專利名稱：：作為流感病毒疫苗佐劑或免疫刺激物的dsRNA的制作方法作為流感病毒疫苗佐劑或免疫刺激物的dsRNA對抗急性或慢性病毒感染的疫苗保護(hù)作用可以通過使用與抗流行性感冒疫苗一起的作為佐劑或免疫刺激物的dsRNA得到促進(jìn)。
背景技術(shù)：
：佐劑已用于促進(jìn)疫苗給予保護(hù)包括人類在內(nèi)的動(dòng)物的免疫作用。鑒別有效和高效的佐劑經(jīng)常是一項(xiàng)困難的任務(wù)。特別受人關(guān)注的是用于對抗流感病毒起保護(hù)作用的疫苗，而最近受關(guān)注的是包括越南毒林和香港毒林在內(nèi)的禽流感病毒H5N1(禽流感)。對抗流感病毒的滅活疫苗已經(jīng)通過腸胃外施用以誘導(dǎo)血清抗體，也已施用于鼻粘膜以提供對流感病毒的粘膜免疫。若干佐劑眾所周知，例如明礬、角簠烯乳劑(MF59,ChironVaccines)和弗氏佐劑。最近，合成的dsRNA聚肌胞苷酸(polyriboinosinicpolyribocytldylicacid)或poly(I:C)已4皮才是i^M乍為滅、;舌流感病毒疫苗用的佐劑或免疫刺激物(參見Ichinohe等，JournalofVirology,March2005,p.2910-2919)。發(fā)明概述本發(fā)明公開了促進(jìn)對抗急性或慢性病毒感染的疫苗保護(hù)作用的方法，所述方法包括對需要保護(hù)的對象聯(lián)合(coordinated)施用與作為佐劑的dsRNA—起施用的免疫誘導(dǎo)量的抗流感疫苗。還公開了促進(jìn)對抗急性或慢性病毒感染的疫苗保護(hù)作用的方法，所述方法包括對需要保護(hù)的對象施用與作為佐劑或免疫刺激物的dsRNA結(jié)合(incombinationwith)的免疫i秀導(dǎo)量的抗流感疫苗。本發(fā)明包括促進(jìn)對抗急性或慢性病毒感染的疫苗保護(hù)作用的方法，所述方法包括基本上同時(shí)或序貫地對需務(wù)限護(hù)的對象施用與作為佐劑或免疫刺激物的dsRNA;昆合的免疫誘導(dǎo)量的抗流感疫苗。本發(fā)明也包括保護(hù)對禽流感感染易感的動(dòng)物(包括人類)對抗由病毒引起的繼發(fā)于抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換(經(jīng)病毒顆粒結(jié)構(gòu)重排所證實(shí))以及基因組重排的病理的方法。本發(fā)明還包括通過將疫苗與合成的特別構(gòu)制的(configured)雙鏈核糖核酸(dsRNA)—起或結(jié)合而聯(lián)合施用給患者，從而增強(qiáng)對抗流感病毒的免疫作用的方法。選用的dsRNA是Ampligen,其為由HEMISPHERxBIOPHARMA，1617JFKBoulevard,Philadelphia,PAUSA獲得，這是一種合成的具有特別構(gòu)制的雙鏈核糖核酸(dsRNA),其保持著其他雙鏈RNA分子(dsRNA)的免疫刺激特性和抗病毒特性，但顯示出毒性大大減弱。如其他dsRNA—樣，Ampligen⑧可以刺激宿主的防御機(jī)制包括先天免疫。Ampligen⑧具有刺激各種dsRNA依賴性胞內(nèi)抗病毒防御機(jī)制的能力，所述抗病毒防御機(jī)制包括2，，5，-寡腺苷酸合成酶/RNaseL和蛋白激酶酶途徑。本發(fā)明的上下文中所使用的"聯(lián)合"的意思獨(dú)立地分別是(l)共同施用，即基本同時(shí)或序貫地施用疫苗和dsRNA,或者是(2)組合物的施用，除藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體之外，所述組合物還包含結(jié)合的和混合物形式的疫苗和dsRNA。錯(cuò)配的dsRNA可以具有通式rIn.r(C12U)n。在該通式和其他的化學(xué)式中產(chǎn)核糖。本發(fā)明中使用的其他錯(cuò)配dsRNA基于選自poly(Cm,U)和poly(CmG)的共聚核苷酸(copolynucleotide)，其中m是數(shù)值為4-29的整數(shù)；而且是通過修飾rln'rCn以沿著聚胞嗜啶核苷酸(rCm)鏈摻入非配對堿基(尿嗜啶和鳥噤呤)而形成的聚肌胞苷酸(polyriboinosinicandpolyribocytidilicacids)復(fù)合物的錯(cuò)配類似物?；蛘?，dsRNA可以通過修飾聚核糖肌苷酸(rln)的核糖基骨架(例如通過包含2，-0-曱基核糖基殘基)而由r(I)r(C)dsRNA衍生。此錯(cuò)配物可以與賴氨酸纖維素等穩(wěn)定RNA的聚合物復(fù)合。這些rln'rCn的錯(cuò)配類似物中，優(yōu)選的類似物是通式rlnr(Cn.,4,U)n或者rln.r(C29,G)n的類似物，它們描述于CarterandTs，o美國專利第4，130，641號和第4,024,222號，所述專利的公開內(nèi)容通過引用作為參考。其中描述的dsRNA通常適合于按照本發(fā)明使用。用于本發(fā)明的錯(cuò)配dsRNA的其他實(shí)例包括r(I)r(C4，U)r(I)r(C7，U)r(I).r(C13，U)r(I)r(C22，U)r(I)'r(C20，G)和r(I)'r(Cp.23,G>p)?；蛘撸琩sRNA可以是配對的形式，因此也可以使用與聚尿苷酸復(fù)合的聚腺苷酸(polyA.polyU)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是使用適當(dāng)疫苗和dsRNA的協(xié)同組合來治療對現(xiàn)在或?qū)砜傻玫降囊呙珙A(yù)防治療敏感的急性和慢性病毒感染，所述感染包括例如HIV、重癥急性呼吸道綜合征(SARS)和包括禽流感在內(nèi)的流行性感冒。附圖簡迷本發(fā)明在以下實(shí)施例和附圖中進(jìn)一步得到解釋和闡述，其中圖1是表明實(shí)施例1結(jié)果的表格；圖2是表明實(shí)施例2結(jié)果的表格；圖3是表明使用三價(jià)流感疫苗的實(shí)施例3結(jié)果的表格；圖4是表明鼻內(nèi)使用三價(jià)疫苗加上Ampligen⑧的實(shí)施例3結(jié)果的表格。圖5是表明按照實(shí)施例3對三價(jià)季節(jié)性流感疫苗和鼻內(nèi)施用Ampligen⑧的直接交叉評價(jià)的表格；而圖6是表明實(shí)施例3結(jié)果的表格。以下各圖中使用的術(shù)語是:A/VN禽流感/越南(H5Nl)毒才朱VN1194禽流感/越南(H5Nl)毒林05/06疫苗2005-2006季的三價(jià)"季節(jié)性"流感疫苗AmpAmpligenI.N.鼻內(nèi)S.C.皮下抗A/VNIgA針對禽流感越南毒林產(chǎn)生的IgA抗體抗A/VNIgG針對禽流感越南毒株產(chǎn)生的IgG抗體A/VN病毒滴度禽流感病毒越南毒抹凄t量的定量(即在鼻粘膜先液中檢測的)抗05/06疫苗針對2005/2006三價(jià)季節(jié)性流感疫苗產(chǎn)生的抗體H5N1禽流感病毒分型優(yōu)選實(shí)施方案描述實(shí)施例l:禽流感病毒抹之間的交叉保護(hù)本研究以Ichinohe等,JournalofVirology,March,2005,第2910-2919頁的方式在小鼠中實(shí)施，這次使用兩林不同的禽流感病毒毒抹，即越南毒抹和香港毒林；和dsRNAAmpligen,如上所述，其單獨(dú)使用或結(jié)合疫苗使用。結(jié)果在圖1和2中給出。在第一幅圖中，根據(jù)鼻洗液中檢測的抗體，當(dāng)鼻內(nèi)施用時(shí)單獨(dú)使用(A/VN)疫苗提供了誘導(dǎo)抗體的陽性結(jié)果，但當(dāng)與Ampligen—起施用時(shí)與單獨(dú)使用疫苗的效果相比產(chǎn)生了不止兩倍的效果。單獨(dú)使用Ampligen未能檢測到任何的IgA抗體。皮下途徑不能在鼻粘膜中產(chǎn)生任何IgA抗體。相比之下，鼻內(nèi)施用后在血清中誘導(dǎo)出有限數(shù)量的IgG抗體，但經(jīng)皮下施用在血清中獲得顯著更大的數(shù)量。再次表明，疫苗加上Ampligen的組合比疫苗單獨(dú)使用產(chǎn)生更好的效果。然后讓小鼠接受禽流感病毒越南毒抹的攻擊，值得注意地，接受了經(jīng)鼻內(nèi)途徑施用疫苗和Ampligen《l合的受攻擊動(dòng)物，其鼻洗液中沒有檢測到病毒；而經(jīng)鼻內(nèi)單獨(dú)使用疫苗、單獨(dú)使用Ampligen和皮下施用疫苗和Ampligen組合，都檢測到不同數(shù)量的病毒。理想的是能在鼻粘膜和其他粘膜中誘導(dǎo)出禽流感病毒的抗體，因?yàn)檫@是典型進(jìn)入/感染點(diǎn)，并且據(jù)信能提供有效的預(yù)防性或緩解性益處。實(shí)施例2:季節(jié)性流感疫苗與H5N1之間的交叉保護(hù)第二組研究類似實(shí)施例1完成，這次最初使用與Ampligen組合的滅活禽流感病毒疫苗越南毒林、或單獨(dú)Ampligen、或單獨(dú)疫苗，然后隨后用不同的禽流感病毒香港毒林攻擊。結(jié)果在如圖2中顯示。在抗A/VNIgA和抗A/VNIgG之下的前兩幅圖是用香港毒林攻擊之前的結(jié)果，而第三幅圖是用_香港毒抹攻擊之后的結(jié)果?？偟膩碚f，在攻擊后的病毒滴度鼻洗液中記錄到有益效果，而使用越南毒林疫苗和Ampligen的組合并于該病毒香港毒抹攻擊后達(dá)到最佳效果。這些結(jié)果表明了當(dāng)經(jīng)過越南毒抹疫苗治療的也接受Ampligen的患者隨后經(jīng)該病毒香港毒林攻擊時(shí)的持續(xù)功效；由此可預(yù)期，當(dāng)將病毒毒林對換而使用香港病毒誘導(dǎo)疫苗隨后經(jīng)越南毒抹攻擊時(shí)，將會發(fā)生類似結(jié)果。-實(shí)施例3:病毒抗原的減量與增量在此實(shí)施例中，按照與實(shí)施例2所用方法類似的方法開展研究，以確定poly(I:C)如何影響動(dòng)物中禽流感越南毒林的施藥。結(jié)杲在圖6中呈現(xiàn)。采用各種劑量的禽流感疫苗(A/VN)和使用不同量的poly(I:C),但不包括A/VN和poly(I:C)，以作為對照。特別引人注目的是l(ig禽流感疫苗和無poly(I:C)與O.l昭禽流感疫苗和10嗎poly(I:C)之間的比較。當(dāng)鼻內(nèi)施用時(shí)，從第一組條形圖可以看出，0.1嗎A/VN和10嗎poIy(LC)的組合，比單獨(dú)使用十倍量的禽流感疫苗誘導(dǎo)出更多抗體。特別顯著的是標(biāo)題"存活率"下的iJ^一組，其中以百分比為基準(zhǔn)，使用十分之一量的禽流感疫苗結(jié)合10嗎poly(I:C)與單獨(dú)使用10嗎A/VN(不含poly(I:C))之間的存活率在數(shù)字Ji^同。還注意到，相比單獨(dú)使用禽流感疫苗時(shí)的可測量數(shù)值，O.I嗎A/VN和10嗎poIy(I:C)組合的鼻洗液中A/VN病毒的滴度相當(dāng)不明顯。從這些數(shù)據(jù)中人們可以得出結(jié)論使用poly(I:C)作為佐劑可使達(dá)到有效存活率(signigicantratesofsurvival)所必需的禽流感疫苗用量減少至1/10(在該實(shí)施例中)。Ampligen的存在似乎具有對抗變異型禽流感病毒的交叉保護(hù)能力并因此減緩了禽流感病毒的抗原漂移?？乖剖且虿《绢w粒基因組內(nèi)容的根本改變所致的病毒結(jié)構(gòu)的改變，所述病毒結(jié)構(gòu)例如為內(nèi)部及外部蛋白、糖蛋白和糖脂類等等。dsRNA減少病毒逃逸(viralescape)及由此伴隨的細(xì)胞損傷的現(xiàn)象。病毒逃逸是經(jīng)病毒或胞內(nèi)病原體改變其宿主范圍，或間接改變其對抗病毒治療或免疫治療的敏感性的過程。本發(fā)明包括了交叉保護(hù)對禽流感感染敏感的動(dòng)物(包括人類)以對抗病毒引起的繼發(fā)于抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換(由病毒遺傳物質(zhì)的突變或重排產(chǎn)生)的病理。圖3中，選用了7組小鼠，每組5只小艮。其中4組經(jīng)鼻內(nèi)或皮下接觸2005/2006三價(jià)流感疫苗。21天內(nèi)重復(fù)鼻內(nèi)接種，14天內(nèi)再次完成鼻內(nèi)接種，總計(jì)1次初次4矣種和2次增強(qiáng)接種。第二次增強(qiáng)接種兩周后，小鼠接受禽流感病毒VN1194(H5N1)毒抹攻擊，對小鼠鼻洗液中IgA抗A/VN的存在情況和數(shù)量以及對小鼠血清中的IgG進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果表明，只有存在Ampligen并以鼻內(nèi)途徑施藥才能誘導(dǎo)出對抗禽流感越南(VN1194)毒林的A/VNIgA抗體。經(jīng)過鼻內(nèi)施用在血清中誘導(dǎo)出對抗VN1194毒抹的IgG抗體，而無論是否存在Ampligen，用皮下施用途徑均能誘導(dǎo)出血清抗體。然后在禽流感VN1194(H5N1)病毒攻擊后評價(jià)鼻洗液中的禽流感病毒滴度。-對于接受了三價(jià)季節(jié)性疫苗和Ampligen佐劑兩者的小組病毒被有效地中和，而其他主JL^現(xiàn)出可檢測數(shù)量的A/VN病毒。圖4表明，如在18天周期內(nèi)評價(jià)的，經(jīng)受住VN1194攻擊的唯一一組動(dòng)物是經(jīng)鼻內(nèi)接受了05/06三價(jià)疫苗加上Ampligen的一組。雖然抗體在血清中出現(xiàn)，但L是它們并未提供對抗VNU94攻擊的有效保護(hù)作用，相反在鼻粘膜出現(xiàn)的抗體在該檢測期內(nèi)有效地防止感染和死亡。這些發(fā)現(xiàn)很重要，因?yàn)樗鼈冏C明了在本研究中通過4吏用經(jīng)鼻內(nèi)施用的三〗介季節(jié)性疫苗與作為疫苗佐劑的Ampligen，賦予了對抗禽流感H5N1毒抹的保護(hù)作用。圖5顯示直接交又評價(jià)，再次表明05/06三價(jià)疫苗和Ampligen的數(shù)量和量，以及施藥途徑，但檢測的是在鼻粘膜或者血清中檢測的被誘出以對抗季節(jié)性三價(jià)疫苗的抗體。結(jié)果表明，只有那些接受了經(jīng)鼻內(nèi)途徑施用的三價(jià)05/06季節(jié)性疫苗和Ampligen兩者的動(dòng)物的鼻粘膜中才出現(xiàn)抗季節(jié)性疫苗的抗體。至于在血清中對抗05/06三價(jià)疫苗抗體的檢測，所有組的"基線"水平都一定程度的提高，但兩次都看到疫苗與Ampligen—起使用有顯著的增加。我們的研究也證明了，血清中抗體的存在不一定提供抗禽流感保護(hù)作用的精確指示，而更可靠的指示是鼻粘膜中誘導(dǎo)的抗體。由雙鏈RNA誘導(dǎo)的、為流感疫苗和其他疫苗提供更有效的免^JM激效果的其它關(guān)鍵細(xì)胞機(jī)制.<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>將禽流感共施用的研究延伸到靈長類動(dòng)物模型，其中疫苗加上共施用的Ampligen被很好地耐受且是有效的。本研究中，用A/VN加上Ampligen(A/越南(H5N1)90|ig/500ml,Ampligen500^ig)對獼猴接種三劑疫苗，分別間隔3周和2周。即接種初始一劑，3周后接種第二劑，2周后接種第三劑。然后在第三劑的2周后，用高劑量的A/VN(A/越南(H5N1)2.5xl05pfU/2.5ml(肺部)和A/越南(H5N1)0.5xl05pfWO.5ml(鼻內(nèi)))經(jīng)氣管內(nèi)和鼻內(nèi)攻擊獼猴。受感染的對照動(dòng)物顯現(xiàn)出呼吸急促、咳嗽、體重減輕和局灶性著生性肺炎(focalconsolidatingpneumonia)。接種疫苗的動(dòng)物沒出現(xiàn)任何癥狀，并受到保護(hù)而免患疾病，肺部組織表現(xiàn)正常。雖然業(yè)已結(jié)合現(xiàn)今認(rèn)為是最實(shí)用和最優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)該理解，本發(fā)明并非限于所公開的實(shí)施方案，相反卻是確定涵蓋包括在所附權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)的各種修改和等同安排。權(quán)利要求1.促進(jìn)對抗急性或慢性病毒感染的疫苗保護(hù)作用的方法，所述方法包括對需要保護(hù)的對象聯(lián)合施用免疫誘導(dǎo)量的抗病毒疫苗和作為佐劑或免疫刺激物的dsRNA。2.促進(jìn)對抗急性或慢性病毒感染的疫苗保護(hù)作用的方法，其中抗病毒疫苗與作為佐劑或免疫激物的dsRNA結(jié)合施用。3.權(quán)利要求1的促進(jìn)對抗急性或慢性病毒感染的疫苗保護(hù)作用的方法，所述方法包括基本同時(shí)或序貫地對需要保護(hù)的對象施用與作為佐劑或免疫刺激物的dsRNA—起混合的免疫誘導(dǎo)量的抗病毒疫苗。4.保護(hù)對禽流感病毒敏感的動(dòng)物和動(dòng)物細(xì)胞對抗病毒引起的繼發(fā)于抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換的病理的方法，其中抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換由病毒顆粒結(jié)構(gòu)中的突變變化或分子重排所證實(shí)，所述方法包括在接觸抗禽流感疫苗之前、期間或之后，使動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞接觸錯(cuò)配的dsRNA。5.促進(jìn)對抗急性或慢性禽流感感染的疫苗保護(hù)作用的方法，所述方法包括對需要保護(hù)的對象聯(lián)合施用免疫誘導(dǎo)量的除禽流感以外的抗病毒疫苗和作為佐劑或免疫刺激物的dsRNA，6.權(quán)利要求5的促進(jìn)對抗急性或慢性禽流感感染的疫苗保護(hù)作用的方法，所述方法包括對需要保護(hù)的對象施用與作為佐劑或免疫刺激物的dsRNA結(jié)合或混合的免疫誘導(dǎo)量的除禽流感以外的抗病毒疫苗。7.保護(hù)對禽流感病毒敏感的動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括在接觸除抗禽流感疫苗以外的流感疫苗之前、期間或之后，使動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)力包4妄觸4告配的dsRNA。8.權(quán)利要求1和2的方法，其中流感疫苗包括標(biāo)準(zhǔn)季節(jié)性三價(jià)流感疫苗。9.權(quán)利要求I、2、3、5、6和7的方法，其中dsRNA另外與RNA穩(wěn)定性聚合體復(fù)合。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述穩(wěn)定性聚M是賴氨酸或者纖維素。全文摘要對抗急性或慢性病毒感染的疫苗保護(hù)作用可以通過使用與抗流行性感冒疫苗一起的作為佐劑或免疫刺激物的dsRNA得到促進(jìn)。文檔編號A61K39/38GK101410133SQ200680052559公開日2009年4月15日申請日期2006年12月6日優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日發(fā)明者D·斯特拉耶,W·A·卡特申請人:半球生物制藥公司