專利名稱：：二氫青蒿素在增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬藥物用途，涉及二氫青蒿素在增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效方面的藥物用途。技術(shù)背景惡性腫瘤是威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，其治療失敗的主要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。惡性腫瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性除了癌細(xì)胞本能地變異外，另一個(gè)重要原因是腫瘤組織微環(huán)境結(jié)構(gòu)和功能異常。這種異常的微環(huán)境形成的機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為與腫瘤組織內(nèi)新生血管結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重缺陷、組織內(nèi)間隙液體壓升高、低氧環(huán)境和酸中毒等因素有關(guān)。最近幾年，血管生成抑制劑作為化療藥物的增敏劑日益引起人們的重視，并在治療多種腫瘤中卓有成效。一些臨床研究表明，血管生成抑制劑能特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生并明顯抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，其聯(lián)合化療方案使非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的治療有望擺脫"瓶頸區(qū)"的牽制，有可能成為晚期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。血管生成抑制劑作為化療增敏劑的合理之處不僅在于化療藥物和血管生成抑制劑可以損壞腫瘤組織不同的組成部分腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，而且血管生成抑制劑可以改變腫瘤血管異常的結(jié)構(gòu)及功能，從而增強(qiáng)化療藥物的治療效果。,一先，血管生成抑制劑可以改善腫瘤血管結(jié)構(gòu)紊亂、滲漏的狀態(tài)，降低腫瘤內(nèi)間質(zhì)液體壓力，增加藥物輸送到腫瘤內(nèi)部，緩解腫瘤組織缺氧，這樣就會(huì)使化療效果大大增強(qiáng)。#汰，血管生成抑制劑可以阻止腫瘤細(xì)胞在化療過后的快速復(fù)蘇。盡管化療或放療可以使大部分腫瘤出現(xiàn)消退，但由于化療藥物或放療的嚴(yán)重不良反應(yīng)而限制了其長期應(yīng)用。治療結(jié)束后腫瘤細(xì)胞可以快速地復(fù)蘇、增殖，且腫瘤細(xì)胞再增殖速度并沒有隨著化療或放療次數(shù)的增加而減少。因此腫瘤消退并沒有真正延長病人的生命，Hudis提出了在化療停藥期間實(shí)施抗血管生成治療的可行辦法，以阻斷腫瘤細(xì)胞的快速再增殖仍需要通過鄰近血管所提供的氧氣和營養(yǎng)。r￥^，血管生成抑制劑可以增強(qiáng)化療藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷作用，化療藥物在新的血管形成期間不但對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有直接的殺傷作用，而且對(duì)那些骨髓源性的功能性、有活力的內(nèi)皮細(xì)胞也具有殺傷作用，這類細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞，CD54+單核細(xì)胞等。內(nèi)皮祖細(xì)胞可分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，在血管生成中發(fā)揮重要作用；CD54+單核細(xì)胞和其他骨髓樣細(xì)胞群是血管新生的發(fā)源地?；熕幬镄┝抗?jié)律性治療方式可以直接殺傷內(nèi)皮細(xì)胞，抑制循環(huán)系統(tǒng)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞。這些內(nèi)皮細(xì)胞大部分可以分泌VEGF，因此在治療過程中化療藥物和一些以VEGF為靶點(diǎn)的藥物合用可以發(fā)揮協(xié)同或累加的治療效果。臨床研究顯示，化療藥物小劑量節(jié)律性治療和血管生成抑制劑長期合用可以發(fā)揮明顯的抗腫瘤效果。青蒿素(artemisinin)是我國科學(xué)家在1971年首次從菊科植物黃花蒿"他w"/^"做aLinn)中提出的具有新型結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯,它具有十分優(yōu)良的抗瘧作用。二氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)為青蒿素類藥物體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物，與青蒿素相比，具有水溶性好，抗瘧療效更強(qiáng)等特點(diǎn)。本課題組前期研究表明，青蒿素類藥物能顯著抑制人卵巢癌裸鼠移植瘤組織及惡性血液腫瘤細(xì)胞株K562、RPMI8226中VEGF的表達(dá)，具有明確的抗腫瘤血管生成作用。臠薰索二絮資霜素
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)的明目的是提供二氫青蒿素在制備增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效藥物中的應(yīng)用。即作為一種靶向腫瘤血管生成抑制劑增強(qiáng)化療藥物在抗腫瘤療效方面的作用。所述二氫青蒿素的分子式為C15H2405。本發(fā)明所制備的藥物為抗腫瘤化療藥物。含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。所述藥物的制劑形式為固體制劑。給藥方式為口服給藥。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)二氫青蒿素是傳統(tǒng)的的青蒿素類抗瘧藥中最具有代表性的藥物，一直以來用于抗瘧治療，本發(fā)明的特點(diǎn)是首次提出二氫青蒿素作為一種靶向腫瘤血管生成抑制劑增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤的治療效果。惡性腫瘤是威脅人類健康最腸i嚴(yán)重的疾病之一，化學(xué)治療仍將是腫瘤治療的主要手段，二氫青蒿素能在腫瘤治療中通過阻斷腫瘤血管生成，克服化療藥物靶向不明確，副作用較大的不足。因此，聯(lián)合化療增強(qiáng)抗腫瘤治療效果將會(huì)得到重要應(yīng)用。(2)本發(fā)明為二氫青蒿素開發(fā)成為化療藥物增敏劑提供藥效學(xué)及其作用機(jī)制的研究依據(jù)，具有將青蒿素類藥物開發(fā)成為腫瘤靶向治療藥物的價(jià)值。(3)本發(fā)明初步探討二氫青蒿素增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效的給藥方案研究，為臨床聯(lián)合化療方案合理化給藥提供藥理學(xué)依據(jù)。圖la為二氫青蒿素(DHA)與環(huán)磷酰胺(CTX)聯(lián)合治療方案I腫瘤生長曲線。圖lb為DHA與CTX聯(lián)合治療方案II腫瘤生長曲線。圖2a為DHA與CTX聯(lián)合治療方案I腫瘤實(shí)體圖。圖2b為DHA與CTX聯(lián)合治療方案II腫瘤實(shí)體圖。圖3為DHA聯(lián)合CTX對(duì)荷瘤小鼠腫瘤重量的影響圖4a為DHA與CTX聯(lián)合治療方案I小鼠肺組織轉(zhuǎn)移灶實(shí)體圖。圖4b為DHA與CTX聯(lián)合治療方案II小鼠肺組織轉(zhuǎn)移灶實(shí)體圖。圖5a為DHA與CTX聯(lián)合治療方案I腫瘤組織VEGF表達(dá)。圖5b為DHA與CTX聯(lián)合治療方案II腫瘤組織VEGF表達(dá)。圖6為DHA對(duì)LLC細(xì)胞增殖的影響。圖7為DHA誘導(dǎo)LLC細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察。圖8a、8b為DHA誘導(dǎo)LLC細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)定量分析。圖9為DHA對(duì)LLC細(xì)胞KDR/flk-1蛋白表達(dá)的影響。具體實(shí)施方式本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步的說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。就作用機(jī)制而言，二氫青蒿素適用于一切依賴血液供應(yīng)才能生長的實(shí)體瘤(如胃癌、肝癌、腸癌和乳腺癌等)，以及血液腫瘤(白血病、多發(fā)性骨髓瘤等)的治療。實(shí)施例l:二氫青蒿素增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對(duì)Lewis肺癌生長和轉(zhuǎn)移的治療作用試驗(yàn)材料二氫青蒿素片劑(浙江華立南湖制藥有限公司)，LLC(LewisLungCarcinoma)細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供)，C57BL/6小鼠100只，雄性，體重20土2g，6~8周齡(中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，免疫組化ElivisionTMplus廣譜試劑盒(KIT-9901/9902/9903)(福州邁新生物技術(shù)有限公司)，鼠抗人VEGF單克隆抗體(SantaCruz公司)。方法(1)Lewis肺癌生長和轉(zhuǎn)移模型建立及給藥方案用含10。/。小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠LLC細(xì)胞，于37。C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，待長滿70-90%面積后傳代。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至lxl0Vr1，在6-8周齡雄性C57BL/6小鼠背部皮下接種，0.2ml/只，共兩只。待腫瘤長至500mmS大小，處死小鼠，無菌條件下取出瘤塊并切割成約lmn^大小，用套管針接種到新的6-8周齡雄性C57BL/6小鼠右前肢腋下，共100只。接種后隨機(jī)分為10組，每組10只，按環(huán)磷酰胺開始給藥時(shí)間不同，應(yīng)用兩個(gè)給藥方案給藥方案I:溶劑對(duì)照組每天生理鹽水灌胃，二氫青蒿素在接種后次日開始給藥，每日1次，連續(xù)25次；環(huán)磷酰胺在接種后第5日開始給藥，隔日1次，連續(xù)5次。參見表l。給藥方案n，溶劑對(duì)照組每天生理鹽水灌胃，二氫青蒿素在接種后次日開始給藥，每日1次，連續(xù)25次；環(huán)磷酰胺在接種后第7日開始給藥，隔日1次，連續(xù)5次。參見表2。表l.二氫青蒿素增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對(duì)Lewis肺癌治療作用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥方案I劑量x給藥次數(shù)組別動(dòng)物數(shù)(只)DHA(mg/kg,qd,ig)x25CTX(mg/kg,qod,ip)溶劑對(duì)照10DHA10100CTX(d5-13)1050DHA+CTX(d5-13)105050DHA+CTX(d5-13)1010050DHA+CTX(d5-13)1020050表2.二氫青蒿素增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對(duì)Lewis肺癌治療作用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥方案II組別動(dòng)物數(shù)(只)劑量x給藥次數(shù)DHA(mg/kg,qd,ig)x25CTX(mg/kg,qod,ip)x5溶劑對(duì)照10DHA10腦CTX(d7國15)1050DHA+CTX(d7-15)105050DHA+CTX(d7-15)1010050DHA+CTX(d7-15)1020050兩個(gè)給藥程序均于末次給藥24h后，處死小鼠，取出瘤塊，取肺部用Bouin's液固定。(2)腫瘤體積變化及藥物的毒副作用給藥期間觀察小鼠的一般情況及移植瘤生長情況，每3天測定一次腫瘤體積。測定方法為用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長軸(a)、短軸(b)，根據(jù)公式V:0.5ab2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤體積增長曲線，同時(shí)測定小鼠體重。小鼠處死后，剖取腫瘤組織稱重，并計(jì)算抑瘤率抑瘤率=1-(用藥組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)X100%。(3)對(duì)腫瘤肺轉(zhuǎn)移的治療作用治療結(jié)束后處死小鼠，剖取肺組織固定于Bouin's液，24h后檢測肺表面腫瘤轉(zhuǎn)移灶，肺組織呈黃色，腫瘤轉(zhuǎn)移灶呈白色隆起。(4)協(xié)同作用評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)合并用藥效果按金氏公式評(píng)價(jià)q=Ea+b/(Ea+Eb-EaEb)，其中Ea+b為兩藥合用的抑制率，Ea和Eb為各藥單用時(shí)的抑制率，當(dāng)q〈1.15時(shí)表示兩藥合用有拮抗作用，q〉1.15時(shí)，表示兩藥有協(xié)同作用。(5)免疫組織化學(xué)上述腫瘤組織取出后用多聚甲醛固定，經(jīng)常規(guī)處理后制成5pm厚石蠟切片，后免疫組化,步驟按福州邁新生物技術(shù)有限公司的即用型第二代免疫組化Elivisionplus光譜試劑盒中提供的操作說明進(jìn)行。DAB顯色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。一抗采用鼠抗人VEGF單克隆抗體(1:50稀釋)，陰性對(duì)照組采用PBS代替特異性一抗。以棕黃色的強(qiáng)弱程度為觀察指標(biāo)。結(jié)果(1)抑制腫瘤生長在小鼠Lewis肺癌移植瘤動(dòng)物模型中，二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)磷酰胺用藥各組的腫瘤生長速度緩慢(圖la,lb)，在治療結(jié)束后腫瘤重量較溶劑對(duì)照組明顯減少(p<0.05)(圖2a，b)。二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)Lewis肺癌有較好的治療作用按給藥方案I，50mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d5-13)給藥組、100mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d5-13)給藥組、200mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d5-13)給藥組平均瘤重分別為1.33士1.02g，0.84土0.48g，0.65士0.45g;三個(gè)劑量組的平均瘤重與溶劑對(duì)照組(2.69士1.62g)、單用二氫青蒿素組(1.67±1.22g)、單用環(huán)磷酰胺(d5-13)組(2.16士1.06g)相比均呈明顯抑制(^<0.05)。按給藥方案II，50mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d7-15)給藥組、100mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d7-15)給藥組、200mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d7-15)給藥組平均瘤重分別為U3土0.51g，0.49士0.28g，0.45士0.22g，三個(gè)劑量組的平均瘤重與溶劑對(duì)照組(2.69士1.62g)、單用二氫青蒿素組(1.67土1.22g)、單用CTX(d7-15)組(1.94士0.69g)相比均呈更明顯抑制(;K0.05)。表明二氫青蒿素確實(shí)能增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對(duì)Lewis肺癌的治療作用。同時(shí)在相同劑量的二氫青蒿素和環(huán)磷酰胺合用組，由于聯(lián)合給藥的時(shí)間點(diǎn)不同表現(xiàn)出對(duì)腫瘤生長抑制作用的不同，100mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d5-13，給藥方案I)的腫瘤重量與100mg/kgDHA十50mg/kgCTX(d7-15，給藥方案II)的腫瘤重量相比以給藥方案II的抑瘤作用更明顯，同樣200mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d5-13，給藥方案I)的腫瘤重量與200mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d7-15，給藥方案II)的腫瘤重量相比以給藥方案II的抑瘤作用更明顯(pO.05)(圖3，表3)。圖la中參溶劑對(duì)照組，〇DHA(100mg/kg)單用組，▲CTX(50mg/kg，d5-13)單用組，△DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg,d5-13)聯(lián)合用藥組，■DHA(100mg/kg)十CTX(50mg/kg,d5-13)聯(lián)合用藥組，□DHA(200mg/kg)十CTX(50mg/kg，d5-13)聯(lián)合用藥組。圖lb中參溶劑對(duì)照組，〇DHA(100mg/kg)單用組，▲CTX(50mg/kg，d7-15)單用組，△DHA(50mg/kg)十CTX(50mg/kg,d7-15)聯(lián)合用藥組，■DHA(100mg/kg)十CTX(50mg/kg,d7-15)聯(lián)合用藥組，□DHA(200mg/kg)十CTX(50mg/kg,d7-15)聯(lián)合用藥組。圖2a中(A)溶劑對(duì)照組，(B)DHA(100mg/kg)單用組，(C)CTX(50mg/kg,d5-13)單用組，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg,d5-13)聯(lián)合用藥組，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg,d5-13)聯(lián)合用藥組，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg,d5-13)聯(lián)合用藥組。圖2b中(A)溶劑對(duì)照組，(B)DHA(100mg/kg)單用組，(C)CTX(50mg/kg,d7-15)單用組，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg,d7-15)聯(lián)合用藥組，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)聯(lián)合用藥組，(F)DHA(200mg/kg)十CTX(50mg/kg,d7-15)聯(lián)合用藥組。圖3中(A)溶劑對(duì)照組，(B)DHA(100mg/kg)單用組，(C)CTX(50mg/kg,d5-13)單用組，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)聯(lián)合用藥組，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)聯(lián)合用藥組，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)聯(lián)合用藥組，(G)CTX(50mg/kg，d7-15)單用組，(H)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg,d7-15)聯(lián)合用藥組，(I)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg,d7-15)聯(lián)合用藥組，(J)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)聯(lián)合用藥組。(2)協(xié)同治療作用根據(jù)金氏公式評(píng)價(jià)二氫青蒿素和環(huán)磷酰胺合用的聯(lián)合治療效果，單用100mg/kg二氫青蒿素組(DHA)的抑瘤率為37.75%，接種后第五天開始單用50mg/kg環(huán)磷酰胺(d5-13)組的抑瘤率為19.76%，合用組100mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d5-13)的抑瘤率為68.89n/。，得q值為1.38;接種后第七天開始單用50mg/kg環(huán)磷酰胺(d7-15)組的抑瘤率為27.97。/。，合用組100mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d7-15)的抑瘤率為81.71%，得q值為1.48，表明在兩個(gè)給藥程序下合用二氫青蒿素和環(huán)磷酰胺均有較好的協(xié)同作用，且以接種后第七天開始合用環(huán)磷酰胺(給藥方案n)的協(xié)同作用更好。(3)藥物的毒副作用用藥期間，各組荷瘤小鼠活動(dòng)良好，未見特殊不良反應(yīng)，無一例死亡。用藥25天后溶劑對(duì)照組及單用二氫青蒿素(100mg/kg)的去瘤體重分別為22.05土1.91g，22.15土1.59g，接種后第5天開始單用環(huán)磷酰胺(50mg/kg)組去瘤體重為22.55±2.32g，環(huán)磷酰胺在接種后第5天開始和50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg二氫青蒿素合用的各組小鼠去瘤體重分別為21.89±1.47g、20.72±0.89g、21.58±1.17g，接種后第7天開始單用環(huán)磷酰胺(50mg/kg)組去瘤體重為22.82±2.17g，環(huán)磷酰胺在接種后第7天開始和50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg二氫青蒿素合用的各組小鼠去瘤體重分別為22.03±1.32g、21.21±0.58g、21.80±1.00g。比較去瘤小鼠體重，各治療組與溶劑對(duì)照組均無顯著差異(p〉0.05，表3)。表3、二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)荷瘤小鼠腫瘤重量及小鼠去瘤體重的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(4)對(duì)荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移的影響在皮下移植瘤模型中，發(fā)現(xiàn)溶劑對(duì)照組小鼠大部分出現(xiàn)自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移，單用DHA、CTX組肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)較溶劑對(duì)照組有不同程度下降，二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療則可以完全抑制腫瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移(圖4a,b,表4)。表4二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)荷瘤小鼠腫瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>圖4a中(A)溶劑對(duì)照組，(B)DHA(100mg/kg)單用組，(C)CTX(50mg/kg，d5-13)單用組，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg,d5-13)聯(lián)合用藥組，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg,d5-13)聯(lián)合用藥組，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)聯(lián)合用藥組。圖4b中(A)溶劑對(duì)照組，(B)DHA(100mg/kg)單用組，(C)CTX(50mg/kg,d7-15)單用組，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg,d7-15)聯(lián)合用藥組，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)聯(lián)合用藥組，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)聯(lián)合用藥組。(5)二氫青蒿素下調(diào)腫瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)檢測腫瘤組織VEGF蛋白的表達(dá)，以細(xì)胞內(nèi)棕黃色強(qiáng)弱來判斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，溶劑對(duì)照組表現(xiàn)為較強(qiáng)至中等的棕黃色，與溶劑對(duì)照組相比，二氫青蒿素單用組及二氫青蒿素與環(huán)磷酰胺聯(lián)合治療各組的腫瘤細(xì)胞內(nèi)棕黃色明顯減弱(圖5a，b)。圖5a中(A)溶劑對(duì)照組，(B)DHA(100mg/kg)單用組，(C)CTX(50mg/kg，d5-13)單用組，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg,d5-13)聯(lián)合用藥組，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg,d5畫13)聯(lián)合用藥組，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg,d5-13)聯(lián)合用藥組。圖5b中(A)溶劑對(duì)照組，(B)DHA(100mg/kg)單用組，(C)CTX(50mg/kg,d7-15)單用組，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)聯(lián)合用藥組，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg,d7-15)聯(lián)合用藥組，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg,d7-15)聯(lián)合用藥組。實(shí)施例2:二氫青蒿素體外誘導(dǎo)Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞凋亡以及下調(diào)VEGF受體KDR/flk-l表達(dá)二氫青蒿素廣西桂林制藥廠惠贈(zèng)方法(1)MTT法檢測細(xì)胞增殖5xl(^ml"LLC細(xì)胞接種于96孔板，以DMSO作為溶劑對(duì)照，用不同濃度二氫青蒿素作用48h后，MTT法檢測，用酶標(biāo)儀在570nm波長下測定吸光度(A57。nm)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率(％):實(shí)驗(yàn)組A57o^/溶劑對(duì)照組A57()nmxl00%。采用IC5o計(jì)算軟件計(jì)算二氫青蒿素抑制LLC細(xì)胞增殖的IC5o值，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算95G/o的置信區(qū)間。(2)形態(tài)學(xué)檢測細(xì)胞凋亡LLC細(xì)胞接種于24孔板，加入不同濃度的二氫青蒿素作用48h后，用無血清培養(yǎng)液洗兩次，加入吖啶橙IOOmg七"和溴化乙啶100mg丄"于暗室混合染色5min，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。(3)流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期LLC細(xì)胞經(jīng)過二氫青蒿素作用48h后，離心收集，經(jīng)PBS清洗2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至lxl0Sm1/1，然后緩慢滴入70%冰冷乙醇固定細(xì)胞，置4。C過夜，已固定的細(xì)胞經(jīng)PBS離心洗滌2次，加入50mg七"碘化丙啶，0.1%Triton-X100，37g丄"EDTA，50mg丄"RnaseA,室溫下避光進(jìn)行DNA染色30min,過300目尼龍網(wǎng)篩，24h內(nèi)上流式細(xì)胞儀測定。采用CellQuest3.lf軟件(美國BectonDickinson)獲取直方圖，ModFit3.0軟件(美國BectonDickinson)計(jì)算細(xì)胞凋亡率及分析細(xì)胞周期相分布。(4)Western-blot法定量分析KDR/flk-l的表達(dá)LLC細(xì)胞經(jīng)不同濃度的二氫青蒿素作用48h后，離心收集，裂解細(xì)胞提取蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，在12%SDS-PAGE上進(jìn)行電泳，每個(gè)泳道上總蛋白50嗎。電泳后蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，膜用含5%脫脂奶粉的TPBS室溫封閉lh，鼠抗人flk-l多克隆抗體(l:500稀釋)4'C放置過夜，經(jīng)TPBS洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫作用lh(l:5000稀釋)，TPBS洗膜，采用ECL法對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行檢測。采用同一張膜通過抗體的洗脫，重新對(duì)p-actin的蛋白條帶進(jìn)行檢測，作為內(nèi)參。結(jié)果(1)抑制LLC細(xì)胞增殖MTT實(shí)驗(yàn)分析表明，用二氫青蒿素處理48h后，LLC細(xì)胞增殖被明顯抑制，且隨藥物濃度增加其抑制率呈遞增趨勢，二氫青蒿素抑制LLC細(xì)胞增殖的ICs。值為53.14—.1/，95%置信區(qū)間為48.69-58.18pmol'L'1。以上結(jié)果表明，二氫青蒿素對(duì)LLC增殖有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性，參見圖6，圖中DHA對(duì)LLC細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC5o)=53.14pmoH/1，95%置信區(qū)間為48.69-58.18jimol.L-1。(2)二氫青蒿素誘導(dǎo)LLC細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察LLC細(xì)胞經(jīng)吖啶橙/溴化乙啶雙染色后，熒光顯微鏡下可見，溶劑對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)密度均勻的綠色熒光，表現(xiàn)為正常細(xì)胞的染色特征，而經(jīng)二氫青蒿素作用48h后，細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變?nèi)缛旧|(zhì)高度凝集，邊緣化等，熒光觀察可見橙色熒光增強(qiáng)，呈致密塊狀分布，并出現(xiàn)凋亡小體，參見圖7，圖7中(A)溶劑對(duì)照組，(B)DHA20pmol'L-1，(C)DHA40^imol'I/1，(D)DHA80pmo1.1/1。(3)二氫青蒿素誘導(dǎo)的LLC細(xì)胞凋亡的流式定量分析經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，根據(jù)PI熒光直方圖顯示，LLC細(xì)胞經(jīng)SOpmohL-1二氫青蒿素作用48h后，細(xì)胞凋亡百分率有明顯增加，經(jīng)40，80pmol七"二氫青蒿素作用48h后，Gl峰前出現(xiàn)了代表凋亡細(xì)胞的亞二倍體峰，細(xì)胞凋亡率分別上升至9.82%和13.86%(圖8a，b)。其中圖8a中(A)溶劑對(duì)照組，(B)DHA20pmol.L國1，(C)DHA40pmol.L國1，(D)DHA80pmol-L-1。(4)二氫青蒿素抑制LLC細(xì)胞KDR/flk-l的表達(dá)LLC細(xì)胞經(jīng)不同濃度二氫青蒿素處理后，提取蛋白，Western-blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)KDR/flk-l蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞KDR/flk-l蛋白的表達(dá)量依次下降。40、80pmol丄"二氫青蒿素濃度組細(xì)胞KDR/flk-l的蛋白表達(dá)量分別降為溶劑對(duì)照組的33.8%和12.6%，與溶劑對(duì)照組相比存在顯著性差異(pO.OOl)，結(jié)果參見圖9。權(quán)利要求1.二氫青蒿素在制備增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效藥物中的應(yīng)用，所述二氫青蒿素的分子式為C15H24O5。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氫青蒿素在制備增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效藥物中的應(yīng)用，其特征是二氫青蒿素作為一種靶向腫瘤血管生成抑制劑在制備增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效藥物中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氫青蒿素在制備增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效藥物中的應(yīng)用，其特征是所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氫青蒿素在制備增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效藥物中的應(yīng)用，其特征是所制備的藥物為抗腫瘤化療藥物。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氫青蒿素在制備增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效藥物中的應(yīng)用，其特征是所述藥物的制劑形式為固體制劑。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的二氫青蒿素在制備增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效藥物中的應(yīng)用，其特征是所述藥物的給藥方式為口服給藥。全文摘要本發(fā)明提供二氫青蒿素在制備增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效藥物中的應(yīng)用。該藥物制劑含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。其制劑形式為固體制劑。本發(fā)明提供的藥物制劑可增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤療效，可用于腫瘤化療過程中的輔助治療。本發(fā)明以血管生成抑制劑能改變腫瘤微環(huán)境的理論為背景，研究并闡明中藥有效單體增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤作用和機(jī)制，為青蒿素類藥物新的用途開發(fā)提供藥理學(xué)依據(jù)，為發(fā)掘血管生成抑制劑新的臨床價(jià)值提供重要依據(jù)，是發(fā)展中醫(yī)藥理論新的研究方向。文檔編號(hào)A61K9/00GK101125140SQ20071007118公開日2008年2月20日申請日期2007年9月18日優(yōu)先權(quán)日2007年9月18日發(fā)明者周慧君,傲李,增王申請人:浙江大學(xué)