專利名稱：一種碳納米管修飾的血糖生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物傳感器的研制領(lǐng)域，具體是指一種碳納米管修飾、以 吡咯并會(huì)啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶血糖生物傳感器及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著我國進(jìn)入信息化社會(huì)，人口結(jié)構(gòu)趨于老齡化，人們對(duì)健康的關(guān)注 日益加強(qiáng)，人民生活水平逐年提高，糖尿病的患病率也隨之提高，在中國
13個(gè)地區(qū)總患病率為0.67%，大城市約1%左右，40歲以后患病率顯著升 高。使用葡萄糖氧化酶作為催化劑的葡萄糖傳感器準(zhǔn)確度受測(cè)量現(xiàn)場(chǎng)的大 氣氧氣壓強(qiáng)、濃度和血液樣本中氧含量的影響。
1991年日本NEC的Iijima教授研制出同軸管狀的納米級(jí)分子碳結(jié)構(gòu) ——碳納米管(CNTs),在全世界引起了廣泛的關(guān)注.碳納米管是由石墨 碳原子層巻曲而成的碳管，有單壁碳納米管(SWNTs)和多壁碳納米管 (MWNTs)之分，前者是由單層石墨片巻積而成，后者是由多層石墨片 巻積而成的，兩端由碳原子的五邊形封頂。碳納米管優(yōu)良的電學(xué)和機(jī)械性 能吸引越來越多的研究者將其應(yīng)用于傳感器領(lǐng)域。目前已有報(bào)道用碳納米 管修飾玻碳、石墨、金剛石、鉭電極等實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖、抗體、氧等物質(zhì)的 檢測(cè)。使用碳納米管修飾電極一方面可以增大電極表面積，另一方面可以 加速電子傳遞速率，從而提高傳感器的響應(yīng)和靈敏度。
絲網(wǎng)印刷屬于孔版印刷，是將絲織物、合成纖維織物或金屬絲網(wǎng)繃在 網(wǎng)框上，采用手工刻漆膜或光化學(xué)制版的方法制作絲網(wǎng)印版?，F(xiàn)代絲網(wǎng)印 刷技術(shù)，則是利用感光材料通過照相制版的方法制作絲網(wǎng)印版(使絲網(wǎng)印 版上圖文部分的絲網(wǎng)孔為通孔，而非圖文部分的絲網(wǎng)孔被堵住)。印刷時(shí) 通過刮板的擠壓，使油墨通過圖文部分的網(wǎng)孔轉(zhuǎn)移到承印物上，形成與原 稿一樣的圖文。絲網(wǎng)印刷設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，印刷、制版簡(jiǎn)易且成本低 廉，適應(yīng)性強(qiáng)。薄膜蒸涂技術(shù)成膜利用高溫蒸發(fā)或等離子濺射的原理，使 蒸涂材料堆積在基板表面形成薄膜，與絲網(wǎng)印刷相比，成膜均勻，但價(jià)格
較高。
發(fā)明專利申請(qǐng)200510049284.4公開了 一種定向碳納米管修飾的全血 葡萄糖生物傳感器，其特征是反應(yīng)層的底層是作為第二電子中介體的定向 碳納米管，其上層是葡萄糖氧化酶以及用作第一電子中介體的試劑、穩(wěn)定 劑、緩沖液組成的混合物。該技術(shù)方案就是采用葡萄糖氧化酶作為催化劑 的，其準(zhǔn)確度受測(cè)量現(xiàn)場(chǎng)的大氣氧氣壓強(qiáng)、濃度和血液樣本中的氧氣含量 的影響，測(cè)量結(jié)果不穩(wěn)定，適用性不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種不受大氣和樣本中氧含量影響、成本低、靈敏度高 的用于測(cè)量葡萄糖濃度的碳納米管修飾的以吡咯并p奎啉醌為輔酶的葡萄 糖脫氬酶的血糖生物傳感器。
一種碳納米管修飾的血糖生物傳感器，包括基底、三電極系統(tǒng)、絕緣 層，三電極系統(tǒng)周圍形成有反應(yīng)腔體，反應(yīng)腔體內(nèi)設(shè)有反應(yīng)層，反應(yīng)腔體 上覆蓋有蓋板，所述的反應(yīng)層包含碳納米管、酶和電子傳遞劑，所述的酶 采用以吡咯并壹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶。
所述的三電極系統(tǒng)由參比電極、工作電極、對(duì)電極組成，工作電極和 對(duì)電極與引線接觸；所述的參比電極采用銀/氯化銀、碳、金、鉑或鈦；所 述的對(duì)電極和工作電極采用碳、金、鉑或鈦。
所述的反應(yīng)層內(nèi)還包含酶活性添加劑，酶活性添加劑包括增活劑和保 活劑，所述的增活劑采用鈣離子或檸檬酸、鄰苯二曱酸等緩沖液，所述的 ?；顒┎捎煤Ｔ逄?、殼聚糖、牛血清白蛋白的一種。
所述的反應(yīng)層還包含親水性高分子，包括羧曱基纖維素、十二烷基苯 磺酸鈉、TritonX-100、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、明膠及其衍生物、十 六烷基三曱基溴化銨的一種或幾種。
所述的電子傳遞劑選用鐵氰化鉀、二茂鐵及其衍生物、亞曱基蘭、普 魯士蘭、N-曱基吡咯烷酮中的一種。
采用檸檬酸或鄰苯二曱酸等緩沖液、氯化鈉溶液以保證穩(wěn)定的參比電 極電位。
所述的反應(yīng)腔體一側(cè)開有用于進(jìn)樣的毛細(xì)孔。 本發(fā)明還提供了一種上述生物傳感器的制備方法。
一種制備上述血糖生物傳感器的方法，包括以下步驟 第一步，采用絲網(wǎng)印刷方法或薄膜蒸涂技術(shù)在聚丙烯或其他高分子材 料基底上形成三電極系統(tǒng)，制得傳感器電極基底；
第二步，將碳納米管溶在濃硫酸和濃硝酸混合溶液中超聲振蕩，過濾
洗滌呈中性后，獲得碳納米管的穩(wěn)定懸浮液；
第三步，將制得的碳納米管懸浮液滴加于電極基底的反應(yīng)腔內(nèi)，進(jìn)行 避光干燥；
第四步，將酶、電子傳遞劑、酶?；顒┖吐然c按一定濃度溶解在緩 沖液中，制得酶溶液；第五步，將制得的酶溶液滴加在電極基底的反應(yīng)腔內(nèi)，避光干燥，在 反應(yīng)腔體上覆蓋蓋板，即制得生物傳感器。
其中，在第二步中，所述的碳納米管中加入有十二烷基苯磺酸鈉、十 二烷基硫酸鈉或十六烷基三曱基溴化銨溶液，進(jìn)行超聲振蕩。
在制備得到的生物傳感器的反應(yīng)腔體內(nèi)滴下一定濃度的葡萄糖試樣 溶液，反應(yīng)層會(huì)溶解，在液相反應(yīng)體系中，由葡萄糖脫氫酶催化葡萄糖， 產(chǎn)生一個(gè)電子；電子傳遞劑得到電子被還原；還原態(tài)的電子傳遞劑擴(kuò)散到 電極表面，在工作電極一定的電位下，還原態(tài)電子傳遞劑可以與工作電極 發(fā)生電子傳遞，回到初始狀態(tài)；同時(shí)電極得到電子，產(chǎn)生相應(yīng)電流；該電 流值與被測(cè)液體中葡萄糖濃度線性相關(guān)，由此獲得傳感器響應(yīng)電流，推算 出試樣溶液中的葡萄糖溶液濃度。
本發(fā)明生物傳感器采用碳納米管修飾電極，不僅可在物理結(jié)構(gòu)上增大 電極接觸表面積，而且可以加快電子傳遞速率，提高電子傳遞效率，從而 提高生物傳感器的響應(yīng)靈敏度。
采用以吡咯并會(huì)啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶作為催化劑，測(cè)量準(zhǔn)確度 不受大氣中氧氣含量的影響，并且不同于NAD+作輔酶測(cè)量時(shí)需要加入 NAD+溶液，其可將吡咯并喹啉醌修飾在葡萄糖脫氫酶中。與使用葡萄糖 氧化酶測(cè)量葡萄糖的傳感器相比，使用吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氬 酶的傳感器，其對(duì)底物葡萄糖的響應(yīng)與氧無關(guān)，從而不受血液中溶解氧或 者測(cè)量現(xiàn)場(chǎng)大氣中氧含量變化的影響，可以更準(zhǔn)確的測(cè)量葡萄糖的濃度， 獲得高性能的傳感器。


圖1為本發(fā)明生物傳感器的俯視圖2為本發(fā)明生物傳感器的縱截面圖3為電極的循環(huán)伏安曲線圖4為生物傳感器對(duì)葡萄糖溶液的電流響應(yīng)關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式
如圖1、 2所示， 一種碳納米管修飾的血糖生物傳感器，包括聚丙烯 和其他高分子材料形成的電絕緣性基底1、通過絲網(wǎng)印刷技術(shù)或薄膜蒸涂 技術(shù)在在基底1上形成參比電極2a、引線2d及與檢測(cè)儀器的接觸部分2e， 并且形成工作電極2b和對(duì)電極2c，該工作電極2b和對(duì)電極2c與引線2d 接觸。進(jìn)而，在基底l上印刷絕緣材料，形成絕緣層5。絕緣層5覆蓋工 作電極2b和對(duì)電極2c的外周部分，使工作電極2b、對(duì)電極2c和參比電 極2a的露出部分面積保持一定。
在形成了電極系統(tǒng)的基底1上形成了包含碳納米管、酶催化劑和電子 傳遞劑等的反應(yīng)層4。膠體3和蓋板6配合形成反應(yīng)腔體3a。
檢測(cè)時(shí)，在生物傳感器的反應(yīng)腔體3a內(nèi)滴下一定濃度的葡萄糖試樣 溶液，反應(yīng)層4會(huì)溶解，在液相反應(yīng)體系中，由葡萄糖脫氫酶催化葡萄糖， 產(chǎn)生一個(gè)電子；電子傳遞劑得到電子被還原；還原態(tài)的電子傳遞劑擴(kuò)散到 電極表面，在工作電極一定的電位下，還原態(tài)電子傳遞劑可以與工作電極 發(fā)生電子傳遞，回到初始狀態(tài)；同時(shí)電極得到電子，產(chǎn)生相應(yīng)電流；該電 流值與被測(cè)液體中葡萄糖濃度線性相關(guān)，由此獲得傳感器響應(yīng)電流，推算 出試樣溶液中的葡萄糖溶液濃度。
如圖3所示，圖中A為本發(fā)明生物傳感器的循環(huán)伏安曲線，B為無碳 納米管修飾的電極的循環(huán)伏安曲線，表明加入碳納米管后，鐵氰化鉀的反 應(yīng)的可逆性得到改善。
如圖4所示，圖中A為本發(fā)明生物傳感器電流響應(yīng)關(guān)系，B為無碳納 米管修飾的電極電流響應(yīng)關(guān)系，表明加入碳納米管后，傳感器的響應(yīng)靈敏 度得到提高。
實(shí)施例
通過絲網(wǎng)印刷技術(shù)在聚丙烯基底上涂上銀糊狀物形成銀/氯化銀偽參
比電極；然后，在基底上印刷導(dǎo)電性碳糊狀物，形成工作電極和對(duì)電極； 印刷絕緣層，使工作電極、對(duì)電極和偽參比電極的露出部分面積保持一定。 使用4.8mg/ml的十二烷基苯磺酸鈉和體積比為0.5%的Triton X-100 混合液配制2.5mg/ml的多壁碳納米管懸浮液，在超聲中震蕩2小時(shí)，形 成穩(wěn)定的懸浮液。用移液器在每片電極反應(yīng)腔內(nèi)滴加3 ^L升該碳納米管懸 浮液，置于干燥箱中避光干燥24小時(shí)，制備得有碳納米管修飾的電極系 統(tǒng)。
然后，在碳納米管層上滴加2微升包含4780U/ml的吡咯并壹啉醌為 輔酶的葡萄糖脫氫酶、O.IM的鐵氰化鉀、lmM的氯化釣和24mg/ml的海 藻糖的檸檬酸緩沖液(pH6.0,含0,2M氯化鈉)。避光干燥后形成4^t感 層，制得葡萄糖傳感器。
測(cè)量過程為，準(zhǔn)備作為葡萄糖濃度為0.5 35mM的試樣溶液。在反應(yīng) 層4上滴下該試樣溶液，同時(shí)，在工作電極上加0.5V恒電位(相對(duì)于銀/ 氯化銀偽參比電極)，向反應(yīng)層供給這種包含葡萄糖的試樣溶液后，試樣 溶液中的葡萄糖通過脫氫酶氧化，與此同時(shí)，反應(yīng)層中的鐵氰化鉀被還原 成亞鐵氰化鉀。施加恒電位20秒時(shí)，測(cè)定工作電極與對(duì)電極之間的電流 值。
測(cè)定各種不同葡萄糖濃度的試樣的電流值，以葡萄糖濃度為橫軸、響 應(yīng)電流值為縱軸，繪制傳感器的應(yīng)答特性圖，其結(jié)果如圖4的A所示，其 傳感器響應(yīng)梯度明顯大于無碳納米管修飾的電極(如圖4的B )。
本發(fā)明生物傳感器常溫下避光保存1個(gè)月后，響應(yīng)衰減不明顯。
權(quán)利要求
1.一種碳納米管修飾的血糖生物傳感器，包括基底(1)、三電極系統(tǒng)(2)、絕緣層(5)，三電極系統(tǒng)(2)周圍形成有反應(yīng)腔體(3)，反應(yīng)腔體(3)內(nèi)設(shè)有反應(yīng)層(4)，反應(yīng)腔體(3)上覆蓋有蓋板(6)，其特征在于所述的反應(yīng)層(4)包含碳納米管、酶和電子傳遞劑，所述的酶采用以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的血糖生物傳感器，其特征在于所述的三電 極系統(tǒng)(2)由參比電極(2a)、工作電極(2b)、對(duì)電極(2c)組成，工 作電極(2b)和對(duì)電極(2c)與引線(2d)接觸；所述的參比電極采用銀 /氯化銀、碳、金、鉑或鈦；所述的對(duì)電極和工作電極采用碳、金、柏或鈦。
3. 如權(quán)利要求1所述的血糖生物傳感器，其特征在于所述的反應(yīng) 層(4)內(nèi)還包含酶活性添加劑，酶活性添加劑包括增活劑和保活劑，所 述的增活劑采用鈣離子或檸檬酸、鄰苯二曱酸等緩沖液，所述的?；顒┎?用海藻糖、殼聚糖、牛血清白蛋白的一種。
4. 如權(quán)利要求1所述的血糖生物傳感器，其特征在于所述的反應(yīng) 層(4)還包含親水性高分子，包括羧曱基纖維素、十二烷基苯磺酸鈉、 TritonX-100、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、明膠及其衍生物、十六烷基三 曱基溴化銨的一種或幾種。
5. 如權(quán)利要求1所述的血糖生物傳感器，其特征在于所述的電子 傳遞劑選用鐵氰化鉀、二茂鐵及其衍生物、亞曱基蘭、普魯士蘭、N-曱基 吡咯烷酮中的一種。
6. 如權(quán)利要求1所述的血糖生物傳感器，其特征在于采用檸檬酸 或鄰苯二曱酸等緩沖液、氯化鈉溶液以保證穩(wěn)定的參比電;f及電位。
7. 如權(quán)利要求1所述的生物傳感器的制備方法，其特征在于所述 的反應(yīng)腔體一側(cè)開有用于進(jìn)樣的毛細(xì)孔。
8. —種制備如權(quán)利要求1-7任一所述血糖生物傳感器的方法，其特 征在于包括以下步驟第一步，釆用絲網(wǎng)印刷方法或薄膜蒸涂技術(shù)在聚丙烯或其他高分子材 料基底上形成三電極系統(tǒng)，制得傳感器電極基底；第二步，將碳納米管溶在濃硫酸和濃硝酸混合溶液中超聲振蕩，過濾 洗滌呈中性后，獲得碳納米管的穩(wěn)定懸浮液；第三步，將制得的碳納米管懸浮液滴加于電極基底的反應(yīng)腔內(nèi)，進(jìn)行 避光干燥；第四步，將酶、電子傳遞劑、酶?；顒┖吐然c按一定濃度溶解在緩 沖液中，制得酶溶液；第五步，將制得的酶溶液滴加在電極基底的反應(yīng)腔內(nèi)，避光干燥，在 反應(yīng)腔體上覆蓋蓋板，即制得生物傳感器。
9、如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于第二步中，所述的 碳納米管中加入有十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基^J吏鈉或十六烷基三曱基 溴化銨溶液，進(jìn)行超聲振蕩。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種碳納米管修飾的血糖生物傳感器，包括基底、三電極系統(tǒng)、絕緣層，三電極系統(tǒng)周圍形成有反應(yīng)腔體，反應(yīng)腔體內(nèi)設(shè)有反應(yīng)層，反應(yīng)腔體上覆蓋有蓋板，所述的反應(yīng)層包含碳納米管、酶和電子傳遞劑，所述的酶采用以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶。本傳感器的相應(yīng)靈敏度顯著提高，對(duì)血液中葡萄糖濃度的測(cè)量不受測(cè)量現(xiàn)場(chǎng)的氧氣壓強(qiáng)、濃度和血液樣本中氧含量的影響。本發(fā)明具有制作工藝簡(jiǎn)單、適合于大批量生產(chǎn)、成本低、測(cè)量使用的樣品量低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61B5/145GK101101273SQ200710069779
公開日2008年1月9日 申請(qǐng)日期2007年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月29日
發(fā)明者惠 徐, 光 李, 酉 王 申請(qǐng)人:浙江大學(xué);杭州雅致科技有限公司