專利名稱：脫酰胺基干擾素－β的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體處于生物學(xué)活性蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及因半胱氨酸、天冬酰胺和其它殘基的取代、缺失或修飾而不同于天然蛋白質(zhì)的突變和化學(xué)改變的干擾素β類似物。
2.背景技術(shù)發(fā)現(xiàn)干擾素β能用于治療人類疾病，包括多發(fā)性硬化癥。多發(fā)性硬化癥(MS)是在環(huán)繞神經(jīng)纖維的保護(hù)性鞘破壞時(shí)發(fā)生的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，其往往致殘。約30％的MS患者具有復(fù)發(fā)-緩解形式的該疾病，在該形式中癥狀在發(fā)作后可完全或部分消失，然后是持續(xù)數(shù)月或數(shù)年的穩(wěn)定期。已證實(shí)給予β干擾素(干擾素-β或IFN-β)能降低MS發(fā)作的頻率。因此，干擾素-β藥物成為控制和治療MS的重要工具。
已開(kāi)發(fā)了重組DNA(rDNA)技術(shù)來(lái)促進(jìn)大規(guī)模生產(chǎn)干擾素-β藥物。這些技術(shù)特別需要解決的問(wèn)題是人β干擾素(其氨基酸序列見(jiàn)圖1(SEQ ID NO1))在17、31和141位含有半胱氨酸殘基(Gene，(1980)，1011-15和Nature，(1980)，285542-547)，這些殘基中至少一些對(duì)其活性不重要，但能隨意形成不希望的分子間或分子內(nèi)連接。在采用rDNA技術(shù)進(jìn)行IFN-β的微生物制備過(guò)程中，觀察到在含有高濃度的IFN-β的提取物中因分子間連接而形成IFN-β的二聚體和寡聚體。形成這種多聚體使得IFN-β的純化和分離費(fèi)力費(fèi)時(shí)，在純化和分離過(guò)程中需要數(shù)個(gè)額外步驟，例如在純化過(guò)程中還原蛋白質(zhì)，再氧化使其恢復(fù)其原始構(gòu)象，從而可能增加不正確二硫鍵的形成。此外，該多聚體與低特異性生物學(xué)活性相關(guān)。
為解決此問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了精細(xì)rDNA技術(shù)改變微生物產(chǎn)生的生物學(xué)活性IFN-β蛋白質(zhì)類似物，所述技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)類似物活性沒(méi)有不利影響但能降低或消除它們形成分子間交聯(lián)或分子內(nèi)鍵從而使得蛋白質(zhì)采取不良四級(jí)結(jié)構(gòu)(例如，降低蛋白質(zhì)活性的構(gòu)象)的能力。已成功地采用定向誘變技術(shù)來(lái)形成突變(方式)改變的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)類似物(本文用“蛋白質(zhì)類似物”指其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸經(jīng)遺傳和/或化學(xué)修飾并保留母體蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的合成蛋白質(zhì))，所述類似物保留了其母體蛋白質(zhì)的所需活性但缺乏形成分子間交聯(lián)或不良分子內(nèi)二硫鍵的能力。發(fā)現(xiàn)17位的半胱氨酸殘基缺失或被另一氨基酸取代的IFN-β生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的合成蛋白質(zhì)類似物具有所需活性和特征。
具體地說(shuō)，干擾素-β1b(IFN-β1b)是IFN-β的一種合成重組蛋白質(zhì)類似物，其是17位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)。作為微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，IFN-β1b是非糖基化的。其也具有N-末端甲硫氨酸缺失。IFN-β1b已配制為顯示能有效治療和控制MS的成功藥物，以Betaseron投入市場(chǎng)。以下許多美國(guó)專利和申請(qǐng)描述了此蛋白質(zhì)類似物、用于其制備的材料和技術(shù)、其作為治療劑的制劑及其治療MS的應(yīng)用并要求了權(quán)益1982年10月19日提交的申請(qǐng)?zhí)?35,154；1986年5月13日授權(quán)的專利號(hào)4,588,585；1988年4月12日授權(quán)的專利號(hào)4,737,462；和1990年9月25日授權(quán)的專利號(hào)4,959,314；各份文獻(xiàn)有關(guān)這些特征的內(nèi)容納入本文作為參考。
也從哺乳動(dòng)物來(lái)源，特別是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞進(jìn)行了用作藥物的IFN-β大規(guī)模生產(chǎn)。稱為IFN-β1a的此IFN-β類似物不具有IFN-β1b的Ser17突變，而且是糖基化的。IFN-β1a配制為治療性產(chǎn)品，以Avonex和Rebith投入市場(chǎng)。
對(duì)于大多數(shù)治療劑，不斷需要鑒定和生產(chǎn)更有效的生物學(xué)活性藥物。以IFN-β藥物為例，需要生物學(xué)活性增加的IFN-β類似物。
此外，一些IFN-β藥物制劑(包括Betaseron)含有人白蛋白(HA或HSA)，一種常規(guī)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。HA是人血產(chǎn)品，其供應(yīng)量日益下降。因此，近年來(lái)需要不含HA的藥物制劑，最好是穩(wěn)定和有效的不含HA的IFN-β制劑。
發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)使干擾素-β脫酰胺基解決了這些需求。脫酰胺基IFN-β是其25位(根據(jù)天然干擾素-β編號(hào))的天冬酰胺脫酰胺基的人干擾素-β蛋白質(zhì)類似物。脫酰胺基產(chǎn)物顯示的天然人干擾素-β的生物學(xué)活性水平升高且無(wú)需HA來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)。
在一具體的實(shí)施方案中，脫酰胺基IFN-β是合成的人干擾素-β1b蛋白質(zhì)類似物，其17位(根據(jù)天然干擾素-β編號(hào))半胱氨酸缺失或?yàn)橹行园被?，特別是絲氨酸取代，其25位天冬酰胺脫酰胺基從而形成環(huán)狀酰亞胺、天冬氨酸或異天冬氨酸殘基。與其IFN-β母體蛋白質(zhì)相比，脫酰胺基的產(chǎn)物顯示所需的天然人干擾素-β的生物學(xué)活性(例如，細(xì)胞病變效應(yīng)或抗增殖活性，例如顯示與多發(fā)性硬化癥發(fā)作頻率降低相關(guān))水平升高。此外，在該蛋白質(zhì)類似物的不含HA制劑中觀察到生物學(xué)活性升高。
也提供了治療性組合物中活性蛋白質(zhì)類似物化合物的制劑及制備和使用方法。
此外，提供了內(nèi)切蛋白酶-C肽圖技術(shù)，該技術(shù)在較低pH時(shí)對(duì)還原的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行酶消化，然后層析分辨肽片段以得到蛋白質(zhì)的指紋分布圖，該技術(shù)可作為脫酰胺基產(chǎn)物的ID檢驗(yàn)而用于質(zhì)控。
閱讀以下發(fā)明詳述結(jié)合附圖可更全面地了解本發(fā)明的這些和其它目的及特征。


圖1是IFN-β的氨基酸序列。
圖2是IFN-β1b的氨基酸序列，其表明本發(fā)明脫酰胺基的位點(diǎn)和性質(zhì)。
圖3參考本發(fā)明INF-βAsn25脫酰胺基說(shuō)明Asn脫酰胺基途徑。
圖4-11顯示了本發(fā)明一方面的各種不含HA的IFN-β穩(wěn)定性藥物和產(chǎn)品批次中脫酰胺基IFN-β1b的效力與含量的圖。
圖12A顯示了本發(fā)明一方面的不含HA的IFN-β穩(wěn)定性樣品的Glu-C肽圖。
圖12B顯示了圖12A的一部分的放大圖。
圖13顯示了不含HA的IFN-β對(duì)照樣品的RP-HPLC分布情況(時(shí)間(分鐘)與應(yīng)答(mV))。
圖14顯示了本發(fā)明一方面的不含HA的IFN-β1b藥物產(chǎn)品批次穩(wěn)定性樣品的RP-HPLC分布情況。
圖15是本發(fā)明一方面的不含HA的IFN-β穩(wěn)定性樣品的RP-HPLC級(jí)分(fraction)的CPE活性圖。
圖16A顯示了本發(fā)明一方面的不含HA的IFN-β穩(wěn)定性樣品的RP-HPLC級(jí)分對(duì)Hs294T的抗增殖活性結(jié)果。
圖16B顯示了本發(fā)明一方面的不含HA的IFN-β穩(wěn)定性樣品的RP-HPLC級(jí)分對(duì)Daudi的抗增殖活性結(jié)果。
本發(fā)明具體實(shí)施方案描述現(xiàn)在將參考數(shù)個(gè)實(shí)施方案描述本發(fā)明的化合物、組合物、物質(zhì)和相關(guān)的技術(shù)及應(yīng)用。教材的結(jié)構(gòu)中說(shuō)明了所述實(shí)施方案的重要特性和特征。盡管結(jié)合這些實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)該知道本發(fā)明不限于這些實(shí)施方案。相反，應(yīng)涵蓋包含在附加的權(quán)利要求所確定的本發(fā)明構(gòu)思和范圍內(nèi)的改變形式、改進(jìn)形式和等價(jià)形式。為全面理解本發(fā)明，以下描述給出了許多具體細(xì)節(jié)。本發(fā)明的實(shí)施可不利用這些具體細(xì)節(jié)中的某些或全部。在其它情況中，未詳細(xì)描述熟知的過(guò)程操作以免不必要地混淆本發(fā)明。
引言本發(fā)明提供脫酰胺基干擾素-β。脫酰胺基IFN-β是其中25位(根據(jù)天然干擾素-β編號(hào))的天冬酰胺脫酰胺基的人干擾素-β蛋白質(zhì)類似物。Asn經(jīng)環(huán)狀酰亞胺中間體脫酰胺基為Asp或異-Asp。脫酰胺基產(chǎn)物顯示的天然人干擾素-β的生物學(xué)活性水平升高且無(wú)需HA來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)。也提供了治療性組合物中的活性蛋白質(zhì)類似物化合物的制劑及其制備和使用方法。
本文用“蛋白質(zhì)類似物”指合成蛋白質(zhì)，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸經(jīng)遺傳和/或化學(xué)修飾并且保留了母體蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，例如致細(xì)胞病變效應(yīng)或抗增殖活性。這種生物學(xué)活性顯示與特定生物學(xué)活性，例如多發(fā)性硬化癥發(fā)作頻率降低相關(guān)。
在一具體實(shí)施方案中，脫酰胺基的IFN-β是純化和分離的合成人干擾素-β1b蛋白質(zhì)類似物，其中17位(根據(jù)天然干擾素-β編號(hào))的半胱氨酸缺失或被中性氨基酸，特別是絲氨酸取代，25位的天冬酰胺脫酰胺基。在具體的實(shí)施方案中，Asn25脫酰胺基為天冬氨酸、異天冬氨酸或環(huán)狀酰亞胺殘基(例如，分別是IFN-βSer17，asp25、βSer17，異-asp25、或IFN-βSer17，環(huán)狀酰亞胺25)。與IFN-β1b相比，脫酰胺基產(chǎn)物顯示的天然人干擾素-β的生物學(xué)活性水平升高。此外，在蛋白質(zhì)類似物的不含HA制劑中觀察到生物學(xué)活性升高，從而能得到不含HA的IFN-β1b治療劑。
在本發(fā)明的合成蛋白質(zhì)類似物中，半胱氨酸17殘基可能被絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代。在一具體的實(shí)施方案中，所述取代是絲氨酸17。天冬酰胺25殘基被天冬氨酸、異天冬氨酸或環(huán)狀酰亞胺取代。圖2說(shuō)明了本發(fā)明的IFN-β1b蛋白質(zhì)類似物的一級(jí)(氨基酸序列(SEQ ID NO2))和二級(jí)(折疊，交聯(lián))結(jié)構(gòu)。在25位，天然Asn殘基脫酰胺基。天冬酰胺經(jīng)環(huán)狀酰亞胺中間體發(fā)生脫酰胺基。此途徑描述于圖3。如下文所詳述的，Glu-C肽圖結(jié)果表明脫酰胺基的主要形式是異-Asp(IFN-βSer17，異-asp25)和環(huán)狀酰亞胺(IFN-βSer17，環(huán)狀酰亞胺25)。
可聯(lián)用重組合成和化學(xué)修飾技術(shù)制備蛋白質(zhì)類似物。如本申請(qǐng)以上“背景技術(shù)”部分引用的專利中所述，最初一般通過(guò)重組DNA定向誘變技術(shù)制備IFN-β1b合成蛋白質(zhì)類似物。定向誘變技術(shù)是熟知的，Lather，R.F.和Lecoq，J.P.在《遺傳工程》(Genetic Engineering)，Academic Press，(1983)，第31-50頁(yè)對(duì)其進(jìn)行了總結(jié)。寡核苷酸-定向誘變具體由Smith，M.和Gillam，S綜述于《遺傳工程原理和方法》(Genetic EngineeringPrinciples and Methods)，Plenum Press(1981)31-32。
然后化學(xué)處理IFN-β1b蛋白質(zhì)類似物使25位的天冬酰胺殘基脫酰胺基。許多可能的脫酰胺基技術(shù)有效且適合于大規(guī)模藥物產(chǎn)生，可采用任何能實(shí)現(xiàn)脫酰胺基同時(shí)保留天然生物學(xué)活性(最好生物學(xué)活性升高)的技術(shù)。泛泛而言，取決于諸條件，可通過(guò)在中溫至高溫(例如，約25-60℃)和低(例如，約0-4)、中(例如，約4-10)到高(例如，約10-14)的各種pH下，以約1分鐘到約90天或更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間培育來(lái)實(shí)現(xiàn)IFN-β蛋白質(zhì)的脫酰胺基。例如，可通過(guò)在最高60℃，或約25和40℃之間(例如40℃)，約pH4時(shí)培育IFN-β(例如，IFN-β1a或IFN-β1b)至少24小時(shí)(例如，最多40天)來(lái)實(shí)現(xiàn)脫酰胺基。通過(guò)升高pH，例如升至約7到最高14的中性到堿性pH，如約8-12(如約8.5)可縮短反應(yīng)時(shí)間和/或降低反應(yīng)溫度。在一個(gè)實(shí)例中，在pH8.4，2-8℃處理14天后IFN-β1b樣品的生物學(xué)活性(CPE)升高至少兩倍，達(dá)到約4.5IU/mg。在中溫(例如，室溫)到高溫(例如，37-40℃)處理14-40天也觀察到活性有實(shí)質(zhì)性升高。
制備脫酰胺基IFN-β蛋白質(zhì)類似物的技術(shù)可產(chǎn)生部分或基本上純的產(chǎn)物。例如，產(chǎn)物中至少25％、至少50％、至少75％或基本上所有合成蛋白質(zhì)類似物在25位(按照天然干擾素-β編號(hào))脫酰胺基。然而，當(dāng)不是基本上所有產(chǎn)物均脫酰胺基時(shí)，該產(chǎn)物仍顯示生物學(xué)活性升高和不含HA的穩(wěn)定性。在一些實(shí)例中，最好純化和分離產(chǎn)物中的脫酰胺基蛋白質(zhì)類似物。可通過(guò)陽(yáng)離子交換HPLC實(shí)現(xiàn)此純化和分離，例如采用以下條件層析固定相Pharmacia Mono S HR 5/5或與之相當(dāng)?shù)墓潭ㄏ?；洗脫劑緩沖液含0.5％Empigen的20mM Tris-HCl，pH7.0；梯度洗脫劑緩沖液中NaCl線性梯度最高達(dá)200mM或更高?？纱笠?guī)模實(shí)施此技術(shù)以進(jìn)行生產(chǎn)。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)合成蛋白質(zhì)由微生物產(chǎn)生時(shí)，其未糖基化。該蛋白質(zhì)類似物也具有N-末端甲硫氨酸缺失。在其它實(shí)施方案中，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)類似物，因而是糖基化的。
如下文所詳述的，與它們的母體IFN-β蛋白質(zhì)相比，各種活性試驗(yàn)證實(shí)脫酰胺基IFN-β1b蛋白質(zhì)類似物的生物學(xué)活性升高。利用不含HA的樣品獲得的穩(wěn)定性結(jié)果表明本發(fā)明的脫酰胺基IFN-β蛋白質(zhì)類似物適合于用作治療劑的不含HA制劑。為制備治療性組合物，可將上述部分或基本上純的蛋白質(zhì)類似物與藥學(xué)上可接受的載體介質(zhì)(例如此類型治療性產(chǎn)品所熟知的)混合。
雖然本發(fā)明組合物顯示不含HA的穩(wěn)定性是有利的特性，但也可對(duì)含HA的制劑脫酰胺基，這些情況不能排除在本發(fā)明范圍以外。此外，雖然本文主要參考IFN-β1b蛋白質(zhì)類似物描述了本發(fā)明，但本發(fā)明也適用于其它IFN-β類似物，包括IFN-β1a類似物。
本發(fā)明的IFN-β蛋白質(zhì)類似物和組合物能顯示生物學(xué)活性提示其能在許多應(yīng)用中用作治療劑，包括調(diào)節(jié)患者的細(xì)胞生長(zhǎng)、治療患者的病毒性疾病和刺激患者的天然殺傷細(xì)胞活性。一種具體應(yīng)用是治療患者的多發(fā)性硬化癥，特別是復(fù)發(fā)-緩解性MS。就這點(diǎn)而言，本發(fā)明的治療劑可用于治療以降低多發(fā)性硬化癥的發(fā)作頻率。脫酰胺基IFN-β蛋白質(zhì)類似物的生物學(xué)活性水平升高表明其作為治療劑，例如用于治療和控制MS的療效升高。
本發(fā)明的另一方面提供了內(nèi)切蛋白酶-C(Glu-C)肽圖技術(shù)。肽圖通過(guò)在較低pH進(jìn)行還原型蛋白質(zhì)樣品的酶消化，然后采用液相層析(例如，RP-HPLC)分辨消化產(chǎn)物片段得到蛋白質(zhì)的指紋分布圖。制作肽圖可作為本發(fā)明脫酰胺基IFN-β蛋白質(zhì)類似物產(chǎn)物的ID檢驗(yàn)而用于質(zhì)控。它也是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)在因氧化或脫酰胺基(而發(fā)生)的諸如剪接、突變和降解的情況中微小一級(jí)結(jié)構(gòu)修飾的有利工具。
已知脫酰胺基IFN-β的一種變體含有環(huán)狀酰亞胺，脫酰胺基的中間體形式。發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定性樣品中此環(huán)狀酰亞胺形式增加。用于IFN-β的常規(guī)肽圖的大多數(shù)酶(包括Lys-C在內(nèi))在中性到高pH處消化蛋白質(zhì)最佳。在中到高pH，環(huán)狀酰亞胺不穩(wěn)定，進(jìn)一步脫酰胺基被人工誘導(dǎo)。因此，監(jiān)測(cè)樣品中環(huán)狀酰亞胺和其它脫酰胺基形式(Asp，異-Asp)的天然水平需要在還原和消化過(guò)程中將樣品維持于低pH環(huán)境。
內(nèi)切蛋白酶-C(Glu-C)肽圖與在pH8以下，例如約3-8(如約3、4、5、6、7或8或介于其間的pH)起作用的還原劑聯(lián)用(couple)。合適的還原劑是三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)?？衫迷趐H約3-8起作用的其它還原劑，例如二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、2-巰基乙胺和硫代乙醇酸。對(duì)于其酶活性，Glu-C肽圖具有兩個(gè)最佳pH，pH7.8和pH4.0。如上所述，已知TCEP在pH8.0以下起作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，新型Glu-C肽圖所利用的樣品制備包括通過(guò)TCEP還原和在4.0的低pH處消化，該pH在保留樣品中脫酰胺基形式，例如環(huán)狀酰亞胺的天然水平的最佳pH范圍內(nèi)?？衫迷撔滦碗膱D技術(shù)來(lái)特征鑒定IFN-β樣品中含脫酰胺基形式(包括環(huán)狀酰亞胺)的消化產(chǎn)物片段。
可通過(guò)Glu-C肽圖檢驗(yàn)IFN-β樣品來(lái)鑒定脫酰胺基位點(diǎn)及其形式(例如，Asp、異Asp、環(huán)狀酰亞胺)?？衫肨CEP還原緩沖制劑中的蛋白質(zhì)樣品(例如2-500mM(或在一些情況中是50-100mM)鹽緩沖液的制劑緩沖液配制的濃度為0.1-10，如0.5mg/ml的0.5ml蛋白質(zhì)樣品)，例如蛋白質(zhì)與TCEP的摩爾比為1∶2-1∶30，如1∶3、1∶4、1∶5、1∶10或1∶20，如1∶10，所述鹽是，例如天冬氨酸鹽、碳酸氫鹽(如，碳酸氫銨)、碳酸鹽(如碳酸銨)、乙酸鹽(如乙酸銨)、磷酸鹽(如磷酸鈉)、檸檬酸鹽、甲酸鹽、琥珀酸鹽、MES、PIPES、ACES、MOPS、MOPSO、HEPES、TES、TRIS-HCl、BIS-TRIS、BIS-TRIS丙烷、ADA、BES、DIPSO、TAPSO、HEPPSO、POPSO、EPPS、TEA等，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道為所需的pH而合適地選擇和利用這些鹽(例如，2mM天冬氨酸，pH4)。培育樣品，例如在約30-40℃(如37℃)直至樣品物質(zhì)被還原。取決于樣品的不穩(wěn)定性，合適的培育時(shí)間可以從約5分鐘-24小時(shí)，例如3小時(shí)。然后用(例如)1-10，如4mg/ml Glu-C消化還原的物質(zhì)，在約30-40℃(如37℃)培育直至樣品物質(zhì)被消化，其中蛋白質(zhì)與Glu-C的質(zhì)量比是1∶1-20∶1(或任何合適的中間比例，包括2∶1、3∶1、4∶1、10∶1等)，例如5∶1。取決于樣品的不穩(wěn)定性，合適的消化時(shí)間可以從約5分鐘-24小時(shí)，例如4小時(shí)?？刹捎靡合鄬游觯鏡P-HPLC分辨肽片段。
以下實(shí)施例章節(jié)描述了具體的肽圖實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果。
實(shí)施例以下實(shí)施例描述了本發(fā)明的各方面，但不是以任何方式限制本發(fā)明。在各種這些實(shí)施例中，對(duì)顯示效力升高的兩種主要的可識(shí)別種類環(huán)狀酰亞胺和其它脫酰胺基形式(Asp和異Asp)進(jìn)行了區(qū)分。所有的形式都是脫酰胺基形式，但當(dāng)要區(qū)別環(huán)狀酰亞胺和其它脫酰胺基形式(Asp和異Asp)時(shí)，有時(shí)將前者稱為“環(huán)狀酰亞胺”，而有時(shí)將后者稱為“脫酰胺基的”或“脫酰胺基”，特別是在附圖標(biāo)記中。
實(shí)施例1不含HA的IFN-β1b穩(wěn)定性樣品的效力升高概述在不含HA的IFN-β1b穩(wěn)定性樣品中觀察到效力升高。致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)生物試驗(yàn)顯示在不含HA的IFN-β25℃穩(wěn)定性樣品中效力隨時(shí)間(T＝0-6個(gè)月)升高。在25℃穩(wěn)定性樣品中也觀察到最終脫酰胺基產(chǎn)物及其中間體，環(huán)狀酰亞胺增加。
制作Glu-C肽圖鑒定了位于Asn25的脫酰胺基位點(diǎn)，該肽圖顯示不含HA的IFN-β1b穩(wěn)定性樣品中脫酰胺基的主要形式是異-Asp和環(huán)狀酰亞胺類似物，而Asp形式略有增加。
從RP-HPLC方法獲得的結(jié)果表明不含HA的IFN-β穩(wěn)定性樣品中脫酰胺基形式(環(huán)狀酰亞胺、Asp和異Asp)明顯增加。
CPE和抗增殖試驗(yàn)顯示不含HA的IFN-β穩(wěn)定性樣品中的脫酰胺基形式的生物學(xué)活性高于母體(酰胺化)IFN-β。
根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為脫酰胺基(形成Asp、異Asp和環(huán)狀酰亞胺類似物)提高了不含HA的IFN-β的生物學(xué)活性。因此，可制備IFN-β的脫酰胺基形式來(lái)提高IFN-β治療劑的生物學(xué)活性，既可以不含HA也可以含HA?？赏ㄟ^(guò)在中溫至高溫和/或在低、中或高pH培育IFN-β溶液(既可以不含HA也可以含HA)來(lái)制備脫酰胺基類似物。本發(fā)明的脫酰胺基產(chǎn)物可降低所需的臨床劑量，增加室溫下液體IFN-β制劑的穩(wěn)定性。降低臨床劑量可減少發(fā)生不利免疫反應(yīng)(例如，中和抗體)的患者比例。
以下提供了從各種穩(wěn)定性研究和IFN-β1b制品分析得到的證實(shí)本發(fā)明的數(shù)據(jù)1.不含HA的IFN-β穩(wěn)定性數(shù)據(jù)如下表1(藥物物質(zhì)2mM天冬氨酸，pH4.0配制)和表2(藥物產(chǎn)品2mM天冬氨酸，pH4.0，9％海藻糖配制)所示，致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)生物試驗(yàn)顯示不含HA的IFN-β1b 25℃穩(wěn)定性樣品的效力隨時(shí)間增加(T＝0-6個(gè)月)表1不含HA的干擾素-β1b藥物物質(zhì)的CPE生物試驗(yàn)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表2不含HA的干擾素-β1b藥物產(chǎn)品的CPE生物試驗(yàn)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)


如下表3和4所示，陽(yáng)離子交換(CEX)-HPLC證實(shí)藥物物質(zhì)和藥物產(chǎn)品的25℃樣品的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)也分別顯示脫酰胺基作用增加(D-IFN-β)表3不含HA的干擾素-β1b藥物物質(zhì)的CEX-HPLC穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表4不含HA的干擾素-β1b藥物產(chǎn)品的CEX-HPLC穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

下表5和6顯示利用反相(RP)-HPLC技術(shù)分別在藥物物質(zhì)和藥物產(chǎn)品的25℃樣品中也觀察到峰D(代表脫酰胺基的環(huán)狀酰亞胺中間體形式)隨時(shí)間增加表5不含HA的干擾素-β1b藥物物質(zhì)的RP-HPLC穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表6不含HA的干擾素-β1b藥物產(chǎn)品的RP-HPLC穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

圖4-11顯示了本發(fā)明一方面的各種不含HA的IFN-β穩(wěn)定性藥物物質(zhì)和產(chǎn)物批次中脫酰胺基的IFN-β1b(“D-IFN％”或“峰D％”)的效力與含量。這些數(shù)據(jù)證實(shí)效力升高與不含HA的IFN-β的脫酰胺基水平相關(guān)。
2.不含HA的IFN-β穩(wěn)定性樣品的特征鑒定圖3顯示了IFN-β1b的一級(jí)序列。發(fā)現(xiàn)脫酰胺基發(fā)生在Asn25。下述試驗(yàn)研究了該脫酰胺基作用的性質(zhì)和脫酰胺基產(chǎn)物的特性2.1Glu-C肽圖肽圖利用酶消化，然后采用RP-HPLC得到蛋白質(zhì)的指紋分布圖。制作肽圖可作為ID檢驗(yàn)而通常用于質(zhì)控。它也是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)因氧化或脫酰胺基(而發(fā)生)的諸如剪接、突變和降解的情況中微小一級(jí)結(jié)構(gòu)修飾的有利工具。已知不含HA的IFN-β含有環(huán)狀酰亞胺，脫酰胺基的中間體形式。此環(huán)狀酰亞胺是不含HA的IFN-β的關(guān)鍵降解變體，發(fā)現(xiàn)它在穩(wěn)定性樣品中含量增加。目前不含HA的IFN-β肽圖所用的大多數(shù)酶(包括Lys-C)在中高pH消化蛋白質(zhì)最佳。環(huán)狀酰亞胺在中高pH不穩(wěn)定，可人工誘導(dǎo)脫酰胺基。因此，監(jiān)測(cè)樣品中環(huán)狀酰亞胺和脫酰胺基作用需要在還原和消化過(guò)程中將樣品維持在低pH環(huán)境中。
開(kāi)發(fā)了與作為還原劑的三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)聯(lián)用的新型內(nèi)切蛋白酶-C(Glu-C)肽圖來(lái)特征鑒定不含HA的IFN-β中含有脫酰胺基形式(包括環(huán)狀酰亞胺)的片段。已知Glu-C肽圖具有兩個(gè)對(duì)其酶活性最佳的pH，pH7.8和pH4.0。已知TCEP在pH8.0以下起作用。開(kāi)發(fā)了能利用樣品制品的新型Glu-C肽圖，該樣品制品包括還原和在4.0的低pH處消化，該pH在保留樣品中脫酰胺基形式，例如環(huán)狀酰亞胺的天然水平的最佳pH范圍內(nèi)。由于本文開(kāi)發(fā)的肽圖利用低pH樣品制品，因而能成功地精確監(jiān)測(cè)不含HA的IFN-β中脫酰胺基形式的天然水平。
采用Glu-C肽圖檢驗(yàn)了不含HA的IFN-β1b藥物產(chǎn)品批次TA2451的穩(wěn)定性樣品(25℃，3、6和9個(gè)月)來(lái)鑒定脫酰胺基位點(diǎn)及其形式(例如，Asp、異Asp、環(huán)狀酰亞胺)。利用TCEP還原用2mM天冬氨酸，pH4.0的制劑緩沖液配制的濃度為0.5mg/ml的各0.5ml蛋白質(zhì)樣品。37℃培育樣品與TCEP3小時(shí)，蛋白質(zhì)和TCEP的摩爾比為1∶10。然后用4mg/ml Glu-C消化還原的物質(zhì)(蛋白質(zhì)和Glu-C的質(zhì)量摩爾比為5∶1)，37℃培育4小時(shí)。采用RP-HPLC層析(ThermoHypersil BioBasic C18，150×4.6mm，5μm)，利用0.1％三氟乙酸配制的乙腈梯度作為洗脫緩沖液，流速為1.0ml/分鐘和柱溫為38℃來(lái)分辨肽片段。
圖12A顯示了本發(fā)明一方面的不含HA的IFN-β穩(wěn)定性樣品的Glu-C肽圖。圖12B顯示了圖12A所述肽圖中22-26分鐘RT部分的放大圖。
如附圖所示，片段E1的峰隨時(shí)間降低，而代表異-Asp、環(huán)狀酰亞胺和Asp的峰升高。那些峰是片段E1中25位Asn的脫酰胺基形式。對(duì)通過(guò)賴氨酰內(nèi)切肽酶消化E1相關(guān)片段得到的E1亞片段進(jìn)行質(zhì)譜和Edman測(cè)序來(lái)特征鑒定該峰。在氨基酸序列中Asn25殘基后是甘氨酸。已知此Asn-Gly序列的脫酰胺基速率快。
根據(jù)此Glu-C肽圖結(jié)果，不含HA的IFN-β穩(wěn)定性樣品中脫酰胺基的主要形式鑒定為異-Asp和環(huán)狀酰亞胺。Asp形式的水平也略有升高。
2.2RP-HPLCRP-HPLC根據(jù)疏水性分離這些化合物。通過(guò)RP-HPLC方法檢驗(yàn)不含HA的IFN-β1b樣品來(lái)特征鑒定IFN-β1b變體(例如，Asp、異-Asp、環(huán)狀酰亞胺)。將檢驗(yàn)樣品注射到Zorbax 300SB-CN，150×4.6mm，3.5μm粒徑的層析柱上，利用0.1％三氟乙酸洗脫緩沖液配制的乙腈梯度分離IFN-β1b變體。對(duì)照樣品的結(jié)果見(jiàn)圖13。
通過(guò)在線LC/質(zhì)譜分析(RP-HPLC/Q-TOF/ESI-MS)進(jìn)行附圖所示的峰鑒定。分出HPLC流出液的約1∶20，以約50ul/分引入質(zhì)譜儀的離子源。所述質(zhì)譜儀是裝有電噴霧離子源的Micromass Q-TOF2儀器。離子電壓設(shè)置在3200，錐孔電壓設(shè)置在50。利用飛行時(shí)間(TOF)分析儀收集m/z 300和2500之間的數(shù)據(jù)。在線LC/質(zhì)量數(shù)據(jù)顯示在一些RP-HPLC峰中有多種蛋白質(zhì)變體共同洗脫。
圖14顯示不含HA的IFN-β1b藥物產(chǎn)品批次穩(wěn)定性樣品(25℃約10個(gè)月)的RP-HPLC分布圖。如圖所示，該分布圖不同于對(duì)照樣品(圖13)，不含HA的IFN-β1b中環(huán)狀酰亞胺(峰D)和脫酰胺基形式(Asp和/或異-Asp)(中峰)顯著增加。觀察到多種次要的其它脫酰胺基和環(huán)狀酰亞胺變體。這些變體是因其不同的疏水特性而得到分離的具有其它結(jié)構(gòu)和化學(xué)修飾的脫酰胺基和環(huán)狀酰亞胺變體。
2.3CPE生物試驗(yàn)IFN-β能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)，其中抑制了一些病毒類型的復(fù)制和導(dǎo)致細(xì)胞的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。利用A549人肺癌細(xì)胞和鼠腦心肌炎(EMC)病毒評(píng)估從不含HA的IFN-β1b藥物產(chǎn)品批次的穩(wěn)定性樣品(25℃約10個(gè)月)獲得的RP-HPLC級(jí)分的生物學(xué)活性。
將細(xì)胞培養(yǎng)在96-孔板中，利用IFN-β1b的連續(xù)稀釋液處理過(guò)夜，再加入病毒。然后培育培養(yǎng)液合適的時(shí)間以使病毒復(fù)制。用充足的IFN-β1b處理的細(xì)胞受到保護(hù)免遭病毒攻擊，保持存活。未受保護(hù)的細(xì)胞發(fā)生致細(xì)胞病變改變，死亡。采用染色技術(shù)和從細(xì)胞活力(光密度檢測(cè))與IFN-β濃度圖制作的劑量反應(yīng)曲線定量測(cè)定干擾素劑量依賴性CPE。IFN-β活性計(jì)算為半最大細(xì)胞保護(hù)所需的濃度(EC50濃度)。
如圖15所示，脫酰胺基級(jí)分(中峰，級(jí)分16)中CPE活性明顯高于母體IFN-β1b級(jí)分(峰B，級(jí)分18)。環(huán)狀酰亞胺級(jí)分(峰D，級(jí)分15)也顯示CPE活性高于母體IFN-β1b級(jí)分。
2.4抗增殖試驗(yàn)IFN-β顯示對(duì)從人腫瘤開(kāi)發(fā)的許多細(xì)胞系有抗增殖活性。利用兩種細(xì)胞系(Hs294T-人黑色素瘤細(xì)胞系和Daudi-衍生自伯基特淋巴瘤的人B成淋巴細(xì)胞系)評(píng)估從不含HA的IFN-β1b藥物產(chǎn)品批次的穩(wěn)定性樣品(25℃約10個(gè)月)獲得的RP-HPLC級(jí)分的生物學(xué)活性。
在96-孔板中連續(xù)稀釋IFN-β測(cè)試樣品。在組織培養(yǎng)基中制備效應(yīng)細(xì)胞，將其加入試驗(yàn)平板。培育3天后，用Alamar藍(lán)染色細(xì)胞或用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)生長(zhǎng)反應(yīng)。細(xì)胞生長(zhǎng)以劑量依賴性方式對(duì)IFN-β起反應(yīng)而受到抑制。從細(xì)胞數(shù)目(光密度檢測(cè))與IFN-β濃度圖制作劑量反應(yīng)曲線。IFN-β活性計(jì)算為半最大細(xì)胞生長(zhǎng)所需的濃度(ED50濃度)。
如圖16A(Hs294T)和16B(Daudi)所示，脫酰胺基級(jí)分(中峰，級(jí)分16)和環(huán)狀酰亞胺級(jí)分(峰D，級(jí)分15)中的抗增殖活性明顯高于母體IFN-β級(jí)分(峰B，級(jí)分18)。
3.結(jié)論根據(jù)上述研究獲得的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)和結(jié)果，脫酰胺基作用(Asp、異Asp和環(huán)狀酰亞胺取代25位的Asn)提高了IFN-β的生物學(xué)活性。因此，可有意制備IFN-β例如IFN-β1b的脫酰胺基形式，來(lái)提高該化合物的生物學(xué)活性?？稍谥懈邷囟然蛟诘?、中或高pH環(huán)境中通過(guò)培育IFN-β來(lái)制備脫酰胺基形式。本發(fā)明的脫酰胺基產(chǎn)物可降低所需的臨床劑量，增加室溫下液體IFN-β制劑(包括不含HA和含HA的IFN-β制劑)的穩(wěn)定性。降低臨床劑量可減少發(fā)生不利免疫反應(yīng)(例如，中和抗體)的患者比例。
實(shí)施例2可制造性數(shù)據(jù)如上所述，進(jìn)行了各實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)各種脫酰胺基技術(shù)。從CPE生物試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)證明采用適合于大規(guī)模藥物生產(chǎn)的方法不難制備脫酰胺基IFN-β。具體地說(shuō)，在中(例如，室溫)到高(例如，37-40℃)溫度下培育14-40天的按照優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)生產(chǎn)的各種樣品中觀察到生物活性明顯升高；在室溫和pH8.8培育GMP樣品約1小時(shí)，和在2-8℃ pH8.4培育約14天使得生物活性幾乎增加兩倍。
CPE生物試驗(yàn)結(jié)果測(cè)試1

測(cè)試2

1)室溫2)樣品在pH8.4，2-8℃培育14天3)樣品在pH8.8，室溫培育1小時(shí)結(jié)論雖然為清晰理解的目的詳細(xì)描述了上述發(fā)明，但應(yīng)知道可在附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)實(shí)施某些改變和改進(jìn)。應(yīng)該注意有許多備選方式可執(zhí)行本發(fā)明方法和組合物。因此，應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明的實(shí)施方案是說(shuō)明性而非限制性，本發(fā)明不限于本文給予的這些細(xì)節(jié)，而可在附加的權(quán)利要求的范圍和等價(jià)體內(nèi)加以改進(jìn)。
本文引用的所有文獻(xiàn)出于所有目的全文納入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種純化和分離的合成人干擾素-β蛋白質(zhì)類似物，其中按照天然干擾素-β編號(hào)的第25位的天冬酰胺被脫酰胺基，和所述蛋白質(zhì)類似物顯示天然人干擾素-β的生物學(xué)活性。
2.如權(quán)利要求1所述的合成蛋白質(zhì)類似物，其特征在于，按照天然干擾素-β編號(hào)的第17位的半胱氨酸缺失或被中性氨基酸取代。
3.如權(quán)利要求2所述的合成蛋白質(zhì)類似物，其特征在于，所述半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代。
4.如權(quán)利要求3所述的合成蛋白質(zhì)類似物，其特征在于，所述天冬酰胺殘基被選自天冬氨酸、異天冬氨酸和環(huán)狀酰亞胺的殘基取代。
5.如權(quán)利要求4所述的合成蛋白質(zhì)類似物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)類似物未糖基化。
6.如權(quán)利要求5所述的合成蛋白質(zhì)類似物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)類似物具有N-末端甲硫氨酸缺失。
7.如權(quán)利要求4所述的合成蛋白質(zhì)類似物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)類似物的生物學(xué)活性高于IFN-βser17。
8.一種具有IFN-β活性的治療性組合物，其含有治療有效量的權(quán)利要求4所述合成蛋白質(zhì)類似物，該類似物與藥學(xué)上可接受的載體介質(zhì)混合。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，至少50％的合成蛋白質(zhì)類似物在按照天然干擾素-β編號(hào)的第25位脫酰胺基。
10.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，基本上所有的合成蛋白質(zhì)類似物在按照天然干擾素-β編號(hào)的第25位脫酰胺基。
11.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述組合物不含HA。
12.一種制備脫酰胺基的IFN-β類似物的方法，包括在約25-60℃的中至高溫的合適條件下培育IFN-β蛋白質(zhì)；純化和分離脫酰胺基的蛋白質(zhì)類似物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，包括在約40℃的溫度培育約14天。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，還包括在pH至少為4進(jìn)行所述培育。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，包括在pH 7-14培育。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，包括在pH 8-9培育約14天。
17.一種治療患者的方法，包括給予所述患者有效量的權(quán)利要求8所述的組合物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述治療是調(diào)節(jié)患者的細(xì)胞生長(zhǎng)，所述有效量是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的所述組合物用量。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述治療是用于患者的病毒性疾病，所述有效量是抑制病毒性疾病的所述組合物用量。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述治療是用于刺激患者的天然殺傷細(xì)胞活性，所述有效量是刺激天然殺傷細(xì)胞的所述組合物用量。
21.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述治療是用于患者的多發(fā)性硬化癥，所述有效量是所述組合物的治療有效量。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述治療包括降低多發(fā)性硬化癥發(fā)作的頻率。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述多發(fā)性硬化癥是復(fù)發(fā)緩解類型。
24.一種制作肽圖的方法，包括在含有還原劑的pH 8以下的緩沖溶液中培育蛋白質(zhì)樣品；用內(nèi)切蛋白酶-C消化所培育的樣品；和通過(guò)液相層析分辨消化產(chǎn)物的肽片段。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述還原劑是三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，在pH約4進(jìn)行所述培育。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述液相層析是RP-HPLC。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)樣品是脫酰胺基的IFN-β。
全文摘要
按照天然干擾素－β編號(hào)的25位天冬酰胺脫酰胺基的干擾素－β類似物顯示的天然人干擾素－β生物學(xué)活性升高并且無(wú)需HA來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脫酰胺基產(chǎn)物適合于大規(guī)模生產(chǎn)，可用于摻入含HA或不含HA的治療劑以治療包括多發(fā)性硬化癥在內(nèi)的疾病。內(nèi)切蛋白酶－C肽圖技術(shù)能利用酶學(xué)消化，然后采用RP－HPLC得到蛋白質(zhì)指紋分布圖，該技術(shù)也可作為脫酰胺基產(chǎn)物的ID和/或定量測(cè)定檢驗(yàn)而用于質(zhì)控。
文檔編號(hào)A61P25/28GK101056890SQ200580038118
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2005年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月10日
發(fā)明者古谷健二, D·約翰遜-杰克遜, D·T·魯斯西奧 申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷公司