專利名稱：抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA在食管癌細(xì)胞移動侵襲研究中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及siRNA領(lǐng)域，具體地說，涉及抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA在食管癌細(xì)胞移動侵襲研究中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的同源靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默的過程，RNAi可以通過人為的引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA，誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因mRNA降解，從而達(dá)到減少基因表達(dá)的目的。RNAi技術(shù)作為新興的基因阻斷技術(shù)，具有明顯的優(yōu)勢，它具有高度的特異性，干擾效率高而且操作簡單。因此以及廣泛的應(yīng)用于基因功能研究以及抗病毒感染、腫瘤治療等熱點領(lǐng)域。
食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重影響人類健康。全世界食管癌患者術(shù)后5年生存率僅為20％-30％。造成食管癌預(yù)后差的一個重要原因是其轉(zhuǎn)移性強，有些病人甚至在確診時已經(jīng)發(fā)生了局部組織浸潤和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。
侵襲和轉(zhuǎn)移是多因素參與的、多步驟完成的分子生物學(xué)變化過程。腫瘤細(xì)胞具有很強的遷移能力，使得它能克服細(xì)胞與細(xì)胞間以及細(xì)胞和基質(zhì)間的粘附作用侵入周圍組織。侵襲性強的細(xì)胞通常都有細(xì)胞突觸多、細(xì)胞間粘附減弱以及通訊連接喪失等特點?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的這些惡性征是由于肌動蛋白結(jié)合蛋白以及一些相關(guān)的連接蛋白引起的細(xì)胞骨架重組所致。
在這些骨架相關(guān)蛋白中，我們研究的是Ezrin。Ezrin基因又稱VIL2，定位于染色體6q25.2～q26，其表達(dá)產(chǎn)物Ezrin蛋白是ERM(ezrin-radixin-moesin)家族成員之一，主要參與細(xì)胞中細(xì)胞骨架與胞膜之間的連接，具有維持細(xì)胞形態(tài)和運動、連接粘附分子及調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。
越來越多的證據(jù)表明Ezrin調(diào)控腫瘤發(fā)展。轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞系及組織樣品中基因表達(dá)的對比結(jié)果顯示，來自嚙齒動物乳腺、人胰腺和結(jié)腸的癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞中Ezrin的表達(dá)顯著提高；同時，Ezrin在多種人類腫瘤中強烈表達(dá)，這些腫瘤包括骨肉瘤、黑色素瘤、星形細(xì)胞瘤、胰腺癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等；進(jìn)一步的研究顯示抑制Ezrin蛋白能消除鼠科動物橫紋肌肉瘤和骨肉瘤細(xì)胞，Ezrin很可能是惡性腫瘤的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子?，F(xiàn)有的研究還提示Ezrin參與腫瘤細(xì)胞的粘附、凋亡尤其是移動侵襲等生物學(xué)過程，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
食管癌中Ezrin的表達(dá)情況最近才得到了初步的闡明，在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)在永生化食管上皮細(xì)胞SHEE向食管癌細(xì)胞SHEEmt的惡性轉(zhuǎn)化過程中Ezrin發(fā)揮著重要的作用。我們最近對食管癌臨床組織樣本的研究也揭示食管癌中Ezrin的表達(dá)模式發(fā)生了改變。然而，Ezrin在食管癌及其它腫瘤中的功能及其表達(dá)改變的機制至今仍未得到很好的闡明。如能應(yīng)用RNAi技術(shù)來抑制食管癌細(xì)胞中Ezrin基因的表達(dá)，從而探討Ezrin在食管癌細(xì)胞中的功能，這將有助于從分子水平闡明Ezrin在這些上皮來源的腫瘤組織細(xì)胞表達(dá)改變的機制，從而為揭開食管癌的發(fā)病機制及治療提供有用的線索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA在食管癌細(xì)胞移動侵襲研究中的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的可以通過以下措施實現(xiàn)。
設(shè)計抑制Ezrin基因表達(dá)的雙鏈siRNA片段依據(jù)Dharmacon公司在網(wǎng)上提供的設(shè)計軟件設(shè)計了兩組siRNA。其堿基序列及作用部位如下E1(SEQ ID NO1)5’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATAGTGGATTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTATCCACATAGTGGAGGG 3’作用于人Ezrin mRNA的第274-292；E2(SEQ ID NO2)5’GATCCCCACTTTGGCCTCCACTATGTTTCAAGAGAACATAGTGGAGGCCAAAGTTTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAAACTTTGGCCTCCACTATGTTCTCTTGAAACATAGTGGAGGCCAAAGTGGG 3’作用于人Ezrin mRNA的第265-283。
本發(fā)明的可以產(chǎn)生抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA的載體，其具有以下的基本結(jié)構(gòu)由啟動子、Ezrin編碼區(qū)、終止密碼、DNA序列順序連接而成的環(huán)狀雙鏈DNA分子；啟動子為可啟動產(chǎn)生siRNA的序列，它是啟動它的下游緊鄰之基因的表達(dá)的元件；啟動子優(yōu)選polymerase-III H1-RNA基因啟動子。
Ezrin編碼區(qū)為表達(dá)權(quán)利要求1所述的siRNA的編碼區(qū)，由19個核苷酸組成，可采用雙向結(jié)合或以發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)形成雙鏈RNA；終止密碼為5～6個T；DNA序列為任何真核質(zhì)粒載體和/或病毒的介于RNA編碼區(qū)和啟動子之間的DNA序列，含有質(zhì)粒載體DNA的復(fù)制起始位點，或含有抗生素抗性基因，包括使細(xì)菌獲得對抗某種抗生素的抗性的基因或使真核細(xì)胞獲得某種抗生素的抗性的基因。所述任何真核質(zhì)粒載體和/或病毒優(yōu)選pSUPER.neo載體。所述抗生素抗性基因優(yōu)選抗生素G418抗性基因neo。
上述載體pSUPER.neo(Oligoengine)具有以下優(yōu)點(1)具有polymerase-IIIH1-RNA基因啟動子，可以產(chǎn)生一個不含多聚腺苷酸尾的小RNA轉(zhuǎn)錄子；(2)可以很精確的啟動轉(zhuǎn)錄；(3)終止信號包含有T5；(4)在第二個尿嘧啶的后面終止轉(zhuǎn)錄，可以產(chǎn)生和合成的siRNA相類似的末端，即3’端含兩個不配對的胸腺嘧啶或尿嘧啶。這個載體能在哺乳動物細(xì)胞里面穩(wěn)定的表達(dá)siRNA，而且還含有neo基因，可以用G418篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，建立細(xì)胞系，適合于做長期的研究。
根據(jù)pSUPER.neo載體圖，我們在線性化載體時采用依次酶切法。同時由于插入siRNA后的載體其Bgl II的酶切位點將被破壞，因此我們在連接后轉(zhuǎn)化之前重新用Bgl II處理半小時，把自身環(huán)化的載體重新酶切成線性，以降低平板克隆生長背景，大大提高陽性質(zhì)粒的篩選的效率。陽性質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和Hind III酶切后可獲得一287bp的片斷，而空載體則可切出一227bp的片斷，因此我們采用了更為敏感的非變性聚丙烯電泳加銀染鑒定的辦法進(jìn)行重組子的篩選。
將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)食管癌細(xì)胞系EC109。為獲得穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞，我們首先使用濃度較高的G418進(jìn)行藥物篩選。轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒PSC和轉(zhuǎn)染以上siRNA的細(xì)胞(分別稱為PSE1和PSE2)的EC109細(xì)胞，由于質(zhì)粒載體上有neo基因，具有G418抗性，因此得以存活；而相比之下，未轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒的對照EC109細(xì)胞則因G418的毒性作用而被殺死。為防止連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中，表達(dá)質(zhì)粒的丟失，仍將細(xì)胞置于藥物濃度相對較低的生長環(huán)境中培養(yǎng)，如果質(zhì)粒丟失，細(xì)胞仍會因G418的毒性作用而被殺死。在上述條件下，細(xì)胞能夠持續(xù)生長，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒的EC109細(xì)胞株已被成功建立。
篩選出來的細(xì)胞株首先進(jìn)行干擾效果的分析。本發(fā)明用RT-PCR和Western blotting分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平，干擾后的細(xì)胞Ezrin表達(dá)均明顯降低，而且轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的細(xì)胞Ezrin基因的表達(dá)未受影響，結(jié)果同時還顯示干擾效果的比較為PSE1＞PSE2。此外，連續(xù)幾代的細(xì)胞總蛋白中Ezrin表達(dá)的檢測也顯示干擾的效果非常的穩(wěn)定。
確定有良好的干擾效果的siRNA用于以下食管癌細(xì)胞粘附、移動以及侵襲能力的研究。
以未處理的EC109細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的PSC細(xì)胞作對照檢測了Ezrin低表達(dá)對細(xì)胞粘附的影響。結(jié)果顯示PSE1、PSE2細(xì)胞的粘附能力明顯較PSC和對照EC109的減弱，提示Ezrin表達(dá)降低可引起細(xì)胞粘附能力的減弱。
應(yīng)用Chamber細(xì)胞移動實驗和細(xì)胞侵襲實驗分別檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化，結(jié)果顯示Ezrin下調(diào)表達(dá)后細(xì)胞的移動性和侵襲性分別比未處理的EC109細(xì)胞減弱了60％和75％，提示Ezrin和細(xì)胞的移動侵襲相關(guān)。
為進(jìn)一步探討Ezrin影響細(xì)胞侵襲的機制，本發(fā)明收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并作了酶譜分析，結(jié)果可見，PSC、PSE1、PSE2和對照EC109細(xì)胞中均出現(xiàn)了分別代表金屬蛋白酶MMP-2(72kD)和MMP-9(92kD)的條帶。但PSE1、PSE2中MMP-2和MMP-9的條帶均比PSC、EC109的弱，而PSC和EC109之間則未見明顯區(qū)別。提示Ezrin的下調(diào)表達(dá)使MMP-2和MMP-9的活性減弱，從而影響了細(xì)胞的侵襲性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明設(shè)計、合成了靶向人Ezrin基因的兩對siRNA，并成功構(gòu)建了它們在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)載體。同時，運用這些siRNA可以有效、特異地干擾Ezrin的表達(dá)，建立了食管癌Ezrin低表達(dá)細(xì)胞株，為深入研究食管癌及其它Ezrin相關(guān)腫瘤中Ezrin的功能打下了堅實的基礎(chǔ)。本發(fā)明還研究了Ezrin與食管癌細(xì)胞粘附以及移動侵襲的關(guān)系，為揭示食管癌的發(fā)病機制以及食管癌的治療提供了重要線索。


圖1為siRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)示意圖；圖2載體構(gòu)建示意圖；圖3為Ezrin基因siRNA哺乳動物內(nèi)表達(dá)載體PSE的酶切鑒定圖；圖4為陽性質(zhì)粒的測序鑒定圖；圖5為Ezrin干擾效果的檢測；圖6為pSUPER.neo載體圖；圖7為移動實驗圖；圖8為侵襲實驗圖；圖9為條件培養(yǎng)基酶譜分析結(jié)果；圖10為粘附實驗圖。
其中，圖3中，1、2泳道為陽性質(zhì)粒，3泳道為陰性對照，第4泳道為100bp DNA marker。圖5中，(A)干擾效果的Western blotting檢測；(B)干擾穩(wěn)定性的檢測；(C)干擾效果的RT-PCR檢測；β-actin和GAPDH分別作為的Western blotting和RT-PCR的上樣對照。圖7中，(A)穿過的細(xì)胞Giemsa染色圖，空箭頭所示為細(xì)胞，實箭頭的為膜上的孔，a，PSE1；b，PSE2；c，PSC；d，EC109；(B)穿過的細(xì)胞計數(shù)所得的柱形圖。圖8中，(A)穿過的細(xì)胞Giemsa染色圖，空箭頭所示為細(xì)胞，實箭頭的為膜上的孔；a，PSE1；b，PSE2；c，PSC；d，EC109；(B)穿過的細(xì)胞計數(shù)所得的柱形圖。圖10中，(A)粘附的細(xì)胞；a，PSE1；b，PSE2；c，PSC；d，EC109；(B)粘附細(xì)胞數(shù)比較。
具體實施例方式
實施例1靶向Ezrin基因的siRNA設(shè)計、合成和退火。
依據(jù)Dharmacon公司在網(wǎng)上提供的設(shè)計軟件設(shè)計了兩組siRNA序列，如表1表1

設(shè)計的原則如下(1)從mRNA的AUG起始密碼開始，尋找5’AA(N19)TT，其中N是任意堿基，結(jié)構(gòu)長度為19bp的序列(如表1)；(2)目標(biāo)序列上不能連續(xù)出現(xiàn)3個或者三個以上的G或者C；(3)干擾序列避免在靶基因的首末端；(4)選擇GC含量在30％-52％之間的序列；(5)靶向ORF區(qū)；(6)挑選的序列在公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較；克隆入siRNA表達(dá)載體中的DNA片段包括兩個短的反向重復(fù)序列，中間由發(fā)夾序列分隔，隨后接上5-6個T作為RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄終止子；片段的5’端加BglII的酶切位點，而3’端則含有HindIII的酶切位點(見圖1)。整理好的序列送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。
合成的寡核苷酸序列(2OD)加入66μl的無核酸酶水中(終濃度為1μg/μl)，充分溶解。退火時，在一新的離心管中依次加入下列試劑(總體積50μl)siRNA正反義鏈各3μl，加上44μl的退火緩沖液(10Mm NaCl，50mM Hepes，pH74)，充分混勻后在PCR儀上完成以下操作94℃ 4min，80℃ 4min，75℃ 4min，然后是70℃ 10min，37℃ 20min，最后冷卻到25℃。產(chǎn)物可以直接用于連接或者保存于4℃。
實施例2表達(dá)載體PSE1和PSE2的構(gòu)建1.載體的線性化及回收在離心管中依次加入下列試劑(總體積50μl)無菌水37.5μl、pSUPER.neo載體5μl、10×緩沖液B 5μl、乙?；疊SA(10mg/ml)0.5μl和HindIII(20u/μl)2μl?；靹蚝?，37℃水浴孵育1h后繼續(xù)往混合物中加入Bgl II(20u/μl)2μl，在37℃水浴再孵育1h。取5μl電泳進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，以未酶切質(zhì)粒為對照，鑒定載體是否已成線性。參照Quick PCR purification kit說明書回收線性pSUPER.neo載體片段。
在酶切混合液中加入5倍體積的PB緩沖液，然后將此混合液轉(zhuǎn)移至QIAquick spin柱，12000×g離心1min；棄流出液，在QIAquickspin柱加入750μl PE緩沖液，12000×g離心1min，棄流出液；將QIAquick spin柱放回原收集管，12000×g再離心1min；接著將QIAquick spin柱轉(zhuǎn)移至一干凈1.5ml離心管中，并加入30μl EB緩沖液于柱中心，室溫下放置1min，室溫下12000×g離心1min。取2μl回收液進(jìn)行電泳，確定回收成功，剩余回收液-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2.將退火后的siRNA連接進(jìn)線性化的載體中退火后的siRNA與線性pSUPER.neo載體的連接。在一新的離心管內(nèi)依次加入以下試劑(冰上操作)2×T4DNA連接酶緩沖液5μl、線狀pSUPER.neo載體1μl、siRNA 3μl和T4 DNA連接酶1μl，混勻，25℃循環(huán)水浴1h。轉(zhuǎn)化前加入1μl Bgl II處理半小時。
3.將連接產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞——JM109。生長出的克隆擴增后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定取2μl質(zhì)粒DNA，加入2μl 10×buffer，2μl乙?；疊SA，8μl無菌水和3μl EcoR I和3μlHindIII限制性內(nèi)切酶。37℃水浴4～5h。8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，并進(jìn)行銀染鑒定，步驟如下10％乙醇固定30min；1％硝酸處理8min；超純水洗兩次后用0.2％的硝酸銀染色30min，然后在3％無水碳酸鈉與0.1％的甲醛組成的顯色液中顯色數(shù)分鐘，最后在10％的冰乙酸中定影。按照載體圖，含有siRNA的重組子經(jīng)酶切后可見287bp的片斷，而空載體對照則可切出227bp的片斷。篩選出的陽性克隆再進(jìn)行測序獲得表達(dá)質(zhì)粒(圖2、3、4)。
實施例3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及干擾效果的分析鑒定后的重組子轉(zhuǎn)染進(jìn)人食管癌細(xì)胞系EC109細(xì)胞，同時還轉(zhuǎn)染空載體做對照。為獲得穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞，我們首先使用濃度較高的G418(400μg/ml)進(jìn)行藥物篩選。轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒PSC和轉(zhuǎn)染以上siRNA的細(xì)胞(分別稱為PSE1和PSE2)的EC109細(xì)胞，由于質(zhì)粒載體上有neo基因，具有G418抗性，因此得以存活；而相比之下，未轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒的對照EC109細(xì)胞則因G418的毒性作用而被殺死。為防止連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中，表達(dá)質(zhì)粒的丟失，仍將細(xì)胞置于藥物濃度相對較低的生長環(huán)境中培養(yǎng)(200μg/ml)，如果質(zhì)粒丟失，細(xì)胞仍會因G418的毒性作用而被殺死。在上述條件下，細(xì)胞能夠持續(xù)生長，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒的EC109細(xì)胞株已被成功建立。
轉(zhuǎn)染的方法為首先，在玻璃試管中加入97μl無血清培養(yǎng)基，然后直接往里加入3μl FuGENE6(Roche公司)轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻后室溫下靜置5min。取1μg質(zhì)粒(PSE質(zhì)粒和pSUPER.neo空載體)加入以上的混合物中，輕輕混勻。室溫下靜置15min后，取以上混合物加入培養(yǎng)皿中，置于5％CO2、濕度95％和37℃條件下培養(yǎng)。24h后，把培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液換為含有G418(400mg/L)的常規(guī)199培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。14天后，抗藥克隆長出，換為培養(yǎng)液中含200mg/LG418的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，傳代擴增。
篩選建立的細(xì)胞株用于干擾效果的分析。本發(fā)明分別用RT-PCR和Western blotting的方法從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行干擾效果的分析。提取細(xì)胞總蛋白Western blotting分析，結(jié)果提示(圖5A)PSE1和PSE2在蛋白水平上對Ezrin均有不同程度的干擾效果，而轉(zhuǎn)染空載體的PSC和未作處理的EC109細(xì)胞之間Ezrin表達(dá)無差異，其中PSE1較對照減弱了87％，而PSE2則為75％。提取細(xì)胞總RNA，用人Ezrin特異性的引物進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示在RNA水平PSE1和PSE2中Ezrin的表達(dá)均較兩個對照減弱，且PSE1＞PSE2(圖5C)，這與Westernblotting的結(jié)果一致。經(jīng)過連續(xù)的傳代，分別收獲第7、8、9代細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測，以確定干擾的穩(wěn)定性(圖5B)。結(jié)果顯示各代均有明顯干擾效果而且程度比較穩(wěn)定。
實施例4Ezrin與EC109細(xì)胞移動和侵襲性的關(guān)系應(yīng)用Chamber細(xì)胞移動實驗和細(xì)胞侵襲實驗分別檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化，結(jié)果顯示Ezrin下調(diào)表達(dá)后細(xì)胞的移動性和侵襲性分別比未處理的EC109細(xì)胞和PSC細(xì)胞減弱了(移動性PSE1較對照減弱了60％，PSE2減弱55％；侵襲性PSE1較對照減弱了75％，PSE2減弱60％)，提示Ezrin和細(xì)胞的移動侵襲相關(guān)(圖7、8)。為進(jìn)一步探討Ezrin影響細(xì)胞侵襲的機制，本發(fā)明收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并作了酶譜分析，結(jié)果可見，PSC、PSE1、PSE2和對照EC109細(xì)胞中均出現(xiàn)了分別代表金屬蛋白酶MMP-2(72kD)和MMP-9(92kD)的條帶。但PSE1、PSE2中MMP-2和MMP-9的條帶均比PSC、EC109的弱，而PSC和EC109之間則未見明顯區(qū)別(圖9)。提示Ezrin的下調(diào)表達(dá)使MMP-2和MMP-9的活性減弱，從而影響了細(xì)胞的侵襲性。
移動和侵襲實驗的方法在Transwell侵襲小室(Invitrigen，8μm濾孔)膜內(nèi)側(cè)表面均勻涂布60μl Matrigel(BD，Biosciences，原液11.1mg/ml，用無血清199培養(yǎng)液按1∶3稀釋)，室溫下放置1h。于小室上室內(nèi)分別加入200μl重懸于無血清199培養(yǎng)液中的細(xì)胞(含1×105個細(xì)胞)，下室加600μl含10％小牛血清的常規(guī)199，置37℃，5％CO2培養(yǎng)24h。取出小室棄除上室液體，用棉簽擦盡上室膜面未穿膜的細(xì)胞，室溫下甲醇固定5min，Giemsa常規(guī)染色，中性樹膠封片，400倍光鏡下計數(shù)10個視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，取其平均值，以侵襲細(xì)胞的相對數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。每組重復(fù)3次。移動實驗除了不用在Transwell小室內(nèi)表面涂Matrigel外，其余步驟和上述侵襲實驗相同。
酶譜法細(xì)胞長成單層后，用1×PBS洗三次，以洗去細(xì)胞表面殘留的血清；然后加入5ml不含血清的培養(yǎng)液，37℃，5％CO2中繼續(xù)培養(yǎng)，24h后，收集培養(yǎng)液；取1ml此條件培養(yǎng)液用蛋白濃縮柱(Pall公司)濃縮至約10μl，與2×SDS樣品緩沖液等體積混勻進(jìn)入下一步實驗；剩余條件培養(yǎng)液保存于-20℃。將制備好的樣品置于37℃水浴中溫育30min，稍離心后，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(40V下，約需4h)。電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.5，2.5％Triton X-100)在室溫?fù)u動下洗滌1h，其間換液一次。然后加入孵育緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl and10mM CaCl2)沒過膠面，用保鮮膜包好平皿，至37℃恒溫箱中，其間換液一次，24h后取出，棄去孵育緩沖液，加入0.1％考馬斯亮蘭染液染色約30min，回收染液，加入脫色液(40％甲醇，10％乙酸)脫色至蘭色背景和白色條帶均十分明顯時，用5％乙酸中止脫色。用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果，以白色條帶的凈光密度值相對定量樣品中酶活性。
實施例5Ezrin與EC109細(xì)胞粘附性的關(guān)系以未處理的EC109細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的PSC細(xì)胞作對照檢測了Ezrin低表達(dá)對細(xì)胞粘附的影響。結(jié)果顯示PSE1、PSE2細(xì)胞的粘附能力明顯較PSC和對照EC109的減弱，其中PSE1減弱了66％，PSE2減弱了45％，提示Ezrin表達(dá)降低可引起細(xì)胞粘附能力的減弱(圖10)。
粘附實驗實施方法為參照Malinda等的方法(1999)，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在孔的底部均勻涂布50μl的Matrigel(BD，Biosciences，原濃度10mg/ml，用無血清199培養(yǎng)基10倍稀釋使用)。37℃孵育1h后用無血清199洗去表面未凝凝膠。每孔加入100μl 0.1％BSA，37℃孵育1-2h。同時用胰酶消化各種細(xì)胞并用無血清199制成細(xì)胞懸液。棄去封閉液，用無血清199洗三次后每孔加入4×105細(xì)胞，置37℃，5％CO2培養(yǎng)1h。棄去培養(yǎng)液，無血清199洗三次。每孔加入150μl無血清199和50μl1mg/ml的MTT，輕輕混勻，置37℃，5％CO2培養(yǎng)3-4h。棄上清，每孔加入100μlDMSO原液，搖床上混勻10分鐘后上酶標(biāo)儀測定490和630nm波長A值。每次實驗設(shè)九個平行孔和三個空白孔(不加凝膠，其余同)，實驗重復(fù)三次。
所有實驗均表明，本發(fā)明所提供的siRNA表達(dá)載體能有效的在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA并能特異、高效的干擾Ezrin的表達(dá)，為研究Ezrin提供很好的工具。同時實驗還證明Ezrin參與食管癌細(xì)胞的粘附、移動以及侵襲等生物學(xué)過程，為研究食管癌的發(fā)病機制和治療提供線索。
抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA在食管癌細(xì)胞移動侵襲研究中的應(yīng)用序列表SEQUENCE LISTING<110>汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院<120>抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA在食管癌細(xì)胞移動侵襲研究中的應(yīng)用<130>
<160>4<170>Patent In version 3.2<210>1<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>1E15’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATAGTGGATTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTATCCACATAGTGGAGGG 3’<210>2<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>2E25’GATCCCCACTTTGGCCTCCACTATGTTTCAAGAGAACATAGTGGAGGCCAAAGTTTTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAAACTTTGGCCTCCACTATGTTCTCTTGAAACATAGTGGAGGCCAAAGTTGGG 3’<210>3<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>35′TCCACTATGTGGATAATAA3′<210>4<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>45′ACTTTGGCCTCCACTATGT3′
權(quán)利要求
1.抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA在食管癌細(xì)胞移動侵襲研究中的應(yīng)用，所述抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA是下列雙鏈RNA中的一種或兩種，其堿基序列及作用部位如下E15’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATAGTGGATTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTATCCACATAGTGGAGGG 3’作用于人Ezrin mRNA的第274-292；E25’GATCCCCACTTTGGCCTCCACTATGTTTCAAGAGAACATAGTGGAGGCCAAAGTTTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAAACTTTGGCCTCCACTATGTTCTCTTGAAACATAGTGGAGGCCAAAGTGGG 3’作用于人Ezrin mRNA的第265-283。
全文摘要
本發(fā)明涉及siRNA領(lǐng)域，公開了抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA在食管癌細(xì)胞移動侵襲研究中的應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計、合成了靶向人Ezrin基因的兩對siRNA，并成功構(gòu)建了它們在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)載體。同時，運用這些siRNA可以有效、特異地干擾Ezrin的表達(dá)，建立了食管癌Ezrin低表達(dá)細(xì)胞株，為深入研究食管癌及其它Ezrin相關(guān)腫瘤中Ezrin的功能打下了堅實的基礎(chǔ)。本發(fā)明還研究了Ezrin與食管癌細(xì)胞粘附以及移動侵襲的關(guān)系，為揭示食管癌的發(fā)病機制以及食管癌的治療提供了重要線索。
文檔編號A61P35/04GK1927404SQ20061003749
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月5日
發(fā)明者許麗艷, 謝劍君, 李恩民 申請人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院