專利名稱：：包含蛋白質nma0939的藥物組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，特別地涉賴于預防+線治療性應用的新型疫苗組^4勿的開發(fā)，所述新型疫苗組^^允許增加針對不同來源的疾病的疫苗抗原的免j^I答的質量。賄技術腦膜炎奈瑟^J求菌(Afe/^er/s邁ei7/'"g/"Ws)是革蘭氏陰性^J求菌，其唯一的已知宿主是人，并JbU畝膜炎J求菌'f頓膜炎(meningococcalmeningitis)的致病因子。通常，在正常辦中的無癥狀攜帶者之中發(fā)i^il種細菌，這種小生境是關于其微生物分離的最常見來源。在世界上，小于2歲的兒童是最易于感翻畝膜炎球菌性腦膜炎的幹沐，然而，青少年和正常^A^N^也可能受到影響。未治療的腦膜炎球菌病(meningococcaldisease)對于大多數患病個體是致命的，和疫苗接種可以通過甚JJ^細菌移居來預防這種t姊。已開發(fā)了贈策略，目的是獲得能夠滿A/斤需要求的疫苗，以^紐"""^體中誘"^4十對這種疾病的保護。為了這個目的，已考慮了莢膜抗原，因為它們的免疫學特異性已允許將這種微生物分類^>清群。這些血';W中的5種已被定義為是it^4ri^界的腦膜炎球菌病的大多數臨床病例的原因。A血清群是#合拉南部非洲中該病流/阡的主要原因。B和C血清群與發(fā)達國家中發(fā)生的大多例相關。Y和W-135血'fr^在美國一些地區(qū)中流行的該疾病和感染的其余病例的大多數之中存在，過去聘出職著增加。因此，頻多糖成為作為疫苗候選物進行研究^H古的目標。賦予針對A、C、Y和W-135血清群的保護的基于莢膜多糖的四價疫苗已在美國得到許可。疫苗接種后所引發(fā)的^^是血清，異性的(RosensteinN.等人，2001.#e/7//^ococca/d/sea記N.Engl.J.Med，344，1378-1388)。不同于其余血;"W的血t^B繼續(xù)為地方'f^伊i/f亍性腦膜炎球菌病的重要原因，并JU^要是由于完憤乏針對其的有效疫苗。已注意到，B艦多糖是弱免疫原性的，加之關于基于這種^^物的疫苗存在誘導免疫耐受和自身免疫的理論風險，這是因為其與存在于人類胎兒結構中的S^鏈具有結構相似性。(FinneJ.等人，1987./tn邁o/zoc/,/fl/z"6oc/^row/7A/Z7e/7/./^cocci'crowea"s(^e/,e/^a///r柳7s^;a0^ifl7/cac/cf如/&。/*g//co/rofe//2S//2"e"ra/a/dejrfra/e"ra/"5wes.J.Immunol,138:4402-4407)。因此，針對B血清群的疫苗的開發(fā)集中于使用亞莢膜抗原。辦蛋醋械g財在70碎—、對于生產基于外膜蛋白質(outermembraneprotein,0MP)的疫苗的最初嘗試基于通過使用去污劑來從外膜蛋白質制備物中去除LPS(FraschCE和RobbinsJD.1978.尸rofec"'o/柳27sfgr卿^e/7/;2卵cocca/d/i"esi^./77./鵬w7c^e/Y".o尸sero妙e2racc/"esa力d5^e"77c"/oT;rc^e"細//ja卵/;:eaj9/》邁octe/.JExpMed147(3):629-44)。然后，使外膜蛋白質0MPs^定以產生懸浮于氯^4內中的聚旨。盡管在動物研究中獲得有希望的結果，i^il些疫苗無法在^A或兒童中誘導殺菌抗體(ZollingerWD等人，1978./鵬w/20ge/2/c/0^o"iVe/sseWs邁ei3/7^/W/.s加e2/rc^e/nFacc//7e//7s/7//ms/1s*<2/7￡//wffla/75r.J.Infect.Dis.137(6):728—39)。這些疫苗的差的性負t^艮大程度上歸因于伴l^"^定過程而出現的三級結構的喪失。因此，接下來的合理步驟是生產以其在夕卜膜嚢泡形式中的天然構M示出所迷蛋白質的疫苗(ZollingerWD等人，1979，co邁/7e;r邁e/7/'/^ococca/^ro砂；9/70//sscc力ar/Vea/7i/妙e2。Wer/zAa76ra/e/rc^e/"/鵬""c^e//c/刀鵬AJ.Clin.Invest.63(5):836—48;WangLY和FraschCE.1984."ere/cpwe/^era/^3〃o"i/s/zmse邁ocfeAInfectI咖un.46(2):408-14136)。這些夕卜膜嚢泡疫苗比0MP聚集體更具有免^^、性，并城^^、小組示出通過吸附至佐劑t^/Ri4呂而得到進一步增強(WangLY和FraschCE.1984.//zaMi/se/ncw/e/.InfectI咖un.46(2):408—14136)。已使用不同配方的可溶^t膜嚢泡疫苗進行了許多功效淵t在20世紀80牛氏，分別作為對于古巴(SierraGV等人，1991.Kacc/zea卵/"Wgro叩"yVb/sser/s邁e/7/77g/"d757/7rc^ec〃o"fWs7s刀J邁awracc/朋〃o"re卯"s//0/&2.NIPHAnnDis.14(2):195-210)和扭卩威(BjuneG等人，1991.^Te"ofowfer//7e邁6ra"eracc/刀e柳/"s^gro叩S邁e/z/邵ococca7cf/微se/刀#onra/.Lancet.338(8775):1093-6)中的疾病暴發(fā)的響應而開發(fā)出了2種最i^A研究的疫苗。由古巴的FinlayInstitute生產的OMV疫苗(商業(yè)上稱為VA"MENG0C-BC)是從菌林B:4:Pl.19，15開始生產的，并且其由所述菌林的0MPs的制^4勿和分離的C血清群艦多^^且成，并吸附至氫氧化鋁(SierraGV■^A，1991.agaj'/wt^rou;^^eii^er/fl邁e/n'/2^772V/s..;rc^ec"'o/z/Wa/a刀d邁ai"51rac"./2a〃o"re卯"s//zNIPHAnnDis.14(2):195-210)。e/j/de/zw'oiog/ca//邁/7acfofa/2f/V/7en//^ococca/5racc/'加"'o/2//7C由."效MemInst0swaidoCruz.94(4):433-40)。由NorwegianNationalInstituteforPublicHealth(NIPH)生產的疫苗最初在由屬于克隆ET-5的菌林(B:15:PI.7,16)引起的疾病的高度地方性流行期間^^1。這種單價疫苗也是M化的夕卜膜嚢泡生產的并吸附在氫氧化鋁上(BjuneG等人，1991.f/Y"e"o/*owter邁加6ra/2e7es/c7eracc//2e柳/"5^gro叩S/ne/ji./^ococca/dfi.sease//)Vor附/.Lancet.338(8775):1093-6)。夕卜膜嚢泡疫苗似乎有^EilW:于足夠天然的構象的夕卜膜蛋白質，從而允許至少在青少年和^A中產生功能f生殺菌抗體。所產生的抗體應答也已顯示增加腦膜炎球菌的調理吞，楚。疫苗的精確配制(例如，0MP含量、LPS^f:和佐劑的存在或不存在)對于免疫原性具有顯著影響(LehmannAK等人，1991.1^"'/7<5<^35*/^<257//"<^/6/6^加7鵬//7(^(加(5.APMIS.99(8):769-72;GomezJA等人，1998._5/y*ecfoffldyu^9/2fs1/刀tAe/so^ppesa/2f/foscter/c/'cfe/yVe/5^er/a/^//^/"ff/s1.Vaccine.16(17):1633-9;SteeghsL等人，1999.iirazu/2卿/z/"7o尸射er胞邁&ra"e尸rofe/'/2S/"a"/7，2，cc力3r/cte—Zte/7c/'e/^yf/由z^o尸Neisseriameningitidis.,///7tfe/zceo尸J力'"ra刀f51oz^e/鵬weW卿o/2記InfectI咖un.67(10):4988-93)。但是，從患者中獲得的分離物的^^謬決速改變，并且^t^有P緣目的所選菌林的疫苗可肯t^數年內變得無效，除非改變疫苗組成以反映當地的^f亍病學。目前，OMV疫苗已比^^可其他B血清^苗更廣j^W吏用，并且在由單一PorA類型引起的疾病M的背景下可f^lL有用的。在菌林之間產生交叉反應性的免疫原仍有待充分定義。來自FinlayInstitute和NIPH疫苗試驗的疫苗4^t后血清的研究暗示，針對PorA(Pl，1類血清亞型蛋白質)和OpcA(另一種主要OMP,以前稱為Opc)的脅(WedegeE等人，1998./艦如ejei7ow5W柳/"5^他軀er胞/z7&ra刀e!o〃^/L9Neisseriameningitidis/'/7阮c/'/7eesa/zdCcwfm/51粉oCb/^rsc^/InfectIrnmun.66(7):3223-31)是重要的血清殺菌活性的*(主要是PorA)，并JLit2種蛋白質均顯示出絲的菌林間的變異性。PorA蛋白是具有^水平的變異性的抗原，其^之間和期間經歷連續(xù)變異(JelfsJ等人，2000.5te《z;e"ce「ar/"/o/2MeporA6fe/2eofsC7o"eoTNeisseriameningitidisf/"r/ag^7/de/z7/c5^resdClinDiagnLabImmunol.7(3):390-5)。在疫苗接種后和疾病后的殺菌^/^主^4十對這種^^。但是，其變異性卻使得具有這樣的問題，即用單個菌林的OMV疫苗(單價的)進行免疫接種所產生的保護作用是否是廣譜的。為了解決這個問題，在荷蘭(RIVM)開發(fā)了一種0MV疫苗，其包含6種不同的致病性分離物的PorA蛋白(VanDerLeyP和PoolmanJT.1992，(70/7S加"/o/ofa卿/〃ra/e"f/z7e/7//^ococcfl/racc/"e5^ra//26asecfo"t力ec7assowter/z7e/z76ra;2epfote/D.InfectImmun.60(8):3156-61;ClaassenI等人，1996.尸roc^c〃OT,c力ajra"er/za〃o/犯cf/jrc^e/oc。/2^s//2//2g柳2.c7eracc//3e.Vaccine.14(10):1001-8)。在這種情況下,Mi至充分絲的H44/76菌林的2種變體中提取出疫苗嚢泡，所述H44/76菌才朱已進4亍了遺傳改造以表達3種獨立的PorA蛋白。顯然，夕卜膜蛋白質(OMP)可以誘"^十對B血辦疾病的功能性免録答，但由于在外膜蛋白質的表面Jl^露的區(qū)域的極大異質性，迄今為止開發(fā)的疫苗中沒有一種是具有4i4保護性的。由夕卜膜嚢泡(OMV)疫苗誘導的it^XA^免疫性已推動了對iS秀導功能性脅JL4在于所有腦膜炎球菌菌林上的夕卜膜抗原(或抗原群)的尋找。如果它們與血清群無關M在于所有菌株上，那么它們可能構MiHt用的腦膜炎球菌疫苗的^出，這將消除在多糖疫苗接種后致病性菌^^上的轉變的^^在問題。由于免tt性的PorA蛋白的變異性,因而其作為通用疫苗的用途受到限制，因此考慮了許多^^要外膜蛋白質用于疫苗候選物，并jut些中的;ut在進一步的開發(fā)中。已考慮的那些包括5類蛋白質(0pcA)、NspA和鐵調節(jié)的蛋白質(TbpA和B、FbpA、FetA)。TbpB與TbpA—起構成了轉鐵蛋白結合復合物的一部分。近期工作暗示，TbpA在鐵結合中具有比TbpB更大的功能作用(PintorM^A，1998.ioai/57'51of7^p」a;^7^jn5尸iz/2C/0;2ai/it/de/feC/Fe邁wts"^yo尸^ei'^e,/a/^/7//^/〃心&JMedMicrobiol47(9):757-60)，Jb^比TbpB更有效的免疫原。已經通過新型技術發(fā)現了高度保守的次要外膜蛋白質，其中使用來自不同腦膜炎球菌菌林的夕卜膜蛋白質制^^勿的組合來免疫小鼠(MartinD等人，1997.氾g力77dmyerKe^^i5wr/a邁e/Zo^7〃(//515i/,/aceCo;7/e,sjPrc^e"/。/2柳/zW^r/er/'/ze繞//"/b"/肌JExpMed185(7):1173-83)。將來自小鼠的B細月細于生產雜,^就針對多種腦膜炎球菌菌林的交叉碧'〖樹所述雜進行篩選。發(fā)現一種具有高度交X^性的單克隆脅與稱為NspA的22kDa夕卜膜蛋白質結合。用重組NspA蛋白進行免疫接種顯示出在小鼠中誘^4十對A"C血清群的菌林的交M應性殺菌應答。疫苗接種還保護小鼠免于致命性腦膜炎球菌感染(MartinD等人，1997.Co/wer7ecfyfe^e,ia/oe"/，7Ws5^r/"ace戶rofe//7Cbn/b/;y戶rotec〃。/2柳/"5^^r/7er/邁e/fa/7/7/b"/o/7.JExpMed185(7):1173-83)。在遺傳Ji^異的腦膜炎球菌菌株中的NspA序列的比較證實，該蛋白質是高度保守的(97%的同源性)(CadieuxN等人,1999.泡"er/c油/a/2dCms^-/!rc^e"/re爿"/V/"e510"fer胞/z6ra/2e戶rc^e//2.InfectI咖un67(9):4955-9)。佳JI]抗NspA單克隆M，通過ELISA在99.2%的來自A-C血清群的受試菌林Ji^^則出NspA的存在(MartinD等人，1997.Cowe/^etf^/^er/a/Z7e/2i/^7〃c^5V/r尸ace尸rofe/力Coo/"er51尸ro""/o"柳//7"^rper/zse/^a///zfec〃肌JExpMed185(7):1173-83)。這些單克隆脅已顯示出針對眾多腦膜炎球菌菌林具有殺菌作用，并且能夠在小鼠模型中減少腦膜炎球菌菌血癥(CadieuxN等人，1999.勘"er/c油7MffC/ws-尸rc^ec〃ye^"/y/〃es射er胞邁6，eInfectI麵n67(9):4955-9)。盡管這個粉腺乎暗示NspA是能夠]^k清群界^X揮保護作用的有希望的疫苗候選物，但來自小鼠的多克隆抗重組NspA血清不與約35。/。的致病性B血清群腦膜炎球菌菌林的表面結合，雖然在這些生物中存在基因(MoeGR等人，1999."i/7"e,ei7ces/刀Sw,尸flcefz/7res51/0/7o尸#一3咖/^yVb/Mer/fl邁e"http://^/〃d2.sCr卿i^ra//751.InfectImmun67(11):5664-75)。微絲^W絲^^艦^甜財發(fā)'醇喊MC58(B血清群腦膜炎球菌)(TettelinH等人，2000.ccrap/eteCe/70邁eife,/7ceo尸yVe/^er/a/He/2/鄰/〃d/s5ter,卿^5Yra/,"M7J《.Science287(5459):1809—15172)和Z2491(A血清群菌林)(ParkhillJ等人，2000.Z柳.Nature404(6777):502-6173)的基因組序列在2000年期間得到闡明和公開。經注釋的基因序列的可得t生應當對腦膜炎球菌疫苗研究具有^J^響。在MC58基因組測序jt^進行的同時，Pizza等人開始鑒定被預測編碼膜結合的、表面暴露的或輸出的蛋白質的開放讀石^匡。似門鑒定了570種此類ORFs，經由聚^#^^應擴增它們，并將它們克隆到^M桿菌(&c/eWc/hco//)中，以允"HMt為具有His尾巴或谷胱甘肽S-^^多酶的融M白絲ii^斤編碼的蛋白質(PizzaM等人，2000.她"〃/7cs"o;2oTKacci'/zeCk^/"e51勿a/威5fero^Tow/7j9胞/7/."^cocci/516/松。/e-6te/7G/7e5fe,/"./多Science287(5459):1816-20)。61%(350種)的所選擇的0RFs得到成功表達，無法表達的那些通常是包*過一個逸17]<^^膜結構域的那些(可能排除了許多夕卜膜結M白質)。所述重組蛋白質進^^化，并用于對小鼠進行疫苗接種。然后，通過酶聯免疫吸附測定法(ELISA)和流式細g就與多種腦膜炎球菌菌林的表面結合^Mt免疫血清進eif估，并且使用血清殺菌測定法就針對2種菌林的殺菌活性ijUt免疫血清進4tif估。最后，基于在所有3種測定法中的陽性應答選擇出了7種蛋白質用于進一步的研究。使用與佐劑相組合的許多這些蛋白質的試驗疫苗制劑已顯示在小鼠中誘導顯著的針對同源腦膜炎球菌菌林(MC58)的殺菌抗體滴度，但所述蛋白質中沒有一種誘導與MC58外膜嚢泡疫苗一樣高的SBA滴度(GiulianiMM等人,2000.Proceedings12thIPNC.第22頁)。另一方面，存在某些iW居表明，這些蛋白質的組合可以在小鼠中顯示出比單種蛋白質更高的免疫原性(SantiniL.等人，2000.Proceedings12thIPNC.第25頁)?？赡芡ㄟ^蛋白質表達的失lte其免疫學'l^t的^^而在這個工作期間排除的眾多開放讀^f醫(yī)也可能具有疫苗潛力并需要進一步研究。一旦了解獨個^^對于腦膜炎奈瑟^J求菌的發(fā)病才雄的貢獻，就可以更有^kit擇疫苗組分?？乖陨砜赡艹蔀橛行У囊呙绾蜻x物，或者M地，減毒的突變體可以#皮#見為疫苗的組分。腦膜炎球菌病的預防和/或治療中的一個重要問M，由于到目前為止用作疫苗的^f、的異質性，迄今為止可得的疫苗中沒有一種能夠賦予通用保護。發(fā)明描述本發(fā)明通過提供包^ii樣的蛋白質的藥物組^^勿而^A^決了前面^A的問題，所述蛋白質的序列即^^L病性孩i^物的不同ySr^間也是高度保守的。本發(fā)明所追求的技術目標是開發(fā)能夠增加宿主的全身和粘皿疫應答的組合物，所述免^I^4十對不同的新型病原^Ml更廣譜的現有病原體。在本發(fā)明的工作目標中，首次凈隨了蛋白質NMA0939作為針對腦膜炎球菌病或4封可由奈瑟NMA0939，由于這種蛋白質在腦膜炎奈瑟M^菌和淋病奈瑟^菌的不同分離物之間的保守特征，所iil且合物能夠誘導具有廣鐠保護的全身和粘l^疫應答。更具體而言，本發(fā)明涉及旨在預防或治療由奈瑟g菌屬的細菌《1起的任何感染的藥物組合物，其包^il種蛋白質。在另一^N^的實施方案中，包含這種抗原的所述藥物組合物可用于預防或治療由腦膜炎奈瑟氏球菌(a:/77e/2/'/2g/1/cVs)或'淋病奈瑟^l菌(AgOT3oT/c>eae)引起的疾病。在本發(fā)明的另一個實施方案中，藥物組合物可以包含具有重組、合成或天然起源的一種或多種抗原。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述組合的藥物組^4勿可以包含多糖^^、，包括細菌多糖，和更M而言，腦膜炎奈瑟維菌多糖。本發(fā)明的藥物組^f勿可以包含綴合的蛋白質-多糖，其中多#^且分是細菌多糖。在本發(fā)明的-HM^t實施方案中，包含NMA0939的藥物組*還包含肽性質的抗原，目的是擴展由衍生自所述組合物的疫苗所誘導的保護譜。本文描述的藥物組合物通過腸胃外或粘膜途徑進行施用，包括通過口部途徑的施用。在本發(fā)明的另一^N^^實施方案中，蛋白質賺0939可以用作免^f、性較弱的肽、多糖或^^原的免疫增強劑或載體，目的是增強針對所皿、多糖或雞^t^的免^^答。實施例ll顯示，當病朝汙生肽與醒0939綴合時，蛋白質NMA0939能夠增強針對所i^的^7JC平。本發(fā)明的范圍內還包^f^]蛋白質^^的保護性決^，其中將它們插入NMA0939^J^列內，目的是誘"f4十對此類決定蔟的增強的免疫應答，從而形成作為藥物組合物的一部分的雜合蛋白質。在本發(fā)明的另一個伊述實施方案中，本發(fā)明的藥物組^4勿可以包含蛋白質NMA0939的片段，所述片段能夠誘"f"4十對腦膜炎球菌或奈瑟氏球菌屬的^^可^細菌的保護性應答。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，藥物組合物包^it過合成或重組DNA技術產生的NMA0939才對^^fiisL腿0939模擬肽。術語"才對^球位"在本文中指^f^能夠誘導M的肽，所述*與蛋白質NMA0939相結合，并由此能夠產生針對奈瑟M^菌屬的保護性免疫應答。也為本發(fā)明的"""^分的是通過單獨賦與^i且射目組^MM包含蛋白質NMA0939或編石騷白質NMA0939的基因的藥物組分iM^測腦膜炎球菌病。附圖簡述圖1.在蛋白質NMA0939的克[^^Ji中使用的載體pM238。圖2.通過將相應于基因咖a狄夕的核苷酸序列克隆在栽體pM238中而獲得的最終構建體。圖3.通過細l^5皮裂而獲得的級分的SDS-PAGE分析。泳道l，全細胞；泳道2,石A^i^定物；泳道3,石icCJi清液；醒襯量標準參照物。圖4.^^i^定物開始的重組蛋白質NMA0939的純化過程的不同級分的純度的SDS-PAGE分析泳道l,在碳驗-碳^tik緩沖液中用2M尿素溶解后的^i定物；泳道2，溶解后的上清液；泳道3，未吸附至純^J^的級分；泳道4，在員色#%中、6的低^"量污染物；泳道5，純化的蛋白質。MWM:^量標準參照物。圖5.在用相同抗原通^±內途徑免疫小鼠后獲得的針對重組蛋白質NMA0939的鉢水平(IgG)，對所述^f、佐以弗氏佐劑(Freund)、氬氧化鋁(Alum)或腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖(PsC)。顯示了在ELISA類型的測定法中獲得的結果，其表示為滴度的倒數，該滴度被計算為在光密度為免疫前血清樣品的光密度的2倍時的血清樣品的稀釋度。圖6,^^]用重組蛋白質NMA0939通ii^內途徑進行免疫的小鼠的血清，識別存在于腦膜炎奈瑟g菌菌抹CU385的OMVs中的抗源決M，對所述重組蛋白質NMA0939佐以弗氏佐劑(Freund)、氬氧化鋁(Alum)或C多糖(PsC)。結^示滴度的倒數，該滴度被計算為在光密度為免疫前血清的光密度的2倍時的血清的稀釋度。圖7.BLAST禾I^在編石騷白質NMA0939的基因("Query")和不同腦膜炎奈瑟啡菌血清群的經注釋的基因^^列("Sbjct")之間進行同源'^^r索的結果。圖&血清對于存在于5種腦膜炎奈瑟Mt菌菌林中的^^的識另'J，所i^jk清是在通:M^內途徑用與腦膜炎奈瑟M^菌的C多糖相〉V^的重組蛋白質NMA0939進行免疫接種后而產生的。在用該蛋白質和^M^劑進行免疫接種后而產生的的血清具有類似的行為。結^4示滴度的倒數，該滴度被計算為在光密度為免疫前血清的光密度的2倍時的血清的稀釋度。圖9.使用用重組蛋白質NMA0939進行免疫接種而獲得的血清，在幼年大^莫型中的針對腦膜炎球菌感染的被動保護實驗，對所述重組蛋白質NMA0939佐以弗氏佐劑(Freund)、氬氧化鋁(Alum)或腦膜炎奈瑟狄菌C多糖(PsC)。A:用菌株CU385進行感染，和B:用菌抹233(C:2a:Pl.5)進行感染。C-:未處理動物的血清的混合物；C+:取決于所述實驗，用菌林CU385或233的腦膜炎奈瑟W求菌夕卜膜嚢^JL疫的小鼠的血清。符號*表示相對于陰'1"樹照組(c-)而言具有統(tǒng)計學Ji^的差異，其中涉錄示為菌落形成#^立/毫升(cfu/ml)的菌血癥水平。圖10.所產生的mAbs(mAbsH10/67,3H3/24和7D6/18)對于重組蛋白質醒0939和一組無關^^的識別。R^、Pl，腦膜炎奈瑟繼菌菌林B:4:P1.15的l類蛋白質；P64k，腦膜炎奈瑟狄菌的丙酮m麵的E3亞基；T.T，破傷風類毒素；HBsAg,乙型肝炎病毒表面抗原。結果顯示為在ELISA類型的測定法中的級Jt度(492nm)。圖11.腦膜炎球菌病的'1^1期患者血清對于重組蛋白質NMA0939的識別。作為陰性對照，佳月#>^*的血清。結^示為在ELISA類型的測定法中的(492nm)。圖12.抗-肽JY1抗體的滴度，其相應于用游離肽(JY1)、重組蛋白質(NMA0939)或綴合物JY1-醒0939免疫的動物的血清。圖13.在用與腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖相混合的重組蛋白質NMA0939(NMA09W+PsC)或用摻J旨質體中的重組蛋白質NMA0939(NMA0"9丄ip)通過鼻內途徑免疫的小鼠的肺灌洗樣品中，針對重組蛋白質NMA0939的抗體7jc平(IgA)。實施例實施例1.在B血清群腦膜炎奈瑟狄菌夕卜膜嚢泡制躲中蛋白質脆0939的檢測。為了研究存在于B血清群腦膜炎奈瑟啡菌(菌林B:4:Pl，19，15)夕卜膜嚢泡中的蛋白質，根據在文獻(Sabounchi-SchuttF等人，(2000).AnimmobilineDryStripapplicationmethodenablinghigh-capacitytwo-dimensionalgelelectrophoresis.^fi7ec加pMre".s21:3649-3656)中描述的方法^ii行二維電泳。f^^JD胰蛋白酶(Promega,Madison，WI，U.S.)對經^^提取的蛋白質進^i^消化。在消^^產生的M過^^1微型柱(ZipTips，MilUpore,MA,U.S.)而:^WJ溶液中。在進行質譜法分析之前，用乙腈60%、甲酸1%從微型柱中洗脫下肽，隨后立即^口到納米尖端(nanotips)(Protana，Denmark)中。測量在酉漆電離源(nanoESI)的、具有四,飛行時間的:^^型質"it^義(QTof-2，Manchester,UnitedKingdom)中進行。在0.98秒中并在掃描之間使用0.02秒間隔，在400-2000的w/z范圍中獲WH普法數據。數據獲#數據處理^^]MassLynx禾聘(M3.5，Micromass)^Mi行?；谫|il^t據的蛋白質鑒定^^ProFound禾1^(ZhangW和ChaitBT.2000.57e",o/z7efr2'c/7印〃cfe邁fl卿./^i//b,鵬"肌AnalChem72:2482-2489.http:〃prowl.rockefeller,edu/cgi-bin/ProFound)來進行。對于包含在數據庫SwissProt(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI(http:〃www.ncM.nlm.nih.gov/)中的細菌基因和蛋白質序列進^t^i索，其中作為將彩'』的可能#^考慮了曱石緣酸的氧化、半皿酸的脫i^和M^M^曱基化(carboxyamidomethylation)?；谫|譜的蛋白鑒定采用MASCOT程序進行(PerkinsDN等，1999.abases1U57'"g鵬^577e"ro邁"r7Electrophoresis20:3551-3567.http:〃爾.matrixscience.com/)。搜索^lt包括半M^酸^^以^^化和脫從得自存在于夕卜膜嚢泡制^4勿中的蛋白質鑒定的結果分析開始，選擇一組肽用于進一步測序。從其中一種肽的通順語法進行的觀'j序開始，證實了在b血'練中存在蛋白質NMA0939的同源物,其未肯^vB血清群的基因組中進^^測或鑒定。NMA0939的該B血清棘白同源物在整個申請文件中被稱作薩0939。實施例2.蛋白質NMA0939與在數據庫中報告的基因產物的同源性分析。關于蛋白質腿0939的鑒定，BLAST程序(AltschulSF等人，1990.勘57'c/oca/a/z^/z/z/e/^s"esrc力加/.JMolBiol215:403-410，http:〃爾.ncbi,nlm.nih.gov/BLAST/)在NCBI數據庫中進行序列同源性搜索。該過程使我們能夠鑒定出淋病奈瑟狄菌以Mf膜炎奈瑟啡菌A血;辦的相應的同源物，其與腦膜炎奈瑟^菌B血、;W菌林MC58的情^Nl同。然而，歷a砂W基因的核苷斷列進行的同源'^i索使^ii實在菌株MC58中^t4在這種基因，il^明在該基因組的注釋中出現了，。經注釋的所^因相應于/Ma砂W0RF,其斜病奈瑟M^菌中鏈同源物(NG00306)。^Jr輛B中，該蛋白質的同源物編碼在位置761673和762295之間的DNA區(qū)域之中，該區(qū)域位于緊接著/2fflM7W基因的下游和咖M7M基因的上游。因此，it^首次^ii在腦膜炎奈瑟^5求菌B血清群中存在蛋白質NMA0939的同源物。在^f性物中沒有成功鑒定出具有錄的相似性值的蛋白質，錄明NMA0939可育^1奈瑟^J求菌屬特異性的^^。實施例3.在;U^桿菌中克l^p表ii^碼腦膜炎奈瑟^菌的蛋白質NMA0939的/2^WW基因。為了克,表達咖a""基因，4細pM-238克隆載體。這種載體允^^JD不同的限制酶^ii行克隆，和在鳩桿菌中以內鏈的形式產生高表ii7JC平的異源蛋白質。pM-238栽體(圖1)具有下述元件色氨酸啟動子，相應于腦膜炎奈瑟氏球菌菌林CU385的P64k^f、的N-末端穩(wěn)定性區(qū)段的序列(編碼47個4J^)，編碼C-末端組氨^巴的序歹iJ，相應于T4噬菌體的轉^if止子的序歹寸，和作為選擇才科己的相應于賦予氨千青霉素:^生的基因的序列。由于P-半孝Ut普酶7acZa亞基的存在，這種克隆載M允i樹過菌落的藍色或白色著色來選擇重組體。才財居編石騷白質腿0939的基因的核苷,列(實施例l)，設計了絲苷酸引物對00"67U和7(M46幾)以用于從菌抹CU385(B:4:Pl.19，15)基因組DNA中擴增無信號碼區(qū)的所#因區(qū)段，Xba-IBql-II704467U:5、GTGGTATCTAGATCTGCCAGCGAGAAACTC、3(SEQIDNo.1)704467L:5、CAACCCGGGA丁CCTTCCTTGTCCAAATC3、(SEQIDNo.2)為了預測信號肽，使用SignalPWorldWideWeb服務器(http:〃爾.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0)。在^jI引物704467U和704467L對編碼NMA0939的基因進行PCR擴增(SaikiRK等人，(1988).SPrimer-directedenzymaticamplificationof腿withathermostableDNApolymerase.5Wey3ce239:487-491)后，PCR產物用Bgl-II和BamH-I限制酶進行消化，并克隆到事先經消化的pM238克隆栽體中。最終的構建體顯示于圖2中，并且將重組蛋白質NMA0939表達為與P64k的N-末端區(qū)段的融妙白。經克隆的基因/2ffl3WW的測序4細ALFexpressII自動測序4義(TermoSequenaseCy5DyeTerminadorKit,AmershamBiosciences)以^S^普酸1573(Seq.ID.No.8)和6795(Seq.ID.No.9)來進行，所錄核苷酸分別結合P64k的穩(wěn)定性區(qū)段和T4噬菌^^^f止子的序列。此處產生的質粒命名為pM-NMA0939以用于^<吏用。為了表達咖a^W基因，通過化學方法用pM-腿0939質粒轉化;U^桿菌GC366菌林(圖2)。表達實驗在補絲1%葡萄糖、1%水解的崎白、0.1%酵母提取物、0.1nMCaCl2、1nMMgS(X和50|ig/mL氨千青霉素的M9含&14^養(yǎng)基(MillerJH.1972.ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NEWYork，USA)中進行。細菌培輛在37。C和250rpm下溫育12小時。將生"^^4勿進行離心，并JUfit^聲瓦解來進行細胞沉淀物的破裂(IKALAB0RTECHNIK)。來自沉淀物和上清液的級分通過SDS-PAGE(Lae咖liUK.1970.6Veflrage。/"rw"wra7/vo^,/z51cfer//^Meas5"e邁W/o尸Meo尸&3"eWo/7A9《eTV.Nature277:680)并力口上用考馬斯亮藍R-250染色來進行分析。表達的百分比通過皿光密度測定法^ii行分析(HBBro咖a2202Ultrascanlaserdensitometer;AmershamPharmaciaBiotech,UnitedKingdom),^^*^定物中獲#^白質腿0939，為該級分的總蛋白質#的約20%(圖3)。將細胞^J定物的樣品溶解于包含不同摩爾濃度(2M、4M、6M和8M)的尿素的碳離-碳MJL緩沖液(0.1M碳酸鈉，0.1M碳錄鈉)中。當^^J具有2M尿素的前嫂沖液時，蛋白質腿0939^j^解。<^#解后的上清'M過金屬親和層析以便iiJ)J目的蛋白質的純化。因此，獲得具有80%純度的樣品，如圖4中所示的。在其在實I^物中進^^N古之前，進行^的透析步驟。為了評估蛋白質腿0939的免^^、性，設計并在小鼠中進行免疫接種實驗，其中施用佐以氫氧化鋁、弗氏佐劑或腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖的蛋白質NMA0939。^^l這些制劑免疫雌性Balb/C小鼠(8-IO周齡)，這些小鼠分成4組，每組8只小鼠。通ii^內途徑進行3狄疫接種，每2次之間間隔7天。4，對照組，其在前3;線疫接種時接受PBS，然而，如同該實驗中的^i且一樣，在實M始后45天時接受佐以氬氧^4呂的所述蛋白質的加強劑量。在表l中描述了這些組的組合物表l:在免疫接種實驗中所使用的Balb/C小鼠組組免疫原120|igNMA0939+弗氏佐劑220|igNMAG939+氬氧化鋁320jugNMA0939+C多糖4PBS在所iti口強劑量后獲得的血清樣品中，通過ELISA測定針對該重組蛋白質和細菌中存在的同源蛋白質的M(IgG)的滴度。在圖5中，顯示了^動物的針對該重組蛋白質的棘滴度。正好在第二次接種后檢測到特異性脅7k平(數據絲示)，在#1次接種后^>高。jH^卜，進4豫由Western印跡法的免疫鑒定，其中識別出相應于所述蛋白質的條帶(數據未顯示)。在用該重組蛋白質進行免疫接種后獲得的血清識別存在于菌株CU385的外膜蛋白質(0MP)制M中的天然蛋白質。這些結tt示在圖6中。為了進行結果的統(tǒng)計學分析，對M滴度進行l(wèi)og轉化以獲得值的正態(tài)分布和/或方差齊性。-*地，組間差異的統(tǒng)計學Jj4iit過簡單AN0VA和隨后的NeumanKeuls多等M^r驗(multipleranktest)i)Ui行分析。實施例5.在腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的不同菌林中編碼蛋白質NMA0939的基因序列的表征。為了分析奈瑟^J求菌屬的致病性物種中編石騷白質NMA0939的基因序列的保守性，<，BLAST禾誘(AltschulSF等人，1990,勘s/c/oca/3//>2^7^i"earc力f。。y,JMolBiol215:403-410.http://www,ncbi.nl瓜nih.gov/BLAST/)iMi行iMJ在NCBI數據庫中注釋的腦膜炎奈瑟^J求菌(A、B和C血清群)和淋病奈瑟^J求菌的基因組的相似性搜索(NC-003116.1，NC-003112.1,NC一003221，NC-002946)。圖7顯示了關于在每種所分析的基因組中產生^比對的那些序列的序列比較的結果。與所獲得的編石騷白質NMA0939的基因序列(Seq.ID.No.3)相比較，那些序列在B血清群中具有99%的同一性，在A血清群中具有100%的同一性,和在林病奈瑟^J求菌的情況下具有96%的同一性。jtW卜，對于屬于B血絲(B:4:Pl.19，15)的3種古巴分離物，測定了所#因的核苷酸序列(Seq.ID.No.5-7),并廁過朋ClustalX餅(http:〃蘭.ebi.ac.uk/clustalw/)j^f亍了序列l(wèi)^時。t時的結果顯示，在所分析的菌抹中和-^歐而言在奈瑟氏球菌屬中在基因的核苷酸序列中存員大的保守性?？紤]到在前面M的序列中存在高度的相似性，M白質NMA0939用作疫苗候選物將允許產生有效的免dS答，具有針對腦膜炎球菌病的廣i射呆護(由于交X^應性)。實施例6.通過用蛋白質NMA0939對Balb/C小鼠進行免疫接種而誘導的具有廣it^用的免^答的^^征。為了評估用蛋白質腿0939進行免疫接種是否誘導了與^^瑟氏球菌屬菌林具有廣泛交X^應性的應答，進行ELISA。用5種奈瑟繼菌屬菌林的完整細胞包被聚笨乙烯平板，所述菌株屬于不同的血清型和血清亞型。*板與血清';^^4勿進#^顯育，所iiir清是針對與不同佐劑相';a^的蛋白質NMA0939而獲得的，如實施例4中所描述的。圖8顯示，存在于腦膜炎奈瑟^J求菌的A、B和C血'辦菌抹中的^^Ml^用與腦膜炎奈瑟^J求菌C多樹目》V給的重組蛋白質NMA0939進行免疫接種后獲得的血清所識別。如所XC^到的，免疫血清識別在不同菌林中存在的該蛋白質，其水平類似于在菌林CU385中所發(fā)現的水平。在用具有^^劑的該蛋白質進行接種后所產生的血清具有類似的行為。實施例7.在幼年大鼠模型中由針對蛋白質NMA0939而產生的鼠類血清所誘導的保護作用。為了測定所獲得的抗血清的功能活性，在幼年大鼠中的腦膜炎球菌感染模型之中進4刊皮動保護測定法。將24只大鼠(5-6狄)分^i且，每組6只大鼠。確定通^1內途^^用的血清是否保護了大鼠不受由細菌(菌抹CU385)引起的感染，所述細菌在1小時后通i^目同途徑接種。';^^個組的血清，并在將它們接種在幼年大鼠中之前作1/10稀釋(在無菌PBS中)。4小時后，對動物進行取洋，并且計數其血液中的活細菌。為了解釋所述結果，進行單側Studentt檢驗，其中比較了所研究的各組與陰'l"樹照(^Mt理的動物的血清';^^)。如在圖9A中所，JL^到的，與陰性對照《i^目比較，接受用與腦膜炎奈瑟M^菌C多糖相〉V給的蛋白質NMA0939進行免疫接種的、鼠的M的^^示出統(tǒng)計Ji^著的差異，因此所述M在幼年大鼠模型中是具有保護性的。在用與氬氧化鋁相濕合的該蛋白進行免疫接種后產生的抗體在該動物模型中也具有保護性(數據未顯示)。通賴菌林233(C:2a:Pl.5)感染幼年大^ii行了類似測定法并ili^^^示在圖9B中，其中發(fā)現，如前面的實驗中一樣，用佐以氬氧^4呂或C多糖的蛋白質NMA0939進行免疫接種的小鼠的抗體能夠保護大鼠不受腦膜炎球菌感染。通itj^從古巴患者中分離的菌抹H44/48和120/90感染幼年大鼠進行了類似測定法，所述菌林的血清學分類與菌林CU385同源。J:b^卜，攻擊實驗用B血清群的菌林H44/76(B:15:P1.7，16)來進行。在所有情況下，用佐以氬氧^45或C多糖的蛋白質NMA0939進行免疫接種的小鼠的抗血清能夠保護幼年大鼠不受腦膜炎球菌感染。實施例8.產生針對蛋白質NMA0939的單克隆M,其能夠介"f^十對腦膜炎奈瑟g菌的殺菌活性。為了產生針對蛋白質NMA0939特異性單克隆抗體(mAbs),和研究介"H十對腦膜炎奈瑟氏球菌的同源和異源菌林的殺菌活性的功能活性，用純度為80%的蛋白質NMA0939的制劑(實施例3)進行免疫接種程序。免疫接種在Balb/C小鼠(H-2d，雄性，5-6周齡)中進行，并且如下^口4齊'J:在免疫接種禾聘的第0、15和30天時，通過皮下途^^用經弗氏佐劑孝L/ft的10jig抗源NMA0939/只小鼠(總^U00jLil);在第50天時，通MM內途^^用在磷^緩沖鹽水(140mMNaCl、270mMKC1、1.5mMKH2P04、6.5mMNa2HP04x2H20，pH7.2)中的10jug抗原/只小鼠。抽血在第0和45天時進行。將來自具有最高滴度(通過使用蛋白質NMA0939作為包被抗原的間接ELISA而測量的)的動物的脾細胞與X63Ag8653小鼠骨髓瘤細胞融合。所得到的雜交瘤根據標準操作程序進行分離和篩選(GavilondoJV.1995.AnticuerposMonoclonales:TeoriayPr6ctica，ElfosScientiae，LaHabana，Cuba)。由所述雜^t^i必的針對蛋白質NMA0939的抗體的瓦應性，以及其與無關抗原的交XgjS性，通過使用5|ig/ml的每種抗原和相同濃度的每種待測定raAbs的間接ELISA來進行測試。圖10顯示了在這個實驗中獲得的結果，獲得了總共3個陽性克隆(mAbsH10/67、3H3/24和7D6/18)，M異l"銳識別蛋白質絲都不^。為了測定針對蛋白質NMA0939而產生的raAbs介^^4十對腦膜炎奈瑟M^菌的同源和異源菌林的殺菌應答的能力，進行殺菌測試。殺菌抗體滴^示為能夠殺死50%或更多細菌的受"^體的最高稀釋度的倒數；所述mAbs中的2種(3H3/24和7D6/18)具有高于1:128的4十對同源菌林B:4:Pl.19,15的殺菌滴度，以及l(fā)種(H10/67)具有高于1:80的滴度。它們ii^示出高于1:64的分別針對異源菌林B:15:Pl.7，16和C:2a:Pl.5的滴度。實施例9.針對蛋白質腿0939的鼠類免答的靶區(qū)域的4^。為了鑒定該蛋白質中更通常被針對該重組抗原而產生的鼠類抗血清所識別的區(qū)域，進行SPOTScan測定法。在纖維素^Ji合^^該蛋白質序列的一組重疊肽，將其與i:100稀釋的血清濕/^"-^顯育。扭源-^/^反應通過下述方式絲3則與綴合物抗鼠類IgG-堿性磷酸^-^溫育，^添加包含底物溴-氯-吲咮基-磷酸酯的溶液?！肥Y到幾個在該蛋白質內存在的共有的^^、性區(qū)域，與用于免疫接種的制劑無關(數據未顯示)。然而，在用佐以弗氏佐劑的該蛋白質進行免疫接種的組中存在廣泛得多的識別模式。實施例10.人類血清對于蛋白質NMA0939的識別。在這個研究中使用來自'tt期個沐的人類血清的M，所述研究通過ELISA^ii行。平糊通過制備型電泳荻得的蛋白質腿0939(5|ig/ml)進行包被。用在包含Tween-20的PBS中的3%則旨#閉平^^，將血清擬目同溶液中進^#釋(1:50)并在平板中進^^顯育。如已廣泛報告的，進行免疫測定法。將#^^^血清用作陰性對照。itt^卜，將來自用針對乙型肝炎的重組疫苗進行疫苗接種的個沐的血清^^物用作無關對照(數據未顯示)。圖11顯示了在這個測定法中^^J5種'fel期的血清而獲得的結果。可以看出，人類血清識別該蛋白質，il4明它在腦膜炎球菌感染期間表達，并且它是免疫原性的。實施例11.蛋白質醒0939作為肽的栽體。為了證實重組蛋白質NMA0939的栽體能力，使其與15聚體的合成肽綴合，所述合成AUM原于HIV-1(分離物JY1)的gpl20蛋白的V3區(qū)域。綴M過戊二醛法^Mi行。在3-劑禾誘表中，將游離的JY1肽、重組蛋白質腿0939和綴合物JT1-NMA0939施用給成年小鼠，其中免疫原由弗氏佐劑進行l(wèi)l/f匕。在第3劑后2周，從經免疫的動物中獲得血清樣品，并且通過ELISA來分析樣品以測定抗-肽脅的滴度。為此，平節(jié)游離肽(20yg/ml)進行^^皮，并且如先前已描述的^ii行免疫測定法。該實驗的結果(圖12)顯示了蛋白質醒0939的栽體能力，其在綴合后能夠絲增強針對肽JY1的抗體應答。實施例12,在通it^占膜途徑用蛋白質NMA0939進行免疫接種后誘導的免録答的評估。為了評估蛋白質艦0939的免^f、性，設計并在小鼠中進行免疫接種實驗，其中施用包嚢到脂質體中或佐以腦膜炎奈瑟狄菌C多糖的蛋白質腿0939。如先前所描述的(CarmenateT等人，(2001).RecombinantOpcproteinfromM^er/a/Z7e/z/i7^7'〃(//51reconstitutedintoliposomeselicitsopsonicantibodiesfollowingimmunization.5/ofecA/o人jff/oc力e瓜34:63-69)，通過M^K-再水化^M^尋脂質體。使用這2種制劑，對于雌性Balb/C小鼠(8-10周齡)進行免疫接種。經鼻內途;fM用3劑(射寸50jag)，每2次之間間隔15天。為了分析在粘膜水平上的免疫應答，在經免疫的動物的肺灌洗液中測量IgAM7jc平。在圖13中顯示了在所分析的2個組中檢測到的IgA抗體的水平。權利要求1.藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含標識為Seq.ID.No4的蛋白質NMA0939。2.才娘權利要求l的藥物組合物，其用ffi防或治療由奈瑟M^菌屬的細菌引起的感染。3.##權利要求1的藥物組^;,其用，防或治療由腦膜炎奈瑟^菌或淋病奈瑟氏球菌？1起的感染。4.才財居權利要求l的藥物組，，^Nr4iMt于，所述藥物組*另外還包^it過重組、合成或天然方式獲得的一種或多種具有不同4錄的抗原。5.才M居權利要求4的藥物組^/，絲4￡^于，所述藥物組^包含多糖^/f、，包括細菌多糖。6.才財居權利要求5的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組^;包含腦膜炎奈瑟W求菌繊多糖。7.才財居權利要求4的藥物組*,^#;(4于，所述藥物組，包含蛋白質-多糖綴^4勿，其中多^tia分是細菌多糖。8.才財居權利要求4的藥物組*,M征在于，所述藥物組*包含肽抗原。9.才權利要求1的藥物組，，其用于通itM胃外或粘膜途^^用。10.#|居權利要求1的藥物組^;，^#棘于，M白質NMA0939用作具有不同性質的抗原的免疫增強劑或栽體。11.藥物組^，絲棘于，所述藥物組^包含^f、蛋白質NMA0939的片l錄才對以肽。12.藥物組分，其特4iL在于，所述藥物組分包含標識為Seq.ID.No4的蛋白質NMA0939,并J^斤述藥物組分用于^v類中以獨立的形iUl與^Ma射目組^M^則腦膜炎球菌病。13.藥物組分，其特征在于，所述藥物組分包含標識為Seq.ID.No3的編石^白質NMA0939的基因，并JL^斤述藥物組分用于在人類中以獨立的形式或與^^ki且射目組^k^r測腦膜炎球菌病。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，特別涉及包含蛋白質NMA0939的藥物組合物的開發(fā)。本發(fā)明的組合物賦予針對由病原體或不由病原體引起的不同疾病的保護。蛋白質NMA0939被鑒定為腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)外膜囊泡制備物的組分，它通過使用重組DNA技術而獲得，并且在動物模型中評估其免疫原性和保護活性。由于編碼蛋白質NMA0939的基因的高度保守性，因而包含這種蛋白質的組合物作為誘導廣泛反應性的免疫應答的抗原具有極大的價值。本發(fā)明的組合物可應用于人類醫(yī)藥學領域。文檔編號A61K39/095GK101443037SQ200680049521公開日2009年5月27日申請日期2006年12月28日優(yōu)先權日2005年12月29日發(fā)明者A·拉赫卡斯特利亞諾,D·加西亞迪亞茲,D·耶羅克羅納,G·薩蒂尼亞加西亞,R·帕龍費蒂,S·岡薩雷斯布蘭克申請人:遺傳工程與生物技術中心