專利名稱：：治療犬流感的疫苗和方法治療犬流感的疫苗和方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及提供用于犬流感病毒相關(guān)疾病的新型疫苗和療法。本發(fā)明公開了流感病毒抗原和將這些抗原呈遞給犬類尤其是狗的方法。其涉及減毒和殺死的病毒。本發(fā)明涉及實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的犬和馬流感疫苗和病毒。本發(fā)明還包括甲型流感，H3、N8、H3N8、H7N7病毒，其包含來自犬和馬流感病毒的至少一個(gè)基因組區(qū)段。本發(fā)明還涉及這些病毒在治療性組合物中的用途，所述治療性組合物用于保護(hù)犬類特別是狗免患流感病毒引起的疾病。
背景技術(shù)：
：從大約1956年開始，馬流感病毒就已經(jīng)被認(rèn)為是馬的主要呼吸道病原體。由馬流感病毒引起的疾病癥狀可以很嚴(yán)重，并且經(jīng)常隨后是繼發(fā)性細(xì)菌感染。已經(jīng)認(rèn)識了兩種馬流感病毒亞型即亞型-1，其原型為A/Equine/Prague/1/56(H7N7)，和亞型-2，其原型為A/Equine/Miami/1/63(H3N8)。目前，主要的病毒亞型是亞型-2，即IHN8毒林?，F(xiàn)在認(rèn)為此毒林可感染犬類，并且可以具有相當(dāng)?shù)亩玖?，在某些案例中?bào)道的犬類致死率高達(dá)36%。可能是完整的或部分的馬流感病毒種間轉(zhuǎn)移至狗中而導(dǎo)致產(chǎn)生了與急性呼吸道疾病相關(guān)的新型犬特異'性;充感病毒。參見7ya/^/z7/ssiono/*f《z///7eZo/7i/e/7zafoPc^s(P.C.Crawford等人，Science310，482-485(2005)),明顯且確定無疑地需要有效的疫苗以治療和預(yù)防這種新型犬流感。附圖簡述圖1顯示了用馬抗原疫苗免疫接種的狗的幾何平均注射位點(diǎn)反應(yīng)。圖2顯示了在用馬流感病毒疫苗免疫接種并用犬流感病毒攻擊的動(dòng)物中的肺實(shí)變平均百分比。發(fā)明概述本發(fā)明提供了馬和犬流感抗原，疫苗，和使用這些疫苗來治療犬類尤其是狗的由犬流感引起的感染、疾病和癥狀的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于保護(hù)動(dòng)物以抵抗由流感病毒引起的疾病的治療性組合物。本文描述了制備所述疫苗的方法和治療動(dòng)物的方法。本發(fā)明的抗原可以是來自任何鳥類和哺乳動(dòng)物的任何經(jīng)鑒定的流感病毒毒林，包括但不限于具有H3N8抗原亞型或更通常稱為H3N8毒林的流感。流感可以具有任何哺乳動(dòng)物來源，包括但不限于豬、鳥、馬或犬來源，優(yōu)選的是馬和犬流感病毒以及相關(guān)抗原。公開了具有標(biāo)示為H3或N8的蛋白質(zhì)的毒林。具有H3N8的毒林是優(yōu)選的。還公開了具有標(biāo)示為H7N7的蛋白質(zhì)的毒林。本文描述了抗原濃度和疫苗生產(chǎn)。描述了細(xì)胞培養(yǎng)基和病毒生長，對于減弱的、殺死的和滅活的病毒的疫苗制備以及疫苗佐劑、制劑、形式、和載體、劑量、施用途徑及測定法也都進(jìn)行了描述。發(fā)明詳述定義和縮寫下面的定義應(yīng)用于本公開內(nèi)容，未被定義的詞語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的含義。當(dāng)與可測量的數(shù)字變量一起使用時(shí)，"大約"是指該變量的所示值，以及在所示值的實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)(例如，在平均值的95%置信區(qū)間內(nèi))或在所示值的10%內(nèi)(任選其中更大的一個(gè))的變量的所有值。"活性免疫"包括狗中的體液免疫和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。"抗體"是指由于對抗原的免疫應(yīng)答而可以與特定抗原結(jié)合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有"恒定"和"可變"區(qū)的"輕"和"重"多肽鏈組成的血清蛋白質(zhì)，并根據(jù)恒定區(qū)的組成被分成幾類(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。對于給定抗原"特異"的抗體表明，該抗體的可變區(qū)專一地識別和結(jié)合特定抗原。抗體可以是多克隆的混合物或是單克隆的?？贵w可以是來自天然來源或來自重組來源的完整免疫球蛋白，或者可是是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分?？贵w可以以多種形式存在，包括，例如Fv、Fab，、F(ab，)2以及單鏈。"抗原"或"免疫原"是指包括一個(gè)或多個(gè)表位(線性的、構(gòu)象的或兩者)的分子，該分子一旦暴露于受試者就會(huì)誘導(dǎo)對于該抗原特異的免疫應(yīng)答。表位是抗原上的特異位點(diǎn)，其與T-細(xì)胞受體或特異性抗體結(jié)合，并通常包含大約3個(gè)氨基酸殘基至大約20個(gè)氨基酸殘基。術(shù)語抗原涉及亞單位抗原一一從在天然狀態(tài)下所述抗原與之相連的完整生物體中分開和分離的抗原一一以及殺死的、減毒的或滅活的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲或其它微生物。術(shù)語抗原也涉及抗體，例如抗獨(dú)特型抗體或其片段，以及能夠模擬抗原或抗原決定簇(表位)的合成肽模擬表位。術(shù)語抗原也涉及在體內(nèi)表達(dá)抗原和抗原決定簇的寡核苷酸或多核苷酸，例如在DNA免疫應(yīng)用中。"抗原性"是指蛋白質(zhì)或多肽被針對該蛋白質(zhì)或多肽而產(chǎn)生的抗體免疫特異性地結(jié)合的能力。"犬"包括通常被稱為狗的動(dòng)物，但還包括犬科中的其他成員。"細(xì)胞免疫應(yīng)答"一一參見免疫應(yīng)答。如本文使用的"伴侶動(dòng)物"是指被當(dāng)作寵物的任何團(tuán)養(yǎng)的非人動(dòng)物。這些動(dòng)物可包括但不限于狗、貓、馬、綿羊、兔、猴和嚙齒類動(dòng)物(包括小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠和雪貂)。"馬"包括通常被稱為馬的動(dòng)物，但還包括馬科中的其他成員。"賦形劑"是指疫苗中不是抗原的任何組分。"第一疫苗，，、"第二疫苗，，、"第三疫苗"等是指可分開施用的疫苗，其可以是相同的或不同的，并且其通?？梢砸匀魏雾樞蚴┯?。這樣，第三疫苗可以在第二疫苗之前或之后施用至受試者。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"異源的"表示來自不同的病毒物種或毒株。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"同源性"、"同源的"等表示多核苷酸或多肽序列之間共享的同一性的程度。當(dāng)關(guān)于病毒物種進(jìn)行使用時(shí)，"同源的"表示相同的病毒物種或毒林。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"寄主細(xì)胞"表示含有質(zhì)粒、病毒或其他載體的細(xì)菌或真核生物細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物、鳥類或昆蟲。"體液免疫應(yīng)答"一一參見免疫應(yīng)答。"雜交瘤"一一參見單克隆抗體。在受試者中的"免疫應(yīng)答"是指對于抗原的體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答或者體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的形成。"體液免疫應(yīng)答"是指通過抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。"細(xì)胞免疫應(yīng)答"是指通過T-淋巴細(xì)胞或其他白細(xì)胞或者兩者介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并且包括由活化的T-細(xì)胞、白細(xì)胞或兩者所產(chǎn)生的細(xì)胞因子、趨化因子和類似分子的產(chǎn)生。可使用標(biāo)準(zhǔn)的免疫測定法和中和測定法來測定免疫應(yīng)答，這些測定法在本領(lǐng)域中是已知的。"免疫原性"是指蛋白質(zhì)或多肽引發(fā)免疫應(yīng)答的能力，所述免疫應(yīng)答特異性地針對引起經(jīng)鑒定的疾病的細(xì)菌或病毒?？乖?免疫學(xué)保護(hù)量"或者"產(chǎn)生免疫應(yīng)答的有效量"是對于在受者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答來說有效的量，所述免疫原性應(yīng)答足以預(yù)防或改善疾病的征兆或癥狀，包括不利的健康影響或其并發(fā)癥。可以誘導(dǎo)體液免疫或細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫或兩者。動(dòng)物對疫苗組合物的免疫原性應(yīng)答可以如此進(jìn)行評估，例如通過測量抗體滴度、淋巴細(xì)胞增值測定法來間接進(jìn)行評估，或者通過監(jiān)視在用野生型毒抹攻擊后的征兆或癥狀來直接進(jìn)行評估。疫苗所賦予的保護(hù)性免疫可通過測量例如臨床征兆的降低來進(jìn)行評估，所述臨床征兆例如為受試者的死亡率、發(fā)病率、溫度讀數(shù)以及總體身體狀況和總體健康和能力。免疫應(yīng)答可包括但不限于細(xì)胞和/和體液免疫的誘導(dǎo)。治療有效的疫苗的量可依賴所使用的特定病毒或被免疫的動(dòng)物的狀況而變化，并且可以由獸醫(yī)醫(yī)生來確定。"鼻內(nèi)"施用是指通過或經(jīng)由鼻子將諸如疫苗的物質(zhì)導(dǎo)入受試者體內(nèi)，并且包括主要通過鼻腔粘膜來轉(zhuǎn)運(yùn)所述物質(zhì)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"分離的"表示單獨(dú)地或者在異源寄主細(xì)胞、或染色體、或栽體(例如質(zhì)粒、噬菌體等)內(nèi)從其天然發(fā)生的環(huán)境中移出。"分離的細(xì)菌，，、"分離的厭氧細(xì)菌"、"分離的細(xì)菌菌林"、"分離的病毒"、"分離的病毒毒林"等是指其中細(xì)菌或病毒基本上不含其他微生物的組合物，例如在培養(yǎng)中，例如當(dāng)從其天然發(fā)生的環(huán)境中分離。當(dāng)用于描述任何特別限定的物質(zhì)(例如多核苷酸或多肽)時(shí)，"分離的"是指從最初細(xì)胞環(huán)境中分離的物質(zhì)，在所述最初細(xì)胞環(huán)境中通常發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)(例如多肽或核酸)。因此，如本文使用的，僅作為例子，用本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建的重組細(xì)胞系使用了"分離的"核酸。備選地，如果特定的蛋白質(zhì)或特異的免疫原性片段作為疫苗而被要求保護(hù)或使用，那么其可被視為分離的，因?yàn)榕c其在自然中存在的情況相比，其已被鑒定、分離并純化至一定程度。如果該蛋白質(zhì)或其特異的免疫原性片段在產(chǎn)生抗原的重組細(xì)菌或真核生物表達(dá)載體中產(chǎn)生，那么其被視為以分離的蛋白質(zhì)或核酸存在。例如，用多核苷酸構(gòu)建的重組細(xì)胞系使用"分離的"核酸。"可代謝佐劑"是由能夠被靶物種代謝的組分組成的佐劑，例如基于植物油的佐劑?？纱x佐劑可以是可代謝的油?？纱x的油是通常出現(xiàn)在植物和動(dòng)物中并且經(jīng)常主要由三?；视突旌衔锝M成的脂肪和油，所述三?；视鸵脖环Q為甘油三酯和中性脂肪。這些非極性、水溶性物質(zhì)是甘油的脂肪酸三酯。三?；视透鶕?jù)其3個(gè)脂肪酸殘基的特性和位置而不同。與"不可代謝佐劑"相比較。"不可代謝佐劑"是由不能被動(dòng)物受試者的機(jī)體所代謝的組分組成的佐劑，所述動(dòng)物受試者被施用以乳劑。適于在本發(fā)明的乳劑中使用的不可代謝的油包括烷烴、烯烴、炔烴，和它們相應(yīng)的酸和醇，其醚和酯，以及其混合物。優(yōu)選地，油的個(gè)別化合物是輕質(zhì)烴化合物，即此類組分具有6-30個(gè)碳原子。油可以合成地制備或從石油產(chǎn)品中純化。用于在本發(fā)明乳劑中使用的優(yōu)選的不可代謝油包括例如礦物油、石蠟油和環(huán)烷。術(shù)語"礦物油"是指一種不可代謝的佐劑油，其是通過蒸餾技術(shù)從石油中得到的液態(tài)烴。該術(shù)語與"液化石蠟"、"液體石蠟"和"石蠟油"同義。該術(shù)語也意圖包括"輕質(zhì)礦物油，，，即類似地通過蒸餾石油得到的、但具有比石蠟油稍微更低的比重的油。參見例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版(Eastern,Pa.:MackPublishingCompany,1990，在第788頁和1323頁)。礦物油可以從多個(gè)商業(yè)來源獲得，例如J.T.Baker(Phillipsburg，PA)、USBCorporation(Cleveland,OH)。優(yōu)選的礦物油是以DRAKE0L的名稱商購可得的輕質(zhì)礦物油。"單克隆抗體"是指由單系雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，所有所述抗體針對特定抗原上的一個(gè)表位。用于制備單克隆抗體的抗原可以以病原體的分離蛋白質(zhì)或整個(gè)病原體來提供。"雜交瘤"是由雜交細(xì)胞所構(gòu)成的無性繁殖細(xì)胞系，所述雜交細(xì)胞通過融合骨髓瘤細(xì)胞和特異的抗體產(chǎn)生細(xì)胞而形成。通常，單克隆抗體是鼠源的；然而，單克隆抗體也指針對抗原的特定表位而制備的抗體的克隆群體，所述抗原通過噬菌體展示技術(shù)或等同于噬菌體展示的方法或非鼠源的雜交細(xì)胞來產(chǎn)生。事件后的"N天"或"M-天"分別是指該事件后的第N或第M天的任何時(shí)間。例如，在施用第一疫苗后14天使用第二疫苗免疫接種受試者表示第二疫苗是在第一次免疫后的第14天的任何時(shí)間施用的。"0RF"表示"開放閱讀框"，即基因的編碼區(qū)。"口服"或"經(jīng)口"施用是指通過或經(jīng)由口將諸如疫苗的物質(zhì)導(dǎo)入受試者體內(nèi)，并且包括吞咽或通過口腔粘膜的轉(zhuǎn)運(yùn)(例如舌下或頰吸收)或兩者。氣管內(nèi)也是口腔或經(jīng)口施用。"口鼻，，施用是指通過或經(jīng)由鼻和口將諸如疫苗的物質(zhì)導(dǎo)入受試者體內(nèi)，如通過例如在鼻內(nèi)放置一個(gè)和多個(gè)小液滴而發(fā)生的?？诒鞘┯冒ㄅc口服和鼻內(nèi)施用相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。"腸胃外施用"是指通過或經(jīng)由不包括消化道的途徑將諸如疫苗的物質(zhì)導(dǎo)入受試者體內(nèi)。腸胃外施用包括皮下施用、肌內(nèi)施用、經(jīng)皮膚施用、皮內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、眼內(nèi)施用和靜脈內(nèi)施用。為本公開內(nèi)容的目的，腸胃外施用不包括主要涉及通過口、鼻、氣管和肺中的粘膜組織轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的施用途徑。"藥學(xué)上可接受的"是指具有如下性質(zhì)的物質(zhì)其在可靠醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，適用于與受試者的組織接觸而無不適當(dāng)?shù)亩拘浴⒋碳?、過敏反應(yīng)等，與合理的收益-風(fēng)險(xiǎn)比相稱，并且對于其所希望的用途來說是有效的，"藥學(xué)上可接受的栽體"是指不干擾活性成分的生物活性的效力，并且對被施用的受試者沒有毒性的栽體介質(zhì)。"多克隆抗體"是指針對特定的病原體或抗原而制備的抗體的混合群體。一般而言，該群體包括多種抗體組，每組針對所述病原體或抗原的某一特定表位。為制備多克隆抗體，通過接種或感染將整個(gè)病原體或分離的抗原導(dǎo)入寄主中從而誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生針對該病原體或抗原的抗體。"預(yù)防感染"表示防止或抑制引起所鑒定的疾病的細(xì)菌或病毒的復(fù)制，抑制細(xì)菌或病毒的傳播，或者防止細(xì)菌或病毒在其寄主內(nèi)立足，或者緩解由感染引起的疾病的癥狀。如果細(xì)菌或病毒載量降低，則認(rèn)為該處理是治療性的。如本文中關(guān)于疫苗而使用的，"保護(hù)作用，，、"保護(hù)"等表示，所述疫苗預(yù)防或降低了由生物體引起的疾病的癥狀，疫苗中所用的抗原來源于所述生物體。術(shù)語"保護(hù)作用"和"保護(hù)"等也表示，所述疫苗可以用于"治療"已在受試者中存在的疾病或者該疾病的一個(gè)或多個(gè)癥狀。"呼吸道"施用是指通過或經(jīng)由吸入霧化(噴霧化)的物質(zhì)來將諸如疫苗的物質(zhì)導(dǎo)入受試者體內(nèi)。在呼吸道施用中，主要的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制包括通過氣管、支氣管和肺中的粘膜吸收噴霧化的物質(zhì)，并因此與鼻內(nèi)或經(jīng)口施用不同。當(dāng)用于描述本發(fā)明的抗體時(shí)，"對…特異的"表示，本發(fā)明的抗體的可變區(qū)專一地識別和結(jié)合特定的H3N8毒林(即，能夠通過在結(jié)合親和力方面可測量的差異而將特定的H3N8蛋白與其他已知蛋白質(zhì)相區(qū)分，盡管在H3N8s蛋白和這樣的多肽之間存在局部的序列同一性、同源性和相似性)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，特異的抗體也可以通過與抗體可變區(qū)外(特別是在分子的恒定區(qū)中)的序列的相互作用而與其他蛋白質(zhì)(或者在ELISA技術(shù)中的其他抗體)相互作用。用于測定本發(fā)明抗體的結(jié)合特異性的篩選測定法是本領(lǐng)域中熟知的和常規(guī)實(shí)施的。關(guān)于此種測定法的全面討論，參見Harlow等人(編輯)，Antibodies:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory;ColdSpringHarbor,NY(1988)，第6章?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中熟知的和常規(guī)實(shí)施的任何方法來產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。"亞單位疫苗"是指包含一種或多種抗原但不包含所有抗原的疫苗類型，所述抗原來源于或同源于來自目的病原體的抗原，所述目的病原體例如為病毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌。這樣的組合物基本上沒有完整的病原體細(xì)胞或病原顆粒，或這些細(xì)胞或顆粒的裂解物。因此，亞單位疫苗可以從至少部分純化或基本上純化的、來自病原體或其類似物的免疫原性多肽來制備。獲得亞單位疫苗中的一種或多種抗原的方法包括標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)、重組生產(chǎn)或化學(xué)合成。因此，"亞單位疫苗"是指由完整的病毒、細(xì)菌或其他免疫原的指定的一種或多種抗原性組分組成的疫苗。"特異的免疫原性片段"表示被抗體識別的序列的一部分，所述抗體對該序列是特異的。"受試者"是指任何具有免疫系統(tǒng)的動(dòng)物，其包括哺乳動(dòng)物，例如狗。"TCID5。"是指"組織培養(yǎng)感染量"，并被定義為對于感染50%的給定批次的經(jīng)接種細(xì)胞培養(yǎng)物所需的病毒稀釋度。可使用多種方法來計(jì)算TCID5。，包括在本說明書中使用的Spearman-Karber方法。對于Spearman-Karber方法的描述，參見B.W.Mahy&H.0.Kangro，r/To/c^r淑力*#，"25-46(1996)。"治療性試劑"是指輔助治療病毒感染或由此引起的疾病或病狀的任何分子、化合物、病毒或療法，優(yōu)選地減毒的或殺死的病毒，或者亞單位或化合物。在本公開內(nèi)容的情況下，"治療有效量"是指可在接受抗原或疫苗的受試者(例如狗)中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原或疫苗的量，所述免疫應(yīng)答足以預(yù)防或改善疾病的征兆或癥狀，包括由病原體感染引起的不利的健康影響或其并發(fā)癥，所述病原體例如為病毒(例如H3N8)、細(xì)菌、寄生蟲或真菌?？梢哉T導(dǎo)體液免疫或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫或體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫兩者。動(dòng)物對疫苗的免疫原性應(yīng)答可以如此進(jìn)行評估，例如通過測量抗體滴度、淋巴細(xì)胞增值測定法來間接進(jìn)行評估，或者通過監(jiān)視在用野生型毒林攻擊后的征兆或癥狀來直接進(jìn)行評估。疫苗所賦予的保護(hù)性免疫可通過測量例如臨床征兆的降低來進(jìn)行評估，所述臨床征兆例如為受試者的死亡率、發(fā)病率、溫度讀數(shù)以及總體身體狀況和總體健康和能力。治療有效的疫苗的量可依賴所使用的特定病毒或受試者的狀況而變化，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。"傳染的"表示能夠從第一只動(dòng)物(狗)傳遞到第二只動(dòng)物(狗)的病毒，其中第二只狗顯示出對所傳染的病毒的血清轉(zhuǎn)化。"治療"是指逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制該術(shù)語所應(yīng)用的病癥、病狀或疾病的進(jìn)程，或預(yù)防所迷病癥、病狀或疾病，或者指預(yù)防此類病癥、病狀或疾病的一種或多種癥狀。"療法"是指上述定義的"治療"的實(shí)施過程。"疫苗"是指選自病毒(經(jīng)修飾的活的、減毒的或殺死的)、或亞單位疫苗或上述內(nèi)容的任何組合的免疫原性組合物。將疫苗施用至受試者導(dǎo)致產(chǎn)生免疫應(yīng)答。可通過任何已知的施用途徑(包括腸胃外、經(jīng)口等)將疫苗直接引入受試者中。第一部分.抗原和病毒毒林，它們的疫苗的生產(chǎn)、制造、配制和施用本發(fā)明一個(gè)方面提供使用下迷抗原以激發(fā)免疫原性應(yīng)答的疫苗。本發(fā)明的有用的抗原。本發(fā)明的抗原可以是來源于任何鳥類和哺乳動(dòng)物的任何經(jīng)鑒定的流感病毒毒林，包括但不限于具有H3亞型血凝素和N8亞型神經(jīng)氨酸酶的流感病毒，或者具有H3N8亞型或更常見地稱為H3N8病毒的流感病毒。所述流感可以具有任何哺乳動(dòng)物或鳥類來源，包括但不限于豬、馬或犬來源。優(yōu)選的是馬和犬流感抗原。具有標(biāo)示為H3或N8的亞型糖蛋白的毒林，更優(yōu)選地具有H3和N8兩者的毒株。如在7>a/7s/p/ss/o/o/*f《u//7e///7w6/7zafo/ogs(P.C.Crawford等人，Sc/e力ce310，482-485(2005))中描述的毒林和變體和突變體及其變體也是優(yōu)選的。病毒HA是流感病毒的寄主物種特異性的重要決定因素。本發(fā)明的流感抗原可從家養(yǎng)的和野生的狗、馬、豬和禽類中分離。選擇用于樣品收集的動(dòng)物應(yīng)表現(xiàn)出急性和/或亞急性臨床癥狀，包括溫和至嚴(yán)重的呼吸道癥狀和發(fā)熱。動(dòng)物還表現(xiàn)出厭食和嗜睡的征象。病毒分離的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括用來自臨床樣本的鼻或咽粘膜樣品接種哺乳動(dòng)物和鳥類細(xì)胞培養(yǎng)物、含胚胎的蛋，通過擦拭鼻腔通道或咽喉或通過收集組織例如脾、肺、扁桃腺以及肝和肺的灌洗液來進(jìn)行收集。可在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)，和可以就其凝集人、公雞(rooster)、火雞或豚鼠紅細(xì)胞的能力來測試尿嚢液或細(xì)胞裂解物，這種能力是推測的關(guān)于流感病毒存在的證據(jù)。病毒毒林和可能的抗原的命名法。曱型流感病毒毒林根據(jù)在病毒顆粒表面上的其糖蛋白的抗原特征而被再分成亞型。這些病毒糖蛋白是血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。通常先命名HA亞型，再命名NA亞型，因而H3N8是指具有血凝素亞型3和神經(jīng)氨酸酶亞型8的病毒。該亞型基于HA和NA的血清學(xué)分析。使用在本文中公開的程序，可制備任何這些亞型的疫苗?，F(xiàn)在有16種經(jīng)鑒定的HA亞型和9種經(jīng)鑒定的NA亞型。野生環(huán)境中可能有更多還沒有被記述的亞型。特別地，經(jīng)鑒定的亞型包括H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15和H16以及Nl、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。亞型的所有這些組合和其任何組合以及使用上文描述的程序或^作為本發(fā)明的有用抗原在本文中被描述;要求保護(hù)。公開了亞型;所有其他HA和NA組合。這包括但不限于優(yōu)選的H3N8和H7N7亞型。流感病毒血凝素(HA)是病毒顆粒表面糖蛋白，其將病毒與寄主細(xì)胞上的HA受體相結(jié)合，并將病毒包膜與胞吞小泡的膜相融合以起始感染過程。其也是保護(hù)性抗體的刺激和形成中最重要的病毒顆粒組分。HA的氨基酸序列以及因此其N-糖基化位點(diǎn)的位置由病毒基因組所決定。流感病毒的分節(jié)段的負(fù)鏈RM基因組由依賴RNA的RNA聚合酶進(jìn)行復(fù)制，所述依賴RNA的RNA聚合酶缺少有效的校正功能，從而導(dǎo)致高比率的轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤，這可以造成表面糖蛋白HA和NA的氨基酸置換。此種高突變頻率的結(jié)果之一是，病毒群體包括在HA的N-聯(lián)聚糖的數(shù)量和位置方面與大多數(shù)病毒不同的突變體。這些寡聚糖的結(jié)構(gòu)可通過其在HA上的位置和通過生物合成的和修剪性的酶的排列來確定，所述酶由在其中生長病毒的寄主細(xì)胞提供。因此，病毒基因組的可塑性和寄主特異的糖基化機(jī)制可以一起產(chǎn)生在結(jié)構(gòu)和功能上比通過以上任一過程單獨(dú)地所能夠形成的更加異質(zhì)的病毒群體。該多樣性被認(rèn)為是這些病毒在各種生物小生境中存活的原因，也是它們具有克服中和抗體和抗病毒試劑的抑制作用的能力的原因。已經(jīng)鑒定出在各種毒株的病毒基因組中的突變，并且在此還要求保護(hù)這些突變的毒抹。例如，這些突變體中的一些描述于rrfl/7^/M/oi7o/*f^///7e///7i/e/7za"Zc^s(P.C.Crawford等人，S"'e飾310，482-485(2005))中，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。本發(fā)明還公開了從所收集的并被鑒定為馬流感毒抹A/Equine/2/Miami/1/63的特定毒林制得的疫苗。該毒林以保藏號ATCCVR317保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209。該毒林最初分離自1963年邁阿密的一匹病馬的鼻洗出物。該病毒在雞胚胎中傳代5次。該病毒被進(jìn)一步分類為H3N8。源自馬的北美H3N8流感病毒的另一個(gè)實(shí)例是A/Equine/Kentucky/1998。源自馬的H3N8的其他實(shí)例是A/Equine/Kentucky/15/2002、A/Equine/0hio/l/2003、A/Equine/Kentucky/1/1994、A/Equine/Massachusetts/213/2003、A/Equine/Wisconsin/2003和A/Equine/NewYork/1999。其他實(shí)例是源自歐洲H3N8流感病毒的A/Equine/Newmarket/A2/1993。本發(fā)明還公開了從所收集的并被鑒定為犬流感毒林A/canine/Iowa/13628/2005和毒林A/canine/Iowa/9Al/B5/08/D12的特定毒林制得的疫苗。后一種毒林，即毒林A/canine/Iowa/9Al/B5/08/D12作為UC25508，于2006年6月29日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209，ATCC登錄號是PTA-7694。該病毒被進(jìn)一步分類為H3N8。除了上述毒株，我們還公開了以下述方式獲得的毒林。鑒定一只或一組表現(xiàn)出呼吸道疾病的臨床征兆的狗，從這些狗中獲得口腔或鼻腔分泌物的樣品或者源自呼吸道組織或內(nèi)部器官組織的樣品，分析這些樣品，并鑒定H3N8流感病毒的存在。使用在本文中描述的程序，分離、純化、培養(yǎng)、生長、產(chǎn)生、濃縮該病毒抗原并鑒定為Pfizer犬流感病毒。適應(yīng)并在含胚胎的蛋或犬細(xì)胞或兩者中傳代，鑒定為主種子(MasterSeed)，犬流感H3N8病毒。優(yōu)選的是犬來源的H3N8流感病毒。也可使用馬或豬來源的H3N8，以及H3或N8亞型的流感病毒。我們公開了以下述方式獲得的毒林。使用馬流感H3N8感染一只或一組狗。從表現(xiàn)出呼吸道疾病的臨床或亞臨床征兆的狗中，獲得狗的口腔或鼻腔分泌物的樣品或者源自呼吸道組織或肺灌洗液或內(nèi)部器官組織的樣品，分析這些樣品，并鑒定H3N8流感病毒的存在。使用在本文中描述的程序，分離、純化、培養(yǎng)、生長、產(chǎn)生、濃縮該病毒抗原并鑒定為犬流感病毒。適應(yīng)并在含胚胎的蛋或犬細(xì)胞或兩者中傳代，鑒定為主種子，犬流感H3N8病毒。優(yōu)選的是犬來源的H3N8流感病毒。也可使用馬或豬來源的H3N8，以及H3或N8亞型的流感病毒。以與在本文中詳細(xì)描述的馬或犬來源的病毒一樣的方式處理豬來源的H3N8病毒。第2部分.關(guān)于生產(chǎn)、制造、配制和施用從第l部分的抗原產(chǎn)生的疫苗的詳細(xì)描述第2部分a)討論。第1部分的病毒抗原可制成有用的包含該病毒抗原的物質(zhì)組合物并配制成有用的制劑或疫苗制劑，所述病毒抗原被修飾以降低其毒力。下列描述提供了生產(chǎn)、制造、配制和施用疫苗的細(xì)節(jié)，所述疫苗可用于預(yù)防或治療狗的與流感病毒感染相關(guān)的臨床征兆，或預(yù)防由犬或馬流感病毒引起的狗的疾病。待治療的犬流感感染可以由馬流感病毒引起，或者其可以是源自馬流感病毒的新的經(jīng)修飾的犬流感。在本文中描述的療法可輔助防止在犬疾病中犬或馬流感病毒的泄出(shedding)。本文描述了用于使用疫苗來治療和免疫動(dòng)物的方法和材料，特別是針對馬和犬流感病毒來治療和免疫狗。該方法包括對狗施用治療有效量的第一、第二和或第三疫苗，所述疫苗能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并且特別是在狗中誘導(dǎo)抗H3N8流感病毒的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的疫苗通常旨在預(yù)防性治療，其針對由馬或犬流感病毒的毒性毒抹引起的疾病來免疫狗。在本文中，我們公開了提供主動(dòng)和或被動(dòng)免疫的疫苗。當(dāng)作為針對馬或犬流感病毒的治療性處理而給予時(shí)，完整疫苗或其蛋白質(zhì)的特異的免疫原性片段都預(yù)期是有效的。因此，通過本發(fā)明提供的免疫可以是主動(dòng)或被動(dòng)免疫，并且該疫苗的預(yù)期用途可以是預(yù)防性的或治療性的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該疫苗進(jìn)一步包括用于針對任何形式的犬或馬流感病毒來免疫狗的疫苗。第2部分b)疫苗生產(chǎn)和抗原濃縮。在本節(jié)中所描述的疫苗可通過在細(xì)胞中生長所選的病毒來生產(chǎn)。病毒的生產(chǎn)優(yōu)選地在馬和犬類哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行。在蛋中進(jìn)行病毒(抗原)生長和生產(chǎn)也是優(yōu)選的。狗腎細(xì)胞系是優(yōu)選的。也可以在任何可用的培養(yǎng)基和許可的細(xì)胞系中完成病毒的繁殖，所述細(xì)胞系可以來自鳥類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞系來自貓、馬、牛和豬細(xì)胞系。該疫苗通常在滅活前包含103-109的TCIDs。的病毒水平。備選地，病毒制劑中的抗原含量可通過血細(xì)胞凝集抑制(HI)試驗(yàn)、單輻射擴(kuò)散或血細(xì)胞凝集測定法來進(jìn)行分析，并且通過使用該測定法，優(yōu)先采用具有10-10，000HA單位/ml，更通常地100-2000HA單位/ml，并且常常地100-1000HA單位/ml(作為每劑量中的施用量)的滴度的疫苗。病毒生長細(xì)胞系和含胚胎的蛋。用于流感病毒繁殖的優(yōu)選細(xì)胞系是犬腎細(xì)胞(DK)?？梢允褂玫钠渌?xì)胞系包括原代和永生化馬腎細(xì)胞(EK)、馬真皮細(xì)胞(ED)、豬睪丸細(xì)胞(ST)、豬腎細(xì)胞(PK)、牛腎細(xì)胞(BK)、貓腎細(xì)胞(FK)、Vero細(xì)胞以及原代和永生化雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)。用于生長流感病毒的優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是傳統(tǒng)的粘附單層培養(yǎng)。備選地，也可使用懸浮和微栽體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。優(yōu)選的微載體是Cytodex3微載體珠(AmershamBiosciencesLtd.)。微載體的其他實(shí)例包括由玻璃、聚硅氧烷和葡聚糖、DEAE、膠原、葡聚糖或明膠組成的珠。用于培養(yǎng)細(xì)胞系和繁殖流感病毒的優(yōu)選容器是滾瓶，優(yōu)選的滾瓶表面積是1760cm2，但可在490-4250cm2的范圍內(nèi)變化。備選地，其他可用的細(xì)胞培養(yǎng)形式包括燒瓶(150cm2-420cm2)、堆疊的模塊(stackedmodules)(21,000cm2-340，000cm2)和攪拌罐(1.0L-900L)。優(yōu)選的感染復(fù)數(shù)(MOI)是0.OOl-O.1，但可在0.0001-2.0的范圍內(nèi)變化。用于從細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲病毒的優(yōu)選窗口期是感染后第2天至第5天，但可在感染后第1天至第7天的范圍內(nèi)變化。也可通過接種含胚胎的蛋來完成病毒的繁殖。通常使用0-12日齡的含胚胎的蛋用于病毒繁殖。優(yōu)選地，將7-8日齡的含胚胎的蛋用于病毒生長。將病毒接種到蛋的羊膜腔中。病毒在羊膜的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并且大量的病毒釋放回羊水中。在接種后2-3天，可以收獲羊水中的病毒。細(xì)胞培養(yǎng)基用于繁殖流感病毒的優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)基制劑包括但不限于以下培養(yǎng)基Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedeaglemedia,DMEM)、基礎(chǔ)的改良的Eagle培養(yǎng)基(basalmodifiedeaglemedia)、0ptimem和Leibovitz-15(L-15)培養(yǎng)基。通常，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充有0.1-IO個(gè)單位的胰蛋白酶。備選地，也可在細(xì)胞培養(yǎng)中使用2-100個(gè)單位的植物來源的胰蛋白酶等價(jià)物(例如Accutase)，以用于病毒的有效繁殖?？稍诖嬖诨虿淮嬖趧?dòng)物來源的組分的情況下使用細(xì)胞培養(yǎng)基。補(bǔ)充動(dòng)物來源組分的一個(gè)實(shí)例是終濃度為0.5-10%的經(jīng)伽馬射線照射的血清。第2部分c)疫苗制備，滅活的或殺死的、亞單位和減毒的、修飾的-活的滅活的或殺死的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗包括滅活的或殺死的H3N8流感病毒疫苗，其包含選自任何馬或犬感染性流感毒林的H3N8馬或犬毒林。參見rra/zs/zz/Wo"i/7/7we/7zafo/c^(P.C.Crawford等人，^/e力ce310，482-485(2005))。疫苗也可包括源自豬的流感H3N8或者H3或N8亞型的任何流感。通過本領(lǐng)域熟知的方法制作滅活疫苗。例如，一旦病毒繁殖到高滴度，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是可通過本領(lǐng)域熟知的方法獲得病毒抗原物質(zhì)。例如，可以通過稀釋、濃縮和提取來獲得病毒抗原物質(zhì)。所有這些方法都已用于獲得合適的病毒抗原物質(zhì)以生產(chǎn)疫苗。可通過使用福爾馬林(例如0.1-10%)、P-丙內(nèi)酯(BPL)(例如0.01-10%)或雙吖丙啶(binaryethyleneimine，BEI)(例如1-10mM)處理或者使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法來滅活病毒，其中雙吖丙啶是優(yōu)選的。提出了常用的條件和試劑，但其他試劑和濃度對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。除了上文詳述的殺死的病毒的生產(chǎn)外，多種減毒方法也是可以的并且是本領(lǐng)域中已知和經(jīng)描述的并可用于本發(fā)明。導(dǎo)致產(chǎn)生修飾的活疫苗的減毒也是可以的。一些此類技術(shù)在此處和下文中描述。在更優(yōu)選的減毒形式中包括在細(xì)胞培養(yǎng)中連續(xù)傳代、在動(dòng)物中連續(xù)傳代、用于產(chǎn)生遺傳修飾的多種方法以及紫外和化學(xué)誘變。亞單位疫苗。另外，可通過重組表達(dá)技術(shù)來產(chǎn)生馬和犬流感亞單位疫苗，其中包括但不限于異源原核表達(dá)(例如大腸桿菌、假單胞菌、沙門氏菌等)和異源真核表達(dá)(例如酵母[畢赤酵母，耶氏酵母(Yarrowia)]、昆蟲細(xì)胞[桿狀病毒]等)和病毒栽體(例如犬腺病毒、人腺病毒、痘病毒、犬皰療病毒)。減毒的和修飾的-活的。從在細(xì)胞系和蛋中培養(yǎng)的流感病毒中制備減毒病毒犬疫苗，所述流感病毒優(yōu)選地是源自流感的H3N8，其通過系列傳代而被減毒，包括在亞最佳溫度下系列傳代至不再能夠引起疾病，但仍能夠引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的狀態(tài)?？赏ㄟ^在細(xì)胞培養(yǎng)物中系列傳代野生型流感病毒毒林來實(shí)現(xiàn)流感病毒的減毒。病毒毒林可以在各種細(xì)胞系統(tǒng)中傳代直到其失去產(chǎn)生疾病的能力而完全保留其免疫原性特征。一旦接種到寄主內(nèi)，該病毒能夠繁殖到一定的程度。也可以通過如下方式來獲得合適的減毒病毒毒林進(jìn)行系列傳代以獲得過減毒的毒林。"過減毒，，表示，用乎減毒的傳代數(shù)目顯著高于通常對于去除病原性所需的數(shù)目。在這些許多次傳代后，這些減毒的病毒保留了其抗原性，例如保留了其血凝素和神經(jīng)氨酸酶抗原，從而其免疫原性能力沒有被破壞。當(dāng)施用時(shí)，這樣的毒林幾乎不產(chǎn)生癥狀和副反應(yīng)，因此是安全、有效的疫苗?？赏ㄟ^流感病毒毒林的冷適應(yīng)來實(shí)現(xiàn)流感病毒的減毒。冷適應(yīng)的流感病毒毒林可通過包括以下步驟的方法來產(chǎn)生傳代野生型流感病毒，隨后選擇在降低的溫度下生長的病毒。例如通過下述方式可以產(chǎn)生冷適應(yīng)的流感病毒在逐漸更低的溫度下，于含胚胎的雞蛋中順次傳代野生型流感病毒，從而選擇在降低的溫度下穩(wěn)定復(fù)制的在所述病毒混合物中的某些成員。冷適應(yīng)的流感病毒毒林表現(xiàn)出溫度敏感表型。溫度敏感的冷適應(yīng)的流感病毒在降低的溫度下復(fù)制，但在特定的較高生長溫度下不再在組織培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制或形成噬斑，在所述溫度下野生型病毒將復(fù)制和形成噬斑。溫度敏感型病毒將會(huì)生長的溫度在本文中是指對于該溫度敏感型病毒而言的"許可"溫度，并且溫度敏感型病毒將不會(huì)生長但相應(yīng)的野生型病毒將會(huì)生長的更高溫度在本文中是指對于該溫度敏感型病毒而言的"非許可"溫度。例如，特定溫度敏感型冷適應(yīng)的流感病毒在30t:或低于3or;的溫度下，在含胚胎的雞蛋中復(fù)制，并且在大約34x:的許可溫度下在組織培養(yǎng)細(xì)胞中形成噬斑，但在大約37x:的非許可溫度下在組織培養(yǎng)細(xì)胞中不形成噬斑。某些冷適應(yīng)的流感病毒可具有顯性干擾表型。即，當(dāng)與另一種流感病毒共感染細(xì)胞時(shí)，它們控制感染，從而損害該其他病毒的生長。也可通過重組方法來產(chǎn)生冷適應(yīng)的流感病毒。在此方法中，鑒定出與經(jīng)鑒定的冷適應(yīng)、減毒、溫度敏感性或顯性干擾表型相關(guān)的一種或多種特異突變，并使用反向遺傳學(xué)方法將其導(dǎo)回野生型流感病毒毒林中。反向遺傳學(xué)需要使用從被流感病毒感染的細(xì)胞中分離的RNA聚合酶復(fù)合物以轉(zhuǎn)錄包含突變的人工流感病毒基因組區(qū)段，用輔助病毒將該合成的RNA區(qū)段合并入病毒顆粒中，隨后選擇包含所需變化的病毒。笫2部分d)疫苗佐劑、制劑、形式和栽體。在本文中呈現(xiàn)的疫苗的組分優(yōu)選地包括一種或多種佐劑。佐劑包括但不限于RIBI佐劑系統(tǒng)(RibiInc.)鋁鹽，包括明礬(0.5-20%,更優(yōu)選的是低于10%，更優(yōu)選的是2和5%),磷酸鋁(0.5-20%,更優(yōu)選的是低于10%，更優(yōu)選的是2和5%)，氫氧化鋁(0.5-20%的鋁膠或吸附氫氧化鋁凝膠(Rehydragel)，更優(yōu)選的是低于10%,更優(yōu)選的是2和5%)，膽固醇，水包油乳劑，油包水乳劑例如弗氏完全和不完全佐劑，嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGA)，SAF-M(Chiron，EmeryvilleCA)，AMPHIGEN佐劑，皂苷和皂普類例如QuilA、QS-21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA),GPI-OIOO(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)(優(yōu)選的急苷濃度為10-100微克，優(yōu)選大約50微克)或者其他皂普級分，單磷酰脂質(zhì)A，阿夫立定脂質(zhì)-胺(Avridine1ipid-amine)佐劑，來自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定腸毒素(重組或其他)，霍亂毒素，或胞壁酰二肽，此外還有許多其他佐劑。免疫原性組合物可進(jìn)一步包含一種或多種其他免疫調(diào)節(jié)劑，例如白細(xì)胞介素、干擾素或其他細(xì)胞因子。免疫原性組合物還可包含慶大霉素和硫柳汞。疫苗的組分可包括藥學(xué)上可接受的賦形劑，包括載體、溶劑和稀釋劑、等滲劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、免疫調(diào)節(jié)劑(例如白細(xì)胞介素、干擾素或其他細(xì)胞因子)、血管收縮劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑等等。典型的載體、溶劑和稀釋劑包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。代表性的等滲劑包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、乳糖等?？捎玫姆€(wěn)定劑包括明膠、清蛋白等。依賴于施用途徑、貯存要求等，以多種形式提供H3N8流感病毒疫苗。例如，可以將疫苗制備成適用于注射器、點(diǎn)滴器、噴霧器等的含水溶液和分散液，或者可以制備成凍千粉末，所述凍干粉末在使用前在鹽水、HEPES緩沖液或第二犬疫苗的含水免疫原性級分等等中重構(gòu)。根據(jù)待使用的施用方式在藥學(xué)上可接受的載體中配制用于本發(fā)明的任一實(shí)施方案的疫苗。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地配制疫苗，所述疫苗包含活的或殺死的馬或犬流感或者其免疫原性片段、編碼馬或犬流感的重組病毒或細(xì)菌載體、其特異免疫原性片段、或者編碼馬或犬流感或其特異免疫原性片段的DNA分子。在肌內(nèi)注射為優(yōu)選的情況下，等滲制劑是優(yōu)選的。一般來說，用于等滲性的添加劑包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在特別的情況下，等滲溶液例如磷酸鹽緩沖鹽水是優(yōu)選的。制劑可進(jìn)一步提供穩(wěn)定劑例如明膠和清蛋白。在一些實(shí)施方案中，向制劑中添加血管收縮劑。根據(jù)本發(fā)明的藥學(xué)制劑以無菌且無熱源的形式提供。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，用于包含本發(fā)明疫苗的優(yōu)選制劑的藥學(xué)上可接受栽體是在由美國農(nóng)業(yè)部或其他國家(例如加拿大或墨西哥或歐洲任何國家)的相當(dāng)?shù)恼畽C(jī)構(gòu)所頒布的規(guī)定中批準(zhǔn)用于任何犬疫苗、多肽(抗原)亞單位疫苗、重組病毒栽體疫苗和DNA疫苗的那些藥學(xué)栽體。因此，用于本發(fā)明疫苗的商業(yè)生產(chǎn)的藥學(xué)上可接受載體是已經(jīng)和將要被美國和其他國家適當(dāng)?shù)恼畽C(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的載體。疫苗可進(jìn)一步與藥學(xué)上可接受的佐劑相混合。在本發(fā)明疫苗的某些制劑中，疫苗與其他犬疫苗相組合以產(chǎn)生多價(jià)疫苗產(chǎn)品，所述多價(jià)疫苗產(chǎn)品可以保護(hù)犬類免患由其他犬病原體引起的廣泛多種的疾病。疫苗組合物任選地可包含疫苗相容性的藥學(xué)上可接受(即，無菌的且無毒的)液體、半固體或固體稀釋劑，其作為藥學(xué)媒介物、賦形劑或介質(zhì)。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖，及其他。穩(wěn)定劑包括清蛋白及其他。可在疫苗組合物中使用任何本領(lǐng)域已知的佐劑，包括可代謝的和不可代謝的佐劑，基于油的佐劑(例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)，基于分枝菌酸酯(mycolate)的佐劑(例如海藻糖二分枝菌酸酯)，細(xì)菌脂多糖(LPS)，肽聚糖(即胞壁質(zhì)、祐肽或者糖蛋白例如N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]或MDP類似物)，蛋白聚糖(例如從肺炎克雷伯氏菌(i7e&/e//ajwe咖o//ae)中提取的)，鏈球菌制劑(例如OK432)，Biostim(例如01K2)，EP109942、EP180564和EP231039的"Iscoms"，氬氧化鋁，急苷，DEAE-葡聚糖，中性油(例如miglyol),植物油(例如花生油)，脂質(zhì)體，和Pluronic⑧多元醇。本發(fā)明的免疫原性組合物可根據(jù)施用途徑制成各種形式。例如，免疫原性組合物可制成適于注射使用的無菌水溶液或分散液形式，或使用凍干技術(shù)制成凍千形式。凍千的免疫原性組合物通常維持在4x:,并可以在有或無佐劑的情況下在穩(wěn)定化溶液(例如鹽水或/和HEPES)中重構(gòu)。另外，本發(fā)明的免疫原性和疫苗組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。如本文使用的，"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、涂覆劑、佐劑、穩(wěn)定化試劑、稀釋劑、防腐刑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑等。載體必須在與本發(fā)明的組分相兼容并對待免疫的受試者無害的意義上是"可接受的"。通常，載體是無菌的和無熱源的。第2部分e)疫苗劑量和測定法。H3N8流感病毒疫苗的劑量大小通常依賴于施用途徑而在大約2.0-0.1ml的體積范圍內(nèi)變化。滅活疫苗通常在滅活前包含103-109TCIDs。的病毒水平。備選地，病毒制劑中的抗原含量優(yōu)選具有10-10,000HA單位/ml的滴度的疫苗，其可以具有100-2000HA單位/ml，更優(yōu)選100-1000HA單位/ml作為每劑的施用量。對于含有修飾的活病毒或減毒病毒的疫苗，治療有效劑量一般在大約105TCID5。-大約1()STCID5。的范圍內(nèi)變化，包括端值。對于包含亞單位抗原(例如流感H3或N8蛋白)的疫苗，治療有效劑量一般在大約lOjag-大約100jLig的范圍內(nèi)變化，包括端值。盡管技術(shù)人員可以容易地確定在本發(fā)明文情況下可用的佐劑和添加劑的量和濃度，但是本發(fā)明設(shè)想了包含大約50pg-大約2000|ig佐劑的組合物，優(yōu)選大約500pg/2ml劑量的疫苗組合物。測定法?？赏ㄟ^病毒分離或通過病毒抗原、病毒RNA或特異抗體檢測方法來檢測流感病毒。用于檢測病毒或病毒組分的方法包括肺組織、鼻上皮細(xì)胞或細(xì)支氣管灌洗液的免疫熒光，組織樣品的免疫組織化學(xué)，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，細(xì)胞培養(yǎng)和免疫過氧化物酶，熒光抗體染色以確定病毒類型和亞型，以及快速酶-免疫分析膜測試。通常就流感病毒來進(jìn)行評估的組織包括肺、肺灌洗液、扁桃體、氣管、脾以及血清。特異地粑向各種病毒表位(即血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)表位)的單克隆抗體也是可用的。用于流感診斷的最常見血清學(xué)測定法是血凝素抑制(HI)測定法。其優(yōu)點(diǎn)之一是，它可以區(qū)分不同的亞型和一個(gè)亞型內(nèi)的抗原變體?？墒褂迷醋择R、犬、豬和鳥的血清來進(jìn)行HI測定法。用于測量抗體的更精確的方法是通過單輻射溶血(singleradialhemolysis,SRH)技術(shù)。SRH比HI測定法更靈敏，并具有更高的精確度。帶面積增加50%代表了抗體的產(chǎn)生并且是最近被感染的證據(jù)。第2部分f)施用的時(shí)機(jī)和途徑。狗的接種優(yōu)選地在6周齡，更優(yōu)選8周齡或更老的狗上進(jìn)行。狗優(yōu)選地接受2個(gè)劑量，每個(gè)劑量通常分別相隔3-4周施用，優(yōu)選地相隔3周，通過皮下注射(SC)，這些依賴于狗的狀態(tài)及其環(huán)境。這將會(huì)得到完整的、廣泛的免疫原性應(yīng)答。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，狗經(jīng)歷一系列共3次免疫接種以產(chǎn)生完整的、廣泛的免疫應(yīng)答。推薦每年使用單劑量進(jìn)行再免疫接種。如果需要，狗任選地在第3和或第6個(gè)月進(jìn)行加強(qiáng)免疫。優(yōu)選的途徑是皮下注射(使用大約lmL)，但是肌內(nèi)注射(IM)(使用大約lmL)或者皮內(nèi)(ID)注射(使用0.1-0.3mL)、口服、口鼻或鼻途徑(使用0.2-0.5mL)也是優(yōu)選的。其他時(shí)間、注射位點(diǎn)、使用的量和施用類型對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。本發(fā)明疫苗的任一實(shí)施方案的施用途徑包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)，口服、口鼻和皮下，以及吸入、栓劑和經(jīng)皮。優(yōu)選的施用途徑包括皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、口鼻和皮下注射。疫苗可以通過任何手段施用，包括但不限于注射器、噴霧器、彌霧機(jī)(misters)、無針注射裝置或微粒轟擊基因槍(生物射彈轟擊)。第3部分.所選疫苗的生產(chǎn)、制造、配制和施用的具體描述在本文中，我們提供了關(guān)于用于治療犬流感的殺死或滅活的單價(jià)疫苗的更詳細(xì)具體描述。第3部分a)殺死的和或滅活的病毒單價(jià)犬流感疫苗使用在上述第1部分中描述的任何抗原，包括優(yōu)選的源自犬或馬流感的流感來源的H3N8抗原，包括滅活的和有佐劑的(adjuvanted)H3N8流感病毒培養(yǎng)物。殺死的或滅活的病毒二價(jià)犬流感疫苗使用在上述第1部分中描述的任何抗原，優(yōu)選地源自犬和馬流感的流感來源的H3N8抗原，滅活的和有佐劑的H3N8流感病毒培養(yǎng)物。然而，所述犬抗原源自一種犬流感病毒而所述馬抗原源自一種馬流感病毒。犬抗原也可由2種犬流感病毒或2種馬流感病毒組成。殺死的或滅活的病毒三價(jià)犬流感疫苗使用在上述第1部分中描述的任何抗原，但更優(yōu)選地源自犬或馬流感的流感來源的H3N8抗原，滅活的和有佐劑的H3N8流感病毒培養(yǎng)物。描述了下列三價(jià)疫苗a)犬抗原源自一種犬流感病毒而馬抗原源自2種馬流感病毒，b)犬抗原源自2種犬流感病毒而馬抗原源自一種馬流感病毒，c)犬抗原源自3種犬流感病毒和或馬抗原源自3種馬流感病毒。描述了以上內(nèi)容的任何組合以制作三價(jià)疫苗。第3部分b)殺死的或滅活的疫苗的生產(chǎn)和抗原濃度在該部分中描述的疫苗可通過在細(xì)胞中生長所選的病毒來生產(chǎn)。病毒的生產(chǎn)優(yōu)選地在馬或犬哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行，在蛋中的病毒(抗原)的生長或產(chǎn)生也是優(yōu)選的。狗腎細(xì)胞系是更優(yōu)選的。病毒繁殖也可在任何可用的培養(yǎng)基中完成，包括可以來自貓、馬、牛、烏或豬細(xì)胞系的許可細(xì)胞系。疫苗應(yīng)當(dāng)在滅活前包含105-108TCIDs。的病毒水平。備選地，可通過血細(xì)胞凝集抑制(HI)試驗(yàn)或血細(xì)胞凝集測定法來分析病毒制劑。使用這種測定法，優(yōu)選滴度為10-10，000HA單位/ml，更通常地100-2000HA單位/ml，更常常地100-1000HA單位/ml的疫苗作為施用量。殺死的或滅活的病毒生長細(xì)胞系和含胚胎的蛋。用于生長流感病毒的優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是傳統(tǒng)的粘附單層培養(yǎng)。備選地，也可使用懸浮和微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。優(yōu)選的微栽體是Cytodex3微栽體珠(AmershamBiosciencesLtd.)0用于培養(yǎng)細(xì)胞系和繁殖流感病毒的優(yōu)選容器是滾瓶形式，優(yōu)選的滾瓶表面積是1760cm2，但可在850-4250cn^的范圍內(nèi)變化。優(yōu)選的感染復(fù)數(shù)(MOI)是0.001-0.1，但可在0.0001-2.0的范圍內(nèi)變化。優(yōu)選地從細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲病毒是在感染后第2天至第5天，但可在感染后第1天至第7天的范圍內(nèi)變化。細(xì)胞培養(yǎng)基用于繁殖流感病毒生長的優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)基制劑包括但不限于以下培養(yǎng)基Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、基礎(chǔ)的改良的Eagle培養(yǎng)基、Optimem和Leibovitz-15(L-15)培養(yǎng)基。通常，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充有0.1-10個(gè)單位的胰蛋白酶。第3部分c)殺死的和滅活的滅活。產(chǎn)生后，可使用本領(lǐng)域常用的任何方法來殺死或滅活病毒。更優(yōu)選的方法是使用BEI來滅活病毒液體，如在下文中描述的。使用福爾馬林和BPL來滅活含病毒的液體也是可用的。第3部分d)殺死的或滅活的疫苗佐劑、制劑、形式和栽體。第1;產(chǎn)生可用、的疫苗。優(yōu)選的制^是將殺死的i苗與佐劑相il合。許多佐劑可與本發(fā)明的疫苗一起使用，應(yīng)注意到其中有幾種是優(yōu)選的。佐劑的量通常包括在lmL劑量中大約25jLig-大約lOOOpg，包括端值。對犬流感疫苗特別有用的佐劑如下，其也可以聯(lián)合使用，優(yōu)選的組合是鋁鹽，包括明礬(0.5-20%,更優(yōu)選的是低于10°/，更優(yōu)選的是2和5%)、磷酸鋁(0.5-20%，更優(yōu)選的是低于10%，更優(yōu)選的是2和5%)、氫氧化鋁(0.5-20%的鋁膠或吸附氫氧化鋁凝膠(Rehydragel)，更優(yōu)選的是低于10%，更優(yōu)選的是2和5%)，AMPHIGEN⑧佐劑，皂苷類(優(yōu)選的是1-100ug范圍內(nèi)的QuilA或QS-21或QA-21，CambridgeBiotechInc.，CambridgeMA)，GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)，其中優(yōu)選的皂苷濃度為10-100微克并且優(yōu)選的是大約50微克，膽固醇，或其他合成的聚合物，DEAE葡聚糖，角鯊烯等。優(yōu)選的佐劑和組合物是2、3、4或5%的明礬，明礬與QuilA、膽固醇的任意組合，使用任何已知的市售疫苗佐劑和制劑。特別優(yōu)選的是單獨(dú)的2-5%明磯，單獨(dú)的QuilA,和被稱為"QAC"的QuilA和膽固醇。QAC可單獨(dú)使用或與另外的QuilA和膽固醇聯(lián)合使用。也可以使用其他已知的佐劑。可以調(diào)整疫苗的其他組分以修飾疫苗的物理和化學(xué)性質(zhì)。例如，佐劑的量通常為在lmL劑量中大約25ng-大約1000pg，包括端值。相似地，本文所描述的疫苗可以與抗生素相組合，所述抗生素的量通常為在lmL劑量中大約ljug-大約60|ig，包括端值。可以有其他成分。第3部分e)殺死的或滅活的疫苗劑量和測定法。H3N8流感病毒疫苗的劑量大小通常依賴于施用途徑而在大約2.0-0.1ml的體積范圍內(nèi)變化。對于含有修飾的活病毒或減毒病毒的疫苗，治療有效刑量一般在大約105TCID5。-大約108TCIDs。的范圍內(nèi)變化，包括端值。對于包含亞單位抗原(例如流感H3或N8蛋白)的疫苗，治療有效劑量一般在大約lOjag-大約lOOyg的范圍內(nèi)變化，包括端值。對于包含滅活流感病毒的疫苗，該疫苗應(yīng)當(dāng)在滅活前包含103-109TCIDs。的病毒水平。疫苗優(yōu)選地具有100-1000HA單位/ml，作為所施用的量/劑。最優(yōu)選的是大約640HA/劑。第3部分f)殺死的或滅活的，施用的時(shí)機(jī)和途徑。參見第2部分f的免疫接種的時(shí)機(jī)。優(yōu)選的途徑是皮下注射(SC)(使用大約lmL)，但是肌內(nèi)(IM)(大約lmL)或皮內(nèi)(使用1.0-0.2mL)以及口鼻和鼻(使用0.2-0.5mL)也是優(yōu)選的。第4部分.疫苗的組合本發(fā)明的抗原和疫苗可以與其他產(chǎn)品或疫苗相組合。例如，它們可以以液體或干燥級分與Pfizer，sCanineVanguard⑧系列產(chǎn)品(包括許多產(chǎn)品)和或Pfizer，sCanineVanguardPlus⑧系列產(chǎn)品(也包括許多產(chǎn)品，包括VanguardPlusCCV/L4)和其他組合相組合，以提供針對主要幼犬疾病的完全保護(hù)。馬或犬流感病毒抗原可在任何各種組合物中與下述犬抗原相組合犬副流感病毒(CPIV)、犬痙熱病毒(CDV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬腺病毒-1(CAV-1)、犬腺病毒-2(CAV-2)、犬鉤端螺旋體(ZeWow/Vflca//②/fl)、流感傷寒鉤端螺、旋體(Ze/^os/;/rfl^r///7o07^osa)、出血黃疽鉤端螺、旋體(Ze;^os/;/i"fl/"er由e邊oiT力fl^7ae)、波摩那鉤端螺旋體(丄e/^os/7/rfl)、布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體(Ze/^osp/s辦ra〃WflM)、犬呼吸道冠狀病毒(CRCV)、腸道犬冠狀病毒(CCV)、牛冠狀病毒(BCV)和支氣管炎博德特氏菌(^r^^/"6raoc力/se;7〃")抗原。另外，本發(fā)明的馬或犬流感病毒抗原和疫苗可與支氣管炎博德特氏菌(p68或81:0110111(^116@或CanvacCCi)和/或犬副流感病毒(CPIV)和/或犬呼吸道冠狀病毒(CRCV)和/或牛冠狀病毒(BCV)疫苗相組合，從而提供預(yù)搭栽(pre-boarding)疫苗以針對犬窩咳嗽(kennelcough)的常見病因進(jìn)行保護(hù)。組合疫苗的起始劑量可為相隔3周的2次lmL劑量，在隨后的搭載(boardings)前可給予單次1mL加強(qiáng)免疫。第5部分.疫苗的具體實(shí)例特別提供以下疫苗。實(shí)例1-3生長的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在a)2或5%明礬或者b)QAC中的細(xì)胞來源的Pfizer馬H3N8(A/Equine/2/Miami/1/1963)。實(shí)例4-6生長的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在a)2或5。/。明礬或者b)QAC中的細(xì)胞來源的Pfizer臨床分離物犬謹(jǐn)8A/Canine/Iowa/9Al/B5/D8/D12。實(shí)例7-9生長的禽蛋在a)2或5。/。明礬或者b)QAC中的蛋來源的Pfizer馬H3N8。實(shí)例10-11生長的禽蛋在a)2或5辭月礬或者b)QAC中的蛋來源的Pfizer臨床分離物犬固8。第6部分.疫苗測試程序的具體實(shí)例本發(fā)明的疫苗可以使用下述方法來評估和驗(yàn)證。對6周齡或更大的目的育種研究用狗施用此處描迷的疫苗。以每組5-20只將狗分配到疫苗組中。疫苗通過皮下或肌內(nèi)途徑，以相隔3周的2次1mL劑量或2次0.5mL劑量進(jìn)行施用。對照狗給予安慰劑疫苗。在第一次和第二次免疫接種的當(dāng)日，然后在第二次免疫接種后以及在攻擊后每周2次，從每只狗中收集血清樣品。通過HI(血細(xì)胞凝集抑制)或SRH(單輻射溶血)就對于疫苗抗原的血清轉(zhuǎn)化來測試來自經(jīng)免疫接種的狗的血清。在第二次免疫接種后的第14天或第28天，通過鼻內(nèi)或口服途徑(其可包括氣管內(nèi))采取氣霧劑或小液滴的形式，用H3N8對狗進(jìn)行攻擊。攻擊后，通過監(jiān)視臨床征兆例如呼吸道癥狀、發(fā)熱、厭食、嗜睡來觀察狗的疾病臨床征兆。通過在攻擊后每隔一天擦拭經(jīng)免疫接種的狗和未經(jīng)免疫接種的對照并進(jìn)行10-14天來收集鼻腔分泌物以測量攻擊病毒的泄出。通過細(xì)胞組織培養(yǎng)(優(yōu)選地狗腎)來證實(shí)泄出病毒的存在。在攻擊后，從一亞組的狗中收集組織樣品，包括氣管、扁桃體、肺。如上所述或通過免疫組織化學(xué)分析來證實(shí)狗組織樣品中病毒的存在。通過比較攻擊病毒的泄出和組織樣品中病毒，用有效疫苗免疫接種的狗與未經(jīng)免疫接種的對照狗相比具有更低的病毒栽量或更低的病毒量。與未經(jīng)免疫接種的對照相比，有效的疫苗在經(jīng)免疫接種的動(dòng)物中會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生更低的病毒栽量或更低的病毒量，并且經(jīng)免疫接種的動(dòng)物會(huì)顯示出與流感感染相關(guān)的臨床征兆的降低。具體的實(shí)例在狗中犬流感疫苗的攻擊和功效研究評估。關(guān)于在犬類中提供抗流感病毒的交叉保護(hù)來評估馬流感疫苗，殺死的病毒。為評估馬流感病毒的血清保護(hù)；包含A/Equine/2/Miami/1/63和A/Equine/Ohio/1/2003的疫苗，將7-10周齡的狗分配到9個(gè)治療組之一中(表2)。在研究的第0天和第21天，通過皮下途徑用1.OmL劑量免疫接種狗。在研究的第0天(第一次免疫接種)、第21天(第二次免疫接種)和第35天(第二次免疫接種后14天)從所有參與研究的狗中收集血液以得到血清。分析所有血清樣品的對于Miami63、0hio03和CIV的HAI。血清學(xué)應(yīng)答數(shù)據(jù)呈現(xiàn)在表3中。在研究的第35天，在下列IVP組中證明了與未經(jīng)免疫接種的動(dòng)物相比較的血清學(xué)滴度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異T02、T03、T04、T06、T07、T08和T09(表3)。另外地，在研究的第21天，在下列IVP組中觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異T06、T07、T08和T09(表3)。初步安全性除了測量血清學(xué)應(yīng)答外，在本研究中還評估了初步疫苗安全性?？偟膩碚f，在任何進(jìn)行評估的IVPs中沒有觀察到臨床上重要的疫苗相關(guān)反應(yīng)。在研究過程中沒有觀察到疫苗相關(guān)的系統(tǒng)反應(yīng)。另外地，在任何治療組中在第一次免疫接種后沒有觀察到注射位點(diǎn)腫脹。在第21天(第二次免疫接種前)，在來自5個(gè)治療組的34只動(dòng)物中，通過觸診注射位點(diǎn)檢測到小的肺脹。在這些組中，4個(gè)組(T02、T03、T06和T07)用2%明礬作為佐劑，而第5個(gè)治療組(T09)用Quil-A/膽固醇/加其他佐劑作為佐劑。在治療期間，第21天腫脹的幾何平均體積的大小范圍是O.07-0.24cm3。在第二次免疫接種后，在研究的第22-24天，在87只動(dòng)物中的58只之中觀察到注射位點(diǎn)肺脹。這些胂脹在免疫接種后24小時(shí)(第22天)到達(dá)峰值，并在研究的第24天尺寸減少直至消退。沒有注射位點(diǎn)肺脹在觸摸時(shí)疼痛或發(fā)熱，而發(fā)現(xiàn)有5個(gè)腫脹在觸摸時(shí)堅(jiān)硬。關(guān)于在犬類中提供抗流感病毒的交叉保護(hù)通過攻擊來評估馬流感疫苗，殺死的病毒9個(gè)治療組中的6個(gè)用CIV進(jìn)行攻擊TOl、T02、T03、T06、T07和T09。在研究第O天，即攻擊當(dāng)日，在用大約1:8/50ml的HA進(jìn)行第二次免疫接種后6周，動(dòng)物顯示出大約6.91ogs/mL的CIV。在與豬流感病毒呼吸道疾病模型相似的模型中，通過氣管內(nèi)途徑攻擊狗。在所有動(dòng)物中每日觀察與呼吸道疾病相關(guān)的臨床征兆流鼻弟、流眼淚、打噴嚏、惡心、厭食、抑郁和咳嗽。另外地，每日收集鼓室溫度和用于病毒分離的鼻/咽拭子。每曰報(bào)道并跟蹤臨床觀察，直到大約50%的經(jīng)攻擊的動(dòng)物表現(xiàn)出呼吸道疾病的臨床征兆。攻擊后5天，59只經(jīng)攻擊的動(dòng)物中的31只表現(xiàn)出一種或多種以下臨床征兆流真弟、流眼淚和/和咳嗽。因此，在研究的第5天，對所有動(dòng)物實(shí)施安樂死并進(jìn)行尸體解剖。記錄肺實(shí)變得分并收集樣品用于病毒分離。肺實(shí)變百分比得分表明，使用這種攻擊可以實(shí)現(xiàn)呼吸道疾病的成功證實(shí)。所有動(dòng)物中的實(shí)變百分比范圍是從9只動(dòng)物中的60%，至8只動(dòng)物中的10-35%實(shí)變，26只動(dòng)物表現(xiàn)出<10%實(shí)變，和16只動(dòng)物表現(xiàn)出無實(shí)變(圖2)。治療組中，具有肺實(shí)變的動(dòng)物的數(shù)目呈現(xiàn)在表5中。盡管在治療組和陰性對照之間觀察到數(shù)字上的差異，但沒有檢測到在肺實(shí)變、肺和扁桃體組織中病毒分離方面的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(表6)。從肺灌洗液樣品中，在陰性對照與T02、T07和T09之間檢測到在病毒分離結(jié)果方面的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<=0.05)(表7)。表2.用于犬血清轉(zhuǎn)化研究的治療組<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表3.在用馬流感抗原疫苗(36252)免疫接種的狗中的血清學(xué)滴數(shù)據(jù)總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表4.在^—個(gè)研究日治療組的P日性;;MHiA^的頻^^布<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表5.具有正肺實(shí)變得分的動(dòng)物的數(shù)目/治療組<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表6.從治療組的肺和扁桃體樣品中的病毒分離<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表7.從治療組的肺灌洗液樣品中的病毒分離<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>*表示在T01和治療組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(p《0.05)具體描述的結(jié)論應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，在本說明書和所附的權(quán)利要求書中使用的單數(shù)表達(dá)(例如"a"、"an"和"the")是指一個(gè)物體或多個(gè)物體，除非上下文另有清晰說明。因此，例如，當(dāng)提及包含"化合物"的組合物時(shí)，可包括單種化合物或者2種或更多種化合物。應(yīng)當(dāng)理解，上述描述意在舉例說明而非限制性的。通過閱讀上述描述，許多實(shí)施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)當(dāng)根據(jù)所附權(quán)利要求書來確定，包括這些權(quán)利要求所授予的等價(jià)形式的全部范圍。所有的文章和參考文獻(xiàn)(包括專利、專利申請和出版物)的公開內(nèi)容以其整體并為所有目的引入本文。根據(jù)本公開內(nèi)容，可以制備和實(shí)施本文所公開的和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法，而不需要過度的實(shí)驗(yàn)。盡管本發(fā)明的組合物和方法以優(yōu)選實(shí)施方案的形式進(jìn)行了描述，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，變化形式可應(yīng)用于所述組合物和/或方法，以及應(yīng)用在本文描述的方法的步驟或步驟的順序中，而不背離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍。更特別地，顯而易見的是，化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的某些試劑可替代本文所描述的試劑并達(dá)到相同或相似的結(jié)果。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員木胡書所限定的本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思之中權(quán)利要求1.針對流感病毒來免疫狗的方法，該方法包括對狗施用治療有效量的包含至少一種減毒或殺死的流感病毒的疫苗。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒選自H3、N8和或H3N8亞型，及其任何組合。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述病毒是流感H3N8亞型。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述病毒來自犬或馬來源。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述病毒能夠或不能夠被傳染至狗。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述病毒能夠被傳染至狗。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所迷病毒不能夠被傳染至狗。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒的量是10-10000HA單位。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述病毒的量是100-1000HA單位。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述病毒來自馬來源。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述病毒是馬流感病毒。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述病毒來自抗原馬流感毒抹A/Equine/2/Miami/1/63。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述病毒選自a)馬流感毒林A/Equine/2/Miami/1/63，和或b)馬流感毒林A/Equine2/Miami/1/63，傳代和保藏的種子毒林MasterSeedVirus,Lot317-9，標(biāo)記為EquineFluA2，317-9MSV，1l-2卜86。14.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述病毒來自犬來源。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14所述的方法，其中所述病毒被殺死。16.根據(jù)權(quán)利要求1-14所述的方法，其中所述疫苗進(jìn)一步包含佐劑，其中所述佐劑可選自a)可代謝的佐劑，b)不可代謝的佐劑，c)2。/。明鞏，d)5。/。明夙，e)QuilA，和f)膽固醇或其任何組合。17.生產(chǎn)疫苗的方法，其中所述疫苗包括權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所迷的疫苗組合物。18.權(quán)利要求1-14中的疫苗在制備用于針對流感病毒來免疫狗的藥物中的用途，所述藥物包含治療有效量的含有至少一種減毒或殺死的流感病毒的疫苗。全文摘要本發(fā)明涉及提供用于犬流感病毒相關(guān)疾病的新型疫苗和療法。本發(fā)明公開了流感病毒抗原和將這些抗原呈遞給犬類尤其是狗的方法。其涉及減毒和殺死的病毒。本發(fā)明涉及實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的犬和馬流感病毒。本發(fā)明還包括甲型流感，其包括H3、N8、H3N8、H7N7和包含來自犬和馬流感病毒的至少一個(gè)基因組區(qū)段的病毒。本發(fā)明還涉及這些病毒在治療性組合物中的用途，所述治療性組合物用于保護(hù)犬類特別是狗免患流感病毒引起的疾病。文檔編號A61P31/16GK101309701SQ200680037106公開日2008年11月19日申請日期2006年9月25日優(yōu)先權(quán)日2005年10月7日發(fā)明者H·A·德拉耶,M·J·休特,S·L·希爾茲申請人:輝瑞產(chǎn)品公司