專利名稱：肉蓯蓉提取物在制備治療帕金森病藥劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肉蓯蓉提取物的用途，尤其涉及肉蓯蓉提取物在在制藥中的 新的用途。
背景技術(shù)：
肉蓯蓉(Herba Cistanchis)是列當(dāng)科肉蓯蓉屬植物，始載于《祌農(nóng)本草經(jīng)》, 屬中醫(yī)補(bǔ)益藥物中的常用品種，具有補(bǔ)腎益精、潤(rùn)腸通便的功效。肉蓯蓉主 治腎虛陽(yáng)痿，遺精早泄，女子不孕，肝腎不足之筋骨痿弱，腰膝冷痛老年 病后，產(chǎn)后，津液不足，腸燥便秘。目前從肉蓯蓉中提取肉蓯蓉總苷(苯乙 醇苷類成分，又稱蓯蓉總苷)。而制成市售的肉歡蓉總苷藥劑主要用來(lái)治療 老年性癡呆疾病。
帕金森病(PD)是中老年人神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病。其特征性病理改變是 中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性減少，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺濃度明顯下降，目 前治療主要依賴多巴胺替代療法。直到目前，左旋多巴制劑治療是最有效的 治療措施，然而，還是在本藥開始臨床應(yīng)用的最初幾年，人們就己經(jīng)發(fā)現(xiàn)， 該藥在長(zhǎng)期應(yīng)用后，療效會(huì)逐漸降低，并出現(xiàn)劑末現(xiàn)象、開關(guān)現(xiàn)象等副反應(yīng)， 且不能阻止病情的進(jìn)展。多巴胺受體激動(dòng)劑的應(yīng)用也未能根本上改變這一狀 況。曾一度喚起人們巨大希望的神經(jīng)保護(hù)藥物，諸如司蘭吉林等藥物，經(jīng)大 規(guī)模的臨床試驗(yàn)，也未發(fā)現(xiàn)能夠顯著起到延緩病情進(jìn)展的作用。因此，進(jìn)行 天然藥物的篩選，具有迫切的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供肉蓯蓉提取物肉蓯蓉總苷在制藥中的新的應(yīng)用。 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)方案是肉蓯蓉總苷在制備治療帕金森病藥劑中的 應(yīng)用。一種肉蓯蓉的提取物在制備治療帕金森病藥劑中的應(yīng)用，所述肉雙蓉的 提取物是由按下述方法制備的
肉蓯蓉在切片后用70%乙醇回流兩次，提取上清，并將提取液水浮后， 得到上清液，將上清液過(guò)大孔樹脂，先用水洗脫，再用甲醇洗脫，其中甲醇 洗后的溶液進(jìn)行蒸干，再用正丁醇溶解蒸干后的產(chǎn)物，得到水相和醇相，將 醇相蒸干后用無(wú)水乙醇精制，可得到肉蓯蓉總苷即為所述肉蓯蓉的提取物。
一種肉蓯蓉的提取物在制備治療帕金森病藥劑中的應(yīng)用，所述肉雙蓉的 提取物是由按下述方法制備的
將lg肉蓯蓉粉末加60ml甲醇進(jìn)行超聲波破碎浸提，浸提液過(guò)濾后得濾 液和濾渣,濾液減壓濃縮至膏狀,用10ml水混懸后過(guò)大孔吸附樹脂，先用水洗
脫，然后再用甲醇洗脫，將甲醇洗脫液集中，減壓濃縮后即得肉灰蓉總苷。
上述的肉蓯蓉總苷的三種主要成分為松果菊苷、異毛蕊花糖苷和毛蕊 花糖苷。
上述的肉蓯蓉的提取物在制備治療帕金森病藥劑的應(yīng)用，其中，可在肉 蓯蓉總苷中加入矯味劑或溶劑制成口服液劑、片劑、丸劑、沖劑、膠囊劑、 注射劑、滴丸劑、糖漿劑、膏劑。
由于肉蓯蓉提取物肉蓯蓉總苷可以用來(lái)制備治療帕金森病的藥劑，能有 效改善帕金森病患者的運(yùn)動(dòng)功能及延緩帕金森病病程進(jìn)展，給中醫(yī)藥治療帕 金森病帶來(lái)了新的希望。


圖1為蓯蓉總苷干預(yù)治療對(duì)MPTP小鼠紋狀體酪氨酸羥化酶陽(yáng)性纖維的 影響；
圖2為蓯蓉總苷干預(yù)治療對(duì)MPTP小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的影響 的試驗(yàn)中各試驗(yàn)組陽(yáng)性神經(jīng)元照片；
圖3為蓯蓉總苷干預(yù)治療對(duì)MPTP小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的影
響；
圖4為蓯蓉總苷干預(yù)治療對(duì)MPTP小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元a -突觸核 蛋白表達(dá)的影響的試驗(yàn)中各試驗(yàn)組的黑質(zhì)神經(jīng)元a-突觸核蛋白的免疫染色照片；
圖5蓯蓉總苷干預(yù)治療對(duì)MPTP小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元a -突觸核蛋 白表達(dá)的影響。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
一、 制備方法
為當(dāng)前的提取肉灰蓉總苷的常規(guī)方法。
制備方法l:肉蓯蓉在切片后用70%乙醇回流兩次，提取上清，并將提 取液水浮后，得到上清液，將上清液過(guò)大孔樹脂DM-130，先用水洗脫，再 用甲醇洗脫，其中甲醇洗后的溶液進(jìn)行蒸干，再用正丁醇溶解蒸干后的產(chǎn)物， 得到水相和醇相，將醇相蒸干后用無(wú)水乙醇精制，即可得到肉灰蓉總苷。該 肉蓯蓉總苷的三種主要成分為松果菊苷、異毛蕊花糖苷和毛蕊花糖苷。
制備方法2:將lg肉蓯蓉粉末加60ml甲醇進(jìn)行超聲波破碎浸提(600W 破碎20min)浸提液過(guò)濾后得濾液和濾渣，濾液減壓濃縮至膏狀，用10ml水 混懸后過(guò)大孔吸附樹脂(AB-8)，先用水洗脫,然后再用甲醇洗脫。將甲醇洗脫 液集中，減壓濃縮后即得肉灰蓉總苷。
二、 使用方法
市售杏輝天力(杭州)藥業(yè)的天力再生牌蓯蓉總苷膠囊用于治療帕金森 病臨床推薦用量是1日3次，2粒/次，0.3g/粒。小鼠62.5mg/kg-100mg/kg, 成人按60kg計(jì)算，3.75g-6g。
三、 實(shí)施例
肉蓯蓉的提取物肉蓯蓉總苷可制成口服液劑、片劑、丸劑、沖劑、膠 囊劑、注射劑、滴丸劑、糖漿劑、膏劑。上述這些劑型中的主要成分為肉灰 蓉總苷。
實(shí)施例1
制成片劑、丸劑、沖劑、糖漿劑、膏劑。除肉蓯蓉總苷外可根據(jù)需要添 加矯味劑。該片劑、丸劑、沖劑、糖漿劑、膏劑成分為包括 肉蓯蓉總苷 5%-90% (重量比)矯味劑 0.1-1% (重量比)
上述矯味劑可選自a -環(huán)糊精(a -CD)、 0 -環(huán)糊精(0 -CD)、 N-LOK變 性淀粉、蔗糖、木糖醇、高果糖、甜蜜素、甜菊糖和蛋白糖中的一種或多種。 實(shí)施例2制成膠囊劑。該膠囊劑成分為包括 肉蓯蓉總苷15%-30% (重量比) 矯味劑 0.5-10% (重量比)
上述矯味劑主要有羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙二醇(PEG)、丙烯
酸樹脂等。
實(shí)施例3制成注射劑、滴丸劑。該注射劑、滴丸劑成分包括 肉蓯蓉總苷 20%-30% (重量比) 溶劑 適量 四、治療機(jī)理
肉蓯蓉提取物在制備治療帕金森病藥劑中的治療機(jī)理 當(dāng)代中醫(yī)學(xué)者通常采用"辨證求因"的傳統(tǒng)方法來(lái)推知帕金森病的中醫(yī) 機(jī)理。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為帕金森病的病機(jī)特點(diǎn)為:本虛標(biāo)實(shí)。導(dǎo)致本虛的原因繁 多，擇其要者大致有(1)年齡因素:帕金森病多發(fā)于老年人,周氏[1'2]認(rèn)為中年 以后陰氣自半，會(huì)出現(xiàn)肝腎自虛的生理性虛衰，兼加勞頓、色欲之消耗,而致 陰精虛少,形體衰敗。(2)情志因素:有作者[3]指出,五志過(guò)激皆能化火,五志化 火,灼傷陰津，能夠使人出現(xiàn)精血暗耗。(3)久病及腎,高年多病重疊,致使肝腎 交虧[2]。以上諸因素導(dǎo)致患者的肝腎陰虛、氣血兩虛作為本病最根本的病理 基礎(chǔ),也是形成內(nèi)風(fēng)痰火瘀的基本根源。周氏指出肝風(fēng)之起,乃由肝腎虧虛所 致在肝腎虧虛的基礎(chǔ)上,痰瘀內(nèi)生，阻滯腦絡(luò)，更加劇了內(nèi)風(fēng)暗動(dòng)[2]。王氏認(rèn)為: 肝腎陰虛,可致虛火內(nèi)生兼加痰濕內(nèi)蘊(yùn)、五志化火等熱邪因素，從而形成風(fēng)火、 痰火、瘀火等，進(jìn)一步加重病情[4]。王永炎等依據(jù)自已的臨床觀察，強(qiáng)調(diào)筋脈 失養(yǎng)，血瘀阻絡(luò)的重要性[5]。潘氏根據(jù)對(duì)3例伴有意識(shí)遲鈍的老年患者的辨治 經(jīng)驗(yàn)[6],提出了帕金森病與老年性癡呆有一定內(nèi)在聯(lián)系的命題，認(rèn)為帕金森 病一病存在心營(yíng)虛損、內(nèi)風(fēng)煽動(dòng)的病理表現(xiàn)。王坤山等認(rèn)為脾陽(yáng)虛弱，氣血 生化乏源又加脾虛濕聚痰生，也能導(dǎo)致震顫[3]?？傊嗅t(yī)認(rèn)為帕金森病一病 的病理實(shí)質(zhì)在于肝腎陰虛，也涉及心脾兩臟。表現(xiàn)為顫振、僵直、行動(dòng)徐緩等癥狀的原因是由于本虛基礎(chǔ)上形成了內(nèi)風(fēng)痰火瘀等病理改變的結(jié)果。內(nèi)風(fēng) 痰火瘀是相互影響的病理因素,其相互影響的共同通路是經(jīng)脈，其最終的病理 結(jié)局是筋脈失養(yǎng)。
近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明肉蓯蓉及其所含有的一些化學(xué)成分具有神 經(jīng)保護(hù)作用。蒲小平等m發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉內(nèi)提取的單體Campneoside II預(yù)先孵育 大鼠小腦顆粒細(xì)胞,可以對(duì)抗^ ^+ (化學(xué)名l-甲基-4-苯基吡啶)誘導(dǎo)的細(xì) 胞凋亡。鄧敏等[8]發(fā)現(xiàn)運(yùn)用肉蓯蓉另一有效成分松果菊苷處理的神經(jīng)細(xì)胞， 其存活率提高，凋亡發(fā)生率顯著降低降，并且caspase-3活性不斷降低，呈 現(xiàn)出與松果菊苷的劑量依賴性關(guān)系。迄今，約有近70種化合物從肉灰蓉屬 植物中分離出來(lái),主要包括苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜及其苷類、木脂素及其苷 類、以及生物堿和糖類等成分。
研究發(fā)現(xiàn)，MPTP可以在體或離體導(dǎo)致選擇性的多巴胺能神經(jīng)元的喪失 [9，。因此，目前MPTP誘導(dǎo)的帕金森模型被公認(rèn)為是最好的模型。MPTPHCL 是人工合成的化合物，具有較高的脂溶性,容易透過(guò)血腦屏障，給動(dòng)物腹腔注 射MPTP后，會(huì)被轉(zhuǎn)移到腦內(nèi)，在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)被單胺氧化酶B (monoamine oxidase B)代謝轉(zhuǎn)化為l-甲基-4-苯基吡啶(MPP+) [11']2]。 MPP+ 是真正的的神經(jīng)毒劑，可以被多巴胺能神經(jīng)元選擇性的攝取[13]，并進(jìn)而導(dǎo)致 多巴胺能神經(jīng)元的死亡。慢性MPTP小鼠模型會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩、肢體抖動(dòng)等 神經(jīng)行為[14]、以及黑質(zhì)和紋狀體的病理改變[15]。這樣建立的慢性MPTP小 鼠模型在行為學(xué)、以及黑質(zhì)和紋狀體病理改變都與國(guó)內(nèi)外的研究一致，能部 分模擬人類帕金森病的病理生理變化，可用作篩選和發(fā)現(xiàn)對(duì)帕金森病有潛在 治療價(jià)值的藥物及研究其治療機(jī)理。a-突觸核蛋白是一個(gè)由140個(gè)氨基酸 組成的酸性蛋白[9]，研究發(fā)現(xiàn)《-突觸核蛋白的改變可是導(dǎo)致帕金森病的重要因素。
為了觀察肉蓯蓉提取物能否在體內(nèi)(invivo)抑制MPTP誘導(dǎo)的多巴胺 能神經(jīng)細(xì)胞的死亡，在慢性MPTP (化學(xué)名甲基-苯基四氫吡啶)模型上 觀察了該提取物的作用和影響。
材料與方法
1、材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
雄性C57BL小鼠，8周齡，體重20-25g,有中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中 心提供。小鼠每籠3只，均侍養(yǎng)于室溫22-25° C的環(huán)境中，12h晝夜節(jié)律, 自由進(jìn)食和飲水。
1.2主要試劑
兔抗細(xì)胞色素c氧化酶亞單位IV抗體(cytochrome c oxidase subunit IV， COX IV) (Cell Signaling, Danvers, MA, U.S.A);
綿羊抗a -突觸核蛋白抗體(識(shí)別a -突觸核蛋白的第108-120位氨基酸， 專供免疫組化分析用，Chemicon， Temecula, CA, U.S.A);
兔抗酪氨酸羥化酶抗體(Chemicon, Temecula， CA， U.S.A.);
辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體((Zymed, South San Francisco, CA， U.S.A.);
熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(Rockland, Gilbertsville, PA， U.S.A); 羅丹明標(biāo)記的驢抗綿羊IgG抗體(Rockland, Gilbertsville, PA, U.S.A);
蓯蓉總苷(杏輝公司，中國(guó))該蓯蓉總苷的三種主要成分為松果菊苷、 異毛蕊花糖苷和毛蕊花糖苷。或按上述2中制備方法提取的蓯蓉總苷。 1.3主要儀器
自制爬桿架選擇長(zhǎng)85cm，直徑1.5cm的不銹鋼鋼管，外緊裹棉紗防 滑，上端覆以直徑2cm的球形突起，試驗(yàn)時(shí)作為小鼠的附著點(diǎn)，然后將其 固定于木制地座，放置在鼠籠中，底座用鋸末覆蓋。
Leica冰凍切片機(jī) 德國(guó)Leica公司
低溫臺(tái)式離心機(jī) 低溫高速離心機(jī) Leica激光共聚焦顯微鏡 Leica圖像分析系統(tǒng) 電子天平 pH計(jì) 2、方法
2.1小鼠帕金森病模型的建立及動(dòng)物分組
德國(guó)Eppendorf公司 德國(guó)Beckman公司 德國(guó)Leica公司 德國(guó)Leica公司 Mettler Toledo上海有限公司 Mettler Toledo上海有限公司首先對(duì)即將入組的小鼠進(jìn)行爬桿試驗(yàn)訓(xùn)練4天，剔除具有行動(dòng)障礙的小 鼠。然后將篩選入組的小鼠隨機(jī)分為，模型組、歡蓉總苷高劑量組、灰蓉總 苷中劑量組、灰蓉總苷低劑量組和正常對(duì)造組。
模型組、蓯蓉總苷高劑量組、蓯蓉總苷中劑量組和灰蓉總苷低劑量組采 用MPTP慢性模型，模型的建立方法同第一部分。對(duì)照組小鼠僅接受生理鹽 水腹腔注射。
蓯蓉總苷高劑量組、蓯蓉總苷中劑量組和蓯蓉總苷低劑量組在腹腔注射 MPTP之前的3天開始蓯蓉總苷灌胃，計(jì)量參照文獻(xiàn)[l]分別為高劑量組蓯 蓉總苷400mg/kg/日；中劑量組蓯蓉總苷200mg/kg/日和低劑量組灰蓉總苷 100mg/kg/日。模型組和正常對(duì)造組小鼠每日灌胃同樣體積的生理鹽水。
2.2行為學(xué)試驗(yàn)
試驗(yàn)采用爬桿法，運(yùn)用計(jì)時(shí)的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。試驗(yàn)時(shí)首先手持小鼠尾巴， 令其倒立于爬桿的頂端，用秒表記錄小鼠自桿頂爬至桿底(前爪觸底)所用 時(shí)間。小鼠適應(yīng)訓(xùn)練4天，記錄第一次MPTP注射前1天，第一次MPTP 注射后7、 14天的爬桿時(shí)間。每次記錄前，先讓小鼠適應(yīng)爬行2次后進(jìn)行測(cè) 量， 一般測(cè)量3次，記錄連續(xù)爬行時(shí)間最短的一次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；如遇小鼠出現(xiàn) 中途停頓或返向攀爬，則重新測(cè)量，時(shí)間計(jì)數(shù)包括小鼠在爬桿頂端的運(yùn)動(dòng)啟 動(dòng)時(shí)間。
2.3冰凍組織切片制備
2.4酪氨酸羥化酶的免疫組織化學(xué)染色
2.5 a-突觸核蛋白的免疫組織化學(xué)染色
1) 從原位雜交保護(hù)液中選取腦片用0.01MPBS漂洗3次，每次5min。
2) 在0.3%H2O2中室溫孵育30min。取出后用0.01 M PBS漂洗3次， 每次5min。
3) 在含10%小牛血清，0.2%Triton的0.01MPBS溶液孵育lh
4) 在含1%小牛血清，0.2%Triton的0.01M PBS溶液中加入綿羊抗a -突觸核蛋白一抗(1:200)， 37° C溫箱中孵育2小時(shí)，然后移至4° C冰箱中 過(guò)夜。取出后用0.01MPBS漂洗3次，每次5min。
5) 在含1%小牛血清，0.2%Triton的0.01M PBS溶液中加入HRP標(biāo)記的抗綿羊IgG抗體孵育，37° C溫箱中孵育1小時(shí)。取出后用0.01M PBS 漂洗3次，每次5min。
6) 0.1M Tris-HCI pH7.5漂洗5min。
7) DAB顯色10分鐘。DAB配制按照中杉公司DAB顯色試劑盒的操作 步驟進(jìn)行。
8) 貼片，晾干，常規(guī)脫水，中性樹膠封片。 2.6免疫組織化學(xué)陰性對(duì)照
不加一抗，其余步驟同相應(yīng)各組免疫組織化學(xué)染色。 2. 7圖像分析及定量
2. 8統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組數(shù)據(jù)的比較用t檢驗(yàn)。多組數(shù) 據(jù)用方差分析(ANOVA)，有顯著性意義是再用Q檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)用SPSSIO.O 軟件處理。PO.05定為有顯著性差異。
3、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1小鼠神經(jīng)行為學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果 3.11對(duì)自主活動(dòng)的影響
小鼠在注射MPTP前后的行為學(xué)變化。小鼠在MPTP腹腔注射后0.5h, 各組小鼠均出現(xiàn)不同程度的運(yùn)動(dòng)障礙，表現(xiàn)為動(dòng)作遲緩、震顫、豎毛、豎尾 和活動(dòng)減少等，但蓯蓉總苷干預(yù)的各組這種現(xiàn)象明顯減輕，而腹腔注射生理 鹽水的正常對(duì)照組則不存在上述改變。部分模型組小鼠在MPTP腹腔注射后 0.5h內(nèi)出現(xiàn)全身震顫、靜止不動(dòng)的現(xiàn)象， 一般持續(xù)0.5h后方能緩解，而灰 蓉總苷干預(yù)的各組均未出現(xiàn)上述現(xiàn)象。與模型組比較,灰蓉總苷干預(yù)的各組 小鼠毛色光亮，模型組小鼠的毛發(fā)則變的雜亂并失去光澤。
3.12爬桿試驗(yàn)結(jié)果
各組小鼠爬桿時(shí)間數(shù)值見(jiàn)表1。本數(shù)據(jù)為各組建模后不同時(shí)間點(diǎn)爬桿時(shí) 間減去建模前爬桿時(shí)間，即得一差值(建模后變化值)，其中建模后爬桿時(shí)間 延長(zhǎng)用正值表示，縮短用負(fù)值表示。結(jié)果顯示在MPTP第一次注射后7天和 14天測(cè)試，模型組小鼠爬桿時(shí)間明顯延長(zhǎng)，與正常組相比統(tǒng)計(jì)有顯著意義 (PO.Ol)。與模型組相比，蓯蓉總苷各組的爬桿時(shí)間均有改善；但只有蓯
10蓉總苷高劑量組與模型組相比，統(tǒng)計(jì)有顯著差異(P<0.01)。并且在MPTP 第一次注射后7天，蓯蓉總苷低劑量組與正常對(duì)照組相比，爬桿時(shí)間延長(zhǎng)， 統(tǒng)計(jì)有顯著意義(P<0.05),在MPTP第一次注射后14天，蓯蓉總苷中、低 兩個(gè)劑量組與正常對(duì)照組相比，爬桿時(shí)間均顯著延長(zhǎng)(PO.Ol)。表l.
蓯蓉總苷干預(yù)治療對(duì)MPTP小鼠建模前后爬桿時(shí)間變化的影響組注射后7天注射后14天
平均爬桿時(shí)平均爬桿時(shí)間
間的變化試的變化試驗(yàn)
驗(yàn)
控制80.75±1.040.89±0.99
MPTP84.75±1.75**5.63土2.45:j::i:
400mg/kg/d TCM+ MPTP81.38土0.92卞卞2.13±1.25"
200mg/kg/d TCM+ MPTP82.88±1.813.50士l.5l:[:
訓(xùn)mg/kg/d TCM+ MPTP83.38±1.69*3.75±1.49$
** PO.01禾P * PO.05對(duì)控制組；忖P O.01對(duì)在MPTP第一次注射后 7天的模型組；tt P<0.01和J PO.05對(duì)控制組；▲ <0.01對(duì)在MPTP第
一次注射后14天的模型組。
3.13小鼠神經(jīng)行為學(xué)的試驗(yàn)結(jié)論
在MPTP第一次注射后7天和14天測(cè)試，模型組小鼠爬桿時(shí)間明顯延 長(zhǎng)，與正常組相比統(tǒng)計(jì)有顯著意義(PO.Ol)。與模型組相比，蓯蓉總苷各 組的爬桿時(shí)間均有改善；但只有蓯蓉總苷高劑量組與模型組相比，統(tǒng)計(jì)有顯 著差異(PO.Ol)。
3.2對(duì)紋狀體酪氨酸羥化酶陽(yáng)性纖維的影響
分別于第一次MPTP注射后的7和14天，運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法觀 察了蓯蓉總苷對(duì)紋狀體酪氨酸羥化酶陽(yáng)性纖維的影響(11=5)，結(jié)果顯示3個(gè) 劑量組的蓯蓉總苷在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均能明顯提高紋狀體酪氨酸羥化酶的表 達(dá)(P<0.05)。
圖1 MPTP注射后紋狀體酪氨酸羥化酶(TH-IR IOD of striatum)的表達(dá)的影響。** PO.01對(duì)控制組，AAP <0.01對(duì)在MPTP第一次注射后7天
的模型組；ttPO.01對(duì)在MPTP第一次注射后14天的模型組。A:正常組; B:模型組(MPTP第一次注射后7天);C模型組(MPTP第一次注射后14天); D:400mg/kg/dTCM組(即蓯蓉總苷干預(yù)組)(MPTP第一次注射后7天)；E: 200mg/kg/d TCM組(MPTP第一次注射后7天)，F(xiàn): 100mg/kg/d TCM group(MPTP第一次注射后7天)，G: 400mg/kg/d TCM組(MPTP第一次注射 后14天)H: 200mg/kg/d TCM組(MPTP第一次注射后14天)；I: 100mg/kg/d TCM組(MPTP第一次注射后14天)。
3.3肉蓯蓉苯乙醇苷類提取物對(duì)黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的影
響
分別于第一次MPTP注射后的7和14天，運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法觀 察了蓯蓉總苷對(duì)黑質(zhì)致密部的酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的影響，腦片的 選擇以過(guò)腳間核平面為核心，前后隔5取一，共得三張腦片，腦片初選后經(jīng) 認(rèn)真比對(duì)，解剖結(jié)構(gòu)完全匹配后進(jìn)行研究，以三張腦片陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)的平均 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，模型組的MPTP第一次注射后7和14天酪氨酸羥 化酶陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量與正常對(duì)照組相比下降，統(tǒng)計(jì)有顯著意義(PO.Ol)， 模型組在MPTP第一次注射后14天酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量比7天 略有減少，但兩者的差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)。盡管三個(gè)劑量組灰蓉 總苷的干預(yù)均能對(duì)抗MPTP導(dǎo)致的酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量的下降， 但只有蓯蓉總苷高劑量組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上與模型組比較差別有顯著性 (P<0.05)。并且與正常對(duì)照組相比，差別不顯著(P〉0.05)。
圖2-3，蓯蓉總苷干預(yù)治療對(duì)MPTP小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的影 響。**P<0.01對(duì)控制組，AP0.05對(duì)MPTP第一次注射后7天后的模型 組，卞P <0.05對(duì)MPTP第一次注射后7天后的模型組。A:正常組；B:模 型組(MPTP 7d); C模型組(MPTP 14d); D: 400mg/kg/d TCM組(MPTP 7d); E: 400mg/kg/d TCM組(MPTP 14d)。
3.4蓯蓉總苷對(duì)a -突觸核蛋白表達(dá)的影響
選擇MPTP第一次注射后的4天作為觀察的時(shí)間點(diǎn)，主要考慮Western blot分析以及系列的激光共聚焦觀察均證實(shí)在該時(shí)間點(diǎn)上，線粒體上a -突觸核蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，而多巴胺能神經(jīng)元尚未大量死亡。根據(jù)病理學(xué)研究 中常用的半定量原則，將黑質(zhì)神經(jīng)元a-突觸核蛋白的免疫染色強(qiáng)度分為三 個(gè)等級(jí)弱陽(yáng)性(淡黃)；中度陽(yáng)性(黃色)；強(qiáng)陽(yáng)性(棕黃)三個(gè)等級(jí)。可 在正常小鼠中見(jiàn)到大量弱陽(yáng)性(淡黃)；中度陽(yáng)性(黃色)的神經(jīng)元，在100 倍鏡下，統(tǒng)計(jì)各組黑質(zhì)致密部所有細(xì)胞形態(tài)完整的a -突觸核蛋白強(qiáng)陽(yáng)性神 經(jīng)元。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)MPTP處理后，黑質(zhì)致密部a-突觸核蛋白的免疫 反應(yīng)明顯增強(qiáng)，呈強(qiáng)陽(yáng)性的神經(jīng)元明顯增多(PO.Ol)，統(tǒng)計(jì)顯示，經(jīng)高劑 量蓯蓉總苷干預(yù)的模型小鼠，其a-突觸核蛋白強(qiáng)陽(yáng)性的神經(jīng)元與模型組小 鼠相比明顯減少(PO.Ol)。圖像經(jīng)高倍放大后可以看到，正常小鼠黑質(zhì)致 密部的大部分神經(jīng)元染色較淺，分布均勻；而模型小鼠黑質(zhì)致密部的大部分 神經(jīng)元染色較深，并且呈聚集狀；經(jīng)高劑量蓯蓉總苷干預(yù)的模型小鼠，與模 型組相比，其黑質(zhì)致密部的神經(jīng)元染色變淺，分布均勻。
以上實(shí)驗(yàn)表明MPTP可以誘導(dǎo)在正常小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的線粒體膜上存 在a -突觸核蛋白的表達(dá)的升高.MPTP小鼠模型中可能存在標(biāo)志線粒體凋亡 的聚集現(xiàn)象。并且可能線粒體上增高的a -突觸核蛋白的表達(dá)促進(jìn)了這種聚 集現(xiàn)象。蓯蓉總苷可以有效的改善MPTP小鼠模型的神經(jīng)行為，抑制MPTP 誘導(dǎo)的小鼠死亡。這種干預(yù)作用可能與其抑制了線粒體上增高的ct -突觸核 蛋白的表達(dá)有關(guān)。
圖4-5，蓯蓉總苷干預(yù)治療對(duì)MPTP小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元a -突觸核 蛋白表達(dá)的影響。**P<0.01對(duì)控制組，AAP0.01對(duì)初次注射MPTP后 4天的模型組，(A,D):正常組；(B, E):模型組(MPTP 4d); (C， F): 400mg/kg/d TCM組(MPTP4d)。
以上實(shí)施例僅供說(shuō)明本發(fā)明之用，而非對(duì)本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以作出各種變換 或變型，因此所有等同的技術(shù)方案也應(yīng)該屬于本發(fā)明的范疇，應(yīng)由各權(quán)利要 求所限定。
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權(quán)利要求
1、肉蓯蓉總苷在制備治療帕金森病藥劑中的應(yīng)用。
2、 一種肉蓯蓉的提取物在制備治療帕金森病藥劑中的應(yīng)用，所述肉灰蓉的提取物是由按下述方法制備的肉蓯蓉在切片后用70%乙醇回流兩次，提取上清，并將提取液水浮后，得到上清液，將上清液過(guò)大孔樹脂，先用水洗脫，再用甲醇洗脫，其中甲醇 洗后的溶液進(jìn)行蒸干，再用正丁醇溶解蒸干后的產(chǎn)物，得到水相和醇相，將 醇相蒸干后用無(wú)水乙醇精制，可得到肉蓯蓉總苷即為所述肉蓯蓉的提取物。
3、 一種肉蓯蓉的提取物在制備治療帕金森病藥劑中的應(yīng)用，所述肉灰 蓉的提取物是由按下述方法制備的將lg肉蓯蓉粉末加60ml甲醇進(jìn)行超聲波破碎浸提，浸提液過(guò)濾后得濾 液和濾渣，濾液減壓濃縮至膏狀，用10ml水混懸后過(guò)大孔吸附樹脂，先用水洗 脫,然后再用甲醇洗脫，將甲醇洗脫液集中，減壓濃縮后即得肉灰蓉總苷。
4、 如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的肉灰蓉總苷的三種主要成分 為松果菊苷、異毛蕊花糖苷和毛蕊花糖苷。
5、 如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的肉蓯蓉的提取物在制備治療 帕金森病藥劑的應(yīng)用，其中，可在肉蓯蓉總苷中加入矯味劑或溶劑制成口服 液劑、片劑、丸劑、沖劑、膠囊劑、注射劑、滴丸劑、糖漿劑、膏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及肉蓯蓉的提取物肉蓯蓉總苷在制備治療帕金森病藥劑中的應(yīng)用。所述肉蓯蓉的提取物是由按下述方法制備的肉蓯蓉在切片后用70％乙醇回流兩次，提取上清，并將提取液水浮后，得到上清液，將上清液過(guò)大孔樹脂，先用水洗脫，再用甲醇洗脫，其中甲醇洗后的溶液進(jìn)行蒸干，再用正丁醇溶解蒸干后的產(chǎn)物，得到水相和醇相，將醇相蒸干后用無(wú)水乙醇精制，可得到肉蓯蓉總苷即為所述肉蓯蓉的提取物。由于肉蓯蓉提取物肉蓯蓉總苷可以用來(lái)制備治療帕金森病的藥劑，能有效改善帕金森病患者的運(yùn)動(dòng)功能及延緩帕金森病病程進(jìn)展，給中醫(yī)藥治療帕金森病帶來(lái)了新的希望。
文檔編號(hào)A61K36/185GK101293016SQ20071004019
公開日2008年10月29日 申請(qǐng)日期2007年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月28日
發(fā)明者唐紅敏, 李文偉, 楊云柯, 越 范, 蔡定芳, 虹 趙, 顧喜喜 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院