專利名稱：一種藥物增溶載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種以殼聚糖為原料的藥物增溶載體，本發(fā)明還涉及該載體的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
納米技術(shù)和可生物降解材料均是當(dāng)前發(fā)展藥物傳輸系統(tǒng)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。聚合物納米膠束研究融合兩者的優(yōu)勢，即可生物降解，又可形成藥物納米載體。聚合物納米膠束具有以下特征1、親水性和柔韌性聚合物在水中可自發(fā)形成膠束，其疏水部分互相纏繞形成“內(nèi)核”，而親水性部分則環(huán)繞在外，形成柔韌的親水性“外殼”，疏水性的內(nèi)核作為藥物的載體或儲(chǔ)庫為疏水性藥物提供了一個(gè)穩(wěn)定的微環(huán)境，親水性的外殼使納米膠束能夠穩(wěn)定地存在于水溶液中和體液中。
2、穩(wěn)定性聚合物具有較低的臨界聚集濃度(Critical micelle concentrations，CMC)和較高的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度(Tg)，使聚合物具有高度的熱力學(xué)穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，從而聚合物膠束在CMC以下不易被破壞，即具有很高的耐稀釋能力，這也預(yù)示著血液的稀釋作用不會(huì)對(duì)聚合物膠束的穩(wěn)定性造成影響，聚合物膠束能以完整的膠束結(jié)構(gòu)在血液中循環(huán)，達(dá)到長循環(huán)和靶向的目的。
3、生物相容性聚合物在體內(nèi)可以通過水解或酶解途徑被降解為具有生物相容性的單體而排出體外，在體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生積蓄作用。
4、緩釋藥物特性藥物一般以被動(dòng)擴(kuò)散方式釋放，由于共聚物納米膠束疏水性內(nèi)核的剛性結(jié)構(gòu)及疏水性物質(zhì)間強(qiáng)大的內(nèi)聚力，使其釋藥速率釋放緩慢。
5.靶向性聚合物納米膠束具有被動(dòng)靶向，這主要是因?yàn)?1)嵌段共聚物膠束的分子量一般大于106，所以不會(huì)被腎排泄；(2)10～100nm的粒徑范圍及親水性且柔韌性的外殼，使其被網(wǎng)狀內(nèi)皮吞噬系統(tǒng)(RES)識(shí)別和攝取的機(jī)會(huì)也大大下降；(3)由于正常組織的細(xì)胞是緊密連接的，因此大分子量的嵌段共聚物膠束無法入內(nèi)；(4)利用腫瘤特有的高通透性和高截留性(enhanced permeability and retention effect，EPR effect)，納米級(jí)的嵌段共聚物膠束能穿透腫瘤部位的毛細(xì)血管壁進(jìn)入腫瘤組織，又由于腫瘤組織的淋巴系統(tǒng)發(fā)育不完善，不能通過淋巴導(dǎo)管將膠束排出，造成膠束在腫瘤部位積蓄并釋藥，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。Yoo(Yoo，H.S.，J Control Release，2001，70(1-2)，63-70)等證實(shí)了腫瘤細(xì)胞對(duì)嵌段共聚物膠束制劑的攝取量比其原料藥要高10倍以上。
目前對(duì)生物降解聚合物納米膠束的研究主要集中在合成高分子材料，主要是兩親性A-B嵌段、A-B-A嵌段共聚物或接枝共聚物。A為親水性組分，B為疏水性組分。由于可供共聚A、B組分及可生物降解的組分較少，在選擇時(shí)存在較大困難，故疏水性組分通常局限在聚內(nèi)酯，如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)或聚氨基酸如聚天冬氨酸、聚谷氨酸等；親水性組分則多為聚乙二醇(PEG)。然而，聚氨基酸作為疏水段可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)，且肽鍵很容易被體內(nèi)的酶斷裂，對(duì)控制釋藥速率不是理想的選擇。接枝共聚物主要是在親水性的鏈如PEG、聚丙烯酸側(cè)引入一些疏水基團(tuán)。膠束可通過化學(xué)偶聯(lián)連接藥物，而化學(xué)偶聯(lián)法在制備特定官能團(tuán)聚合物時(shí)困難較大，安全性較差。另外，無論嵌段共聚物或接枝共聚物的制備及表征均比較煩瑣，生產(chǎn)條件苛刻。另外，人工合成的高分子共聚物對(duì)疏水性藥物的增溶還不是十分理想，例如Zhang，Z.(Zhang，Z.，F(xiàn)eng，S.S，Biomaterials，2006，27(2)，262-70)等合成的poly(lactide)/VitaminE TPGS copolymer，其紫杉醇最高載藥量僅為5％(w/w)。D.Le Garrec(Le Garrec，D.，Gori，S.，J Control Res，99(1)，83-101)制備了poly(N-vinylpyrrolidone)-block-poly(D，L-lactide)，其紫杉醇最高載藥量也僅為5％(w/w)。
殼聚糖(Chitosan)是甲殼質(zhì)(Chitin)脫乙酰基的產(chǎn)物，是天然界唯一帶有正電荷的多糖，具有來源廣泛、價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、無毒、良好的生物相容性和生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)。殼聚糖分子鏈上帶有大量活性氨基和羥基，易于化學(xué)修飾而改善其物化性質(zhì)，如酰化、硫酸酯化和氧化、接枝與交聯(lián)、羥乙基化、羥甲基化等。殼聚糖的化學(xué)改性是當(dāng)前國內(nèi)外非?；钴S的一個(gè)領(lǐng)域，其衍生物已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日用化工、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等各個(gè)方面，但在藥物傳遞系統(tǒng)中的應(yīng)用研究還較少。在殼聚糖骨架上分別引入親水基和疏水基，形成兩親性聚合物，在水中可自發(fā)形成膠束，可作為藥物載體。目前國外已報(bào)道了O-羥乙基-N-膽烷酸殼聚糖(Park，Jae Hyung，Kwon，Seunglee，J ControlRelease，95(3)，579-588)，O-羥乙基N-去氧膽酸殼聚糖(Kuen Yong Lee，Won Ho Jo，Macromolecules，1998，31，378-383)，O-羥乙基-N-季銨棕櫚酰殼聚糖(Uchegbu，I.F.Sadiq，L.Arastoo，M.，Int J Pharm，2001，224(1-2)，185-99)，N-烷基-O-十二烷基-葡萄糖-殼聚糖(Ngimhuang，Jerasak，F(xiàn)urukawa，Polymer，45(3)，837-841)，但都沒有作為難溶性藥物或微溶性藥物載體得到應(yīng)用。代昭等(代昭，中草藥，2003，34(2)，120-122)報(bào)道了十六烷基水溶性低分子量殼聚糖，紫杉醇載藥量最高僅為14.6％(w/w)。CN 1439655公開一種新型殼聚糖衍生物N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖，反應(yīng)條件較為苛刻，所用氯磺酸是個(gè)及其活潑的強(qiáng)酸，遇水會(huì)爆炸，生產(chǎn)上不安全，磺化過程需在10℃ N2下進(jìn)行，且膠束終濃度＞0.18mg/ml時(shí)即發(fā)生溶血，臨界膠束濃度較高，為450mg/L，紫杉醇載藥量為25％(w/w)，但是稀釋不穩(wěn)定，稀釋至0.67mg/ml時(shí)只能穩(wěn)定1.5h，稀釋至0.6mg/ml則立即混濁(Zhang，Can，Qineng，Ping，et al.Colloids and Surfaces BBiointerfaces，2004，39(1-2)，69-75)。CN 1698899公開一種直接以疏水碳鏈修飾殼聚糖，在合適的分子量和合適的取代度下在水介質(zhì)中可形成膠束，但是對(duì)藥物載藥量較低，如紫杉醇僅6.7％(w/w)。AkioMiwa等(Miwa，Akio Ishibe，Atsuo，Pharm Res，1998，15(12)，1844-1850)以甲殼素為原料，先取代140％的羧甲基，脫乙?；?，再取代90％的十二烷基，過高的取代度給工藝帶來了一定難度，反應(yīng)條件較為激烈，如脫乙酰反應(yīng)需在110℃反應(yīng)2h，且在脫乙酰的同時(shí)分子鏈大量斷裂，該膠束在5mg/ml溶血高達(dá)50％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的針對(duì)上述技術(shù)問題提供一種以可生物降解的天然來源的殼聚糖作為原料，通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾得到的安全性好、載藥量高的藥物增溶載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述載體的制備方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述載體在制藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明在現(xiàn)有的技術(shù)基礎(chǔ)之上，改善合成工藝，在較為溫和的條件下引入羧甲基或羥乙基作為親水基，引入烷?；蛲榛鳛槭杷?≥5C)，選擇合適的殼聚糖分子量(5000～100萬)、控制取代位置(親水基主要取代在6位羥基，疏水基主要取代在2位氨基)和取代度(親水基50～120％且疏水基20～60％)，選擇合適的載藥工藝制備反應(yīng)條件溫和、低毒、高載藥量、高穩(wěn)定性的殼聚糖聚合物膠束。
本發(fā)明的目的可以通過下列技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)一種藥物增溶載體，該載體是在殼聚糖骨架6位和2位分別引入親水性的羧甲基或羥乙基和疏水性的烷基或烷?；?，使其能在水中自組合成納米膠束的具有兩親性的殼聚糖衍生物。
所述的藥物增溶載體，其中親水性的羧甲基或羥乙基取代殼聚糖6位羥基和2位氨基，以6位羥基為主，總?cè)〈?0～120％，并且疏水性的烷基或烷酰基取代殼聚糖6位羥基和2位氨基，以2位氨基為主，總?cè)〈?0～60％。
所述的藥物增溶載體，其中疏水烷基或?；奶荚訑?shù)不低于5。
所述的藥物增溶載體，其中選用的殼聚糖分子量5×103～1×106，脫乙酰度為＞70％。
所述的藥物增溶載體的制備方法，包括下列步驟將殼聚糖分散于異丙醇或甲醇中，采用提供親水基團(tuán)的物質(zhì)與殼聚糖骨架上的6位羥基和2位氨基進(jìn)行取代反應(yīng)，在堿性條件下30～50℃攪拌反應(yīng)3～10h，使其主要在6位羥基取代；再采用提供疏水基團(tuán)的物質(zhì)與殼聚糖骨架上的2位氨基和6位羥基進(jìn)行取代反應(yīng)，堿性條件下40～70℃反應(yīng)4～12h，使其主要取代在2位氨基；親水基和疏水基的取代反應(yīng)順序可前后顛倒；控制殼聚糖脫乙酰度為＞70％，親水基總?cè)〈葹?0～120％，疏水基總?cè)〈葹?0～60％即可。
所述的制備方法，其中提供親水基團(tuán)的物質(zhì)是氯乙酸、環(huán)氧乙烷；提供疏水基團(tuán)的物質(zhì)是碳原子數(shù)均不小于5的鹵代烴、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰鹵。
所述的藥物增溶載體在制備難溶或微溶于水的藥物的增溶制劑中的應(yīng)用；其中難溶或微溶于水的藥物是紫杉烷類、環(huán)孢素類、喜樹堿類、黃酮類、二氫吡啶類、小蘗堿類、長春堿類、蒽醌類、鬼臼毒素類抗腫瘤藥或者難溶或微溶于水的非甾體抗炎藥中的任一物質(zhì)或其衍生物；難溶于水的藥物優(yōu)選紫杉烷類抗腫瘤藥。
該藥物增溶載體的使用方法是將所述兩親性殼聚糖衍生物與水按重量比為3～50∶1000的比例(優(yōu)選5～20∶1000)溶解，得到兩親性殼聚糖衍生物納米膠束；將治療有效量的難溶或微溶于水的有機(jī)藥物用藥學(xué)上可接受溶劑溶解后，與所述兩親性殼聚糖衍生物納米膠束混合后，經(jīng)超聲處理，溶液用截留分子量為12000～14000的透析袋透析，凍干制得粒徑為10～1000nm的聚合物膠束即可。
具體方案如下在殼聚糖6位羥基和2位氨基引入羧甲基或羥乙基為親水基，其中親水基取代以6位羥基為主；在2位氨基和6位羥基引入烷酰基或烷基為疏水基(碳原子數(shù)不低于5)，其中疏水基取代以2位氨基為主。殼聚糖引入親水基和疏水基，使其成為具有兩親性的聚合物分子，在水介質(zhì)中可組裝成膠束，相對(duì)疏水的烷?；蛲榛奂蓛?nèi)核，親水基修飾的殼聚糖形成親水性的外殼，具有穩(wěn)定膠束、有效躲避生物體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕捉和蛋白質(zhì)吸附的作用。因此這類高分子材料是一類優(yōu)良的藥物載體，尤其對(duì)于難溶性抗腫瘤藥物及其它難溶于水的非抗腫瘤藥物。該藥物載體可用于血管內(nèi)或肌肉注射、口服、腔道和外用。該聚合物作為藥物載體，粒徑在10～1000nm可控，表面光滑，均勻度好，顆粒規(guī)則無粘連，再分散性好，載藥量和包封率高。
本發(fā)明以殼聚糖為原料，在殼聚糖分別引入羧甲基/疏水烷基、羧甲基/疏水烷?；⒘u乙基/疏水烷基，羥乙基/疏水烷酰基，制得兩親性殼聚糖衍生物。羧甲基、羥乙基分別為氯乙酸、環(huán)氧乙烷與6位羥基和2位氨基反應(yīng)，主要在6位羥基取代；疏水烷基或疏水烷?；鶠闅ぞ厶?位氨基和6位羥基與鹵代烴、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰鹵(C數(shù)皆≥5)反應(yīng)，主要取代在2位氨基。親水基和疏水基的取代反應(yīng)順序可前后顛倒。元素分析、電位滴定及1H-NMR測得其脫乙酰度為＞70％；羧甲基或羥乙基總?cè)〈葹?0～120％；烷基或烷?；?cè)〈葹?0～60％。
殼聚糖衍生物的合成及膠束制備方法詳細(xì)說明如下一、6-O-羧甲基-2-N-烷基殼聚糖的制備1、先接親水基再接疏水鏈1.1 6-O-羧甲基殼聚糖的制備殼聚糖混懸于異丙醇中，加入NaOH，30～50℃攪拌1～12h，加入氯乙酸，30～50℃反應(yīng)3～10h，傾去上清液，加入適量水，用NaOH調(diào)pH6～8，加甲醇或丙酮沉淀，過濾，濾餅用濃度為80～90％的甲醇或乙醇洗滌，樣品真空干燥，即制得6-O-羧甲基殼聚糖，為淡黃色或白色粉末。
合成路線圖解如下 1.2 6-O-羧甲基-2-N-烷基殼聚糖的制備1.2.1鹵代烴6-O-羧甲基殼聚糖均勻分散在異丙醇中，加入NaOH，30～40℃堿化，攪拌下加入鹵代烴，40～70℃反應(yīng)4～12h，調(diào)pH6～8，加甲醇或丙酮沉淀，過濾，濾餅乙醚洗滌，樣品真空干燥。
合成路線圖解如下
1.2.2烷基醛取6-O-羧甲基殼聚糖1g，混懸于甲醇或乙醇中，加入烷基醛，反應(yīng)1h后，加入NaBH4水溶液，繼續(xù)攪拌12h，NaOH液調(diào)pH7，甲醇或丙酮沉淀，過濾，濾餅用濃度為80～90％的甲醇、丙酮和正己烷依次洗滌，真空干燥，即得6-O-羧甲基-2-N-烷基殼聚糖。
合成路線圖解如下 2、先接疏水鏈再接親水基2.1 2-N-烷基殼聚糖的制備方法同“項(xiàng)一”下的1.2，以殼聚糖替換6-O-羧甲基殼聚糖即可。
2.2 6-O-羧甲基-2-N-烷基殼聚糖的制備方法同“項(xiàng)一”下的1.1，以2-N-烷基殼聚糖替換殼聚糖即可。
二、6-O-羧甲基-2-N-烷酰基殼聚糖的制備方法1、先接親水基再接疏水鏈1.1 6-O-羧甲基殼聚糖的制備方法方法同“項(xiàng)一”下的1.1。
1.2 6-O-羧甲基-2-N-烷?；闹苽?.2.1與脂肪酸酐反應(yīng)脂肪酸通過分子間脫水而得到酸酐。將6-O-羧甲基殼聚糖分散在甲醇中，攪拌下滴加脂肪酸酐丙酮溶液(含少量吡啶)，25～70℃保溫反應(yīng)5～15h，加入丙酮沉淀，過濾，濾餅用濃度為80～90％的甲醇洗滌，真空干燥，即得6-O-羧甲基2-N-烷?；鶜ぞ厶恰?br> 合成路線圖解如下
1.2.2與脂肪酰鹵反應(yīng)脂肪酸與二氯亞砜、三氯化磷、五氯化磷、三溴化磷、五溴化磷中的一種反應(yīng)，制得脂肪酰鹵。將6-O-羧甲基殼聚糖分散于二甲亞砜中(含有少量吡啶)，攪拌下滴加脂肪酰鹵，40～70℃反應(yīng)5～12h，加入丙酮沉淀，過濾，濾餅用丙酮洗滌，真空干燥，即得6-O-羧甲基2-N-烷?；鶜ぞ厶?。
合成路線圖解如下
2、先接疏水鏈再接親水基2.1 2-N-烷酰基殼聚糖的制備方法同“項(xiàng)二”下的1.2，以殼聚糖代替6-O-羧甲基殼聚糖即可。
2.2 6-O-羧甲基2-N-烷?；鶜ぞ厶堑闹苽浞椒ㄍ绊?xiàng)一”下的1.1，以2-N-烷?；鶜ぞ厶谴鏆ぞ厶羌纯伞?br> 三 6-O-羥乙基-2-N-烷基殼聚糖的制備1、先接親水基再接疏水鏈1.1 6-O-羥乙基殼聚糖的制備殼聚糖混懸于異丙醇中，加入NaOH，30～50℃攪拌1～12h，冰浴下加入環(huán)氧乙烷，冰浴攪拌2～6h，升溫至30～50℃繼續(xù)反應(yīng)3～10h，傾去上清液，加入一定量水，用NaOH調(diào)pH6～8，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸餾水中室溫透析72h，透析液凍干即制得高取代的6-O-羥乙基殼聚糖。
合成路線圖解如下
1.2 6-O-羥乙基-2-N-烷基殼聚糖的制備方法同“項(xiàng)一”中1.2，以6-O-羥乙基殼聚糖代替6-O-羧甲基殼聚糖即可。
2、先接疏水鏈再接親水基2.1 2-N-烷基殼聚糖的制備方法同“項(xiàng)二”下的1.2，以殼聚糖代替6-O-羧甲基殼聚糖即可。
2.2 6-O-羥乙基-2-N-烷基殼聚糖的制備方法同“項(xiàng)三”下的1.1，以2-N-烷基殼聚糖代替殼聚糖即可。
四 6-O-羥乙基-2-N-烷?；鶜ぞ厶堑闹苽?、先接親水基再接疏水鏈1.1 6-O-羥乙基殼聚糖的制備方法同“項(xiàng)三”下的1.1。
1.2 6-O-羥乙基-2-N-烷?；鶜ぞ厶堑闹苽浞椒ㄍ绊?xiàng)二”下的1.2，以6-O-羥乙基殼聚糖代替6-O-羧甲基殼聚糖即可。
2、先接疏水鏈再接親水基2.1 2-N-烷?；鶜ぞ厶堑闹苽浞椒ㄍ绊?xiàng)二”下的1.2，以殼聚糖代替6-O-羧甲基殼聚糖即可。
2.2 6-O-羥乙基-2-N-烷酰基殼聚糖的制備方法同“項(xiàng)三”下的1.1，以2-N-烷酰基殼聚糖代替殼聚糖即可。
五、兩親性殼聚糖衍生物膠束制備方法按每1ml水中溶解3～20mg的兩親性殼聚糖衍生物的比例，將制得的兩親性殼聚糖衍生物溶于水中，經(jīng)超聲處理(超聲處理的頻率及處理時(shí)間均是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的，下同)，制備成粒徑為10～1000nm的殼聚糖膠束。
六、以兩親性殼聚糖衍生物作為載體，制備含難溶藥物的藥物組合物兩親性殼聚糖衍生物溶于水后，將難溶性藥物如紫杉醇用適當(dāng)溶劑溶解，與兩親性殼聚糖衍生物水溶液混合，經(jīng)超聲處理，制得粒徑為10～1000nm的聚合物膠束。所謂適當(dāng)溶劑，指藥學(xué)上使用的能溶解該藥物的溶劑。
七、采用兩親性殼聚糖衍生物作為載體制備藥物組合物，可對(duì)難溶性藥物有增溶作用。
可使用該兩親性殼聚糖衍生物作為載體的難溶藥物有紫杉醇、環(huán)孢素、替尼泊甙、羥基喜樹堿、喜樹堿、長春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多西紫杉醇，燈盞花素、銀杏內(nèi)酯、水飛薊素、柔紅霉素、絲裂霉素、氨甲喋呤、吲哚美辛、布洛芬、萘普生，尤其是對(duì)紫杉醇、替尼泊甙、羥基喜樹堿、喜樹堿、長春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多西紫杉醇有增溶效果，但并不局限于這些所列藥物。
本發(fā)明的有益效果一、該兩親性殼聚糖衍生物膠束對(duì)以上藥物具有較好增溶作用，尤其對(duì)紫杉醇有明顯的增溶效果，當(dāng)6-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖衍生物水溶液濃度為0.57％(w/v)時(shí)，載體與藥物投藥比為1.7∶1時(shí)，載藥量為34.40％(w/w)，包封率為89.90％，進(jìn)一步增加載體與藥物投藥比至1.7∶1.2，載藥量進(jìn)一步增加，為37.65％(w/w)，包封率為80.52％。6-O-羥乙基-2-N-辛基殼聚糖衍生物水溶液濃度為0.57％(w/v)時(shí)，載體與藥物投藥比為1.7∶0.8時(shí)，載藥量為26.99％(w/w)，包封率為76.23％。以烷?；嫱榛?，載藥相似。
二、本發(fā)明輔料亦可用于血管內(nèi)或肌肉注射和口服有機(jī)藥物、水不溶性或難溶性藥物和兩親性藥物的載體。作為靜脈給藥系統(tǒng)，其溶血反應(yīng)符合靜脈注射藥用輔料標(biāo)準(zhǔn)。以6-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖載體材料為例考查其溶血性。
1實(shí)驗(yàn)方法取人血4ml，生理鹽水離心(2500rpm，10min)洗滌至上清液無色。移取2ml的血細(xì)胞混懸液到100ml的容量瓶，生理鹽水定容至100ml，得2％血細(xì)胞混懸液。分別配制10mg/ml的吐溫80(tween80)、6-O-羧甲基2-N-辛基殼聚糖空白膠束(micelles)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophore EL)，按表1配制得到終濃度分別0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2、4mg/ml的樣品溶液，搖勻后，置37℃恒溫水浴中。9號(hào)管和10號(hào)管分別為0％溶血和100％溶血。37℃孵育3h后，3000rpm離心10min，取上清液，于416nm紫外分光光度計(jì)測定其吸收值，以空白樣品為對(duì)照。按下列公式計(jì)算溶血百分?jǐn)?shù)。

表1溶血實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)


2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果以樣品在試管中的終濃度為橫坐標(biāo)，以溶血百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，得到溶血曲線，見圖1。
兩親性聚合物具有低分子表面活性劑相似的結(jié)構(gòu)，而低分子表面活性劑對(duì)血細(xì)胞膜有著傷害作用，因此我們考察了殼聚糖兩親性衍生物對(duì)血細(xì)胞膜的傷害情況。Tween80和Cremophore EL是最常用的兩種可靜脈注射的低分子表面活性劑，我們將殼聚糖兩親性衍生物與之進(jìn)行比較。從圖1我們可以看出6-O-羧甲基2-N-辛基殼聚糖空白膠束的溶血性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于tween80，在2mg/mL(管7)時(shí)，6-O-羧甲基2-N-辛基殼聚糖空白膠束僅溶血2.3％，而tween80溶血47.4％，在濃度為4mg/mL(管8)時(shí)，tween80溶血達(dá)68.5％，而6-O-羧甲基2-N-辛基殼聚糖空白膠束溶血僅5.1％?？梢姎ぞ厶茄苌锏娜苎赃h(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于tween80。Cremophore EL略優(yōu)于殼聚糖衍生物，并無顯著差異。但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，Cremophore EL具有較高的致敏性，其每天靜脈注射的最大耐受劑量僅為75mg，而tween80為500mg。目前還未有殼聚糖致敏性及其它副作用的報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明中其它殼聚糖衍生物溶血情況與6-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖衍生物相似。因此，相對(duì)于tween80和Cremophor EL而言，殼聚糖衍生物是良好的可靜脈注射的藥用輔料。
三、殼聚糖兩親性衍生物的臨界膠束濃度(Critical micelle concentrations，CMC)測定。
采用最為靈敏的熒光探針法。以芘為熒光探針，芘是一種疏水性芳香化合物，對(duì)環(huán)境極性極敏感。當(dāng)兩親性分子的濃度低于CMC時(shí)，溶液中不會(huì)形成膠束，芘溶解在極性的水中；隨著兩親性分子的濃度高于CMC，膠束形成。芘相向膠束內(nèi)核的疏水部分分配，從而進(jìn)入非極性環(huán)境，繼而在其熒光廣譜中可以觀察到一系列變化，如熒光強(qiáng)度將增加，放射光譜中振動(dòng)精細(xì)結(jié)構(gòu)(the vibrational fine structure of the emission spectra)發(fā)生變化，激光光譜中(0，0)波段紅移。因此，通過以芘的發(fā)射光譜中的I1/I3比(在固定的激發(fā)波長下掃描，I1、I3分別代表發(fā)射光譜中第一和第三強(qiáng)峰的熒光強(qiáng)度比)或激發(fā)光譜中I338/I333比(激發(fā)光譜中波長分別為338nm和333nm的熒光強(qiáng)度比)對(duì)兩親分子的濃度作圖即可獲得兩親分子的表觀CMC。實(shí)施例1～16中殼聚糖衍生物的CMC皆在3～20mg/L范圍內(nèi)，預(yù)示它有極好的稀釋穩(wěn)定性。
四、載藥殼聚糖聚合物膠束穩(wěn)定性考察一般而言，載藥越高，穩(wěn)定性越差。本發(fā)明以載藥量為34.40％(w/w)的6-O-羧甲基2-N-辛基殼聚糖膠束為例，以市售制劑紫杉醇注射液(Taxol)為對(duì)照，考察稀釋及溫度對(duì)載藥殼聚糖膠束的影響，結(jié)果見表2。
表2紫杉醇?xì)ぞ厶悄z束的稀釋穩(wěn)定性

可見，殼聚糖聚合物膠束不僅具有極高的載藥量，還具有非常優(yōu)越的穩(wěn)定性。
綜上所述，本發(fā)明用可生物降解的天然來源的殼聚糖作為原料，進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，引入羧甲基/疏水烷基、羧甲基/疏水?；?、羥乙基/疏水烷基，羥乙基/疏水酰基，在水介質(zhì)中自發(fā)形成納米級(jí)膠束，在體內(nèi)具有良好的生物相容性、生物可降解性和稀釋穩(wěn)定性，對(duì)難溶性藥物有較好的增溶作用，可作為毒性小、不會(huì)產(chǎn)生溶血反應(yīng)的可靜脈注射給藥的藥物載體。
本發(fā)明研究的兩親性的殼聚糖衍生物，可以在水中自發(fā)形成納米級(jí)膠束，不但可用于難溶藥物的增溶和包裹，控制藥物釋放，而且由于其親水的殼和疏水的核組成的納米膠束結(jié)構(gòu)，可以延長體內(nèi)循環(huán)、減少網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬，增加腫瘤靶向，達(dá)到減少毒副作用，增加療效的目的。
本發(fā)明提供的兩親性殼聚糖衍生物的臨界聚集濃度低，載藥量高、藥物包封率高，納米膠束穩(wěn)定。本輔料毒性小、可作為難溶性有機(jī)藥物的載體，以納米級(jí)分散體系用于注射、口服、腔道和外用。本發(fā)明制備方法簡單，工藝成熟，適于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)。


圖1吐溫80、6-O-羧甲基2-N-辛基殼聚糖空白膠束、聚氧乙烯蓖麻油溶血曲線。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明加以進(jìn)一步的說明，但下述實(shí)施例并不限制本專利的權(quán)利范圍。
實(shí)施例16-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖的制備(先接親水基再接疏水基)1、6-O-羧甲基殼聚糖的制備1g殼聚糖混懸于異丙醇中，加入5g NaOH、30℃攪拌堿化12h，加入6g氯乙酸的異丙醇溶液，35℃反應(yīng)5h，傾去上清液，加入一定量水，用NaOH水溶液調(diào)pH7，甲醇沉淀，過濾，90％乙醇洗滌真空干燥，即制得高取代的6-O-羧甲基殼聚糖，為淡黃色或白色粉末。
2、6-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖的制備A與鹵代烷反應(yīng)1g 6-O-羧甲基殼聚糖均勻分散在異丙醇中，加入2g NaOH，35℃堿化，攪拌下加入正辛氯，30℃反應(yīng)8h，調(diào)pH7，加丙酮沉淀，過濾，濾餅乙醚洗滌，樣品真空干燥即得6-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖。
元素分析測得脫乙酰化度為91.5％，羧甲基取代度為90％，辛基取代度為45％。
B與烷基醛反應(yīng)取6-O-羧甲基殼聚糖1g，混懸于甲醇或乙醇中，加入1.02g正辛醛，反應(yīng)1h后，加入NaBH4水溶液，繼續(xù)攪拌12h，NaOH液調(diào)pH7，甲醇沉淀，過濾，濾餅用濃度為80～90％的甲醇、丙酮和正己烷依次洗滌，真空干燥，即得6-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖。
元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，羧甲基取代度為90％，辛基取代度為48％。
實(shí)施例26-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖的制備(先接疏水基再接親水基)1、2-N-辛基殼聚糖的制備方法同實(shí)施例1中2，以殼聚糖代替6-O-羧甲基殼聚糖。
2、6-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖的制備方法同實(shí)施例1中1，以2-N-辛基殼聚糖代替殼聚糖元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，羧甲基取代度為95％，辛基取代度為48％。
實(shí)施例3
6-O-羧甲基-2-N-癸基殼聚糖的制備用正癸氯、正癸醛代替實(shí)施例1、2中的正辛氯、正辛醛，制備方法同實(shí)施例1、2。
元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，羧甲基取代度為98％，癸基取代度為40％。
實(shí)施例46-O-羧甲基-2-N-十二烷基殼聚糖的制備用十二烷基氯、十二烷基醛代替實(shí)施例1、2中的正辛氯、正辛醛，制備方法同實(shí)施例1、2。
元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，琥珀?；〈葹?6％，十二烷基取代度為39％。
實(shí)施例56-O-羧甲基-2-N-辛酰基殼聚糖的制備(先接親水基再接疏水基)1、6-O-羧甲基殼聚糖的制備制備方法同實(shí)施例1中的1。
2、6-O-羧甲基-2-N-辛?；鶜ぞ厶堑闹苽銩與酸酐反應(yīng)3.6g正辛酸(0.05mol)，滴入4ml醋酸酐，120℃蒸出醋酸，得到正辛酸酐。將6-O-羧甲基殼聚糖1g分散在甲醇中，攪拌下滴加正辛酸酐，40℃反應(yīng)8h，加入丙酮沉淀，過濾，濾餅用80％甲醇洗滌，真空干燥，即得6-O-羧甲基-2-N-辛?；鶜ぞ厶?。
B與酰鹵反應(yīng)2.88g正辛酸(0.02mol)，二氯亞砜6ml，50℃回流反應(yīng)3h，減壓蒸餾除去過量的二甲亞砜，加入少量無水乙醚待用。將1g羧6-O-甲基殼聚糖分散在二甲亞砜(含少量吡啶)中，攪拌下滴加辛酰氯，60℃反應(yīng)10h，加入丙酮沉淀，過濾，濾餅用丙酮洗滌，真空干燥，即得6-O-羧甲基-2-N-辛?；鶜ぞ厶?。
實(shí)施例66-O-羧甲基-2-N-辛?；鶜ぞ厶堑闹苽?先接疏水基再接親水基)1、2-N-辛?；鶜ぞ厶堑闹苽浞椒ㄍ瑢?shí)施例5中的2，以殼聚糖代替6-O-羧甲基殼聚糖。
2、6-O-羧甲基-2-N-辛?；鶜ぞ厶堑闹苽浞椒ㄍ瑢?shí)施例1中的1，以2-N-辛?；鶜ぞ厶谴鏆ぞ厶恰?br> 元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，羧甲基取代度為100％，辛?；〈葹?7％。
實(shí)施例76-O-羧甲基-2-N-癸?；鶜ぞ厶堑闹苽浞椒ㄍ瑢?shí)施例5，6，用正癸酰氯、正癸酸酐分別代替實(shí)施例5、6中的正辛酰氯、正辛酸酐。
元素分析測得脫乙酰化度為91.5％，羧甲基取代度為95％，癸?；〈葹?2％。
實(shí)施例86-O-羧甲基-2-N-十二烷酰基殼聚糖的制備制備方法同實(shí)施例5、6，用月桂酰氯、月桂酸酐分別代替實(shí)施例5、6中的正辛酰氯、正辛酸酐。
元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，羧甲基取代度為96％，N-十二烷酰基取代度為40％。
實(shí)施例96-O-羥乙基-2-N-辛基殼聚糖的制備——先接親水基團(tuán)，后接疏水基團(tuán)1、6-O-羥乙基殼聚糖的制備1g殼聚糖混懸于異丙醇中，加入5gNaOH、30℃攪拌堿化12h，冰浴下加入7ml環(huán)氧乙烷，室溫反應(yīng)2h，40℃反應(yīng)5h，加入一定量水，用NaOH水溶液調(diào)pH7，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸餾水中室溫透析72h，過濾，濾液凍干即制得高取代的6-O-羥乙基殼聚糖。
2、6-O-羥乙基-2-N-辛基殼聚糖的制備方法同實(shí)施例1中的2，以6-O-羥乙基殼聚糖代替6-O-羧甲基殼聚糖。
元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，羥乙基取代度為91％，辛基取代度為的取代度為39％。
實(shí)施例106-O-羥乙基-2-N-辛基殼聚糖的制備——先接疏水基團(tuán)，再接親水基團(tuán)1、2-N-辛基殼聚糖的制備方法同實(shí)施例2中1。
2、6-O-羥乙基-2-N-辛基殼聚糖的制備方法同實(shí)施例9中1，以2-N-辛基殼聚糖代替殼聚糖。
元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，羥乙基取代度為87％，辛基取代度為35％。
實(shí)施例116-O-羥乙基-2-N-癸基殼聚糖的制備用正癸氯、正癸醛代替實(shí)施例9、10中的正辛氯、正辛醛，制備方法同實(shí)施例9、10。
元素分析測得脫乙酰化度為91.5％，羥乙基取代度為90％，N-癸基取代度為30％。
實(shí)施例126-O-羥乙基-2-N-十二烷基殼聚糖的制備用月桂氯、十二烷基醛代替實(shí)施例9、10中的正辛氯、正辛醛，制備方法同實(shí)施例9、10。
元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，羥乙基取代度為92％，十二烷基取代度為32％。
實(shí)施例136-O-羥乙基-2-N-辛?；鶜ぞ厶堑闹苽洹椒ㄒ?、6-O-羥乙基殼聚糖的制備方法同實(shí)施例9的1。
2、6-O-羥乙基-2-N-辛?；鶜ぞ厶堑闹苽浞椒ㄍ瑢?shí)施例5的2，以6-O-羥乙基殼聚糖代替6-O-羧甲基殼聚糖。
元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，羥乙基取代度為95％，辛酰基取代度為35％。
實(shí)施例146-O-羥乙基-2-N-辛?；鶜ぞ厶堑闹苽洹椒ǘ?、2-N-辛?；鶜ぞ厶堑闹苽浞椒ㄍ瑢?shí)施例5的2，以殼聚糖代替6-O-羧甲基殼聚糖。
2、6-O-羥乙基-2-N-辛?；鶜ぞ厶堑闹苽浞椒ㄍ瑢?shí)施例9的1，以辛?；鶜ぞ厶谴鏆ぞ厶?。
元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，羥乙基取代度為92％，辛酰基取代度為40％。
實(shí)施例156-O-羥乙基-2-N-癸?；鶜ぞ厶堑闹苽浞椒ㄍ瑢?shí)施例13、14，用癸酰氯、癸酸酐分別代替實(shí)施例13、14中的辛酰氯、辛酸酐。
元素分析測得脫乙酰化度為91.5％，羥乙基取代度為92％，癸?；〈葹?2％。
實(shí)施例166-O-羥乙基-2-N-十二烷酰基殼聚糖的制備方法同實(shí)施例13、14，用月桂酰氯、月桂酸酐、分別代替實(shí)施例13、14中的正辛酰氯、正辛酸酐。
元素分析測得脫乙?；葹?1.5％，羥乙基取代度為89％，十二烷?；〈葹?8％。
實(shí)施例17兩親性殼聚糖衍生物膠束的制備及膠束粒徑測定將兩親性殼聚糖衍生物40mg溶解在7ml水中于50℃攪拌2h，然后冰浴下超聲30min后，用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm，25℃，He-Ne激光測定，實(shí)施例1～16衍生物粒徑在150～300nm，如6-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖膠束粒徑為175nm，6-O-羧甲基-2-N-辛?；鶜ぞ厶悄z束粒徑為167nm，6-O-羥乙基-2-N-辛基殼聚糖膠束粒徑為188nm，6-O-羥乙基-2-N-辛酰基殼聚糖膠束粒徑206nm。
實(shí)施例181、包含紫杉醇兩親性殼聚糖衍生物膠束的制備(1).透析法兩親性殼聚糖衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃攪拌2h。紫杉醇30mg溶解在1ml乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，冰浴超聲30min后，用透析袋(MWCO12000～14000)在蒸餾水中室溫透析12h，離心3000rpm 5min，用0.45μm濾膜過濾，冷凍干燥。用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm，25℃，He-Ne激光測定6-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖膠束粒徑為238nm，Zeta電位為-25mV，HPLC測得溶液濃度為2.968mg/mL，載藥量為34.40％(w/w)，包封率為89.90％。6-O-羥乙基-2-N-辛基殼聚糖膠束粒徑為203nm，Zeta電位為+18mV，HPLC測得溶液濃度為2.060mg/mL，載藥量為26.67％(w/w)，包封率為76.23％。
(2).溶劑揮發(fā)法兩親性殼聚糖衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃攪拌2h，紫杉醇30mg溶解在1mL氯仿中。然后在室溫?cái)嚢柘聦⒍呷芤夯旌?，繼續(xù)攪拌過夜，使氯仿?lián)]發(fā)，離心(3000rpm)5min，用0.22μm濾膜過濾，冷凍干燥。HPLC測得6-O-羧甲基-2-N-辛基殼聚糖膠束溶液濃度為0.8310mg/ml，載藥量為12.78％(w/w)，包封率為24.93％；6-O-羥乙基-2-N-辛基殼聚糖膠束，溶液濃度為0.67mg/ml，載藥量為10.57％(w/w)，包封率為20.10％。
2、兩親性殼聚糖衍生物膠束中紫杉醇含量的測定用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法進(jìn)行含量測定。流動(dòng)相為甲醇∶水＝75∶25(v/v)，色譜柱為Lichrospher C18(150×4.6mm)，柱子粒徑為5μm。流速為1.0mL/min，檢測波長為227nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱溫為30℃，注射樣品體積為20μl。
權(quán)利要求
1.一種藥物增溶載體，其特征在于該載體是在殼聚糖骨架6位和2位分別引入親水性的羧甲基或羥乙基和疏水性的烷基或烷?；?，使其能在水中自組合成納米膠束的具有兩親性的殼聚糖衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物增溶載體，其特征在于親水性的羧甲基或羥乙基取代殼聚糖6位羥基和2位氨基，以6位羥基為主，總?cè)〈?0～120％，并且疏水性的烷基或烷?；〈鷼ぞ厶?位羥基和2位氨基，以2位氨基為主，總?cè)〈?0～60％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物增溶載體，其特征在于疏水烷基或?；奶荚訑?shù)不低于5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物增溶載體，其特征在于所選用的殼聚糖分子量5×103～1×106，脫乙酰度為＞70％。
5.權(quán)利要求1所述的藥物增溶載體的制備方法，其特征在于包括下列步驟將殼聚糖分散于異丙醇或甲醇中，采用提供親水基團(tuán)的物質(zhì)與殼聚糖骨架上的6位羥基和2位氨基進(jìn)行取代反應(yīng)，在堿性條件下30～50℃攪拌反應(yīng)3～10h，使其主要在6位羥基取代；再采用提供疏水基團(tuán)的物質(zhì)與殼聚糖骨架上的2位氨基和6位羥基進(jìn)行取代反應(yīng)，堿性條件下40～70℃反應(yīng)4～12h，使其主要取代在2位氨基；親水基和疏水基的取代反應(yīng)順序可前后顛倒；控制殼聚糖脫乙酰度為＞70％，親水基總?cè)〈葹?0～120％，疏水基總?cè)〈葹?0～60％即可。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于提供親水基團(tuán)的物質(zhì)是氯乙酸、環(huán)氧乙烷；提供疏水基團(tuán)的物質(zhì)是碳原子數(shù)均不小于5的鹵代烴、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰鹵。
7.權(quán)利要求1所述的藥物增溶載體在制備難溶或微溶于水的藥物的增溶制劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的難溶或微溶于水的藥物是紫杉烷類、環(huán)孢素類、喜樹堿類、黃酮類、二氫吡啶類、小蘗堿類、長春堿類、蒽醌類、鬼臼毒素類抗腫瘤藥或者難溶或微溶于水的非甾體抗炎藥中的任一物質(zhì)或其衍生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的難溶于水的藥物是紫杉烷類抗腫瘤藥。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于該藥物增溶載體的使用方法是將所述兩親性殼聚糖衍生物與水按重量比為3～50∶1000的比例溶解，得到兩親性殼聚糖衍生物納米膠束；將治療有效量的難溶或微溶于水的有機(jī)藥物用藥學(xué)上可接受溶劑溶解后，與所述兩親性殼聚糖衍生物納米膠束混合后，經(jīng)超聲處理，溶液用截留分子量為12000～14000的透析袋透析，凍干制得粒徑為10～1000nm的聚合物膠束即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藥物增溶載體及其制備方法和應(yīng)用。該載體是在殼聚糖骨架6位和2位分別引入親水性的羧甲基或羥乙基和疏水性的烷基或烷?；?，使其能在水中自組合成納米膠束的具有兩親性的殼聚糖衍生物。該載體臨界聚集濃度低，載藥量高、毒性小、藥物包封率高，納米膠束穩(wěn)定，可作為難溶或微溶性藥物的載體，本發(fā)明制備方法簡單，工藝成熟，適于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K9/19GK1840198SQ200610037810
公開日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2006年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月16日
發(fā)明者周建平, 霍美蓉, 魏彥, 張勇, 許向陽, 李玲, 張祖菲 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)