專利名稱：微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗，用于隱孢子蟲病的預(yù)防 和治療，同時還提供了該疫苗的的制備方法，屬于寄生蟲病疫苗制備技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種人畜共患的寄生性原蟲，主要寄 生于人和其它哺乳動物的胃腸道、禽類的呼吸道等粘膜的上皮細(xì)胞內(nèi)，由它 引起的疾病稱隱孢子蟲病。隱孢子蟲病分布廣泛，人畜感染率高，且危害嚴(yán) 重，臨床上以嚴(yán)重水樣腹瀉為主要特征。在艾滋病人中隱孢子蟲感染率可達(dá) 到10% 50%，是艾滋病人的主要致死因素之一。該病是今后醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)界 防治的重要寄生蟲病。雖經(jīng)多年研究，迄今尚無有效的防治藥物以及預(yù)防辦 法，已篩選了 200多種藥物，包括所有的抗生素、抗球蟲藥和磺胺類藥物用 于該病的治療，但沒有任何藥物對隱孢子蟲有殺滅作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗，是抗微小隱孢子蟲 的新型疫苗，對于隱孢子蟲病的預(yù)防和治療有明顯效果。
本發(fā)明還提供了該疫苗的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗，其特征在于以真核表達(dá)載體
pVAXl為載體，將兩個微小隱孢子蟲保護(hù)性抗原基因聯(lián)合CPG免疫加強(qiáng)序列 串聯(lián)插入到pVAXl真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)，獲得了含免疫加強(qiáng)序列的微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗。
所述的微小隱孢子蟲保護(hù)性抗原基因?yàn)镃P12和CP21。
本發(fā)明的微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗的制備工藝，包括如下步驟 根據(jù)微小隱孢子蟲保護(hù)性抗原基因序列的開放性閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行
PCR， TA克隆。將所得的包含免疫性加強(qiáng)序列的兩個保護(hù)性抗原基因串聯(lián)克 隆入真核表達(dá)載體pVAXl載體，構(gòu)建含免疫加強(qiáng)序列的微小隱孢子蟲雙價重 組核酸疫苗。提取重組質(zhì)粒并利用試劑盒純化后，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。并通過間 接免疫熒光、SDS-PAGE電泳分析及Western blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。之后 利用微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗進(jìn)行動物保護(hù)性試驗(yàn)以驗(yàn)證效果。
具體的工藝是將CPG-CP12、 CP21目的基因與T載體進(jìn)行連接，分別 用fe/a7J、 fcoA7禾卩&o/(7、 進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，回收片段與經(jīng)過
和屈W雙酶切反應(yīng)的真核表達(dá)載體pVAXl進(jìn)行連接，構(gòu)建 pVAXl-CpG-CP12-CP21重組載體。
免疫受損宿主隱孢子蟲病癥狀的嚴(yán)重性和長病程表明，隱孢子蟲病與宿 主的免疫系統(tǒng)關(guān)系密切。因此，對該病的防治疫苗將起重要作用，而其關(guān)鍵 在于尋找有效的抗隱孢子蟲疫苗的候選分子。
利用新的保護(hù)性抗原基因，構(gòu)建新型疫苗，對隱孢子蟲的防治起到非常 關(guān)鍵的作用。由于隱孢子蟲的感染及其特點(diǎn)與免疫功能密切相關(guān)，宿主感染 隱孢子蟲卵囊后其病情輕重、病程長短，治療效果可能主要取決于機(jī)體的免 疫狀態(tài)。因此，免疫干預(yù)是控制隱孢子蟲病更合適的途徑。
本發(fā)明的積極效果在于選用了兩個保護(hù)性抗原基因進(jìn)行了雙價核酸疫 苗的研制，并在此基礎(chǔ)上引入了 CPG免疫加強(qiáng)序列，以增強(qiáng)其免疫保護(hù)效果。 微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗本身具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫作用，并且引入的CPG基序又具有激活免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，分泌免疫球蛋白 和各種細(xì)胞因子的作用，兩者優(yōu)勢組合，從而可以達(dá)到更好的預(yù)防動物微小 隱孢子蟲病的目的。


圖l、 pVAXl-CPG-CP12-CP21載體構(gòu)建示意圖； 圖2、 pVAXl-CPG-CP12-CP21基因轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的間接免疫熒光圖； 圖3、pVAXl-CPG-CP12-CP21轉(zhuǎn)染后SDS-PAGE及Western blotting鑒定圖； 圖4、核酸疫苗對免疫小鼠抗微小隱孢子蟲感染的保護(hù)效果。
具體實(shí)施例方式
為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實(shí)施例。其作用被理解為是對本發(fā)明 的闡釋而非對本發(fā)明的任何形式的限制。 實(shí)施例l
微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗的制備
本發(fā)明以微小隱孢子蟲免疫相關(guān)蛋白基因CP12、 CP21為例，進(jìn)行重組真核表 達(dá)載體的構(gòu)建。
微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗的制備步驟
參照CP12、 CP21基因序列開放性閱讀框及真核表達(dá)載體pVAXl物理圖譜設(shè)
計(jì)引物并引入酶切位點(diǎn)。 CP12上游引物
QF1:5' -CTGGATCCTCCATGACGTTCCTGACGTTATGTCAGATGCATCAATA -3，；其 中5'端含有及朋///位點(diǎn)以及CPG免疫加強(qiáng)序列； 下游引物QR1:5， -GGGGCGAATTCTATTTGTTCATTCATCTG-3， ; 5、端含有&oy /位點(diǎn)。
CP21上游引物QF2: 5， -CCGAATTCGGTGGCGGTGGCTCGATGTCTAAAAGAGCAT -3， 其中5、端含 有fcoAV位點(diǎn)以及Linker序列；
下游引物QR2:5， -CTGGCTCTCGAGCTATTCATCTGTTTGAAC-3， ;5、端含有J力o/ 位點(diǎn)。
利用上述引物序列進(jìn)行PCR反應(yīng)(通用參數(shù)為94°C 4min; 94°C 45s， 55°C 50s， 72°C lmin， 30個循環(huán)后于72。C延伸10min)，將各個PCR純化產(chǎn)物 克隆分別至PMD18-T載體，經(jīng)PCR及相對應(yīng)的酶切鑒定后，送生物公司測序鑒 定。凝膠回收各個目的片段然后與用^9^7^i7^/進(jìn)行雙酶切的真核表達(dá)載 體pVAXl連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Eco"' DH5a感受態(tài)細(xì)胞后篩選重組質(zhì)粒，用 ^M^/"和i7 o/進(jìn)行雙酶切反應(yīng)鑒定，將重組質(zhì)粒命名為pVAXl-CPG-CP12-CP21 (如圖l)。提取重組質(zhì)粒pVAX卜CPG-CP12-CP21,并利用質(zhì)粒純化試劑盒進(jìn)行 質(zhì)粒的純化，37°C， 5。/。C02孵箱培養(yǎng)Hela細(xì)胞，使細(xì)胞達(dá)到50% 80%融合，按 Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72小時后更換培養(yǎng)基并用 G418進(jìn)行篩選，同時用未加轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作對照。當(dāng)對照細(xì)胞大部分死亡時， 用含低濃度的G418的培養(yǎng)基維持篩選。l周后有陽性克隆形成，待其逐漸增 大后轉(zhuǎn)移擴(kuò)大培養(yǎng)。分別收集培養(yǎng)上清液、轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對照細(xì)胞。基因轉(zhuǎn)染 后進(jìn)行免疫熒光、SDS-PAGE電泳分析及Westernblotting鑒定(如圖2、 3)。 實(shí)施例2
微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗的用途
將50只4 6周齡，18 22g的雌性清潔級BALB/c小鼠分成5組，每組10只， 其中第 一 組為陰性對照組(肌注100u1/只生理鹽水)，第二組 pVAXl-CPG-CP12-CP21肌注組(佐劑為司苯甘油，100ug/只)，第三組為pVAXl 肌注組(佐劑為司苯甘油，100ug/只)，第四組pVAX1-CPG-CP12-CP21,滴鼻 組(佐劑為司苯甘油，100ug/只)，第五組陽性對照組，肌肉注射卵囊抗原
6100ug/只。各組注射三次，間隔兩周。三免一周后口服接種微小隱孢子蟲卵 囊lX10"個/只進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)，攻蟲后每隔兩天收集各組糞便，用飽和硫酸鋅 浮集法收集卵囊，將沉淀溶于一定量的水中，混勻后，取一滴置于血細(xì)胞計(jì) 數(shù)板中，在低倍鏡下記數(shù)隱孢子蟲卵囊總數(shù)。同時進(jìn)行體液和細(xì)胞免疫水平 的檢測。于每次免疫前尾靜脈采血，分離血清，用微小隱孢子蟲卵囊抗原作
為包被抗原，通過間接ELISA方法對鼠血清中工gG變化情況進(jìn)行檢測(如附圖 4所示)。第三次免疫后l周，每組隨機(jī)各取4只小鼠放血處死，取脾臟，力n2mL PBS，在200目篩上研磨，用PBS稀釋成細(xì)胞懸液(1(T個/mL)。取100u L細(xì)胞 懸液，加？1冗標(biāo)記的抗€04+和？￡標(biāo)記的抗008+兔抗鼠單克隆抗體，避光作用 40min，然后用PBS洗液洗2遍，加入O. 5mL熒光保存液，用流式細(xì)胞儀檢測CD4+、 CD8+ T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，并用SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
免疫保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組免疫保護(hù)率明顯優(yōu)于陰性對照組，排出 的卵囊明顯減少，排出時間也縮減(見附圖4)。體液免疫檢測結(jié)果證實(shí)一免 后各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比IgG滴度變化不大。二免后IgG滴度逐漸上升，第三 次免疫后，各實(shí)驗(yàn)組均顯示一定的抗體效價，其中pVAX1-CPG-CP12-CP21滴 鼻組血清抗體效價最高，于陰性對照組相比差異極顯著(P〈O.OD。細(xì)胞水 平免疫檢測結(jié)果表明免疫組004+ 、 CD8+變量明顯高于陰性對照組，與陰性對 照組差異均極顯著(P<0.01)，且滴鼻組鼠的004+ 、 CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)升值 較注射組高。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明的微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗 pVAXl-CPG-CP12-CP21，對微小隱孢子蟲免疫保護(hù)率較高，可以用來作為微 小隱孢子蟲病的預(yù)防和治療性疫苗。
權(quán)利要求
1、一種微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗，其特征在于以真核表達(dá)載體pVAX1為載體，將兩個微小隱孢子蟲保護(hù)性抗原基因聯(lián)合CPG免疫加強(qiáng)序列串聯(lián)插入到pVAX1真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)，獲得了含免疫加強(qiáng)序列的微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的微小隱孢子蟲 保護(hù)性抗原基因?yàn)镃P12和CP21。
3、 權(quán)利要求l所述的重組疫苗的制備工藝，是通過工藝實(shí)現(xiàn)的根據(jù)微小隱孢子蟲保護(hù)性抗原基因序列的開放性閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn) 行PCR， TA克隆；將所得的包含免疫性加強(qiáng)序列的兩個保護(hù)性抗原基因串 聯(lián)克隆入真核表達(dá)載體PVAX1載體，構(gòu)建含免疫加強(qiáng)序列的微小隱孢子蟲 雙價重組核酸疫苗。
4、 權(quán)利要求2所述的重組疫苗的制備工藝，包括以下步驟將CPG-CP12、 CP21目的基因與T載體進(jìn)行連接，分別用及做力7、 和&o7t7、 Z力W進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，回收片段與經(jīng)過萬a朋W和Z力oJ雙酶切 反應(yīng)的真核表達(dá)載體pVAXl進(jìn)行連接，構(gòu)建pVAXl-CpG-CP12-CP21重組載 體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗及制備工藝，以真核表達(dá)載體pVAX1為載體，將兩個微小隱孢子蟲保護(hù)性抗原基因聯(lián)合CPG免疫加強(qiáng)序列串聯(lián)插入到pVAX1真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)，獲得了含免疫加強(qiáng)序列的微小隱孢子蟲雙價核酸疫苗。選用了兩個保護(hù)性抗原基因進(jìn)行了雙價核酸疫苗的研制，并在此基礎(chǔ)上引入了CPG免疫加強(qiáng)序列，以增強(qiáng)其免疫保護(hù)效果。本發(fā)明疫苗具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫作用，并且引入的CPG基序又具有激活免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，分泌免疫球蛋白和各種細(xì)胞因子的作用，兩者優(yōu)勢組合，從而可以達(dá)到更好的預(yù)防動物微小隱孢子蟲病的目的。
文檔編號A61K48/00GK101422620SQ200810050899
公開日2009年5月6日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者于欽磊, 宮鵬濤, 張國才, 張西臣, 李建華, 李淑紅, 舉 楊 申請人:吉林大學(xué)