專利名稱：：超聲波癌治療促進(jìn)劑和殺細(xì)胞劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種超聲波癌治療促進(jìn)劑，其用于促進(jìn)通過(guò)對(duì)患部照射超聲波進(jìn)行的超聲波癌治療，本發(fā)明還涉及一種殺細(xì)胞劑，其受到超聲波的照射，通過(guò)該照射而成為細(xì)胞毒素，能夠殺傷癌細(xì)胞等作為殺滅對(duì)象的細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，在癌治療中，為了提高治療效果和患者的QOL(生活質(zhì)量)這兩方面，提出了非侵入性并能夠有效治療患部的聲動(dòng)力化學(xué)療法。這種療法是通過(guò)超聲波的照射來(lái)進(jìn)行所投與藥劑(超聲波并用劑)的抗腫瘤活化，進(jìn)行腫瘤的治療。已知有使用富勒烯(fullerene)作為超聲波治療用并用劑的方法(例如，參照日本特開(kāi)2002-241307號(hào)報(bào)和國(guó)際公開(kāi)第2002/66061號(hào)小冊(cè)子)。此外，還已知使用色素作為超聲波治療用并用劑的方法(參照日本特開(kāi)2001-253836號(hào)公報(bào)、國(guó)際公開(kāi)第98/1131號(hào)小冊(cè)子和日本特開(kāi)2003-226654號(hào)公報(bào))。在這種方法中，通過(guò)應(yīng)用超聲波的效果來(lái)激發(fā)因光產(chǎn)生自由基物種(radicalspecies)的有機(jī)物或富勒烯，從而進(jìn)行治療。一方面，還提出了在癌治療中應(yīng)用氧化鈦的光催化活性的方案。例如，提出了氧化鈦?zhàn)鳛獒t(yī)療用具的應(yīng)用(參照日本特開(kāi)平4-357941號(hào)公報(bào))、作為給藥系統(tǒng)(DDS)的載體的應(yīng)用(參照曰本凈爭(zhēng)開(kāi)2001-200050號(hào)7>4艮和美國(guó)專利第6677606號(hào)i兌明書(shū))的方案。進(jìn)而，還提出了通過(guò)對(duì)2~3mm粒度的氧化鈦進(jìn)行35~42kHz的超聲波照射、并產(chǎn)生羥基自由基而分解有機(jī)物的技術(shù)(例如，參照日本特開(kāi)2003-26406號(hào)公報(bào))。
發(fā)明內(nèi)容這次，本發(fā)明人得到如下見(jiàn)解通過(guò)以特定頻率的超聲波照射某種半導(dǎo)體顆粒，可確保高的安全性的同時(shí)顯著提高使用超聲波的癌的治療效果。而且，本發(fā)明人還得到如下見(jiàn)解通過(guò)使用給藥系統(tǒng)，可進(jìn)一步提高癌的治療效果，其中，該給藥系統(tǒng)將上述半導(dǎo)體顆粒投與到患者體內(nèi)而到達(dá)癌細(xì)胞，其后對(duì)患部照射特定頻率的超聲波。因此，本發(fā)明的目的是提供在確保高安全性的同時(shí)可有效殺傷癌細(xì)胞等作為殺滅對(duì)象的細(xì)胞的超聲波癌治療促進(jìn)劑和殺細(xì)胞劑。而且，本發(fā)明的超聲波癌治療促進(jìn)劑含有金屬半導(dǎo)體顆粒。而且，本發(fā)明的殺細(xì)胞劑含有金屬半導(dǎo)體顆粒，受到超聲波照射，通過(guò)該照射成為細(xì)胞毒素(cytotoxin)。進(jìn)一步，本發(fā)明的癌的治療方法的特征在于，對(duì)包括人的動(dòng)物投與殺細(xì)胞劑，投與后，對(duì)癌細(xì)胞照射超聲波，通過(guò)該照射使殺細(xì)胞劑成為細(xì)胞毒素，該細(xì)胞毒素殺傷癌細(xì)胞。而且，本發(fā)明的、殺細(xì)胞劑用于制造超聲波癌治療促進(jìn)劑的用途是上述超聲波癌治療促進(jìn)劑用于如下的方法對(duì)包括人的動(dòng)物投與前述超聲波癌治療促進(jìn)劑，投與后，對(duì)癌細(xì)胞照射超聲波，通過(guò)該照射使殺細(xì)胞劑成為細(xì)胞毒素，該細(xì)胞毒素殺傷癌細(xì)月包。圖l是表示例4中對(duì)各種顆粒測(cè)定的、照射1分鐘超聲波時(shí)的細(xì)胞的殺傷率的圖。圖2是表示例5中對(duì)各種濃度的含Ti02顆粒(Ti02/PAA)的試—險(xiǎn)溶液進(jìn)4亍測(cè)定的細(xì)胞的生存率的圖。圖3是表示例6中對(duì)各種顆粒測(cè)定的、起因于超聲波照射時(shí)的超氧陰離子的產(chǎn)生的、借助還原系顯色試劑顯示的吸光度上升的圖。圖4是表示例7中對(duì)各種顆粒測(cè)定的、起因于超聲波照射時(shí)的羥基自由基的產(chǎn)生的、借助活性氧檢測(cè)用熒光試劑顯示的熒光強(qiáng)度的圖。圖5是表示例8中對(duì)各種顆粒測(cè)定的、起因于超聲波照射時(shí)的過(guò)氧化氫的產(chǎn)生的、借助TPM-PS氧化顯示的吸光度上升的圖。圖6是表示例9中對(duì)各種顆粒測(cè)定的、起因于超聲波照射時(shí)的單線態(tài)氧(Singletoxygen)的產(chǎn)生的、<昔助單線態(tài)氧4全觀'J用熒光試劑顯示的熒光強(qiáng)度的圖。圖7是表示例10中對(duì)TiO2(A)測(cè)定的、起因于超聲波照射時(shí)的超氧陰離子的產(chǎn)生的、借助還原系顯色試劑顯示的吸光度上升的圖。圖8是表示例12中對(duì)各種顆粒測(cè)定的、照射l分鐘超聲波時(shí)的細(xì)胞的生存率的圖。圖9是表示例13中對(duì)各種顆粒測(cè)定的、起因于超聲波照射時(shí)的羥基自由基的產(chǎn)生的、借助活性氧檢測(cè)用熒光試劑顯示的熒光強(qiáng)度的圖。圖IO是表示例14中對(duì)各種濃度的含Ti02顆粒的試驗(yàn)溶液進(jìn)行測(cè)定的、細(xì)胞的生存率的圖。圖11是表示例15中對(duì)各種顆粒測(cè)定的、照射l分鐘超聲波時(shí)的細(xì)胞的殺傷率的圖。圖12是表示例16中對(duì)Ti02/PAA顆粒和PBS緩沖溶液進(jìn)行測(cè)定的、照射2分鐘超聲波時(shí)(有超聲波)和無(wú)照射(無(wú)超聲波)的細(xì)胞的生存率的圖。圖13是表示例17中測(cè)定的、小鼠的相對(duì)腫瘤增殖率的隨時(shí)間變化的圖。具體實(shí)施例方式超聲波癌治療促進(jìn)劑本發(fā)明第一方案的超聲波癌治療促進(jìn)劑含有金屬半導(dǎo)體顆粒?？稍诒景l(fā)明中使用的金屬半導(dǎo)體顆粒只要是含有通過(guò)超聲波照射活化而可以殺滅或破壞癌細(xì)胞的金屬半導(dǎo)體而形成的顆粒則沒(méi)有限制，可以是各種金屬半導(dǎo)體顆粒。雖然某種金屬半導(dǎo)體顆粒通過(guò)超聲波照射活化而殺滅或破壞細(xì)胞的全部機(jī)理不明確，但只要是至少通過(guò)超聲波照射可以生成自由基物種的金屬半導(dǎo)體顆粒，則可期待上述效果。超聲波產(chǎn)生自由基物種而得到。即，認(rèn)為這些半導(dǎo)體顆粒所帶來(lái)的生物性殺傷效果在于自由基物種的質(zhì)和量的增加。其理由,皮推測(cè)如下，但如下理由終歸為假設(shè)，本發(fā)明并不限于下述任何說(shuō)明。即，僅通過(guò)超聲波照射則在體系中產(chǎn)生過(guò)氣化氫和羥基自由基，但是根據(jù)本發(fā)明人的見(jiàn)解，在氧化鈦等半導(dǎo)體顆粒的存在下，過(guò)氧化氫和羥基自由基的生成得到促進(jìn)。而且，在這些半導(dǎo)體顆粒的存在下，特別是氧化鈦的存在下，看到超氧陰離子和單線態(tài)氧的生成得到促進(jìn)。這些自由基物種的特異性的生成是在使用納米級(jí)的微粒的情況下照射超聲波時(shí)觀察到的現(xiàn)象。認(rèn)為這種效果是在金屬半導(dǎo)體微粒存在下超聲波產(chǎn)生的特異的現(xiàn)象。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，優(yōu)選使用具有光感應(yīng)特性的金屬半導(dǎo)體顆粒作為金屬半導(dǎo)體顆粒，更優(yōu)選為具有光催化活性的金屬半導(dǎo)體顆粒和由于量子效應(yīng)顯示發(fā)光的量子點(diǎn)。此處，具有光催化活性的金屬半導(dǎo)體顆粒是指受到光能引起電荷分離的金屬半導(dǎo)體的顆粒。此外，量子點(diǎn)是指具有如下特征的結(jié)構(gòu)由于電子載流子的能量分布是離散的，因此在存在室溫等熱激發(fā)這樣的狀態(tài)下也在量子能級(jí)(quantumlevel)間不連續(xù)地發(fā)生載流子的遷移，結(jié)果顯示出尖銳的發(fā)光。使用這種顆粒，可以通過(guò)超聲波的照射充分地活化而殺滅細(xì)胞。作為這種金屬半導(dǎo)體顆粒的具體例子，可以列舉Ti02、ZnO、W03、Sn02、Fe203、ln203、BaTi03、Ti03、SrTi03、Nb205、丁&205等金屬氧化物；CdS、MoS2、ZnS等金屬硫化物；和SiC、CdSe、InGaP等復(fù)合金屬半導(dǎo)體。這些金屬半導(dǎo)體顆粒具有光感應(yīng)特性，但是由于不是富勒烯或色素等光敏化劑，因此在對(duì)患者投與后的治療階段中不會(huì)產(chǎn)生光過(guò)敏癥的問(wèn)題，安全性非常高。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，作為金屬半導(dǎo)體顆粒可以使用具有光催化活性的金屬半導(dǎo)體顆粒，作為優(yōu)選例可以歹'j舉Ti02、ZnO、Sn02、W03、ln203、SrTi03、Nb205、Ta205,更優(yōu)選1102。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，作為金屬半導(dǎo)體顆?？梢允褂昧孔狱c(diǎn)，作為優(yōu)選例可以列舉CdSe、CdS、CdTe、ZnS、ZnSe、InGaP、ZnTe及其混合物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，金屬半導(dǎo)體顆粒優(yōu)選具有50200nm的粒徑，更優(yōu)選50150nm。在此粒徑范圍內(nèi)的話，以到達(dá)胂瘤為目的而投與到患者體內(nèi)時(shí)，能夠如同給藥系統(tǒng)一樣，由于EPR效應(yīng)而有效地到達(dá)癌組織并蓄積。因此，通過(guò)超聲波的照射可以高效率地殺滅或石皮壞癌組織。根據(jù)本發(fā)明其它的優(yōu)選實(shí)施方式，在金屬半導(dǎo)體顆粒具有不足50nm(例如數(shù)nm)的粒徑的情況下，還可將金屬半導(dǎo)體顆粒之間以多官能連接子(linker)連接，加大表觀上的尺寸，得到EPR效應(yīng)。這種實(shí)施方式特別是在使用量子點(diǎn)作為金屬半導(dǎo)體顆粒的情況下有效。即，雖然量子點(diǎn)一l殳具有2nm10nm的粒徑，但通過(guò)使多個(gè)量子點(diǎn)聚集或結(jié)合成具有50150nm的粒徑的二次顆粒的形態(tài)，乂人而由于EPR效應(yīng)可實(shí)現(xiàn)高的癌治療效果。根據(jù)本發(fā)明其它的優(yōu)選實(shí)施方式，為了利用EPR效應(yīng)，還可以將金屬半導(dǎo)體顆粒包封入脂質(zhì)體這樣的藥劑封入體中。此外，如果對(duì)這樣得到的復(fù)合顆粒進(jìn)一步賦予抗體等生物芯片，還可能產(chǎn)生超出EPR效應(yīng)的對(duì)腫瘤的靶向?？捎糜诒景l(fā)明的金屬半導(dǎo)體顆粒不僅是單一種類的金屬半導(dǎo)體顆粒，還包括多種金屬半導(dǎo)體顆粒的混合物或復(fù)合物。作為具體的例子可以列舉氧化鈦納米顆粒與氧化鐵納米顆粒的復(fù)合物、氧化鈦納米粒與賴的復(fù)合物、以及二氧化硅包覆氧化鈦等。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，優(yōu)選在金屬半導(dǎo)體顆粒的表面結(jié)合聚合物或源自生物體的高分子而形成。由此，即使在使用原本是固體中性這樣的半導(dǎo)體的情況下，也可以實(shí)現(xiàn)以半導(dǎo)體顆粒為主要成分的超聲波癌治療促進(jìn)劑的分散化，在生物體環(huán)境中能夠安全地給藥。這里，作為與金屬半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合的聚合物，只要是親水性高分子即可。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，作為與金屬半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合的聚合物，優(yōu)選使用具有羧基的聚合物，例如，羧曱基淀粉、羧甲基葡聚糖、羧曱基纖維素、聚羧酸類和具有羧基單元的共聚物(copolymer),從親水性高分子的水解性和溶解度的觀點(diǎn)出發(fā)，更優(yōu)選聚丙烯酸、聚馬來(lái)酸等聚羧酸類、以及丙烯酸/馬來(lái)酸或丙烯酸/,黃酸系單體的共聚物(copolymer),更進(jìn)一步優(yōu)選聚丙烯酸。當(dāng)具有羧基的聚合物與金屬半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合，顆粒就帶負(fù)電荷，因而高度分散且容易使生物體分子或藥劑固定化，從而適用于通過(guò)點(diǎn)滴等進(jìn)行全身給藥。因此，表面結(jié)合了聚丙烯酸的金屬半導(dǎo)體顆粒適于臟器內(nèi)部的癌的治療，在將與特定細(xì)胞的親和力高的(生物體)分子或藥劑固定化的情況下，作為親和力更高的金屬半導(dǎo)體顆粒，特別適用于對(duì)患部的靶向療法。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，作為與金屬半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合的聚合物，優(yōu)選使用陽(yáng)離子性聚合物，例如重均分子量在1000-IOOOOO范圍的胺，更優(yōu)選聚氨基酸、多肽、聚胺類和具有胺單元的共聚物(copolymer),從水溶性高分子的水解性和溶解度的觀點(diǎn)出發(fā)，進(jìn)一步優(yōu)選聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚烯丙基胺等聚胺類；最優(yōu)選聚乙烯亞胺。當(dāng)陽(yáng)離子性聚合物與金屬半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合，顆粒就帶正電荷，因而高度分散并容易迅速吸附進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，適用于通過(guò)注射或涂抹進(jìn)行的局部給藥。因此，表面結(jié)合了聚乙烯亞胺的金屬半導(dǎo)體顆粒特別適于皮膚癌或早期癌等表層的癌的治療。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，作為與金屬半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合的聚合物，優(yōu)選使用非離子性聚合物，例如聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、葡聚糖或它們的共聚物，更優(yōu)選聚乙二醇。當(dāng)非離子性聚合物與金屬半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合，顆粒不帶電就可通過(guò)水合分散，因而在體內(nèi)(血中)長(zhǎng)期穩(wěn)定，容易在癌組織蓄積，也適用于全身給藥。因此，用聚乙二醇包覆的金屬半導(dǎo)體顆粒特別適于從表層到深層的廣范圍的癌的治療。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，優(yōu)選金屬半導(dǎo)體顆粒分散在溶劑中而形成。由此，可以通過(guò)點(diǎn)滴、注射、涂:沐等各種方法有效地對(duì)患者體內(nèi)投與金屬半導(dǎo)體顆粒。此外，從安全性的觀點(diǎn)出發(fā)，分散液優(yōu)選具有中性的液體性質(zhì)，更優(yōu)選為生理鹽水。殺細(xì)力包劑根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施方式，提供殺細(xì)胞劑，其含有金屬半導(dǎo)體顆粒，受到超聲波照射，通過(guò)該照射成為細(xì)胞毒素。通過(guò)將該殺細(xì)胞劑投與到體內(nèi)，受到超聲波照射，通過(guò)該照射成為細(xì)胞毒素，乂人而可以破壞或殺滅細(xì)胞，^f旦是不限于體內(nèi)，在試管中也能破壞或殺滅作為殺滅對(duì)象的細(xì)胞。該實(shí)施方式中，殺滅對(duì)象沒(méi)有特別的限定，但優(yōu)選為癌細(xì)胞。在本實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素優(yōu)選由上述半導(dǎo)體顆粒通過(guò)超聲波照射產(chǎn)生的自由基物種所產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明中的殺細(xì)胞劑包含選自1102、Sn02、ZnO和CdSe所組成的組中的至少一種半導(dǎo)體顆粒，優(yōu)選為T(mén)i02。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，這些半導(dǎo)體顆粒受到400kHz~20MHz的超聲波照射，通過(guò)該照射能夠成為細(xì)胞毒素。這種殺細(xì)胞劑被投與到體內(nèi)，受到超聲波照射，通過(guò)該照射成為細(xì)胞毒素，從而可以殺傷細(xì)胞，^旦是不限于體內(nèi)，也能在試管中殺傷作為殺滅對(duì)象的細(xì)胞。本發(fā)明中，殺滅對(duì)象沒(méi)有特別的限定，優(yōu)選為癌細(xì)胞。即，根據(jù)本發(fā)明中的殺細(xì)胞劑，可通過(guò)照射超聲波活化而殺傷癌細(xì)胞。此外，這些半導(dǎo)體顆粒由于不是富勒烯或色素等光敏化劑，因而在對(duì)患者投與后的治療階段中不會(huì)產(chǎn)生光過(guò)敏癥的問(wèn)題，安全性非常高。這些半導(dǎo)體顆粒通過(guò)照射超聲波活化而殺傷細(xì)胞的效果，可以由通過(guò)超聲波照射產(chǎn)生自由基物種而得到。即，認(rèn)為這些半導(dǎo)體顆粒所帶來(lái)的生物性殺傷效果在于自由基物種的質(zhì)和量的增加。其理由^C推測(cè)如下，^旦如下理由鄉(xiāng)冬歸為Wi設(shè)，本發(fā)明并不限于下述任《可說(shuō)明。即，僅通過(guò)超聲波照射則在體系中產(chǎn)生過(guò)氧化氫和羥基自由基，但是根據(jù)本發(fā)明人的見(jiàn)解，在氧化鈦等半導(dǎo)體顆粒的存在下，過(guò)氧化氫和羥基自由基的生成得到促進(jìn)。而且，在這些半導(dǎo)體顆粒的存在下，特別是氧化鈦的存在下，看到超氧陰離子和單線態(tài)氧的生成得到促進(jìn)。這些自由聲波時(shí)的頻率在400kHz~20MHz的范圍、優(yōu)選在600kHz~10MHz的范圍、更優(yōu)選在lMHz~10MHz的范圍顯著觀察到的現(xiàn)象。認(rèn)為這種效果是在金屬半導(dǎo)體微粒存在下超聲波產(chǎn)生的特異的現(xiàn)象。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，半導(dǎo)體顆沖立具有20200nm的沖立4圣，更^尤選50~200nm的并立^圣，進(jìn)一步4尤選50~150nm的4立徑。在此粒徑范圍內(nèi)的話，以到達(dá)腫瘤為目的而投與到患者體內(nèi)時(shí)，能夠如同給藥系統(tǒng)一樣，由于EPR效應(yīng)而有效地到達(dá)癌組織并蓄積。而且，如上所述，通過(guò)400kHz20MHz的超聲波照射而引起自由基物種的特異性生成。因此，通過(guò)照射超聲波可以高效率地殺傷癌組織。根據(jù)本發(fā)明其它的優(yōu)選實(shí)施方式，在半導(dǎo)體顆粒具有不足50nm(例如數(shù)nm)的粒徑的情況下，還可加大表觀上的尺寸而得到EPR效應(yīng)。即，將半導(dǎo)體顆粒之間通過(guò)以多官能連接子連接等方法結(jié)合成具有粒徑為50-150nm的二次顆粒的形態(tài)，從而由于EPR效應(yīng)而實(shí)現(xiàn)高的癌治療效果。才艮據(jù)本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施方式，為了利用EPR效應(yīng)，還可以將半導(dǎo)體顆粒包封入如脂質(zhì)體這樣的藥劑封入體中。本發(fā)明中的半導(dǎo)體顆粒的粒徑能夠通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定。具體而言，可;f尋到^f吏用粒徑分布測(cè)定裝置(ZetasizerNano,malverninstruments公司制造)、用累積量分析得到的Z-averagesize所表示的值。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，如果進(jìn)一步對(duì)半導(dǎo)體顆粒賦予抗體等生物芯片，則還可能產(chǎn)生超出EPR效應(yīng)的對(duì)胂瘤的覃巴向?？捎糜诒景l(fā)明的半導(dǎo)體顆粒不僅是單一種類的半導(dǎo)體顆粒，還包括多種半導(dǎo)體顆粒的混合物或復(fù)合物。作為具體的例子可以列舉氧化鈦納米顆粒與氧化鐵納米顆粒的復(fù)合物、氧化鈦納米顆粒與鉑的復(fù)合物、以及二氧化硅包覆氧化鈦等。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，優(yōu)選在半導(dǎo)體顆粒的表面結(jié)合聚合物和/或源自生物體的高分子而形成。由此，即使在使用原本是固體中性這樣的半導(dǎo)體的情況下，也可以實(shí)現(xiàn)以半導(dǎo)體顆粒為主要成分的殺細(xì)胞劑的分散化，在生物體環(huán)境中能夠安全地給藥。這里，作為與半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合的聚合物，為親水性高分子即可。從確保血中滯留性的觀點(diǎn)出發(fā)，作為半導(dǎo)體顆粒與聚合物和/或源自生物體的高分子的結(jié)合形式，只要是投與到體內(nèi)后24~72小時(shí)后能確保分散性的程度的結(jié)合形式，則不做特別限定，但是基于在生理?xiàng)l件下的分散穩(wěn)定性優(yōu)異而且超聲波照射后也沒(méi)有聚合物的游離且對(duì)正常細(xì)胞的傷害少的特點(diǎn)，希望是共價(jià)結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，作為與半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合的聚合物，優(yōu)選使用陰離子性聚合物，例如羧曱基淀粉、羧曱基葡聚糖、羧甲基纖維素、聚羧酸類和具有羧基單元的共聚物(copolymer)等具有羧基的聚合物，從親水性高分子的水解性和溶解度的觀點(diǎn)出發(fā)，更優(yōu)選聚丙烯酸、聚馬來(lái)酸等聚羧酸類以及丙烯酸/馬來(lái)酸或丙烯酸/磺酸系單體的共聚物(copolymer),更進(jìn)一步優(yōu)選聚丙烯酸。當(dāng)陰離子性聚合物與半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合，顆粒就帶負(fù)電荷，因而高度分散且通過(guò)該聚合物的官能團(tuán)使生物分子或藥劑固定化，從而適用于通過(guò)點(diǎn)滴等進(jìn)行全身給藥。因此，表面結(jié)合了聚丙烯酸的半導(dǎo)體顆粒適于臟器內(nèi)部的癌的治療，在將與特定細(xì)胞的親和力高的(生物體)分子或藥劑固定化的情況下，作為親和力更高的半導(dǎo)體顆粒，特別適用于對(duì)患部的靶向療法。固定了陰離子性聚合物的半導(dǎo)體顆粒復(fù)合體的優(yōu)選；電位是_50~-20mV。在此范圍內(nèi)時(shí)，由于易于通過(guò)負(fù)電荷的排斥而確保顆粒的分散性，不易形成聚集塊，因而不必?fù)?dān)心給藥后會(huì)導(dǎo)致血管堵塞等二次危害。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，作為與半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合的聚合物，優(yōu)選使用陽(yáng)離子性聚合物，例如重均分子量在1000~IOOOOO范圍的胺，更優(yōu)選聚氨基酸、多肽、聚胺類和具有胺單元的共聚物(copolymer),從水溶性高分子的水解性和溶解度的觀點(diǎn)出發(fā)，進(jìn)一步優(yōu)選聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚烯丙基胺等聚胺類，最優(yōu)選聚乙烯亞胺。當(dāng)陽(yáng)離子性聚合物與半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合，顆粒就帶正電荷，因而高度分散并容易迅速吸附進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，適用于通過(guò)注射或涂抹進(jìn)行的局部給藥。因此，表面結(jié)合了聚乙蜂亞胺的半導(dǎo)體顆粒特別適于皮膚癌或早期癌等表層的癌的治療。固定了陽(yáng)離子性聚合物的半導(dǎo)體顆粒復(fù)合體的優(yōu)選的；電位是+20~+50mV。在此范圍內(nèi)時(shí)，由于易于通過(guò)負(fù)電荷的排斥來(lái)確保顆粒的分散性，能夠適用于局部給藥。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，作為與半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合的聚合物，優(yōu)選使用非離子性的具有親水性基團(tuán)(羥基和/或聚氧化亞烷基)的聚合物，例如聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、葡聚糖或它們的共聚物，更優(yōu)選聚乙二醇。當(dāng)非離子性聚合物與半導(dǎo)體顆粒表面結(jié)合，顆粒不帶電就可通過(guò)水合分散，因而在體內(nèi)(血中)長(zhǎng)期穩(wěn)定，容易在癌組織蓄積，也適用于全身給藥。因此，用聚乙二醇包覆的半導(dǎo)體顆粒特別適于從表層到深層的廣范圍的癌的治療。固定了非離子性的具有親水性基團(tuán)的聚合物的半導(dǎo)體顆粒復(fù)合體的優(yōu)選的；電位是-20~+20mV。在此范圍內(nèi)的話，由于變得血中蛋白質(zhì)不易靜電吸附，因而易于避免吸收進(jìn)入細(xì)網(wǎng)狀內(nèi)皮組織、腎排泄、吸收入肝臟等，能夠確?？勺阋缘竭_(dá)目標(biāo)部位(腫瘤)的血中滯留性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，優(yōu)選由半導(dǎo)體顆粒分散在溶劑中而形成。由此，能夠通過(guò)點(diǎn)滴、注射、涂抹等各種方法將半導(dǎo)體顆粒有效地投與到患者體內(nèi)。另外，從安全性的觀點(diǎn)出發(fā)，分散液優(yōu)選具有中性的液體性質(zhì)，更優(yōu)選生理鹽水。半導(dǎo)體顆粒相對(duì)于分散體優(yōu)選含有0.001~1質(zhì)量％以下，更優(yōu)選含有O.OOl~0.1質(zhì)量％。在此范圍內(nèi)的話，投與后，能夠在24~72小時(shí)后有效地使顆粒蓄積在患部(腫瘤)。即，易于在患部(胂瘤)蓄積顆粒濃度，而且還能夠確保血中的顆粒的分散性，不易形成聚集塊，不必?fù)?dān)心給藥后會(huì)導(dǎo)致血管堵塞等二次危害。治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的超聲波癌治療促進(jìn)劑和殺細(xì)胞劑能夠通過(guò)點(diǎn)滴、注射、涂抹等各種方法投與到患者體內(nèi)。從利用顆粒大小帶來(lái)的EPR效應(yīng)和血中滯留性而通過(guò)所謂的DDS性治療來(lái)減輕患者負(fù)擔(dān)的觀點(diǎn)出發(fā)，特別優(yōu)選能夠使用通過(guò)靜脈或皮下的給藥路徑。而且，被投與到體內(nèi)的促進(jìn)劑或殺細(xì)胞劑，如同給藥系統(tǒng)那樣，能夠到達(dá)癌組織并蓄積。然后，對(duì)蓄積有促進(jìn)劑或殺細(xì)胞劑的癌組織進(jìn)4亍超聲波處理。從殺傷細(xì)月包的效果和安全性的觀點(diǎn)出發(fā)，所使用的超聲波的頻率優(yōu)選20kHz20MHz，更優(yōu)選400kHz~20MHz,進(jìn)一步優(yōu)選600kHz~1OMHz,最優(yōu)選1MHz~1OMHz。超聲波的照射時(shí)間應(yīng)該考慮作為治療對(duì)象的癌組織的位置和大小來(lái)酌情決定，沒(méi)有特別的限定。由此，能夠通過(guò)超聲波高效地殺傷患者的癌組織，實(shí)現(xiàn)高的癌治療效果。超聲波能夠從外部到達(dá)生物體內(nèi)的深部，通過(guò)將本發(fā)明的促進(jìn)劑或殺細(xì)胞劑組合使用，能夠在非侵入的狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)對(duì)存在于生物體內(nèi)深部的患部或靶部位的治療。而且，通過(guò)本發(fā)明的促進(jìn)劑或殺細(xì)胞劑在患部或靶部位的蓄積，能夠通過(guò)不對(duì)周邊的正常細(xì)胞產(chǎn)生惡性影響的程度的微弱的超聲波，只對(duì)本發(fā)明的促進(jìn)劑或殺細(xì)胞劑蓄積的局部產(chǎn)生作用。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，雖然作為金屬半導(dǎo)體顆粒更優(yōu)選Ti02,但是也提出了在癌治療中利用該金屬半導(dǎo)體顆粒的光催化活性的方案。此時(shí)，可以通過(guò)使用紫外線的照射來(lái)對(duì)患部或靶部位進(jìn)行治療，該照射到達(dá)的深度是距生物體表層部2mm。另一方面，通過(guò)使用超聲波的照射進(jìn)行生物體內(nèi)的診斷等時(shí)，在距離生物體表層部2mm以上的內(nèi)部也可以進(jìn)行。因此，通過(guò)使用超聲波能夠從外部到達(dá)生物體內(nèi)部的更深部位，通過(guò)與本發(fā)明的促進(jìn)劑組合使用，能夠在非侵入的狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)對(duì)存在于生物體內(nèi)深部這樣的患部或輩巴部位的治療。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，作為優(yōu)選的適用部位，可以考慮難以實(shí)施切除手術(shù)的臟器，具體而言可以列舉脾腺癌、膀胱癌、腦腫瘤。對(duì)超《波照射部并沒(méi)有特別的限定，沖艮據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，為了得到更好的效果，可將超聲波照射部設(shè)置于內(nèi)窺鏡或?qū)Ч艿萬(wàn)巨夠到達(dá)患部或靶部位的器具并直接照射。此外，對(duì)于難以實(shí)施切除手術(shù)的臟器，或者從患者的QOL的觀點(diǎn)出發(fā)可以從體外以非侵入的狀態(tài)照射。具體而言，對(duì)于消化器官的表層癌，可從腹部進(jìn)行超聲波照射，使超聲波到達(dá)患部，殺傷癌組織。實(shí)施例例l:聚丙烯酸結(jié)合型氧化鈦(TiOVPAA)顆粒的制造混合3.6g四異丙氧基鈦和3.6g異丙醇，在冰冷卻下滴加到60ml超純水中，進(jìn)行水解。滴加后，在室溫?cái)嚢?0分鐘。攪拌后，滴加lmll2N硝酸，在80。C攪拌8小時(shí)，膠溶。膠溶結(jié)束后，使用0.45jim的過(guò)濾器過(guò)濾，使用脫鹽柱(PD-IO,AmerstiamPharmaciaBioscience公司制)進(jìn)行溶液交換而制得固體成分為1%的銳鈦礦型氧化鈦溶膠。將此分散液裝入容量100m1的小瓶中，用200kHz的超聲波處理30分鐘。進(jìn)行超聲波處理前后的平均分散粒徑分別是36.4nm、20.2nm。超聲波處理后，濃縮溶液，調(diào)制成固體成分為20%的氧化鈦溶膠(銳鈦礦型)。將0.75ml得到的氧化鈦溶膠分散于20ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，加入10ml溶解了0.2g聚丙烯酸(平均分子量5000,和光純藥)的DMF后，攪拌混合。將溶液移入水熱反應(yīng)容器中，150。C下反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至反應(yīng)容器溫度為50。C以下，取出溶液后，加入80ml水，攪拌混合。使用蒸發(fā)器除去DMF和水后，再次添加20ml水，制成聚丙烯酸修飾氧化鈥水溶液。添加lml2N鹽酸，沉淀氧化^;顆粒，離心后除去上清液/人而分離未反應(yīng)的聚丙烯酸。再次加入水進(jìn)行洗滌，離心后除去水。加入10ml50mM石岸酸緩沖液(pH7.0)后，用200kHz的超聲波處理30分鐘，分散氧化鈦顆粒。超聲波處理后，使用0.45pm的過(guò)濾器過(guò)濾，制得固體成分為1.5%的聚丙烯酸修飾氧化鈦溶膠。使用ZetasizerNanoZS(sysmex公司制)測(cè)定制得的聚丙烯酸修飾氧化鈦微粒(銳鈦礦型)的分散粒徑，用累積量法分析得出平均分散粒徑為45.5nm。該測(cè)定如下進(jìn)行向；電位測(cè)定池中加入含有聚乙烯亞胺結(jié)合氧化鈦微粒的分散液0.75ml，將溶劑的各種參數(shù)設(shè)置為與水的值相同，在25T通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法進(jìn)行測(cè)定。例2:聚乙烯亞胺結(jié)合型氧化鈦(TiCb/PEI)顆粒的制造混合3.6g四異丙氧基鈦和3.6g異丙醇，在水冷卻下滴加到60ml超純水中，進(jìn)行氷解。滴加后，在室溫?fù)璋?0分鐘。攪拌后，滴力口lmll2N硝酸，在80。C攪拌8小時(shí)，膠溶。膠溶結(jié)束后，使用0.45jLim的過(guò)濾器過(guò)濾，進(jìn)而使用脫鹽柱(PD-10,AmershamPharmaciaBioscience公司制)進(jìn)行溶液交換而制得固體成分為1%的酸性氧化鈦溶膠。將此分散液裝入容量100ml的小瓶中，用200kHz的超聲波處理30分鐘。進(jìn)行超聲波處理前后的平均分散粒徑分別是36.4nm、20.2nm。超聲波處理后，濃縮溶液，調(diào)制成固體成分為20%的氧化鈥:容膠。將0.75ml所得到的氧化鈦溶膠分散于20ml的二曱基甲酰胺(DMF)中，加入10ml溶解了450mg聚乙烯亞胺(平均分子量10000，和光純藥7>司制)的DMF后，攪4半混合。將溶液移入水熱反應(yīng)容器(HU-50,三愛(ài)科學(xué)公司制)中，150。C下反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至反應(yīng)容器溫度為50。C以下，加入兩倍量的異丙醇，-使聚乙烯亞胺結(jié)合氧化鈦;隊(duì)粒沉淀，離心后除去上清液從而分離未反應(yīng)的聚乙烯亞胺。加入70%的乙醇進(jìn)行洗滌，離心后除去乙醇。加入10ml蒸餾水后，用200kHz的超聲波處理30分鐘，分散聚乙烯亞胺結(jié)合氧化鈦微粒。超聲波處理后，使用0.45(im的過(guò)濾器過(guò)濾，制得固體成分為1.5%的聚乙烯亞胺結(jié)合氧化鈥樣吏粒的分散液。使用ZetasizerNanoZS(sysmex公司制)測(cè)定制得的聚乙烯亞胺結(jié)合氧化鈦微粒的分散粒徑，聚乙烯亞胺結(jié)合氧化鈦微粒的平均粒徑為67.7nm。該測(cè)定如下進(jìn)行向；電位測(cè)定池中加入含有聚乙烯亞胺結(jié)合氧化鈦微粒的分散液0.75ml，將溶劑的各種參數(shù)設(shè)置為與水的值相同，在25°C通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法進(jìn)行測(cè)定。例3:聚乙二醇結(jié)合型氧化鈦(TiO一PEG)顆粒的制造混合3.6g四異丙氧基鈦和3.6g異丙醇，在水冷卻下滴加到60ml超純水中，進(jìn)行水解。滴加后，在室溫?cái)嚢?0分鐘。攪拌后，滴力口lmll2N硝酸，在80。C攪拌8小時(shí)，膠溶。膠溶結(jié)束后，使用0.45pm的過(guò)濾器過(guò)濾，進(jìn)而使用脫鹽柱(PD-10,AmershamPharmaciaBioscience公司制)進(jìn)行溶液交換而制得固體成分為1%的酸性氧化鈦溶膠。將該酸性氧化鈦溶膠裝入容量100ml的小瓶中，使用超聲波發(fā)生器MIDSONIC200(KAIJO公司制)用200kHz的超聲波處理30分鐘。用12N的硝酸稀釋1000倍后，使用ZetasizerNanoZS(sysmex^^司制)，向石英測(cè)定池中加入分散液O.lml,將溶劑的各種參數(shù)設(shè)置為與水的值相同，在25。C通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定超聲波處理后的平均分散粒徑。其結(jié)果是分散粒徑為20.2nm。使用蒸發(fā)皿將該氧化4太溶膠在50°C下進(jìn)行溶液的濃縮，最終調(diào)制為固體成分為20%的酸性氧化鈦溶膠。接下來(lái)，在聚氧乙烯-單烯丙基-單曱醚與馬來(lái)酸酐的共聚體(平均分子量33659,日本油脂制)lg中加入5ml水，水解后進(jìn)行冷凍干燥。反應(yīng)結(jié)束后，溶解于5ml的二曱基曱酰胺(DMF)溶液中并調(diào)制200mg/ml聚乙二醇溶液。將1.875ml得到的聚乙二醇溶液分散于27.725ml的DMF溶液中，加入事先制成的銳鈦礦型氧化鈦溶膠0.9ml，攪拌混合。將溶液移入水熱反應(yīng)容器HU-50(三愛(ài)科學(xué)公司制)中，150。C下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至反應(yīng)容器溫度為50。C以下，使用蒸發(fā)器除去DMF后，加入10ml蒸餾水制得聚乙二醇結(jié)合氧化《太水溶液。進(jìn)一步，以下述條件上HPLC,證實(shí)不保留餾分有UV吸收峰，回收此餾分。HPLC:AKTApurifier,AmershamPharmaciaBiosciences^司制色謙柱HiPrep16/60SephacrylS-300HR,AmershamPharmaciaBioscience公司制流動(dòng)相石舞酸鹽緩沖液(pH7.4)流速0.3ml/min用蒸餾水將此分散液稀釋為0.01%水溶液，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定分散粒徑和；電位，分散粒徑為45.4nm,;電位為l,lmV。該測(cè)定如下進(jìn)4亍4吏用ZetasizerNanoZS，向；電4立測(cè)定池中加入聚乙二醇結(jié)合氧化鈦水溶液0.75ml，將溶劑的各種參數(shù)設(shè)置為與水的值相同，在25。C進(jìn)行測(cè)定。例4:通過(guò)超聲波照射的細(xì)胞殺傷試驗(yàn)首先，準(zhǔn)備以下半導(dǎo)體顆粒。Ti02/TAA顆粒(于例1中制備的顆粒)Sn02顆粒(C丄化成制，SNW15WT%-G02,中性分散體，分散粒徑39nm)ZnO顆粒(C丄化成制，ZnMS15WT%-G01，中性分散體，分散粒徑67nm)CdSe顆4立(QuantumDot/〉司制，Qdot655ProteinA標(biāo)i己，中性分散體，分散粒徑8nm)這里，通過(guò)例1所示的動(dòng)態(tài)光散射法得到上述各種顆粒的分散粒徑。接下來(lái)，將上述半導(dǎo)體顆粒分散于PBS緩沖溶液(pH6.8)中，在含有l(wèi)xl04cells/ml的Jurkat細(xì)胞的力口入10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中，以1/10的量添加此溶液，調(diào)制成終濃度為0.05%的試驗(yàn)溶液。此外，作為比較例，準(zhǔn)備以下的不是金屬半導(dǎo)體的顆粒，同上述方法調(diào)制試驗(yàn)溶液。Si02顆粒(C丄化成制，SiMS10WT%-G360,中性分散體，分散粒徑105nm)Au顆粒(ICNBiomedicals,Inc制，ProteinA20證，Goldconjugate,中性分散體，分散粒徑40nm)此處，通過(guò)例1所示的動(dòng)態(tài)光散射法得到上述各種顆粒的分散粒徑。通過(guò)超聲波照射裝置(OG技研公司制，ULTRASONICAPPARATUSES－2:lMHz)，以0.5W/cm2、50%dutycycle運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)上述得到的各試驗(yàn)溶液照射1分鐘超聲波，進(jìn)行細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)。其結(jié)果如圖l所示。如圖l所示，所有添加了半導(dǎo)體顆粒的溶液的細(xì)胞生存率都低，即殺傷率高，因而證實(shí)了能夠通過(guò)超聲波照射殺傷細(xì)胞。另一方面，這種殺傷效果沒(méi)有在作為比較例使用的Si02顆?；駻u顆粒上得到證實(shí)。例5:半導(dǎo)體顆粒濃度的依賴性使用例l中制得的Ti02顆粒(Ti02/PAA)作為半導(dǎo)體顆粒，通過(guò)超聲波照射進(jìn)行細(xì)胞殺傷濃度依賴性試驗(yàn)。于PBS緩沖液(pH6.8)中調(diào)制氧化鈥顆粒，在含有l(wèi)xl04cells/mH々Jurkat細(xì)胞的加入10。/。血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中，以1/10的量添加，調(diào)制成終濃度為0.001%、0.01%、0.05°/。和0.1%的試驗(yàn)溶液。通過(guò)超聲波裝置(OG技研公司制，ULTRASONICAPPARATUSES-2:lMHz),以0.5W/cm2、50%dutycycle運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)此試驗(yàn)溶液照射l分鐘超聲波，進(jìn)行細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)，研究半導(dǎo)體顆粒濃度的依賴性。其結(jié)果如圖2所示。證實(shí)了在所有添加了氧化鈦顆粒的溶液濃度中，細(xì)胞生存率都降低。特別是在終濃度0.05%溶液中細(xì)胞的生存率降低，由此可知細(xì)胞殺傷效果高的終濃度是0.05%。例6:超聲波照射時(shí)的超氧陰離子生成能力的評(píng)價(jià)首先，準(zhǔn)備以下半導(dǎo)體顆粒。Ti02顆粒(A)(石原產(chǎn)業(yè)制，銳鈦礦型氧化鈦，STS-240,中性分散體，分散粒徑52nm)Sn02顆粒(C丄化成制，SNW15WT%-G02，中性分散體，分散粒徑39nm)ZnO顆粒(C.I.化成制，ZnMS15WT%-G01,中性分散體，分散粒徑67nm)接下來(lái)，將上述半導(dǎo)體顆粒分散在PBS緩沖液(pH6.8)中，使固體成分的終濃度為0.1%,將作為超氧陰離子發(fā)生試劑的還原系顯色試劑WST-1(同仁化學(xué)制)加入水溶液中形成0.5%的溶液，調(diào)制試-驗(yàn)二容液。此外，作為比較例，準(zhǔn)備不是金屬半導(dǎo)體的Si02顆粒(C丄化成制，SiMS10WT%-G360，中性分散體，分散粒徑105nm),同上述方法調(diào)制試驗(yàn)溶液。通過(guò)超聲波照射裝置(OG技研公司制，ULTRASONICAPPARATUSES-2:lMHz)，以0.5W/cm2、50%dutycycle運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)上述制備的各試驗(yàn)溶液照射5分鐘超聲波，通過(guò)紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的吸收。其結(jié)果如圖3所示。如圖3所示，對(duì)于作為半導(dǎo)體顆粒的所有顆粒，隨著WST-1的分解而生成黃色甲臘(formazan),從而證實(shí)了吸光度的上升。即，證實(shí)了Ti02顆粒、Sn02顆粒和ZnO顆粒通過(guò)超聲波照射生成超氧陰離子。例7:超聲波照射時(shí)的羥基自由基生成能力的評(píng)價(jià)首先，準(zhǔn)備以下半導(dǎo)體顆粒。Ti02顆粒(A)(石原產(chǎn)業(yè)制，銳鈦礦型氧化4t，STS-240,中性分散體，分散粒徑52nm)Sn02顆粒(C丄化成制，SNW15WT%-G02,中性分散體，分散粒徑39nm)ZnO顆粒(C.I.化成制，ZnMS15WT%-G01,中性分散體，分散粒徑67nm)接下來(lái)，將上述半導(dǎo)體顆粒分散在PBS緩沖液(pH6.8)中，使固體成分的終濃度為0.1%,將作為羥基自由基生成試劑的活性氧檢測(cè)用熒光試劑羥基苯基熒光素(hydroxylphenylfluorescein)(HPF，第一化學(xué)藥品制)加入到上述含有金屬氧化物顆粒的溶液中形成5pM的溶液，調(diào)制試驗(yàn)溶液。此外，作為比較例，準(zhǔn)備Si02顆粒(C.I.化成制，SiMS10WT%-G360,中性分散體，分散粒徑105nm),同上述方法調(diào)制試驗(yàn)溶液。通過(guò)超聲波照射裝置(OG技研公司制，ULTRASONICAPPARATUSES-2:lMHz),以0.5W/cm2、50%dutycycle運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)上述得到的各試驗(yàn)溶液照射5分鐘超聲波，通過(guò)熒光光度計(jì)測(cè)定Ex二490nm、Em^515nm下的波長(zhǎng)。其結(jié)果如圖4所示。如圖4所示，對(duì)于作為半導(dǎo)體顆粒的所有顆粒，HPF反應(yīng)生成熒光素，證實(shí)了熒光強(qiáng)度的上升。即，證實(shí)了Ti02顆粒、Sn02顆粒和ZnO顆粒通過(guò)超聲波照射生成輕基自由基。例8:超聲波照射時(shí)的過(guò)氧化氫生成能力的評(píng)價(jià)首先，準(zhǔn)備以下半導(dǎo)體顆粒。Ti02顆粒(A)(石原產(chǎn)業(yè)制，銳鈦礦型氧化鈦，STS-240，中性分散體，分散粒徑52nm)Sn02顆粒(C丄化成制，SNW15WT%-G02，中性分散體，分散粒徑39nm)ZnO顆粒(C丄化成制，ZnMS15WT%-G01,中性分散體，分散粒徑67nm)接下來(lái)，將上述半導(dǎo)體顆粒分散在PBS緩沖液(pH6.8)中，使固體成分的終濃度為0.1%，調(diào)制試驗(yàn)溶液。此外，作為比較例，準(zhǔn)備Si02顆粒(C丄化成制，SiMS10WT%-G360，中性分散體，分散粒徑105nm)，同上述方法調(diào)制試驗(yàn)溶液。通過(guò)超聲波照射裝置(OG技研公司制，ULTRASONICAPPARATUSES-2:lMHz)，以0.5W/cm2、50%dutycycle運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)上述得到的各試驗(yàn)溶液照射5分鐘超聲波，按照AmplexRedHydrogenPeroxide/PeroxidaseAssayKit(MolecularProbes公司制)的操作手冊(cè)，使用此試劑盒，取io(vi上述試驗(yàn)溶液進(jìn)行測(cè)定。其結(jié)果如圖5所示。如圖5所示，證實(shí)了Ti02顆?？赏ㄟ^(guò)超聲波照射更有效地生成過(guò)氧化氫。例9:超聲波照射時(shí)的單線態(tài)氧生成能力的評(píng)價(jià)首先，準(zhǔn)備以下半導(dǎo)體顆粒。Ti02顆粒(A)(石原產(chǎn)業(yè)制，銳鈦礦型氧化鈦，STS-240，中性分散體，分散粒徑52nm)Sn02顆粒(C丄化成制，SNW15WT%-G02,中性分散體，分散粒徑39nm)ZnO顆粒(C.I.化成制，ZnMS15WT%-G01,中性分散體，分散粒徑67nm)Ti02/PAA(由例l制得)Ti02/PEG(由例3制得)接下來(lái)，將上述半導(dǎo)體顆粒分散在PBS緩沖液(pH6.8)中，使固體成分的終濃度為0.05%,調(diào)制試驗(yàn)溶液。此外，作為比較例，準(zhǔn)備Si02顆粒(C丄化成制，SiMS10WT%-G360，中性分散體，分散粒徑105nm)，同上述方法調(diào)制試-驗(yàn)溶液。通過(guò)超聲波照射裝置(OG技研公司制，ULTRASONICAPPARATUSES-2:lMHz)，以0.5W/cm2、50%dutycycle運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)上述得到的各試驗(yàn)溶液照射5分鐘超聲波，按照SingletOxygenSensorGreenReagent(MolecularProbes公司)的才喿4乍手冊(cè)，使用此公司的試劑盒，取100(il上述試驗(yàn)溶液，通過(guò)熒光光度計(jì)測(cè)定起因于單線態(tài)氧的在Ex^488nm、En^525nm下的熒光強(qiáng)度。其結(jié)果如圖6所示。如圖6所示，證實(shí)了Ti02顆?？赏ㄟ^(guò)超聲波照射更有效地生成單線態(tài)氧。例10:對(duì)頻率的依賴性在2ml的微管中調(diào)制由PBS緩沖液850|il、還原系顯色試劑WST-1(同仁化學(xué)制)50(il、0.1%氧化4太顆粒100pl組成的溶液。使用Ti02顆粒(A)(石原產(chǎn)業(yè)制，銳鈦礦型氧化鈦，STS-240,中性分散體，分散粒徑52nm)作為氧化鈦顆粒。將所得的微管置于水浴中，在超聲波振子3cm的距離，使用多頻率超聲波發(fā)生裝置(MODEL4021{KAIJYO}，輸出功率200W)以同一強(qiáng)度照射超聲波。分別于照射后0、3、6分鐘取樣，每次取200fi1,同例6的測(cè)定方法，測(cè)定超氧陰離子。分別對(duì)28、50、100、200和600kHz的各照射頻率進(jìn)行測(cè)定。此外，作為對(duì)照，對(duì)未添加氧化鈦顆粒的情況進(jìn)行與上述同樣的測(cè)定。其結(jié)果如圖7所示。如圖7所示，由于鈦的存在而產(chǎn)生超氧陰離子，進(jìn)而其效果在照射頻率最高的600kHz的情況下最為顯著。例ll:顆粒的穩(wěn)定性將以下的顆粒分別分散于水、PBS緩沖液(pH7.4)和含有1()0/。血清的RPMI1640的培養(yǎng)基中，得到顆粒最終濃度為0.01%的樣品。氧化鈦(C)(將P25顆粒(日本Aerosil公司制)分散于PBS緩沖液(pH6.8)中制得，分散粒徑500nm)按照例1制得的Ti02/PAA顆粒按照例3制得的Ti02/PEG顆粒氧化鈦顆粒(A)(STS-240,石原產(chǎn)業(yè)制，中性分散體，分f夂粒徑52nm)氧化鈦顆粒(B)(TKS-203,Tayca制，凝J太礦型氧化鈥，中性分散體，分散粒徑120nm)Sn02顆粒(C丄化成制，SNW15WT%-G02,中性分散體，分散粒徑39nm)ZnO顆粒(C.I.化成制，ZnMS15WT%-G01,中性分散體，分散粒徑67nm)作為各顆粒的穩(wěn)定性的指標(biāo)，測(cè)定了各分散液中平均分散粒徑的變化。該測(cè)定如下進(jìn)行向石英測(cè)定池中加入分散液O.lml，將溶劑的各種參數(shù)設(shè)置為與水的值相同，使用ZetasizerNanoZS(sysmex7/^司制)，l小時(shí)后和24小時(shí)后在25。C通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法進(jìn)行測(cè)定。對(duì)各分散液測(cè)得的平均分散粒徑示于表1中。如表l所示，與作為中性分散體市售的氧化鈦(A)或氧化鈦(B)比較，本例制得的Ti02/PAA和Ti02/PEG的平均分散粒徑的變化少，由此可知具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>(單位應(yīng))例12:通過(guò)超聲波照射的細(xì)胞殺傷試驗(yàn)首先，將Ti02/PAA顆粒(例l中制得的，中性分散體，分散粒徑45.5nm)分散于PBS緩沖溶液(pH6.8)中，在含有1x104cells/ml的Jurkat細(xì)胞的加入10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中，以1/10的量添加該溶液，調(diào)制Ti02/PAA顆粒終濃度為0.01%和0.001%的試驗(yàn)溶液。此外，作為比4交例，準(zhǔn)備Ti02顆粒(C)(將P25顆粒(日本Aerosil公司制)分散于PBS緩沖液(pH6.8)中制得，分散粒徑500nm),同上述方法調(diào)制試驗(yàn)溶液。此處，通過(guò)例l所示的動(dòng)態(tài)光散射法得到上述各種顆粒的分散粒徑。通過(guò)超聲波照射裝置(OG技研公司制，ULTRASONICAPPARATUSES-2:1MHz),以0.5W/cm2、50%dutycycle運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)上述得到的各試驗(yàn)溶液照射1分鐘超聲波進(jìn)行細(xì)胞殺傷試驗(yàn)。其結(jié)果如圖8所示。如圖8所示，證實(shí)了所有添加了分散粒徑為45.5nm的Ti02/PAA顆粒的溶液的腫瘤細(xì)胞殺傷效果都高。另一方面，在作為比較例使用的分散粒徑500nm的TiO2顆粒(C)中該細(xì)胞殺傷效果未得到證實(shí)。例13:超聲波照射時(shí)的羥基自由基生成能力的評(píng)價(jià)首先，準(zhǔn)備以下半導(dǎo)體顆粒。Ti02顆粒(A)(石原產(chǎn)業(yè)制，銳鈥礦型氧化鈦，STS-240,中性分散體，分散粒徑52nm)Ti02顆粒(D)(石原產(chǎn)業(yè)制，銳鈥礦型氧化鈦，STS-230，中性分散體，分散粒徑15nm)Ti02顆粒(C)(將P25顆粒(日本Aerosil公司制)分散于PBS緩沖液(pH6.8)中制得，分散粒徑500nm)接下來(lái)，將上述半導(dǎo)體顆粒分散在PBS緩沖液(pH6.8)中，使固體成分的終濃度為0.05%,將作為羥基自由基生成試劑的活性氧檢測(cè)用熒光試劑羥基苯基熒光素(HPF,第一化學(xué)藥品制)加入到上述含有金屬氧化物顆粒的卩容液中形成5(iM的溶液，調(diào)制試驗(yàn)溶液。此外，作為對(duì)照，準(zhǔn)備PBS緩沖液(pH6.8),同上述方法調(diào)制試驗(yàn)溶液。通過(guò)超聲波照射裝置(OG技研公司制，ULTRASONICAPPARATUSES-2:lMHz),以0.5W/cm2、50%dutycycle運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)上述得到的各試驗(yàn)溶液照射5分鐘超聲波，通過(guò)熒光光度計(jì)測(cè)定起因于羥基自由基的在Ex^490nm、Em二515nm下的熒光強(qiáng)度。其結(jié)果如圖9所示。如圖9所示，對(duì)于分散粒徑為52nm的Ti02顆粒(A)和分散粒徑為15nm的Ti02顆粒(D),證實(shí)了生成比對(duì)照更顯著的羥基自由基。然而，在分散粒徑為500nm的TiO2顆粒(C)中，生成羥基自由基未得到證實(shí)。例14:顆粒的安全性首先，將Ti02/PAA顆粒(例1中制得的，中性分散體，分散粒徑45.5nm)、Ti02/PEI顆粒(例2中制得的，中性分散體，分散粒徑67.7nm)和Ti02/PEG顆粒(例3中制得的，中性分散體，分散粒徑45.4nm)分散于PBS緩沖溶液(pH6.8)中，得到各種分散液。在含有1x104cells/ml的Jurkat細(xì)胞的力n入10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中，以1/10的量添加這些分散液，調(diào)制成Ti02系復(fù)合顆粒的終濃度為O.l、O.Ol和0.001質(zhì)量％的試樣液。此外，作為對(duì)照試驗(yàn)，同樣僅添加PBS緩沖液調(diào)制對(duì)照試樣液。調(diào)制后，在C02孵育器中37。C培養(yǎng)24小時(shí)，使用CellTiterGroKit(BIORAD公司制)測(cè)定活細(xì)胞數(shù)。以對(duì)照試樣液的生存率作為100%與各試-驗(yàn)液比4交的結(jié)杲如圖10所示。如圖10所示，對(duì)于O.l~0.001質(zhì)量％的所有試樣液，顯示了高細(xì)胞生存率，即高安全性。例15:使用結(jié)合有聚合物的TiC^顆粒的通過(guò)超聲波照射的細(xì)胞殺傷試-驗(yàn)將Ti02/PAA顆粒(例1中制得)、Ti。2/PEI顆粒(例2中制得)和Ti02/PEG顆粒(例3中制得)分散于PBS緩沖液(pH6.8)中，在含有1x104cells/ml的Jurkat細(xì)胞的加入10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中，以1/10的量添加這些溶液，調(diào)制成終濃度為0.05%的試驗(yàn)溶液。通過(guò)超聲波照射裝置(OG技研公司制，ULTRASONICAPPARATUSES-2:lMHz),以0.5W/cm2、50%dutycycle運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)上述得到的各試驗(yàn)溶液照射1分鐘超聲波，進(jìn)行細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)。其結(jié)果如圖ll所示。如圖ll所示，添加了Ti02/PAA顆粒、Ti02/PEI顆粒和Ti02/PEG顆粒的任意顆粒的溶液的細(xì)胞生存率低，即殺傷率高。特別是添加了Ti02/PEG顆粒的溶液的細(xì)胞生存率極其低，因此，證實(shí)該Ti02/PEG顆?？赏ㄟ^(guò)超聲波照射殺傷細(xì)胞的效果特別高。例16:通過(guò)超聲波照射的細(xì)胞殺傷試驗(yàn)2首先，將Ti02/PAA顆粒(例l中制得的，中性分散體，分散粒徑45.5nm)分散于PBS緩沖液(pH6.8)中，在含有5x104cells/ml的Jurkat細(xì)胞的加入10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中，以1/10的量添力口該溶液，調(diào)制3mlTi02/PAA顆粒的終濃度為0.05%的試驗(yàn)溶液。此外，準(zhǔn)備PBS緩沖溶液(pH6.8)作為對(duì)照，同上法調(diào)制試驗(yàn)溶液。通過(guò)超聲波照射裝置(松下電工公司制，EH2435:5MHz)對(duì)上述得到的各試驗(yàn)溶液以最大功率連續(xù)照射2分鐘超聲波，進(jìn)行細(xì)胞的殺傷試^r。其結(jié)果如圖12所示。一夸添加PBS緩沖溶液且沒(méi)進(jìn)行超聲波照射的活細(xì)胞數(shù)量作為100%,以生存率表示。如圖12所示，證實(shí)了添加了分散粒徑為45.5nm的Ti02/PAA顆粒的溶液的腫瘤細(xì)胞殺傷效果高。例17:抗胂瘤效果試驗(yàn)用源自人膀胱癌的確立細(xì)胞抹(establishedcellline)(T-24)對(duì)棵鼠(nudemouse)(Balb/c、雄、3周齡)皮下接種并形成腫瘤，形成約0.63mm3左右的腫瘤。將例1中制得的PAA-TiO2用PBS緩沖液稀釋至0.5。/。，對(duì)腫瘤局部注射100pl。自給藥24小時(shí)后，使用超聲波照射裝置(OG技研公司制，ULTRASONICAPPARATUSES-2:lMHz;探針徑10mm),以功率1W、50%的1永沖、lMHz的超聲波照射1分鐘。在皮膚上涂抹水溶性高分子凝膠，并在其上緊密接觸探針(超聲波照射部)后進(jìn)行照射。每組小鼠數(shù)為6只，將僅投與PBS或無(wú)處理的動(dòng)物作為對(duì)照組。超聲波照射后，測(cè)定各個(gè)個(gè)體的腫瘤體積，求出以各個(gè)個(gè)體的超聲波照射施工日(0日)時(shí)的PAA-Ti02給藥前的腫瘤體積作為1時(shí)的各測(cè)定時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積(相對(duì)腫瘤增殖率)。結(jié)果示于圖13中。如圖13所示，僅在氧化鈦+超聲波照射存在時(shí)，證實(shí)了肺瘤的大幅的增殖抑制效果。權(quán)利要求1.超聲波癌治療促進(jìn)劑，其含有金屬半導(dǎo)體顆粒。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述金屬半導(dǎo)體顆粒通過(guò)超聲波照射可以生成自由基物種。3.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述金屬半導(dǎo)體顆粒具有光感應(yīng)特性。4.根據(jù)權(quán)利要求l~3任一項(xiàng)所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述金屬半導(dǎo)體顆粒具有光催化活性。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述具有光催化活性的金屬半導(dǎo)體顆粒選自Ti02、ZnO、Sn02、W03、ln203、SrTi03、>^205和了&205所組成的組。6.根據(jù)權(quán)利要求l~5任一項(xiàng)所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述金屬半導(dǎo)體顆粒是Ti02。7.根據(jù)權(quán)利要求l~6任一項(xiàng)所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述金屬半導(dǎo)體顆粒具有50~200nm的粒徑。8.根據(jù)權(quán)利要求l3任一項(xiàng)所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述金屬半導(dǎo)體顆粒是量子點(diǎn)。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述量子點(diǎn)是選自CdSe、CdS、CdTe、ZnS、ZnSe、InGaP和ZnTe所組成的組中的至少一種。10.根據(jù)權(quán)利要求16、8和9任一項(xiàng)所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述金屬半導(dǎo)體顆粒具有二次顆粒的形態(tài)，該二次顆粒的形態(tài)是通過(guò)聚集或結(jié)合形成的，并具有50~200nm的粒徑。11.根據(jù)權(quán)利要求l~10任一項(xiàng)所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述金屬半導(dǎo)體顆粒是多種金屬半導(dǎo)體顆粒的混合物或復(fù)合體。12.根據(jù)權(quán)利要求l~ll任一項(xiàng)所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，在上述金屬半導(dǎo)體顆粒的表面結(jié)合聚合物或源自生物體的高分子而形成。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述聚合物是具有羧基的聚合物。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述聚合物是陽(yáng)離子性聚合物。15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述聚合物是非離子性聚合物。16.根據(jù)權(quán)利要求l~15任一項(xiàng)所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，由上述金屬半導(dǎo)體顆粒分散在溶劑中而形成。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述分散液具有中性的液體性質(zhì)。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的超聲波癌治療促進(jìn)劑，上述分散液是生理鹽水。19.殺細(xì)胞劑，其含有金屬半導(dǎo)體顆粒，受到超聲波照射，通過(guò)該照射成為細(xì)胞毒素。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的殺細(xì)胞劑，其被投與到體內(nèi)，受到超聲波照射，通過(guò)該照射成為細(xì)胞毒素。21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的殺細(xì)胞劑，殺滅對(duì)象是癌細(xì)胞。22.根據(jù)權(quán)利要求19~21任一項(xiàng)所述的殺細(xì)胞劑，上述細(xì)胞毒素是由上述半導(dǎo)體顆粒通過(guò)超聲波照射產(chǎn)生的自由基物種所產(chǎn)生的。23.根據(jù)權(quán)利要求1922任一項(xiàng)所述的殺細(xì)胞劑，其含有具有20~200nm粒徑并選自作為上述金屬半導(dǎo)體顆粒的Ti02、Sn02、ZnO和CdSe所組成的組中的至少一種半導(dǎo)體顆粒，受到400kHz~20MHz的超聲波照射，通過(guò)該照射成為細(xì)胞毒素。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的殺細(xì)胞劑，上述半導(dǎo)體顆粒是Ti02。25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的殺細(xì)胞劑，上述半導(dǎo)體顆粒是在該顆粒表面與聚合物和/或源自生物體的高分子結(jié)合而形成的。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的殺細(xì)胞劑，上述聚合物是陰離子性聚合物。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的殺細(xì)胞劑，上述聚合物是陽(yáng)離子性聚合物。28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的殺細(xì)胞劑，上述聚合物是非離子性的具有親水性基團(tuán)的聚合物。29.根據(jù)權(quán)利要求23~28任一項(xiàng)所述的殺細(xì)胞劑，由上述半導(dǎo)體顆粒分散在溶劑中而形成。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的殺細(xì)胞劑，上述溶劑具有中性的液體性質(zhì)。31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的殺細(xì)胞劑，上述溶劑是生理鹽水。32.根據(jù)權(quán)利要求29~3H壬一項(xiàng)所述的殺細(xì)胞劑，其含有0.001~1質(zhì)量％的上述半導(dǎo)體顆粒。33.根據(jù)權(quán)利要求23~28任一項(xiàng)所述的殺細(xì)胞劑，上述半導(dǎo)體顆粒具有被冷凍干燥的粉末形態(tài)。34.根據(jù)權(quán)利要求23~33任一項(xiàng)所述的殺細(xì)胞劑，通過(guò)經(jīng)由靜脈的給藥路徑投與到體內(nèi)。35.根據(jù)權(quán)利要求23~33任一項(xiàng)所述的殺細(xì)胞劑，通過(guò)經(jīng)由皮下的給藥路徑投與到體內(nèi)。36.癌的治療方法，其特征在于，該方法為對(duì)包括人的動(dòng)物投與權(quán)利要求1935任一項(xiàng)所述的殺細(xì)胞劑，投與后，對(duì)癌細(xì)胞照射超聲波，通過(guò)該照射使殺細(xì)胞劑成為細(xì)胞毒素，該細(xì)胞毒素殺傷癌細(xì)胞。37.權(quán)利要求19~35任一項(xiàng)所述的殺細(xì)胞劑用于制造超聲波癌治療促進(jìn)劑的用途，其中，上述超聲波癌治療促進(jìn)劑被用于如下方法對(duì)包括人的動(dòng)物投與上述超聲波癌治療促進(jìn)劑，投與后，對(duì)癌細(xì);9包照射超聲波，通過(guò)該照射Y吏殺細(xì)胞劑成為細(xì)胞毒素，該細(xì)胞毒素殺傷癌細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明提供超聲波癌治療促進(jìn)劑和殺細(xì)胞劑，其確保高安全性的同時(shí)能夠顯著提高使用超聲波的癌的治療效果。該超聲波癌治療促進(jìn)劑和殺細(xì)胞劑含有金屬半導(dǎo)體顆粒，通過(guò)超聲波的照射活化而可以殺死或破壞癌細(xì)胞。文檔編號(hào)A61K47/34GK101346149SQ200680049369公開(kāi)日2009年1月14日申請(qǐng)日期2006年10月26日優(yōu)先權(quán)日2005年10月26日發(fā)明者坂西俊明,大神有美,曾根崎修司,金平幸輝申請(qǐng)人:Toto株式會(huì)社