專利名稱：血清中微小核糖核酸的檢測方法和用于檢測的試劑盒、生物芯片及其制作和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人和動物血清中微小核糖核酸分子的 檢測方法、用于檢測血清中微小核糖核酸的試劑盒或生物芯片以及試劑盒和生 物芯片的制作和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
微小核糖核酸，英文名為microRNA，簡寫作raiRNA，是一類長約19至23個核 苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子，它們在進(jìn)化上高度保守，廣泛存在于動植 物細(xì)胞中，近五年來在人類、小鼠、大鼠等多種生物物種中鑒別出數(shù)百種微小 核糖核酸分子。微小核糖核酸通過識別靶mRNA的3'端非翻譯序列，與之不完全 互補(bǔ)，從而抑制靶mRNA的翻譯。其序列、結(jié)構(gòu)、豐度和表達(dá)方式的多樣性使微 小核糖核酸成為信使RNA強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)因子并在基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域中起著超乎 想象的重要作用。
微小核糖核酸與動物的許多正常生理活動密切相關(guān)，涉及生物個體發(fā)育； 組織分化；細(xì)胞調(diào)亡以及能量代謝等生命活動的方方面面。同時，微小核糖核 酸也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在千絲萬縷的聯(lián)系，在發(fā)生某種疾病時總有一 些微小核糖核酸表達(dá)量是上調(diào)的， 一些是下調(diào)的。微小核糖核酸與疾病的關(guān)聯(lián) 有兩個層面首先，微小核糖核酸的變化可能是病因，這是因?yàn)榧膊〉囊种埔?子以及促進(jìn)因子都有可能是微小核糖核酸的靶位點(diǎn)，當(dāng)微小核糖核酸本身先發(fā) 生了紊亂表達(dá)，比如本來抑制疾病促進(jìn)因子的微小核糖核酸表達(dá)量降低了，或 者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表達(dá)量升高了，其最終結(jié)果都會導(dǎo)致下游 一系列基因表達(dá)的變化以及某些通路的整體紊亂，進(jìn)而誘發(fā)疾病發(fā)生；其次， 微小核糖核酸的變化也可以是疾病的結(jié)果，這是因?yàn)楫?dāng)疾病(如癌癥)發(fā)生時， 會導(dǎo)致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的劇烈擴(kuò)增，若微小核 糖核酸正好位于這一變化區(qū)段內(nèi)，那么其表達(dá)量將發(fā)生極其顯著的變化。最近研究發(fā)現(xiàn)慢性淋巴細(xì)胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中幾種微小核糖 核酸的表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)；分析比較人肺癌、乳腺癌組織中微小核糖 核酸表達(dá)時發(fā)現(xiàn)有若干組織特定的微小核糖核酸的表達(dá)水平相對于正常組織發(fā) 生了變化。也有研究證明微小核糖核酸影響了心肌肥厚、心衰、動脈粥樣硬化等 心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展并且與二型糖尿病等代謝性疾病有密切關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果 提示微小核糖核酸表達(dá)與疾病發(fā)生和發(fā)展之間存在必然聯(lián)系。微小核糖核酸完全 可以作為一類新的疾病標(biāo)志物，相比于傳統(tǒng)的病理切片或單一使用的生化指標(biāo)等 手段，能更加準(zhǔn)確幫助疾病定性，診斷疾病的發(fā)展階段，判斷并發(fā)癥的發(fā)生和惡 性疾病復(fù)發(fā)率及疾病的預(yù)后，并診斷藥效和療效。此外，微小核糖核酸還是潛在 的藥物靶點(diǎn)，如果抑制疾病過程中上調(diào)的微小核糖核酸和過表達(dá)下調(diào)的微小核糖 核酸，將有可能極大地緩解疾病的發(fā)生和發(fā)展。然而，因?yàn)槿撕蛣游镂⑿『颂呛?酸的研究工作才開展4年左右，目前還沒有相關(guān)的微小核糖核酸試劑盒。因此， 需要我們更深入研究腫瘤，各種急慢性傳染病和急慢性疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病， 免疫系統(tǒng)疾病，心血管系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等)過程中微小核糖核酸的特 異變化，對微小核糖核酸的進(jìn)一步探索將為我們提供疾病診療新途徑。微小核糖 核酸試劑盒的研發(fā)和在臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用將具產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)效益和社會前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是通過研究各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性 肝炎，艾次滋病等)和急慢性疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，心血管系 統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等)過程中血清微小核糖核酸的特異變化，得到在疾病 及正常生理狀態(tài)下差異表達(dá)程度大的一類血清微小核糖核酸探針，應(yīng)用于疾病鑒 定和病程，惡性疾病復(fù)發(fā)率及預(yù)后和藥效的診斷相關(guān)的PCR試劑盒和生物芯片， 以提高疾病的早期發(fā)現(xiàn)率以及確診的準(zhǔn)確性和療效。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的一種技術(shù)方案為 血清中微小核糖核酸分子的檢測方法
1) 收集血清樣本；
2) 將10 u 1血清作為buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，來制備cDNA樣品；
3) 用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設(shè)計引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；4) 進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；
5) EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。
所述步驟5)之后還包括下列步驟用熒光染料EVA GREEN檢測并比較血清 樣本相對于正常血清中微小核糖核酸的量的變化。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的另一種技術(shù)方案為
血清中微小核糖核酸分子的檢測方法
1、 使用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取血清總RNA (10ml血清通常能富集 約10ug左右的RNA);
2、 通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA;
3、 用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設(shè)計引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；
4、 進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；
5、 EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。
所述步驟5之后還包括下列步驟用熒光染料EVA GREEN檢測并比較血清樣 本相對于正常血清中微小核糖核酸的量的變化。
在上述檢測方法中，我們首次使用了 RT-PCR技術(shù)來發(fā)現(xiàn)并證明人和動物血 清中能檢測到各種微小核糖核酸，而且它們具有不同的組織來源和表達(dá)豐度。 其次，為了研究在各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性肝炎，艾次滋病等) 和急慢性疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，心血管系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng) 疾病等)過程中血清微小核糖核酸的特異變化，我們選取再生障礙性貧血、乳腺 癌、骨肉瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、糖尿病病人血清樣品，同時用人全部五百多 個成熟體微小核糖核酸設(shè)計引物進(jìn)行了血清微小核糖核酸的定量PCR實(shí)驗(yàn)，以得 到與疾病相關(guān)的差異表達(dá)的一類血清微小核糖核酸探針。我們直接用病人血清進(jìn) 行定量PCR實(shí)驗(yàn)，用熒光染料EVA GREEN檢測并比較相對于正常血清各種疾病血 清中微小核糖核酸的量的變化。
一種用于血清中微小核糖核酸檢測的生物芯片，包括人血清中能正常檢測到 的全部微小核糖核酸的探針。
此芯片能高通量地篩選血清中穩(wěn)定變化的微小核糖核酸探針，同時通過血清 中微小核糖核酸的整體變化預(yù)測和診斷疾病。
最后我們通過定量PCR技術(shù)和生物芯片技術(shù)篩選得到和再生障礙性貧血、乳腺癌、骨肉瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、糖尿病等疾病相關(guān)的血清微小核糖核酸， 作為預(yù)測疾病以及診斷病變程度的探針，來制備PCR試劑盒。
一種用于血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒，包括一批血清微小核糖核酸探 針以及Taq酶、dNTP試劑。
目前對疾病進(jìn)行臨床診斷的生物化學(xué)及分子生物學(xué)手段還比較繁瑣和粗糙， 比如對于癌癥的診斷，需要將手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)染色檢驗(yàn)，過程復(fù)雜又耗 時耗力。此外，目前尚沒有一套早期預(yù)測及診斷重癥疾病的簡易又精確的方法。 鑒于目前疾病診斷方法的單一以及早期發(fā)現(xiàn)與預(yù)測的困難，我們亟待找到一種比 目前現(xiàn)有方法都更簡單可靠同時又簡單易行的新方法來鑒定疾病的發(fā)生以及判 斷病理階段。我們選取血清中的微小核糖核酸作為研究對象，希望通過檢測血清 中的微小核糖核酸解決臨床早期診斷等問題。檢測血清中的微小核糖核酸有以下 幾個優(yōu)勢首先，血清相對組織較易獲得，甚至在平常體檢中都可以收集到；其 次，血清中的微小核糖核酸反映的是整個機(jī)體的生理病理情況，其檢測結(jié)果具有 指導(dǎo)意義；第三，血清中某些特定的微小核糖核酸可以指示特定的組織器官的病 變，因此其又可以作為疾病診斷的一個參數(shù)。總之，檢測血清中的微小核糖核酸， 簡單易行且效果優(yōu)越，從血清中的微小核糖核酸的特異性變化這一新角度出發(fā)發(fā) 現(xiàn)疾病并且區(qū)分程度，將建立一種更敏感更精確的用于疾病早期確診等的全新技 術(shù)。
本發(fā)明與原有技術(shù)相比，其優(yōu)勢在于 一、簡單易行，成本低廉。二、特別 適用于早期診斷。三、輸出的結(jié)果簡單明了且精確。
四

圖1正常人血清中直接檢測到的部分微小核糖核酸RT-PCR結(jié)果。 圖2提取正常人血清中RNA，檢測其中微小核糖核酸的RT-PCR結(jié)果。 圖3病人血清中部分微小核糖核酸相對于正常人血清中微小核糖核酸的變 化量。
五具體實(shí)施例方式
1、血清中的微小核糖核酸的RT-PCR實(shí)驗(yàn)我們使用了 RT-PCR技術(shù)次發(fā)現(xiàn)并證明人和動物血清中不僅能檢測到各種微
小核糖核酸，而且其表達(dá)量相當(dāng)豐富。具體步驟為(1)收集小鼠,大鼠，正常
人及某些病人的血清。(2)制備cDNA樣品。此操作有兩種方案， 一種方案為將 10ul血清作為buffer直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，另一種為使用Trizol試劑 (Invitrogen公司)先提取血清總RNA (10ml血清通常能富集約10wg左右的 RNA)，然后通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4 u 1 5XAMV buffer、 2 u 1 10mM each dNTP mixture (Takara公司)、0. 5 u 1 RNase Inhibitor (Takara公司)、2 u 1 AMV (Takara公司)以及1. 5 y 1基因特異性反向引物混 和物，反應(yīng)步驟為16'C孵育15分鐘，42。C反應(yīng)l小時，85。C孵育5分鐘。(3) PCR及電泳觀察。將cDNA按1/50稀釋，取1 y 1稀釋后的cDNA，加入0, 3 y 1 Taq 酶(Takara公司)，0.2ul 10 y M正向引物，0. 2 u 1 10uM通用反向引物，1.2ul 25mM MgCl" 1.6ul 2, 5mM each dNTP mixture (Takara公司)，2wl 10XPCR buffer, 13. 5ulH20， 20ul體系進(jìn)行PCR。 PCR的反應(yīng)條件是95°C 5分鐘進(jìn) 行1個循環(huán)—95°C 15秒，60°C 1分鐘進(jìn)行40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物取10u 1進(jìn)行 3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在紫外燈下觀察。
具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖。圖1是以正常人血清為研究對象，將血清作為buffer 直接進(jìn)行RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們選用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸進(jìn) 行PCR反應(yīng)，圖1為其中的12種微小核糖核酸。它們分別是血細(xì)胞特異性的微 小核糖核酸miR-181a、 miR-181b、 miR-223、 miR-142-3p、 miR-142-5p、 miR-150， 來自心肌及骨骼肌的微小核糖核酸miR-l、 miR-133a、 miR-206，來自腦組織的 微小核糖核酸MR-9、 miR-124a，以及來自肝臟的微小核糖核酸miR-122a。從結(jié) 果可以看出上述四種組織來源的微小核糖核酸在血液中都能檢測到。但是并非全 部五百多個成熟體微小核糖核酸在血清中都有高豐度表達(dá)，有些微小核糖核酸是 很微量的，甚至不能正常檢測到。為了進(jìn)一步驗(yàn)證血清中存在微小核糖核酸，我 們先提取正常人血清中的RNA，然后選用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸進(jìn) 行PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。圖2的結(jié)果與圖1的結(jié)果很吻合，PCR產(chǎn)物都單 一，表明這兩種實(shí)驗(yàn)方法都能檢測到人血清微小核糖核酸的表達(dá)和豐度。此外， 我們用同樣的方法檢測了小鼠和大鼠血清中五百多個微小核糖核酸的表達(dá)和豐 度，同樣發(fā)現(xiàn)不同組織來源的微小核糖核酸在小、大鼠血清中有表達(dá)(圖沒列出)。
82、 血清中微小核糖核酸的real-time PCR實(shí)驗(yàn)
為了研究各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性肝炎，艾次滋病等)和急 慢性疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，心血管系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病 等)過程中血清微小核糖核酸的特異變化，我們進(jìn)行了血清微小核糖核酸的定量 PCR實(shí)驗(yàn)。定量PCR實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)步驟同RT-PCR—樣，唯一不同是在PCR的 時候加入了熒光染料EVA GREEN。儀器使用的是ABI Prism 7300熒光定量PCR 儀，反應(yīng)條件為95°C 5分鐘進(jìn)行1個循環(huán)一95°C 15秒，60°C 1分鐘進(jìn)行40 個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理方法為AACt法，ct設(shè)為反應(yīng)達(dá)到域值時的循環(huán)數(shù)，則每個 微小核糖核酸相對于標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參的表達(dá)量可以用方程2—"t表示，其中ACt =Ct# 。 -Ct a#。我們將病人血清樣本與正常人血清樣本直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，通過定量 PCR反應(yīng)比較其中所含微小核糖核酸的量。
我們選取再生障礙性貧血、乳腺癌、骨肉瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、糖尿病 病人血清樣品，同時用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。圖3 僅是上述提及的四種組織來源的12種微小核糖核酸在正常人和病人血清中進(jìn)行 定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。再生障礙性貧血、乳腺癌、骨肉瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、 糖尿病病人血清中微小核糖核酸的量相對于正常人的量的比值分別有上調(diào)和下 調(diào)，表明血清微小核糖核酸可以作為一類新的疾病診療預(yù)測的標(biāo)志物。此外，從 圖3可知，在一種疾病中不同微小核糖核酸在血清中表達(dá)水平不同，提示可能是 不同疾病過程中，對不同組織來源的微小核糖核酸，血細(xì)胞免疫應(yīng)答不同或細(xì)胞 破裂或分泌微小核糖核酸途徑不同造成的。
3、 用于診斷疾病的血清微小核糖核酸芯片的制作
為了驗(yàn)證通過定量PCR篩選出的與疾病相關(guān)的一類血清微小核糖核酸探針 準(zhǔn)確可靠性，我們制作了血清微小核糖核酸的生物芯片，該芯片包含了人血清中 能正常檢測到的全部微小核糖核酸的探針。此外，芯片能高通量地篩選血清中穩(wěn) 定變化的微小核糖核酸探針，同時通過血清中微小核糖核酸的整體變化預(yù)測和診 斷疾病。我們首先通過測序的方法或定量PCR方法確定血清中有一個以上拷貝的 微小核糖核酸，然后合成這些微小核糖核酸的的反向互補(bǔ)探針，再把這些探針用芯片點(diǎn)樣儀SmartArrayTM點(diǎn)制在一張75X25 mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上。點(diǎn) 制在芯片上的樣品還包括作為內(nèi)標(biāo)的U6、 tRNA，人工制備的30個堿基長度的外 標(biāo)，陽性對照Hex等。整個點(diǎn)陣分成4個亞陣，每個亞陣有23行，21列，點(diǎn)間 距為185um，點(diǎn)的直徑約為130um，每條探針重復(fù)三次。芯片操作流程為(1) 提取血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量；(2)微小核糖核酸的 分離取50-100yg總RNA用Ambion's miRNA Isolation Kit (Cat 1560) 分離微小核糖核酸；(3)微小核糖核酸樣品的熒光標(biāo)記利用T4 RNA連接酶標(biāo) 記方法進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后再用無水乙醇沉淀，吹干后用于芯片雜交；(4)雜 交與清洗將RNA溶于16 P L雜交液中(15%甲酰胺；0.2% SDS; 3XSSC; 50X Denhardt' s solution)，于42。C雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42。C左右含0. 2% SDS， 2XSSC的液體中洗4分鐘，而后在0.2XSSC液體中室溫洗4分鐘，玻片 甩干后即可用于掃描；(5)芯片掃描芯片用LuxScan 10K/A雙通道激光掃描 儀進(jìn)行掃描；(6)數(shù)據(jù)提取及分析采用LuxScan3. 0圖像分析軟件對芯片圖像 進(jìn)行分析，把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，最后用SAM分析挑選差異表達(dá)基因。
將定量PCR技術(shù)和生物芯片技術(shù)雙重驗(yàn)證的在疾病及正常生理狀態(tài)下差異 表達(dá)程度大的一類血清微小核糖核酸探針，用于制備生物芯片，方法同上。此芯 片與傳統(tǒng)芯片相比，制作工藝和操作流程沒有很大改進(jìn)，但是此芯片簡化了探針 庫，由此將大大減少芯片的制作成本和生產(chǎn)時間，易于制備。同時也增加了芯片 的疾病針對性和實(shí)用性。將此芯片投入實(shí)踐，僅僅需要病人的血清而不需要任何 其它組織就可以在早期發(fā)現(xiàn)疾病，幫助指導(dǎo)診斷和治療。
4、專門用于疾病診斷與預(yù)測的微小核糖核酸試劑盒的制作
用于診斷預(yù)測各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性肝炎，艾次滋病等) 和急慢性疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，心血管系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng) 疾病等)的微小核糖核酸試劑盒的制作工藝和操作流程是基于定量PCR技術(shù)和生 物芯片技術(shù)。我們首先通過測序的方法或PCR方法確定正常血清中有一個以上拷 貝的微小核糖核酸。然后通過定量PCR技術(shù)和生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生 理狀態(tài)下表達(dá)量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預(yù)測是否發(fā)生癌變 或其它疾病以及診斷病變程度的探針。此試劑盒包括一批血清微小核糖核酸探針，Taq酶、dNTP等試劑。此試劑盒價值在于只需要血清而不需要其它組織樣品， 通過最精簡的探針庫檢測微小核糖核酸的變化趨勢，再通過該變化趨勢預(yù)測疾病 的發(fā)生可能或診斷疾病的病理階段。因此將此試劑盒投入實(shí)踐，特別對于不能活 檢組織的疾病如胰腺癌等，可以增加在早期發(fā)現(xiàn)病變的可能，幫助指導(dǎo)診斷和治 療，把疾病的確診和治療推上一個新高度。
權(quán)利要求
1、血清中微小核糖核酸分子的檢測方法，其特征是，所述檢測方法包括下列步驟6)收集血清樣本；7)將10μl血清作為buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，來制備cDNA樣品；8)用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設(shè)計引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；9)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；10)EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征是，所述步驟5)之后還包括 下列步驟用熒光染料EVA GREEN檢測并比較血清樣本相對于正常血清中微小核 糖核酸的量的變化。
3、 血清中微小核糖核酸分子的檢測方法，其特征是，所述檢測方法包括下 列步驟① 使用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取血清總RNA (10ml血清通常能富集 約10ug左右的RNA);② 通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA;③ 用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設(shè)計引物進(jìn)行PCR反應(yīng)； 進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；⑤EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。
4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征是，所述步驟⑤之后還包括下 列步驟用熒光染料EVA GREEN檢測并比較血清樣本相對于正常血清中微小核糖 核酸的量的變化。
5、 一種用于血清中微小核糖核酸檢測的生物芯片，其特征是，所述生物芯 片含有人血清中能正常檢測到的全部微小核糖核酸的探針。
6、 一種用于血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒，其特征是，所述試劑盒中 設(shè)有一批血清微小核糖核酸探針以及包括Taq酶、dNTP在內(nèi)的試劑。
7、 一種應(yīng)用血清中微小核糖核酸檢測的生物芯片的檢測方法，其特征是， 該制作方法包括下列步驟(1) 提取血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量；(2) 微小核糖核酸的分離取50-100ug總RNA用Ambion's miRNAIsolation Kit (Cat tt. 1560)分離微小核糖核酸；(3) 微小核糖核酸樣品的熒光標(biāo)記利用T4 RNA連接酶標(biāo)記方法進(jìn)行熒光 標(biāo)記，然后再用無水乙醇沉淀，吹干后用于芯片雜交；(4) 雜交與清洗將RNA溶于16uL雜交液中(15M甲酰胺；0.2%SDS; 3XSSC; 50XDenhardt's solution)，于42。C雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42。C左右含 0.2%SDS， 2XSSC的液體中洗4分鐘，而后在0. 2XSSC液體中室溫洗4分鐘， 玻片甩干后即可用于掃描；(5) 芯片掃描芯片用LuxScan 10K/A雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描；(6) 數(shù)據(jù)提取及分析采用LuxScan3. 0圖像分析軟件對芯片圖像進(jìn)行分析， 把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，最后用SAM分析挑選差異表達(dá)基因。
8、 一種用于血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒的制作方法，其特征是，該 制作方法包括下列步驟I .通過測序的方法或PCR方法確定正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸；II. 通過定量PCR技術(shù)和生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生理狀態(tài)下表達(dá)量 和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預(yù)測是否發(fā)生癌變或其它疾病以及 診斷病變程度的探針；III. 將步驟II中得到的一類血清微小核糖核酸探針和包括Taq酶、dNTP在內(nèi) 的試劑，制備成用于血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒。，
全文摘要
本發(fā)明涉及血清中微小核糖核酸分子的檢測方法、用于檢測血清中微小核糖核酸的試劑盒或生物芯片以及試劑盒和生物芯片的制作和應(yīng)用方法，目的在于檢測血清微小核糖核酸的變化，得到在疾病及正常生理狀態(tài)下差異表達(dá)程度大的一類血清微小核糖核酸探針，應(yīng)用于疾病鑒定和病程，惡性疾病復(fù)發(fā)率及預(yù)后和藥效的診斷相關(guān)的PCR試劑盒和生物芯片，以提高疾病的早期發(fā)現(xiàn)率以及確診的準(zhǔn)確性和療效。本發(fā)明的技術(shù)方案為血清中微小核糖核酸分子的檢測方法收集血清樣本；將10μl血清作為buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，來制備cDNA樣品；用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設(shè)計引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。
文檔編號G01N27/447GK101424640SQ200710134620
公開日2009年5月6日 申請日期2007年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者一 巴, 燕 張, 張峻峰, 張紅杰, 張辰宇, 柯 曾, 媛 殷, 進(jìn) 王, 王可慧, 星 蔡, 郭繼剛, 熹 陳, 陳江寧 申請人:南京大學(xué)