)S2251底物不反應(yīng)。然而，當(dāng)UK與PLG同時(shí)存在于反應(yīng)中，可將PLG轉(zhuǎn)化成有效的溶纖維蛋白酶，而與S2251底物作用，進(jìn)而產(chǎn)生吸光值的明顯變化。反觀本發(fā)明溶纖維蛋白酶(Scfz)與PLG混合后，對(duì)S2251底物仍不產(chǎn)生反應(yīng)，證實(shí)本發(fā)明溶纖維蛋白酶不具有活化溶纖維蛋白酶原的能力。由上述檢測結(jié)果可知，本發(fā)明的溶纖維蛋白酶具有分解纖維蛋白的能力，亦具有分解纖維蛋白原的能力，但不會(huì)活化溶纖維蛋白酶原。因此，本發(fā)明的溶纖維蛋白酶可用于治療血栓相關(guān)性疾病，且可避免現(xiàn)有血栓溶解劑因促進(jìn)溶纖維蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槿芾w維蛋白酶而造成的出血等副作用。上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的組成物與制備方法，而非用于限制本發(fā)明。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員均可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾與改變。因此，本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍如權(quán)利要求所載。1權(quán)利要求一種溶纖維蛋白酶，其特征為(a)N末端序列為ASYNGXSS；其中，A代表丙氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，N代表天冬酰胺殘基，G代表甘氨酸殘基及X代表未測出；(b)如圖4A所示的LC/MSMS圖譜；及(c)分子量為20-23kD。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶纖維蛋白酶，其中，溶纖維蛋白酶由菇蕈分離而得。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶纖維蛋白酶，其中，溶纖維蛋白酶由裂褶菌分離而得。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶纖維蛋白酶，其為單體。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的溶纖維蛋白酶，其具有分解纖維蛋白及纖維蛋白原的能力，但不會(huì)活化溶纖維蛋白酶原。6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的溶纖維蛋白酶，其可用于制備用于治療血栓相關(guān)疾病的藥物。7.—種制備如根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶纖維蛋白酶的方法，其包括(a)將可產(chǎn)生溶纖維蛋白酶的菇蕈進(jìn)行液體培養(yǎng)；(b)將步驟(a)得到的培養(yǎng)液中的菇蕈菌絲體濾除；(c)將步驟(b)得到的培養(yǎng)液以尺寸排阻型分離膜劃分，得到第一濾液及第二濾液，其中第一濾液包含可通過分離膜的相對(duì)較小的分子，而第二濾液包含不可通過分離膜的相對(duì)較大的分子；(d)使步驟(c)得到的第一濾液中的蛋白質(zhì)沉淀，得到粗蛋白質(zhì)；及(e)將步驟(d)得到的粗蛋白質(zhì)純化，得到溶纖維蛋白酶。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，菇蕈為裂褶菌。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，步驟(c)的尺寸排阻型分離膜為陶瓷濾膜。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，尺寸排阻分離膜的尺寸排阻限值為10至150kDa。11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，在進(jìn)行步驟(d)之前，將從步驟(c)得到的第一濾液進(jìn)一步濃縮。12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，在步驟(d)中，粗蛋白質(zhì)通過在第一濾液中添加硫酸銨，使得第一濾液中的蛋白質(zhì)沉淀而得到。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，在進(jìn)行步驟(e)之前，通過透析除去粗蛋白質(zhì)中的鹽類。14.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，在步驟(e)中，將步驟(d)得到的粗蛋白質(zhì)依序進(jìn)行疏水交互作用層析、陰離子交換層析及膠體過濾層析，且于每次層析后檢測各提出份的溶纖維蛋白酶活性，選取及合并顯示高溶纖維蛋白酶活性的提出份。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，疏水交互作用層析通過使用phenylS印haroseTMHighPerformance凝膠管柱而進(jìn)行。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，陰離子交換層析通過使用MonoQ5/50GL管柱而進(jìn)行。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，膠體過濾層析通過使用Superdex7510/300GL管柱而進(jìn)行。18.—種具有溶纖作用的藥物組成物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶纖維蛋白酶及藥學(xué)上可接受的載體。19.一種根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥物組成物，其用于制備用于治療血栓相關(guān)疾病的藥物。20.—種根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶纖維蛋白酶在制備用于治療血栓相關(guān)疾病的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種新型溶纖維蛋白酶(亦稱溶血纖維蛋白酶)及其制備方法與用途。本溶纖維蛋白酶經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明具有分解纖維蛋白(fibrin)及纖維蛋白原(fibrinogen)的能力，但不會(huì)活化溶血纖維蛋白酶原(plasminogen)。由于本新型酶不具備活化溶血纖維蛋白酶原的能力，使本發(fā)明的物質(zhì)在應(yīng)用時(shí)(如中風(fēng)后處理)可避免發(fā)生不可預(yù)測的出血現(xiàn)象。文檔編號(hào)A61K38/48GK101768580SQ20081018774公開日2010年7月7日申請(qǐng)日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者陳秀男申請(qǐng)人:陳秀男