專利名稱：：混合免疫抗原及其在建立單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種混合免疫抗原及其在建立單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的方法中的應(yīng)用，更確切地說是利用由抗生素、病毒和細(xì)菌3大類中的至少兩種免疫抗原產(chǎn)生的混合抗原，一次免疫小鼠后用一次融合、每種抗體分別單獨(dú)篩選的方法，同時(shí)獲得能分別穩(wěn)定分泌抗不同抗原的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，且每種抗體只與各自相應(yīng)的特異性抗原發(fā)生反應(yīng)，而不與其他類型的抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，又稱單克隆抗體技術(shù)，是在體細(xì)胞融合技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種成熟技術(shù)，主要是將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與免疫動(dòng)物B淋巴細(xì)胞進(jìn)行融合，產(chǎn)生能連續(xù)傳代、穩(wěn)定分泌特異抗體的雜交細(xì)胞。單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，便于人為處理和質(zhì)量控制，并且可工廠化生產(chǎn)，來源容易。單克隆抗體用途廣泛，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和其他研究領(lǐng)域中顯示了極大的應(yīng)用價(jià)值。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，單克隆抗體在疾病診斷、判斷預(yù)后、防治以及致病機(jī)制研究等方面起著巨大的促進(jìn)作用。迄今全球已研制出數(shù)千種單克隆抗體。盡管單克隆抗體在各個(gè)研究領(lǐng)域中的作用顯得越來越重要，應(yīng)用也越來越廣泛，但是分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的建立卻并非易事，因?yàn)橹苽鋯慰寺】贵w包括抗原制備、動(dòng)物免疫、建立抗體檢測(cè)方法、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存、穩(wěn)定性測(cè)定以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)等一系列復(fù)雜步驟，一般要花費(fèi)6個(gè)月以上的時(shí)間。傳統(tǒng)方法中每只小鼠只能免疫一種純化抗原，將這種免疫小鼠的脾臟B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合后，形成的雜交瘤細(xì)胞只能分泌針對(duì)這種純化抗原的單一單克隆抗體。由于這種方法對(duì)小鼠自始自終只能免疫一種純化抗原，每次細(xì)胞融合也只能用一只小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，所以一個(gè)工作人員經(jīng)過半年左右的辛勤努力，即使工作進(jìn)展順利，也只能得到針對(duì)一種抗原的單克隆抗體，工作效率很低。有關(guān)單克隆抗體的制備方法在以下專利文件中均有記載CM200410000190.3,CN200410080352.9CN200610165844.7C函0510096125.XC隨120432.XC隱145286.2.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是采用至少兩種抗原混合免疫、一次細(xì)胞融合、不同抗體分別單獨(dú)篩選的技術(shù)，建立一種快速生產(chǎn)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的高效方法，克服傳統(tǒng)方法生產(chǎn)效率低，費(fèi)工費(fèi)時(shí)、成本高等缺點(diǎn)；本發(fā)明充分利用機(jī)體龐大的B淋巴細(xì)胞體系，制備至少兩種抗原同時(shí)免疫同一只小鼠，改變了傳統(tǒng)觀念中每只小鼠只能免疫一種純化抗原而產(chǎn)生只能分泌針對(duì)這種純化抗原的單一單克隆抗體的認(rèn)識(shí)，本研究在單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)技術(shù)上是重大突破，這對(duì)全世界雜交瘤技術(shù)的學(xué)術(shù)研究和實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。本發(fā)明的技術(shù)方案為(1)免疫用混合抗原的制備用抗生素、病毒和細(xì)菌3大類中的至少兩種免疫抗原作為混合免疫抗原，其制備方法為按每只小鼠60-80wg的抗原量，將抗原用生理鹽水稀釋到適當(dāng)濃度(2.0mg/ml-10.Omg/ml)，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，確定抗原的最佳濃度為抗生素抗原的重量份為4.5-6.0、病毒抗原的重量份為4.0-8.0、細(xì)菌毒素LPS的重量份為3.5-5.5。將每種抗原等體積比例混合后，按10ng/ml加入bsin作為免疫增強(qiáng)劑。最后加入等體積的完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，在漩渦振蕩器上乳化，直至乳化良好為止，分別制成完全佐劑抗原和不完全佐劑抗原，作為免疫小鼠的佐劑抗原。以同樣方法將所用抗原分別制成不混合的單一乳化抗原，每種抗原又包括完全佐劑和不完全佐劑兩類劑型，用作單一抗原免疫對(duì)照。(2)試驗(yàn)小鼠及其免疫取純種小鼠，按常規(guī)方法預(yù)養(yǎng)和篩選，分組。每組每只小鼠按設(shè)計(jì)分別腹腔注射相應(yīng)佐劑抗原0.2ml，另設(shè)一組不免疫小鼠作為空白對(duì)照。首次免疫使用完全弗氏佐劑抗原，以后每隔3周以不完全弗氏佐劑抗原加強(qiáng)免疫一次。免疫三次以后，間隔七天，尾靜脈采血，收集血清，檢測(cè)血清效價(jià)。融合前3天，選取抗體水平最高的小鼠，腹腔注射0.2ml不加佐劑的混合抗原加強(qiáng)免疫。(3)間接ELISA檢測(cè)方法的建立用間接ELISA檢測(cè)所有雜交瘤細(xì)胞上清。分別用每一種單一抗原包被ELISA反應(yīng)板，以免疫小鼠血清作為陽性血清，按常規(guī)方法建立ELISA方法，用于相應(yīng)單抗陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選。間接ELISA操作流程如下1)包被抗原做適當(dāng)稀釋，每孔100iU加入酶標(biāo)板，37。C孵育lh，4'C過夜。次日取出，PBST洗滌5次，拍干。2)封閉每孔加330Ul封閉液，37'C封閉lh，PBST洗滌5次，拍干。3)加樣將雜交瘤細(xì)胞上清用PBS稀釋后，按順序加入酶標(biāo)板，每孔100iU，37'C反應(yīng)lh，PBST洗滌5次，拍干。4)加酶標(biāo)二抗將羊抗鼠酶標(biāo)二抗用PBS作1:1000稀釋后，每孔100wl加入酶標(biāo)板，37'C反應(yīng)lh，PBST洗滌5次，拍干。5)加底物每孔加入底物TMB100nl，37。C反應(yīng)15min，PBST洗滌5次，拍干。6)終止反應(yīng)每孔加入終止液50u1。15min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定并記錄每孔的OD值。7)結(jié)果判定P/N=(待檢樣品孔OD值一空白孔OD值)/(陰性對(duì)照孔OD值一空白孔OD值)。若P》1.0，且P/N》2，記為陽性；若P/N〈2，記為陰性。(4)能分別穩(wěn)定分泌抗青霉素、病毒和細(xì)菌毒素單抗的雜交瘤細(xì)胞株的建立1)細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的篩選分別獲取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，在體外融合形成雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選得到雜交瘤細(xì)胞株。2)特異性單抗陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選分別用每一種單一抗原包被ELISA反應(yīng)板，用所建立的間接ELISA檢測(cè)所有雜交瘤細(xì)胞上清。篩選各自相應(yīng)的抗體陽性細(xì)胞克隆。3)特異性單抗陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆細(xì)胞上清有特異性抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過3次亞克隆，取連續(xù)兩次亞克隆陽性率為100%的雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)到細(xì)胞瓶繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)后，收獲細(xì)胞液氮凍存。(5)單抗的制備、提純和特性鑒定挑選經(jīng)產(chǎn)母鼠；每只腹腔注射0.5ml滅菌液體石蠟。IO天后，每只小鼠腹腔注射106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。待小鼠腹部明顯膨大時(shí)，收集腹水，常規(guī)處理后采用辛酸-硫酸銨法提純腹水單抗，并進(jìn)行效價(jià)、抗體蛋白含量和與其他抗生素交叉反應(yīng)性的測(cè)定。(6)抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株的抗體分泌穩(wěn)定性測(cè)定1)雜交瘤細(xì)胞的凍存選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，收集于離心管內(nèi)離心10min,棄去上清。用凍存液將細(xì)胞懸浮，并使細(xì)胞的數(shù)量調(diào)整到106個(gè)/ml左右，分裝于細(xì)胞凍存管中1.5ml/管，加蓋封嚴(yán)，注明細(xì)胞代號(hào)、凍存日期。將凍存管置-2(TC2h，懸于液氮罐上層液氮蒸汽中過夜，再投入液氮罐。2)雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇抗體分泌陽性雜交瘤細(xì)胞分別凍存l、2、3、4、5、6個(gè)月時(shí)，從液氮中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，迅速投入37'C水浴中l(wèi)min，融化后1000r/min離心10min，棄上清，用DMEM-20完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到25cn^細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37'C，5。/。CCb培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑可以從市場(chǎng)上直接購(gòu)買。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用至少兩種抗原混合免疫小鼠后用一次融合、每種抗體分別單獨(dú)篩選的方法，同時(shí)獲得能分別穩(wěn)定分泌抗不同抗原的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，且所分泌的多種單克隆抗體的效價(jià)都與傳統(tǒng)方法制備的單抗效價(jià)相似，特異且穩(wěn)定。與用單一純化抗原免疫小鼠的傳統(tǒng)方法相比，本方法使工作效率能成倍甚至數(shù)倍提高，可以極大促進(jìn)單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，取得明顯的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。具體實(shí)施例方式l.抗原制備共制備3大類抗原中的10種免疫抗原。各抗原的制備方法-1)抗生素-載體蛋白偶聯(lián)物的制備①氨芐青霉素(AMPI)-載體蛋白偶聯(lián)物的制備取AMPI8mg、BSA(牛血清白蛋白)14mg加入到pH6.0的PBS中，充分溶解后，緩慢加入25%戊二醛8ul,滴加過程不斷搖動(dòng)，37。C避光反應(yīng)46h，期間每隔30min輕輕晃動(dòng)一次，使之充分反應(yīng)后置4'C過夜。取AMPI10mg、HSA(人血清白蛋白)10mg加入到0.067mol/LpH6.0的PBS中，充分溶解后，緩慢加入25%戊二醛12"1，滴加過程不斷搖動(dòng)，37。C避光反應(yīng)46h，期間每隔30min輕輕晃動(dòng)一次，使之充分反應(yīng)后置4。C過夜。將上述所有連接產(chǎn)物分別用pH6.0的PBS透析48h,每46h換液l次。透析結(jié)束后，12000r/min離心30min，收集上清，取出少量樣品經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂?，紫外分光光度法鑒定，并計(jì)算連接產(chǎn)物的結(jié)合比。分裝后-2(TC保存?zhèn)溆?。②諾氟沙星-BSA偶聯(lián)物的制備稱取諾氟沙星2.82mg，羥基琥珀酰亞胺5.07mg，碳化二亞胺10.16mg溶于1.6ml二甲基甲酰胺，室溫下反應(yīng)12h，其間震蕩數(shù)次；稱取2.5mgBSA溶于1.1mlpH7.4的PBS液中；將NFLX反應(yīng)液逐滴加入到BSA溶液中，每種0.8ml，邊加邊振蕩，混勻后放4。C過夜，期間搖動(dòng)數(shù)次，收集連接物，PBS液透析2-3d，12000r/min離心30min，取上清，-201:冷凍保存?zhèn)溆?；③鏈霉素肟的制備稱取0.lg無水乙酸鈉傾入lml雙蒸水中，再加入鏈霉素163.3mg和CM06mg，室溫下反應(yīng)24h，每4一6h震蕩一次。所得產(chǎn)物即為鏈霉素肟(SM-oxime)。吸取150ul上述混合液加入20%乙醇中，0.lgEDC溶于上液記為A液；5mgBSA溶于0.75ml水中記為B液。將B液與A液混合，室溫下反應(yīng)24h，每3—6h震蕩一次。PBS液透析72h,每6—8h換液一次。收集產(chǎn)物一2(TC分裝保存。取出少量樣品經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂?，紫外分光光度法鑒定，并計(jì)算連接產(chǎn)物的結(jié)合比。'四環(huán)素(Tc)與載體蛋白BSA(牛血清白蛋白)連接物的制備將0.15umolBSA溶于7.5ml醋酸緩沖液中(0.lmol/LPH4.2)，加入266umol甲醛溶液，再將169umo1四環(huán)素鹽酸鹽溶解于3.5ml甲醇中，將四環(huán)素甲醇溶液逐滴加入到上述BSA溶液中，室溫、暗處避光反應(yīng)24h，每3-6h震蕩一次。用0.lmol/L、PH4.2的醋酸緩沖液透析24h，每6-8h換液一次。收集產(chǎn)物-2(TC分裝保存。取出少量樣品經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂?，紫外分光光度法鑒定并計(jì)算連接產(chǎn)物的結(jié)合比。2)病毒抗原的制備①新城疫病毒抗原的制備將NDV種毒經(jīng)10"咅稀釋后接種于911日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚接0.2ml，37。C孵育，每6-8h照胚一次。棄除24h死亡胚，取出36h-72h自然死亡雞胚和活胚，置4'C條件下冷藏24h后，無菌收取尿囊液，觀察胚體病變情況，測(cè)定病毒血凝價(jià)和血凝抑制價(jià)。將透析袋在大體積的2%NaHC03和lmmol/lEDTA(pH8.0)的溶液中煮沸10min，用蒸餾水清洗，在lmmol/lEDTA(pH8.0)的溶液中煮沸10min，冷卻后4。C過夜。用前用去離子水沖洗干凈。病毒液經(jīng)0.3%甲醛滅活36h，離心10min取上清于透析袋中，扎緊袋口，放入大燒杯或容器中，用蔗糖于4'C包埋4h左右，待透析袋內(nèi)液體量濃縮至原體積的1/5-1/10時(shí)，吸出袋內(nèi)液體，于-20'C保存?zhèn)溆?。差速離心純化濃縮后的病毒液，4'C8000rpm高速離心30min棄去沉淀，取上清于4'C25000rpm超速離心2.5h棄去上清，沉淀懸浮在PBS緩沖液(PH7.2)中,吹打稀釋混勻后再差速離心兩次。最終沉淀用2-3mlPBS吹打稀釋混勻后再于4。C8000rpm高速離心30min取上清，此上清即為濃縮純化的病毒液。用紫外分光光度計(jì)測(cè)其280nm、260nm波長(zhǎng)處吸光度，按以下公式計(jì)算病毒蛋白含量蛋白含量(mg/ml"1.45OD2咖m-0.74OD260nm。將其分裝于EP管中，-20°〇保存，用于免疫小鼠制備單抗。取同批次同日齡不接種病毒的雞胚，37'C正常孵化72h后，置4"C條件下冷藏24h，無菌收取尿囊液，經(jīng)與免疫抗原同樣的濃縮純化處理后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其280nm、260nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算其蛋白含量。將此空白尿囊液分裝于EP管中，用作空白抗原對(duì)照，-20'C保存。②H9N1亞型禽流感病毒抗原的制備將H9N1亞型禽流感病毒種毒經(jīng)10M音稀釋后接種于911日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚接0.2ml，37。C孵育，每6-8h照胚一次。棄除24h死亡胚，取出36h-72h自然死亡雞胚和活胚，置4"C條件下冷藏24h后，無菌收取尿囊液，觀察胚體病變情況，測(cè)定病毒血凝價(jià)和血凝抑制價(jià)。其后的步驟同上述新城疫病毒抗原的制備方法。③豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原的制備將生長(zhǎng)良好的單層Marc-145細(xì)胞，按照0.1TCID5o/細(xì)胞接種PRRSV毒種，37X:吸附1h后，加入細(xì)胞維持液，置37。C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。接毒后，每日觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)病變細(xì)胞達(dá)75%以上時(shí)即可收獲。PRRSV最佳收毒時(shí)間為54h。將PRRSV毒種用DMEM稀釋液做10倍系列稀釋，取l(T6、l(T7和l(T8三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種Marc-145細(xì)胞4瓶，在37。C含5%002培養(yǎng)箱中培養(yǎng)察3閂，每日觀察并記錄細(xì)胞病變，計(jì)算TCIDso。經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒抗原(病毒含量》5X1(fTCID5o/mlPRRSV)，于無菌容器中按總量的0.1%向病毒液中加甲醛溶液(40%),振蕩10分鐘，換瓶后置37'C下滅活24h。期間每曰上，下午過各振搖一次，每次10分鐘(或置搖床上滅活)。滅活病毒液置28'C保存。豬偽狂犬病毒(PRV)抗原的制備將生長(zhǎng)良好的單層Vero細(xì)胞，倒去生長(zhǎng)液，按照0.1TCID5Q/細(xì)胞接種PRV，37。C吸附1h后，加入細(xì)胞維持液，置37。C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。接毒后，每日觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)病變細(xì)胞達(dá)75%以上時(shí)即可收獲。PRV最佳收毒時(shí)間為30h。置4'C保存，應(yīng)不超過7日。將PRV用DMEM稀釋液做10倍系列稀釋，取1(T6、10—7、10—8三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種Vero細(xì)胞4瓶，在37'C含5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察3日，計(jì)算TCID50。。經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒抗原(病毒含量》5xlcTTCID5o/mlPRV)，于無菌容器中按總量的0.1%向病毒液中加甲醛溶液(40%)，振蕩10分鐘，換瓶后置37"C下滅活36h。期間每日上，下午過各振搖一次，每次10分鐘(或置搖床上滅活)。滅活病毒液置28。C保存。3)細(xì)菌抗原的制備①志賀氏菌LPS的制備用LB培養(yǎng)基增殖雞鮑氏志賀氏菌，先用平板分離單個(gè)菌落，然后將培養(yǎng)好的純細(xì)菌接種到培養(yǎng)液里培養(yǎng)16h左右，30005000r/min離心收集菌體。所得菌體用無菌PBS液稀釋、凍融后超聲處理，再加入苯酚劇烈攪拌30min。離心后棄去水相和變性蛋白，酚相加等量水重復(fù)抽提23次，離心后取水相透析48h,換水46次。收集透析液加終濃度為50iig/ml的DNA酶和RNA酶，37。C作用4h。水浴10min，離心30min收集上清，加無水乙醇沉淀。離心30min，沉淀用PBS液稀釋后，再用蒸餾水透析48h。離心3h所得沉淀即為L(zhǎng)PS。②大腸桿菌LPS的制備用LB培養(yǎng)基增殖豬大腸桿菌，其培養(yǎng)方法、細(xì)菌的收集和LPS的提取均與上述志賀氏菌LPS的制備方法相同。表l按重量份各抗原組分<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4)免疫用佐劑混合抗原的制備以每只小鼠60-80wg的抗原量，將上述制備的4種抗生素偶聯(lián)抗原、4種病毒抗原和2種細(xì)菌毒素抗原用生理鹽水稀釋到適當(dāng)濃度(2.0mg/ml-10.0mg/ml)，抗生素抗原、病毒抗原、細(xì)菌毒素LPS以表1中重量份計(jì)算，表l中僅隨機(jī)列舉了抗原組成的混合抗原中的一部分。將所述每種抗原等體積比例混合后，按10ng/ml加入bursin作為免疫增強(qiáng)齊U。最后加入等體積的完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，在漩渦振蕩器上乳化，直至乳化良好為止，分別制成完全佐劑抗原和不完全佐劑抗原，作為免疫小鼠的佐劑抗原。以同樣方法將上述10種抗原分別制成不混合的單一乳化抗原，用作單一抗原免疫對(duì)照。共制備混合抗原72種、單一抗原10種，每種抗原又包括完全佐劑和不完全佐劑兩類劑型。2.免疫小鼠選8-12周齡Balb/c小鼠168只，分為84組，每組2只。1-83組每只小鼠分別按表l腹腔注射佐劑抗原0.2ml，第84組不免疫作為空白對(duì)照。首次免疫使用完全弗氏佐劑抗原，以后每隔3周以不完全弗氏佐劑抗原加強(qiáng)免疫一次。免疫三次以后，間隔七天，尾靜脈采血，收集血清，用ELISA方法檢測(cè)血清效價(jià)，當(dāng)血清中針對(duì)上述各種抗原的抗體水平均達(dá)到1:6400以上時(shí)，可用于融合。融合前3天，選取抗體水平最高的小鼠，腹腔注射0.2ml(0.6mg/ml)不加佐劑的混合抗原加強(qiáng)免疫。3.能分別穩(wěn)定分泌抗單一抗原的單抗雜交瘤細(xì)胞株的建立1)細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的篩選分別獲取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，在體外融合形成雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選得到雜交瘤細(xì)胞株。2)特異性單抗陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選用間接ELISA檢測(cè)所有雜交瘤細(xì)胞上清。分別用上述10種抗原(4種抗生素、4種病毒和2種細(xì)菌LPS)中的每一種單一抗原包被ELISA反應(yīng)板，篩選各自相應(yīng)的抗體陽性細(xì)胞克隆。間接ELISA操作流程如下包被抗原做適當(dāng)稀釋后加入酶標(biāo)板，每孔100ul，37。C孵育lh，4。C過夜。次日取出，PBST洗滌5次，拍干。封閉每孔加330ul封閉液，37。C封閉lh，PBST洗滌5次，拍干。加樣將雜交瘤細(xì)胞上清用PBS作10倍稀釋后，按順序加入10不同種抗原包被的酶標(biāo)板，每孔100ul，37。C反應(yīng)lh，PBST洗滌5次，拍干。加酶標(biāo)二抗將羊抗鼠酶標(biāo)二抗用PBS作1:1000稀釋后加入酶標(biāo)板，每孔100nl，37r反應(yīng)lh,PBST洗滌5次，拍干。加底物每孔加入底物TMB100iU，37。C反應(yīng)15min，PBST洗滌5次，拍干。終止反應(yīng)每孔加入終止液50ul。15min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定并記錄每孔的0D值。結(jié)果判定P/N=(待檢樣品孔OD值一空白孔OD值)/(陰性對(duì)照孔OD值一空白孔OD值)。若P^LO，且P/N》2，記為陽性；若P/N〈2，記為陰性。①檢測(cè)4種抗生素單克隆抗體的ELISA方法抗生素-BSAlixg/m及抗生素-HSA2ug/ml37°Clh，4。C過夜，丄PBST(PH7.4，0.01M)洗滌4次0.5%明膠封閉300ul/孔，，37°Clh，PBST洗滌4次加適當(dāng)稀釋的待測(cè)樣品，100ul/L37°C30min，PBST洗滌4次羊抗鼠酶標(biāo)二抗1:1000稀釋，100ul/孔I37°C30min，PBST洗滌4次TMB底物，100ul/孔I37°C15min終止液50ul/孔丄室溫5min測(cè)OD值結(jié)果判定P禮O，且P膨2，記為陽性。②檢測(cè)4種病毒單克隆抗體的ELISA方法，'純化病毒1:3200稀釋包被，100P1/孔37。Clh后4。C過夜PBST洗滌5次，拍干每孔加:fooui封閉液"37'C濕盒中封閉lh，洗滌5次，拍干1:3200稀釋的陰,性血清用100ul/孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，F(xiàn)37。C作用lh，洗滌5次，拍干加入1:1000PBS，釋的HRP-羊抗鼠IgG,100lU/孔J37'C作用lh,洗滌5次，拍干TMB,物100lU/孔丄"。C濕盒避光反應(yīng)l5min平入終止液50ul/孔，15min內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀取450nm處的OD值。結(jié)果判定OD值接近l.O，P/N》2.0判為陽性。③檢測(cè)2種細(xì)菌毒素LPS單克隆抗體的ELISA方法純化LPS1:6000稀釋包被，lOOu1/孔37'Clh后4。C過夜PBST洗滌4次，拍干每孔加poui封閉液v37'C濕盒中封閉lh，洗滌4次，拍干l:3200稀釋的陰/，性血清用100iU/L，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，，37'C作用lh，洗滌4次，拍干加入1:1000PBS稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100u1/孔37'C作用lh，洗滌4次，拍干tmb;^物iooiu/孔37'C濕盒避光反應(yīng)15min加入終止液50y1/孔，15min內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀取450nm處的OD值。結(jié)果判定:P》1.0，且P膨2，記為陽性￡3)免疫小鼠血清抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果末次免疫后7天，用所建立的ELISA方法測(cè)定每組小鼠血清抗體，結(jié)果詳見表2.4)單克隆抗體陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選結(jié)果經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選、ELISA檢測(cè)，無論是混合抗原免疫組還是單一免疫組，細(xì)胞融合率和陽性率均較高，詳見表3。陽性孔經(jīng)亞克隆，從混合免疫組共得到4株能夠穩(wěn)定分泌分別抗4種抗生素抗體的雜交瘤細(xì)胞株，依次命名為1C8、2D5、3F7、4C5;4株分別抗4種病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，依次命名為FND1,FND2,FND3,FND4;4株抗LPS單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，依次命名為ALPS1，ALPS2，ALPS3,ALPS4。表2.免疫小鼠血清抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果(均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3.雜交瘤細(xì)胞的融合率和陽性率_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.腹水及細(xì)胞培養(yǎng)上清中單抗的制備、提純和特性鑒定挑選經(jīng)產(chǎn)小鼠，每只腹腔注射0.5ml滅菌液體石蠟。7-IO天后，每只小鼠腹腔注射106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。待小鼠腹部明顯膨大時(shí)，收集腹水，37。C孵育lh，4。C過夜，次日將腹水3000r/min離心10min，去除表兩油層，吸取上清備用。采用辛酸-硫酸銨法提純細(xì)胞上清和腹水中的單抗，并對(duì)其進(jìn)行效價(jià)、抗體蛋白含量和與其他抗原交叉反應(yīng)性的測(cè)定。結(jié)果表明，細(xì)胞上清中抗體效價(jià)最高能達(dá)到1:51200,腹水中抗體效價(jià)最高能達(dá)到1:1638400。腹水中抗體蛋白的濃度為245.28mg/ml。(1)不同方法建立的雜交瘤細(xì)胞株所分泌細(xì)胞上清單抗的滴度比較結(jié)果詳見表4.表4.不同方法建立的雜交瘤細(xì)胞株所分泌細(xì)胞上清單抗的滴度(均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>度(2)不同方法建立的雜交瘤細(xì)胞株所分泌小鼠腹水單抗的滴度比較結(jié)果詳見表5.表5.不同方法建立的雜交瘤細(xì)胞株所分泌小鼠腹水單抗的滴度(均值)組別抗生素單一免疫、融合病毒單一免疫、融合LPS單一免疫、融合三種抗原混合免疫腹水抗體滴度1:16384001:1638400〉1:2121:2115.抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株的抗體分泌穩(wěn)定性測(cè)定1)雜交瘤細(xì)胞的凍存選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，收集于離心管內(nèi)離心10min，棄去上清。用凍存液將細(xì)胞懸浮，并使細(xì)胞的數(shù)量調(diào)整到10S個(gè)/ml左右，分裝于細(xì)胞凍存管中1.5m1/管，加蓋封嚴(yán)，注明細(xì)胞代號(hào)、凍存日期。將凍存管置-2(TC2h，懸于液氮罐上空過夜，再投入液氮罐。2)雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇從液氮中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，迅速投入37C水浴中l(wèi)min，融化后1000r/min離心10min，棄上清，用DMEM-20完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到25ci^細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37。C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。權(quán)利要求1.一種混合免疫抗原，其特征在于由抗生素抗原、病毒抗原和細(xì)菌抗原3大類中的至少兩種免疫抗原混合而成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合免疫抗原，其特征在于每一種抗原的濃度為，抗生素抗原4.5-6.0mg/ml、病毒抗原為4.0-8.0mg/ml、細(xì)菌毒素LPS為3.5-5.5mg/ml。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的混合免疫抗原，其特征在于每種抗原在混合時(shí)按等體積比例混合。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的混合免疫抗原，其特征在于混合免疫抗原的劑型為完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑之一。5.混合免疫抗原在建立單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的方法中的應(yīng)用，包括以下步驟用抗原免疫小鼠，將免疫小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選抗體，其特征在于所述用抗原免疫小鼠是采用至少兩種抗原混合的免疫抗原免疫同一只小鼠，將免疫小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞進(jìn)行一次融合，每種抗體分別單獨(dú)篩選。6.根據(jù)權(quán)利要求5述的混合免疫抗原在建立單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的方法中的應(yīng)用，其特征在于獲得的單克隆抗體亞型為IgG2類。全文摘要本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。涉及一種混合免疫抗原及其在建立單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的方法中的應(yīng)用，其主要技術(shù)特征為利用抗生素、病毒和細(xì)菌3大類中的至少兩種免疫抗原作為混合抗原，一次免疫小鼠后用一次融合、每種抗體分別單獨(dú)篩選的方法，同時(shí)獲得能分別穩(wěn)定分泌抗不同抗原的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，且每種抗體只與各自相應(yīng)的特異性抗原發(fā)生反應(yīng)，而不與其他類型的抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。突破了傳統(tǒng)方法中每只小鼠只能免疫一種純化抗原的做法。采用本方法所分泌的多種單克隆抗體的效價(jià)都與傳統(tǒng)方法制備的單抗效價(jià)相似，特異且穩(wěn)定，提高了生產(chǎn)效率，節(jié)約了時(shí)間，降低了成本。文檔編號(hào)A61P35/00GK101406700SQ20071018971公開日2009年4月15日申請(qǐng)日期2007年10月10日優(yōu)先權(quán)日2007年10月10日發(fā)明者任向陽,劉秋燕,劉紅英,昶張,霞楊,王川慶,陸陳申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)