專利名稱：用于治療多發(fā)性硬化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用特殊的劑量給藥方式治療受試者的多發(fā)性硬化(MS)的方法和流程，以及附有所述應(yīng)用之說明書的制品。
背景技術(shù)：
多發(fā)性硬化多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)(MS)是人中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的炎性脫髓鞘退行性疾病。它是一種世界范圍的疾病，在美國影響約300,000名患者；它是一種年輕成人的疾病，70％-80％在20至40歲之間發(fā)病(Anderson et al.，Ann.Neurology 31(3)333-6(1992)；Noonan et al.，Neurology 58136-8(2002))。MS是基于臨床發(fā)病病程、磁共振成像(MRI)掃描評(píng)估以及活組織切片檢查和尸檢材料的病理分析的異質(zhì)性病變(Lucchinetti et al.，Ann.Neurol.47707-17(2000))。該疾病自身表現(xiàn)為缺陷的許多可能組合，包括脊髓、腦干、顱神經(jīng)、小腦、大腦和認(rèn)知綜合征。進(jìn)行性傷殘是大多數(shù)MS患者的命運(yùn)，尤其是在包括25年前景時(shí)。一半患者在發(fā)病后的15年內(nèi)行走需要拐杖。MS是年輕和中年成人中神經(jīng)性傷殘的主要原因，直至過去十年，仍未有已知的有效治療方法。由于非特異性臨床發(fā)現(xiàn)，MS難以診斷，這導(dǎo)致了包含數(shù)種技術(shù)進(jìn)步在內(nèi)的高度組織化診斷標(biāo)準(zhǔn)的開發(fā)，包括MRI掃描、誘發(fā)電位和腦脊液(CSF)研究。所有診斷標(biāo)準(zhǔn)依賴不同時(shí)間發(fā)生在中心白質(zhì)內(nèi)的離散損傷的普遍原理，而不是從諸如感染、血管疾患或自身免疫性疾患等其它病因方面來解釋(McDonald et al.，Ann.Neurol.50121-7(2001))。MS有四種疾病樣式復(fù)發(fā)緩和型MS(RRMS；發(fā)病案例的80％-85％)、原發(fā)進(jìn)行型MS(PPMS；發(fā)病案例的10％-15％)、進(jìn)行性復(fù)發(fā)型MS(PRMS；發(fā)病案例的5％)；以及繼發(fā)進(jìn)行型MS(SPMS)(Kremenchutzky et al.，Brain 122(Pt10)1941-50(1999)；Confavreux et al.，N.Engl.J.Med.343(20)1430-8(2000))。估計(jì)50％的RRMS患者將在10年內(nèi)發(fā)展成SPMS，而高達(dá)90％的RRMS患者最終將發(fā)展成SPMS(Weinshenker et al.，Brain 112(Pt1)133-46(1989))。
目前，四類六種藥物在美國批準(zhǔn)用于治療RRMS，而沒有藥物批準(zhǔn)用于治療PPMS。RRMS治療包括干擾素類，IFN-β-1a(REBIF和AVONEX)和IFN-β-1b(BETASERON)；醋酸格拉默(COPAXONE)，一種多肽；natalizumab(TYSABRI)；以及米托蒽醌(NOVANTRONE)，一種胞毒劑。其它藥物也已不同程度的成功應(yīng)用，包括皮質(zhì)類固醇、甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤和靜脈內(nèi)(IV)免疫球蛋白。正如最近兩次事后分析(meta-analysis)所顯示的，目前已批準(zhǔn)的治療方法對(duì)于RRMS的復(fù)發(fā)率以及防止致殘的益處是相對(duì)適度的(約30％)(Filippini et al.，Lancet 361545-52(2003))。
其它臨床研究評(píng)價(jià)了MS中的其它免疫調(diào)節(jié)劑，包括腫瘤壞死因子-α抑制劑和改變的肽配基，它們使MS加重而不是改善(Lenercept MultipleSclerosis Study Group and the University of British Columbia MS/MRI，Neurology 53457-65(1999)；Bielekova et al.，Nat.Med.61167-75(2000)，勘誤見Nat.Med.61412(2000))。
MS病理生理學(xué)的主要觀點(diǎn)認(rèn)為炎癥主要是由CD4+Th1 T細(xì)胞介導(dǎo)的。基于此理論的治療方法，諸如IFN-β和醋酸格拉默降低但未完全阻止惡化的發(fā)生或傷殘的累積。
正如MS診斷標(biāo)準(zhǔn)中CSF寡克隆帶的包含以及鞘內(nèi)IgG合成增加所證實(shí)的，人MS中體液組分的存在已無疑公認(rèn)了數(shù)十年(Siden A.，J.Neurol.22139-51(1979)；McDonald et al.，Ann.Neurol.50121-7(2001)；Andersson et al.，Eur.J.Neurol.9243-51(2002)；O′Connor，P.，Neurology 59S1-33(2002))。寡克隆帶的存在、游離輕鏈的增加以及鞘內(nèi)IgM合成的增加與MS病情相關(guān)，并且可以作為更嚴(yán)重后果的預(yù)示(Rudick et al.，Mult.Scler.1150-5(1995)；Zeman et al.，Acta Cytol.4551-9(2001)；Izquierdo et al.，Acta Neurol.Scand.105158-63(2002)；Wolinsky J.，J.Neurol.Sci.206145-52(2003)；Villar et al.，Ann.Neurol.53222-6(2003))。
在進(jìn)行型和復(fù)發(fā)型MS患者的血清中檢測到抗髓磷脂抗體(髓磷脂堿性蛋白(MBP)和髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG))(Reindl et al.，Brain 1222047-56(1999)；Egg et al.，Mult.Scler.7(5)285-9(2001))。在MS患者的CSF中也檢測到抗髓磷脂抗體(Reindl et al.，Brain 1222047-56(1999)；Egg et al.，Mult.Scler.7(5)285-9(2001)；Andersson et al.，Eur.J.Neurol.9243-51(2002))。在MS患者中還觀察到別的抗體類型，諸如抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體或抗神經(jīng)絲抗體(Mata et al.，Mult.Scler.5379-88(1999)；Sadatipour et al.，Ann.Neural.44980-3(1998))。最近的一份報(bào)告表明，血清抗MOG和抗MBP抗體的存在是從臨床上分離的脫髓鞘活動(dòng)進(jìn)展到明確的RRMS的強(qiáng)預(yù)示信號(hào)(Berger et al.，N.Engl.J.Med.349139-45(2003))。發(fā)生病情惡化的校準(zhǔn)比率對(duì)于兩種抗體都呈血清陽性的患者而言是76.5，而對(duì)于只對(duì)抗MOG抗體呈血清陽性的患者而言是31.6。
國際病理學(xué)協(xié)會(huì)發(fā)現(xiàn)結(jié)合髓磷脂的抗體存在于大多數(shù)MS患者中，此外在MS損傷中還發(fā)現(xiàn)了漿細(xì)胞和B細(xì)胞，這為MS中的體液作用提供了另外的證據(jù)(Prineas and Wright，Lab.Invest.38409-21(1978)；Esiri M.，Neuropathol.Appl.Neurobiol.69-21(1980)；Genain et al.，Nat.Med.5170-5(1999)；Lucchinetti et al.，Ann.Neurol.47707-17(2000)；Wingerchuk et al.，Lab.Invest.81263-81(2001))。B細(xì)胞在MS患者的CSF中也是可檢測到的，而存在相對(duì)高比例的B細(xì)胞可能預(yù)示著更嚴(yán)重的致殘進(jìn)程(Cepok et al.，Brain 124(Pt 11)2169-76(2001))。
在患RRMS或視性眼陣攣-肌陣攣綜合征的受試者中，據(jù)報(bào)道Rituximab消減所有受試者中的外周B細(xì)胞，并降低了有些患者中的CSF B細(xì)胞數(shù)目(Pranzatelli et al.，Neurology 60(Suppl 1)PO5.128A395(2003)；Cross et al.，“Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS”(abstract)EighthAnnual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment inMultiple Sclerosis ACTRIMS，20-1(October，2003))。還可參閱Cree et al.，“Tolerability and Effects of Rituximab″Anti-CD20 Antibody″in NeuromyelitisOptica and Rapidly Worsening Multiple Sclerosis”，Meeting of the Am.Acad.Neurol.(April，2004)。
CD20抗體及使用它的療法淋巴細(xì)胞是在造血過程中在骨髓中生成的多種類型白細(xì)胞之一。有兩種主要的淋巴細(xì)胞群B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)和T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)。本文特別感興趣的淋巴細(xì)胞是B細(xì)胞。
B細(xì)胞在骨髓中成熟，然后離開骨髓并在它們的細(xì)胞表面表達(dá)抗原結(jié)合抗體。當(dāng)幼稚B細(xì)胞初次遇到其膜結(jié)合抗體特異性的抗原時(shí)，細(xì)胞開始快速分裂，且其后代分化成為記憶B細(xì)胞和稱做“漿細(xì)胞”的效應(yīng)細(xì)胞。記憶B細(xì)胞具有較長的壽命，并繼續(xù)表達(dá)與最初的親本細(xì)胞具有相同特異性的膜結(jié)合抗體。漿細(xì)胞不生成膜結(jié)合抗體，但改為生成可分泌形式的抗體。分泌型抗體是體液免疫的主要效應(yīng)分子。
CD20抗原(也稱做人B淋巴細(xì)胞限制分化抗原，Bp35)是位于前B(pre-B)淋巴細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞上、分子量約35kD的疏水性跨膜蛋白質(zhì)(Valentine et al.，J.Biol.Chem.264(19)11282-11287(1989)；及Einfeld et al.，EMBO J.7(3)711-717(1988))。該抗原也在超過90％的B細(xì)胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)上表達(dá)(Anderson et al.，Blood 63(6)1424-1433(1984))，但在造血干細(xì)胞、原B細(xì)胞(pro-B)、正常漿細(xì)胞或其它正常組織上沒有發(fā)現(xiàn)(Tedder et al.，J.Immunol.135(2)973-979(1985))。CD20調(diào)節(jié)細(xì)胞周期起始和分化的激活過程的早期步驟(Tedder et al.，見上文)，并可能作為鈣離子通道起作用(Tedder et al.，J.Cell.Biochem.14D195(1990))。
假如CD20在B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)，則該抗原可用做“靶向”此類淋巴瘤的候選者。本質(zhì)上，這種靶向作用可概括如下對(duì)患者施用對(duì)B細(xì)胞CD20表面抗原特異的抗體。這些抗CD20抗體特異結(jié)合正常和惡性B細(xì)胞的CD20抗原(表面上)；抗體與CD20表面抗原結(jié)合可導(dǎo)致贅生性B細(xì)胞的破壞和消減。此外，可將具有破壞腫瘤潛力的化學(xué)試劑或放射性標(biāo)記物與抗CD20抗體偶聯(lián)，使得該試劑特異“投遞”至贅生性B細(xì)胞。不考慮方法，首要目標(biāo)是破壞腫瘤；具體方法可根據(jù)所使用的具體抗CD20抗體來決定，因此可利用的靶向CD20抗原的方法可能變化相當(dāng)大。
Rituximab(利妥昔單抗，RITUXAN)抗體是針對(duì)CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人單克隆抗體。Rituximab就是1998年4月7日發(fā)布的美國專利5,736,137(Anderson等人)中稱為“C2B8”的抗體。RITUXAN指示用于治療患有復(fù)發(fā)的或難治的低級(jí)或?yàn)V泡性CD20陽性B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。作用機(jī)制的體外研究表明RITUXAN結(jié)合人補(bǔ)體并通過補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)溶解淋巴樣B細(xì)胞系(Reff et al.，Blood 83(2)435-445(1994))。此外，它在抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)測定法中具有顯著活性。最近，RITUXAN在氚標(biāo)記胸苷摻入測定法中顯示出具有抗增殖效果，并直接誘導(dǎo)凋亡，而其它抗CD19和CD20抗體則不然(Maloney et al.，Blood88(10)637a(1996))。在試驗(yàn)中還觀察到RITUXAN與化學(xué)療法和毒素之間的協(xié)同作用。具體而言，RITUXAN使耐藥性人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系對(duì)多柔比星(doxorubicin)、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒蛋白的細(xì)胞毒性作用敏感(Demidem et al.，Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3)177-186(1997))。體內(nèi)臨床前研究顯示RITUXAN可能通過補(bǔ)體和細(xì)胞介導(dǎo)的過程從獼猴的外周血、淋巴結(jié)和骨髓中消減B細(xì)胞(Reff et al.，Blood 83(2)435-445(1994))。
美國在1997年11月批準(zhǔn)將Rituximab用于治療患有復(fù)發(fā)的或難治的低級(jí)或?yàn)V泡性CD20陽性B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的患者，每周一劑375mg/m2，共四劑。2001年4月，食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)了用于治療低級(jí)NHL的額外要求復(fù)治(每周一次，共四劑)和額外的給藥方案(每周一次，共八劑)。已經(jīng)有超過300,000名患者暴露于Rituximab，或是作為單一療法或是聯(lián)合免疫抑制劑或化療藥物。還已經(jīng)作為維持療法用Rituximab治療患者，可長達(dá)2年(Hainsworth et al.，J.Clin.Oncol.211746-51(2003)；Hainsworth et al.，J.Clin.Oncol.204261-7(2002))。
也已在B細(xì)胞和自身抗體表現(xiàn)出在疾病病理生理學(xué)中發(fā)揮作用的多種非惡性自身免疫性紊亂中研究了Rituximab(Edwards et al.，Biochem.Soc.Trans.30824-828(2002))。已有報(bào)導(dǎo)，Rituximab潛在減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(Leandro et al.，Ann.Rheum.Dis.61883-888(2002)；Emery et al.，Arthritis Rheum.48(9)S439(2003))、狼瘡(Eisenberg，Arthritis Res.Ther.5157-159(2003)；Leandro et al.，Arthritis Rheum.462673-2677(2002))、免疫性血小板減少癥(D′Arena et al.，Leuk.Lymphoma 44561-562(2003))、自身免疫性貧血(Zaja et al.，Haematologica 87189-195(2002)，勘誤見Haematologica 87336(2002))、自身免疫性神經(jīng)病(Pestronk et al.，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 74485-489(2003))、副腫瘤性視性眼陣攣-肌陣攣綜合征(Pranzatelli et al.，Neurology 60(Suppl.1)PO5.128A395(2003))、以及復(fù)發(fā)緩和型多發(fā)性硬化(RRMS)(Cross et al.，(abstract)，Eighth Annual Meeting ofthe Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis，20-21(2003))的征候和癥狀。
已在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者中進(jìn)行了II期研究(WA16291)，提供了有關(guān)Rituximab的安全性和功效的48周跟蹤數(shù)據(jù)(Emery et al.，ArthritisRheum.48(9)S439(2003)；Szczepanski et al.，Arthritis Rheum.48(9)S121(2003))。將總共161名患者隨機(jī)平分為四個(gè)治療組甲氨蝶呤、僅Rituximab、Rituximab加甲氨蝶呤、以及Rituximab加環(huán)磷酰胺(CTX)。Rituximab治療攝生法為第1天和第15天靜脈內(nèi)施用1克。大多數(shù)RA患者對(duì)輸注Rituximab有很好的耐受，而36％的患者在其首次輸注期間發(fā)生至少一種不良后果(與30％接受安慰劑的患者相比)?？偠灾?，認(rèn)為大多數(shù)不良后果在嚴(yán)重程度上是溫和至中度的，而且所有處理組之間很平衡。在48周中四個(gè)組共有19件嚴(yán)重的不良事件，其中Rituximab/CTX組稍多一些。所有組之間的感染發(fā)生率很平衡。該RA患者群體中嚴(yán)重感染的平均比率為每100患者-年4.66，低于基于社會(huì)的流行病學(xué)研究中所報(bào)告的RA患者中需要住院治療的感染比率(每100患者-年9.57)(Doran et al.，Arthritis Rheum.462287-2293(2002))。
所報(bào)導(dǎo)的Rituximab在少數(shù)神經(jīng)學(xué)紊亂患者中的安全譜，包括自身免疫性神經(jīng)病(Pestronk et al.，J.Neuro.Neurosurg.Psychiatry 74485-489(2003))、視性眼陣攣/肌陣攣綜合征(Pranzatelli et al.，Neurology 60(Suppl.1)PO5.128A395(2003))、和RRMS(Cross et al.，Preliminary Results from aphase II trial of rituximab in MS(abstract)Eighth Annual Meeting of theAmericas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis，20-21(2003))，與在腫瘤學(xué)或RA中所報(bào)導(dǎo)的類似。正在RRMS受試者中進(jìn)行的Rituximab聯(lián)合干擾素-β(IFN-β)或醋酸格拉默的研究者發(fā)起試驗(yàn)(IST)(Crosset al.，見上文)中，接受治療的10名受試者中有1個(gè)在首次輸注Rituximab后發(fā)生中度發(fā)燒和打寒戰(zhàn)，之后入院徹夜觀察，而其他9名受試者完成了四次輸注攝生法，沒有報(bào)告任何不良事件。
關(guān)注CD20抗體的專利和專利出版物包括美國專利5,776,456、5,736,137、5,843,439、6,399,061和6,682,734，以及US 2002/0197255、US 2003/0021781、US 2003/0082172、US 2003/0095963、US 2003/0147885(Anderson等人)；美國專利6,455,043、US 2003/0026804和WO 2000/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO 2000/27428(Grillo-Lopez和White)；WO 2000/27433和US 2004/0213784(Grillo-Lopez和Leonard)；WO 2000/44788(Braslawsky等人)；WO2001/10462(Rastetter，W.)；WO 2001/10461(Rastetter和White)；WO2001/10460(White和Grillo-Lopez)；US 2001/0018041、US 2003/0180292、WO 2001/34194(Hanna和Hariharan)；US 2002/0006404和WO 2002/04021(Hanna和Hariharan)；US 2002/0012665和WO 2001/74388(Hanna，N.)；US 2002/0058029(Hanna，N.)；US 2003/0103971(Hariharan和Hanna)；US2002/0009444和WO 2001/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO 2001/97858(White，C.)；US 2002/0128488和WO 2002/34790(Reff，M.)；WO 2002/060955(Braslawsky等人)；WO 2002/096948(Braslawsky等人)；WO 2002/079255(Reff和Davies)；美國專利6,171,586和WO 1998/56418(Lam等人)；WO1998/58964(Raju，S.)；WO 1999/22764(Raju，S.)；WO 1999/51642、美國專利6,194,551、美國專利6,242,195、美國專利6,528,624和美國專利6,538,124(Idusogie等人)；WO 2000/42072(Presta，L.)；WO 2000/67796(Curd等人)；WO 2001/03734(Grillo-Lopez等人)；US 2002/0004587和WO 2001/77342(Miller和Presta)；US 2002/0197256(Grewal，I.)；US 2003/0157108(Presta，L.)；WO 04/056312(Lowman等人)；US 2004/0202658和WO2004/091657(Benyunes，K.)；WO 2005/000351(Chan，A.)；US 2005/0032130A1(Beresini等人)；US 2005/0053602A1(Brunetta，P.)；美國專利6,565,827、6,090,365、6,287,537、6,015,542、5,843,398和5,595,721(Kaminski等人)；美國專利5,500,362、5,677,180、5,721,108、6,120,767和6,652,852(Robinson等人)；美國專利6,410,391(Raubitschek等人)；美國專利6,224,866和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO 2001/13945(Barbera-Guillem，E.)；US2005/0079174A1(Barbera-Guillem，E.)；WO 2000/67795(Goldenberg)；US2003/0133930和WO 2000/74718(Goldenberg和Hansen)；US 2003/0219433和WO 2003/68821(Hansen等人)；WO 2004/058298(Goldenberg和Hansen)；WO 2000/76542(Golay等人)；WO 2001/72333(Wolin和Rosenblatt)；美國專利6,368,596(Ghetie等人)；美國專利6,306,393和US 2002/0041847(Goldenberg，D.)；US 2003/0026801(Weiner和Hartmann)；WO 2002/102312(Engleman，E.)；US 2003/0068664(Albitar等人)；WO 2003/002607(Leung，S.)；WO 2003/049694、US 2002/0009427和US 2003/0185796(Wolin等人)；WO 2003/061694(Sing和Siegall)；US 2003/0219818(Bohen等人)；US 2003/0219433和WO 2003/068821(Hansen等人)；US 2003/0219818(Bohen等人)；US 2002/0136719(Shenoy等人)；WO 2004/032828(Wahl等人)；以及WO 2002/56910(Hayden-Ledbetter)。還可參見美國專利5,849,898和EP 330,191(Seed等人)；EP 332,865 A2(Meyer和Weiss)；美國專利4,861,579(Meyer等人)；US 2001/0056066(Bugelski等人)；WO 1995/03770(Bhat等人)；US 2003/0219433 A1(Hansen等人)；WO 2004/035607(Teeling等人)；US 2004/0093621(Shitara等人)；WO 2004/103404(Watkins等人)；WO 2005/000901(Tedder等人)；US 2005/0025764(Watkins等人)；WO2005/016969和US 2005/0069545 A1(Carr等人)；WO 2005/014618(Chang等人)。其中某些格外包括狼瘡的治療。
關(guān)注使用Rituximab的療法的出版物包括Perotta and Abuel，“Responseof chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab”，Abstract # 3360Blood 10(1)(part 1-2)88B(1998)；Stashi et al.，“Rituximab chimeric anti-CD20monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathicthrombocytopenic purpura”，Blood 98(4)952-957(2001)；Matthews，R.，“Medical Heretics”，New Scientist(7 April，2001)；Leandro et al.，“Clinicaloutcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocytedepletion”，Ann Rheum Dis，61833-888(2002)；Leandro et al.，“Lymphocytedepletion in rheumatoid arthritisearly evidence for safety，efficacy and doseresponse”，Arthritis and Rheumatism 44(9)S370(2001)；Leandro et al.，“Anopen study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”，Arthritis and Rheumatism 462673-2677(2002)；Edwards and Cambridge，“Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed todeplete B lymphocytes”，Rhematology 40205-211(2001)；Edwards et al.，“B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmunedisorders”，Biochem.Soc.Trans.，30(4)824-828(2002)；Edwards et al.，“Efficacy and safety of Rituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonalantibodyA randomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoidarthritis”，Arthritis and Rheumatism 46(9)S197(2002)；Levine and Pestronk，“IgM antibody-related polyneuropathiesB-cell depletion chemotherapy usingRituximab”，Neurology 521701-1704(1999)；DeVita et al.，“Efficacy ofselective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis”，Arthritis &Rheum.462029-2033(2002)；Hidashida et al.，“Treatment ofDMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab”，Presented at the AnnualScientific Meeting of the American College of Rheumatology，Oct 24-29，NewOrleans，LA 2002；Tuscano，J.，“Successful treatment of Infliximab-refractoryrheumatoid arthritis with Rituximab”，Presented at the Annual Scientific Meetingof the American College of Rheumatology，Oct 24-29，New Orleans，LA 2002；Specks et al.，“Response of Wegener’s granulomatosis to anti-CD20 chimericmonoclonal antibody therapy”，Arthritis & Rheumatism 44(12)2836-2840(2001)；Anolik et al.，“B lympocyte Depletion in the Treatment of SystemicLupus(SLE)Phase I/II Trial of Rituximab(RITUXAN)in SLE”，Arthritis AndRheumatism 46(9)S289-S289，Abstract 717(October，2002)；Albert et al.，“APhase I Tial of Rituximab(Anti-CD20)for Treatment of Systemic LupusErythematosus”，Arthritis And Rheumatism 48(12)3659-3659，Abstract LB9(December，2003)；Martin and Chan，“Pathogenic Roles of B cells in HumanAutoimmunityInsights from the Clinic”，Immunith 20517-527(2004)。
發(fā)明概述本發(fā)明至少部分涉及CD20抗體劑量的選擇，以便在諸如PPMS或RRMS等多發(fā)性硬化患者中提供安全有效的治療攝生法。
因此，本發(fā)明涉及在受試者中治療多發(fā)性硬化的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的CD20抗體，以提供約0.5至4克的初次抗體暴露，隨后是約0.5至4克的第二次抗體暴露，所述第二次暴露是直到距初次暴露約16至60周時(shí)才提供的，且每次抗體暴露是作為一劑或兩劑(two doses)抗體提供給受試者的。
此外，本發(fā)明涉及包括以下各項(xiàng)的制品(a)裝有CD20抗體的容器；及(b)附有關(guān)于在受試者中治療多發(fā)性硬化的說明書的包裝插頁，其中所述說明書指出對(duì)受試者施用一定量的抗體，它有效提供約0.5至4克的初次抗體暴露，隨后是約0.5至4克的第二次抗體暴露，所述第二次暴露是直到距初次暴露約16至60周時(shí)才提供的，且每次抗體暴露是作為單劑或兩劑抗體(as one or two doses of antibody)提供給受試者的。
附圖簡述

圖1A是比較鼠源2H7(SEQ ID NO1)、人源化2H7.v16變體(SEQ IDNO2)和人κ輕鏈亞組I(SEQ ID NO3)每種的輕鏈可變區(qū)(VL)氨基酸序列的序列對(duì)比。2H7和hu2H7.v16的VL的CDR如下CDR1(SEQ ID NO4)、CDR2(SEQ ID NO5)和CDR3(SEQ ID NO6)。
圖1B是比較鼠源2H7(SEQ ID NO7)、人源化2H7.v16變體(SEQ IDNO8)和人重鏈亞組III共有序列(SEQ ID NO9)每種的重鏈可變區(qū)(VH)氨基酸序列的序列對(duì)比。2H7和hu2H7.v16的VH的CDR如下CDR1(SEQID NO10)、CDR2(SEQ ID NO11)和CDR3(SEQ IDNO12)。
在圖1A和圖1B中，每條鏈中的CDR1、CDR2和CDR3都包括在括號(hào)內(nèi)，側(cè)翼為框架區(qū)FR1-FR4，如圖所示。2H7指鼠源2H7抗體。兩行序列之間的星號(hào)指示這兩種序列之間不同的位置。殘基編號(hào)依照Kabat等人，《sequences of Immunological Interest》，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.，1991，插入顯示為a、b、c、d和e。
圖2顯示了成熟2H7.v16輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO13)。
圖3顯示了成熟2H7.v16重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO14)。
圖4顯示了成熟2H7.v31重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO15)。2H7.v31的輕鏈與2H7.v16相同。
圖5顯示了成熟2H7.v16和2H7.v511輕鏈(分別是SEQ ID NO13和16)的對(duì)比，采用Kabat可變區(qū)殘基編號(hào)和Eu恒定區(qū)殘基編號(hào)。
圖6顯示了成熟2H7.v16和2H7.v511重鏈(分別是SEQ ID NO14和17)的對(duì)比，采用Kabat可變區(qū)殘基編號(hào)和Eu恒定區(qū)殘基編號(hào)。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述I.定義“B細(xì)胞”是在骨髓中成熟的淋巴細(xì)胞，包括幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞或效應(yīng)B細(xì)胞(漿細(xì)胞)。本文中的B細(xì)胞可以是正常的或非惡性的B細(xì)胞。
“B細(xì)胞表面標(biāo)志”或“B細(xì)胞表面抗原”在本文中指在B細(xì)胞表面上表達(dá)的、可用能結(jié)合它的抗體靶向它的抗原。例示性B細(xì)胞表面標(biāo)志包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白細(xì)胞表面標(biāo)志(描述參見《The Leukocyte Antigen Facts Book》，第2版，1997，Barclay等人編，Academic Press，Harcourt Brace & Co.，New York)。其它B細(xì)胞表面標(biāo)志包括RP105、FcRH2、B細(xì)胞CR2、CCR6、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA和239287。本文中特別感興趣的B細(xì)胞表面標(biāo)志較之哺乳動(dòng)物的其它非B細(xì)胞組織優(yōu)先在B細(xì)胞上表達(dá)，且可在前體B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞二者上表達(dá)。優(yōu)選的B細(xì)胞表面標(biāo)志在本文中是CD20。
“CD20”抗原或“CD20”是在超過90％來自外周血或淋巴樣器官的B細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的一種約35kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在于正常B細(xì)胞以及惡性B細(xì)胞二者上，但在干細(xì)胞上不表達(dá)。文獻(xiàn)中CD20的其它名稱包括“B淋巴細(xì)胞限制抗原”和“Bp35”。例如，Clark et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)821766(1985)中描述了CD20抗原。
“抗體拮抗劑”在本文中指在結(jié)合B細(xì)胞上的B細(xì)胞表面標(biāo)志后破壞或消減哺乳動(dòng)物中的B細(xì)胞和/或干擾一種或多種B細(xì)胞功能(例如通過降低或阻止由B細(xì)胞引發(fā)的體液反應(yīng))的抗體。優(yōu)選的是，抗體拮抗劑能夠在用其處理的哺乳動(dòng)物中消減B細(xì)胞(即降低循環(huán)中的B細(xì)胞水平)。這種消減可通過各種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)，諸如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)、抑制B細(xì)胞增殖、和/或誘導(dǎo)B細(xì)胞死亡(如通過凋亡)。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”指由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體，隨后引起靶細(xì)胞溶解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcyRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)中第464頁表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測定法，諸如美國專利5,500,362或5,821,337中所描述的?？捎糜诖祟悳y定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評(píng)估目的分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes et al.，PNAS(USA)95652-656(1998)中所公開的。
“人效應(yīng)細(xì)胞”指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)物功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)物功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。
術(shù)語“Fc受體”和“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的FcR(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“激活受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)域。激活受體FcγRIIA在其胞質(zhì)域中包含基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質(zhì)域中包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見Daёron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。FcR的綜述參見Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 425-34(1994)；及de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126330-341(1995))。術(shù)語“FcR”在本文中涵蓋其它FcR，包括未來將會(huì)鑒定的FcR。該術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，它負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer et al.，J.Immunol.117587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24249(1994))。
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”指在存在補(bǔ)體時(shí)分子溶解靶物的能力。補(bǔ)體激活途徑是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子(如抗體)起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測定法，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202163(1996)中所描述的。
“生長抑制性”抗體指那些阻止或降低表達(dá)抗體所結(jié)合的抗原的細(xì)胞增殖的抗體。例如，抗體可在體外和/或在體內(nèi)阻止或降低B細(xì)胞增殖。
“誘導(dǎo)凋亡”的抗體指那些根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)凋亡測定法諸如膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細(xì)胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞破裂和/或膜囊形成(稱作凋亡小體)的測定，誘導(dǎo)例如B細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡的抗體。
術(shù)語“抗體”在本文中使用其最廣的含義，具體覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展示所需生物學(xué)活性。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
為了本文的目的，“完整抗體”指包含重鏈和輕鏈可變區(qū)及Fc區(qū)的抗體。
“天然抗體”通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的分子量約150,000道爾頓的異型四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在具有不同免疫球蛋白同種型的重鏈中有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(VH)，接著是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(VL)，而另一端是一個(gè)恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)排列在一起，而輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語“可變的”指可變區(qū)中的某些部分在抗體序列中差異廣泛且用于每種特定抗體針對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱作高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段?？勺儏^(qū)中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自包含四個(gè)FR，它們大多采取β-折疊構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在某些情況中形成β-折疊結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。恒定區(qū)不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但顯示出多種效應(yīng)物功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)中抗體的參與。
用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱作“Fab”片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和一個(gè)殘余“Fc”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab′)2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且仍能夠交聯(lián)抗原。
“Fv”是包含完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變區(qū)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，各個(gè)可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)相互作用而在VH-VL二聚體表面確定了一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)高變區(qū)的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段因在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與Fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。本文中Fab’-SH是其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶至少一個(gè)游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab′)2抗體片段最初是作為成對(duì)Fab’片段生成的，在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。
來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將抗體歸入不同的類別。完整抗體有五種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。將與不同抗體類別對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作α、δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，該Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Plückthun，在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，269-315，1994。
術(shù)語“雙抗體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)。
術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時(shí)指由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的變體外，這種變體通常以極少量存在。與典型的包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品不同，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的同一決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)越性體現(xiàn)在它們未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”指示由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體的特征，并不解釋為需要通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler et al.，Nature256495(1975)描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利4,816,567)?！皢慰寺】贵w”還可使用例如Clackson et al.，Nature 352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)中描述的技術(shù)由噬菌體抗體庫分離。
單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們顯示出所需的生物學(xué)活性(美國專利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長類動(dòng)物(如舊大陸猴類(Old World Monkey)，諸如狒狒、恒河猴或獼猴)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列以及人恒定區(qū)序列的“靈長類化(primatized)”抗體(美國專利5,693,780)。
非人(如鼠源)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常，人源化抗體將包含基本上不少于至少一個(gè)、通常兩個(gè)如下可變區(qū)，其中所有或基本上所有的高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR，除了上文所述的FR替代。任選的是，人源化抗體還將包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jones etal.，Nature 321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(如輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變區(qū)中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)和/或來自“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變區(qū)中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987))。“框架”或“FR”殘基指本文定義的高變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
“裸抗體(naked antibody)”指未偶聯(lián)異源分子，諸如細(xì)胞毒性模塊或放射性標(biāo)記物的抗體(本文所定義的)。
結(jié)合CD20抗原的抗體的實(shí)例包括“C2B8”，現(xiàn)在稱作“Rituximab”(利妥昔單抗，“RITUXAN”)(美國專利5,736,137)；釔[90]標(biāo)記的2B8鼠源抗體，稱作“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”(ZEVALIN)，可從IDECPharmaceuticals，Inc.購買(美國專利5,736,137；2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，編號(hào)HB11388)；鼠源IgG2a“B1”，也稱作“Tositumomab”(托西莫單抗)，任選用131I標(biāo)記以產(chǎn)生“131I-B1”抗體或“I131-tositumomab”抗體(BEXXARTM)，可從Corixa購買(還可見美國專利5,595,721)；鼠源單克隆抗體“1F5″(Press et al.，Blood 69(2)584-591(1987)及其變體，包括“框架修補(bǔ)”或人源化1F5(WO 03/002607，Leung，S.；ATCC保藏物HB-96450)；鼠源2H7和嵌合2H7抗體(美國專利5,677,180)；人源化2H7；HuMax-CD20(Genmab，丹麥，WO 2004/035607)；AME-133(Applied MolecularEvolution)；A20抗體或其變體，諸如嵌合或人源化A20抗體(分別是cA20或hA20)或IMMU-106(US 2003/0219433，Immunomedics)；結(jié)合CD20的抗體，包括表位消減的Leu-16、1H4或2B8，任選與IL-2偶聯(lián)，見US2005/0069545 A1和WO 2005/16969(Carr等人)；結(jié)合CD22和CD20的雙特異性抗體，例如hLL2xhA20(WO 2005/14618，Chang等人)；單克隆抗體L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，可從國際白細(xì)胞分類研究組(International Leukocyte Typing Workshop)獲得(Valentine等人，在《LeukocyteTyping III》中，McMichael編，第440頁，Oxford University Press，1987)；1H4(Haisma et al.，Blood 92184(1998))；抗CD20 auristatin E偶聯(lián)物(SeattleGenetics)；抗CD20-IL2(EMD/Biovation/City of Hope)；抗CD20 MAb療法(EpiCyte)；及抗CD20抗體TRU 015(Trubion)。
術(shù)語“Rituximab”或“RITUXAN”在本文中指針對(duì)CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國專利5,736,137中稱作“C2B8”，包括其保持結(jié)合CD20能力的片段。Rituximab可從Genentech購買。
純粹為了本文的目的且除非另有說明，“人源化2H7”指結(jié)合CD20的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體在體內(nèi)有效消減靈長類B細(xì)胞，該抗體在其重鏈可變區(qū)(VH)中至少包含來自抗人CD20抗體的CDR H3序列SEQ ID NO12(圖1B)和基本上人重鏈亞組III(VHIII)的人共有框架(FR)殘基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體還包含重鏈CDR H1序列SEQ ID NO10和CDR H2序列SEQ ID NO11，更優(yōu)選還包含輕鏈CDR L1序列SEQ IDNO4、CDR L2序列SEQ ID NO5、CDR L3序列SEQ ID NO6和基本上人輕鏈κ亞組I(VκI)的人共有框架(FR)殘基，其中VH區(qū)可連接人IgG鏈恒定區(qū)，其中所述區(qū)可以是例如IgG1或IgG3。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類抗體包含VH序列SEQ ID NO8(v16，如圖1B所示)，任選還包含VL序列SEQ ID NO2(v16，如圖1A所示)，它可在重鏈中具有氨基酸替代D56A和N100A以及在輕鏈中具有S92A(v96)。優(yōu)選的是，所述抗體是包含輕鏈和重鏈氨基酸序列分別為SEQ ID NO13和14(如圖2和3所示)的完整抗體。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是包含輕鏈和重鏈氨基酸序列分別為SEQ ID NO13和15(如圖2和4所示)的2H7.v31。本文中的抗體還可在Fc區(qū)中包含至少一個(gè)改進(jìn)ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代，諸如其中氨基酸替代是S298A/E333A/K334A的抗體，更優(yōu)選具有重鏈氨基酸序列SEQ ID NO15(如圖4所示)的2H7.v31。任何這些抗體還可在Fc區(qū)中包含至少一個(gè)降低CDC活性的氨基酸替代，例如至少包含替代K322A。見美國專利6,528,624 B1(Idusogie等人)。
優(yōu)選的人源化2H7是如下完整抗體或抗體片段，其包含輕鏈可變區(qū)序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO2)；和重鏈可變區(qū)序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO8)。
當(dāng)人源化2H7抗體是完整抗體時(shí)，優(yōu)選的是，它包含輕鏈氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS
SPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO13)；和重鏈氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO14)或重鏈氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO15)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，基于2H7型式16的變體的可變區(qū)將具有v16的氨基酸序列，除了下表指出的氨基酸替代的位置。除非另有說明，2H7變體將具有與v16相同的輕鏈。
“分離的”抗體指已經(jīng)由其天然環(huán)境的一種成分鑒別和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分指將會(huì)干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry方法的測定，抗體重量超過95％，最優(yōu)選重量超過99％，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)通過使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE達(dá)到同質(zhì)。既然抗體的天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個(gè)純化步驟來制備。
“受試者”在本文中指人類受試者。通常，此類受試者符合接受多發(fā)性硬化治療的條件。為了本文的目的，此類符合條件的受試者是正在發(fā)生、已經(jīng)發(fā)生、或有可能發(fā)生多發(fā)性硬化的一種或多種征候、癥狀或其它指標(biāo)；已經(jīng)診斷有多發(fā)性硬化，無論是例如最近診斷(具有“新發(fā)作”的MS)，先前診斷有新的復(fù)發(fā)或加劇，先前診斷并處于消退期等；和/或有風(fēng)險(xiǎn)形成多發(fā)性硬化的受試者。患有或有風(fēng)險(xiǎn)患上多發(fā)性硬化的受試者可任選作為已經(jīng)對(duì)血清、腦脊液(CSF)和/或MS損傷中CD20陽性B細(xì)胞水平升高篩選的受試者或者使用檢測諸如下述自身抗體的測定法篩選的受試者而得到鑒定，其中定性且優(yōu)選定量評(píng)估自身抗體生成。與多發(fā)性硬化有關(guān)的例示性此類自身抗體包括抗髓磷脂堿性蛋白(MBP)、抗髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)、抗神經(jīng)節(jié)苷脂和/或抗神經(jīng)絲抗體?？稍谑茉囌叩难濉⒛X脊液(CSF)和/或MS損傷中檢測此類自身抗體?！吧叩摹弊陨砜贵w或B細(xì)胞水平在本文中意指所述自身抗體或B細(xì)胞水平顯著超過未患MS的個(gè)體的水平。
“治療”受試者在本文中指治療性處理和預(yù)防性措施二者。需要治療的受試者包括早就患有多發(fā)性硬化的受試者以及要預(yù)防多發(fā)性硬化的受試者。因此，受試者可能已經(jīng)診斷為患有多發(fā)性硬化或者可能有患上多發(fā)性硬化的傾向或易感性。
MS的“癥狀”指受試者所發(fā)生的且指示MS的結(jié)構(gòu)、功能或感覺方面的任何病態(tài)現(xiàn)象或偏離正常。
“多發(fā)性硬化”指以髓磷脂的進(jìn)行性破壞為特征且常致殘的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病。國際上公認(rèn)有四種形式的MS，即原發(fā)進(jìn)行型多發(fā)性硬化(primary progressive multiple sclerosis)(PPMS)、復(fù)發(fā)緩和型多發(fā)性硬化(relapsing-remitting multiple sclerosis)(RRMS)、繼發(fā)進(jìn)行型多發(fā)性硬化(SPMS)和進(jìn)行性復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化(PRMS)。
“原發(fā)進(jìn)行型多發(fā)性硬化”或“PPMS”的特征為從發(fā)作開始病情漸進(jìn)性的發(fā)展，而根本沒有重疊的復(fù)發(fā)和緩和?？赡苡胁∏榉€(wěn)定的時(shí)期，可能有較好和較壞的某些天或某些周。PPMS與RRMS和SPMS的區(qū)別在于其發(fā)作多在三十多歲后期或四十多歲早期，男性與女性同樣有可能患此病，而且最初的病情常常在脊髓而不是腦。PPMS經(jīng)常轉(zhuǎn)移入腦部，但較RRMS或SPMS而言損傷腦區(qū)的可能性較小；例如，PPMS患者產(chǎn)生認(rèn)知問題的可能性較小。PPMS是MRI掃描顯示炎性(釓增強(qiáng))損傷的可能性最小的MS亞型。該疾病的原發(fā)進(jìn)行形式影響所有多發(fā)性硬化患者的10-15％。可依照McDonald etal.，Ann.Neurol.50121-7(2001)的標(biāo)準(zhǔn)確定PPMS。本文中所治療的患PPMS的受試者通常是可能或確定診斷患有PPMS的人。
“復(fù)發(fā)緩和型多發(fā)性硬化”或“RRMS”的特征在于復(fù)發(fā)(也稱為病情加重)，在此期間新癥狀可能出現(xiàn)而老癥狀重新出現(xiàn)或惡化。復(fù)發(fā)之后是病情緩和期，在此期間患者完全或部分從復(fù)發(fā)期間所造成的缺陷中恢復(fù)。復(fù)發(fā)可持續(xù)數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月，而恢復(fù)則可能是緩慢和逐步的，或者幾乎是瞬間的。絕大部分MS患者首先診斷為RRMS。這通常是在他們二十多歲或三十多歲的時(shí)候，盡管診斷要知道的早得多或晚得多。表現(xiàn)出此MS亞型的女性患者是男性的兩倍。在復(fù)發(fā)期間，髓磷脂，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白質(zhì)區(qū)中神經(jīng)纖維(神經(jīng)元)周圍的保護(hù)性隔離鞘，可能被身體自身免疫系統(tǒng)的炎性反應(yīng)所損傷。這引起許多神經(jīng)學(xué)癥狀，根據(jù)CNS的哪個(gè)區(qū)域損傷而變化相當(dāng)大。在復(fù)發(fā)后，炎性反應(yīng)立即逐漸變?nèi)?，且CNS中一種特殊類型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(稱為少突膠質(zhì)細(xì)胞)發(fā)起髓鞘重新形成-軸突周圍的髓鞘可被修復(fù)的過程。很可能是此髓鞘重新形成造成了病情緩和。大約50％的RRMS患者在發(fā)病10年內(nèi)轉(zhuǎn)變成SPMS。30年后，此數(shù)字升高至90％。在任何時(shí)間，此疾病的復(fù)發(fā)緩和形式占所有MS患者的55％。
“繼發(fā)進(jìn)行型多發(fā)性硬化”或“SPMS”的特征在于臨床神經(jīng)學(xué)損傷的穩(wěn)定發(fā)展，具有或沒有疊加的復(fù)發(fā)及較小的緩和和平穩(wěn)狀態(tài)。發(fā)生SPMS的人先前將經(jīng)歷過RRMS時(shí)期，此時(shí)期可能已持續(xù)了2至40年或更長時(shí)間的任何時(shí)長。存在的任何疊加的復(fù)發(fā)和緩和都傾向于隨著時(shí)間的過去逐漸變少。從所述疾病的繼發(fā)進(jìn)行階段開始，致殘開始發(fā)展得比其在RRMS期間快得多，盡管這樣的發(fā)展在某些個(gè)體中仍然可以是相當(dāng)緩慢的。10年后，50％的RRMS患者將發(fā)展成SPMS。到25至30年，此數(shù)字將上升至90％。SPMS傾向于與較RRMS而言較低水平的炎性損傷形成相關(guān)，但病情繼續(xù)發(fā)展。在任一時(shí)間，SPMS都占全部多發(fā)性硬化患者的30％左右。
“進(jìn)行性復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化”或“PRMS”的特征在于臨床神經(jīng)學(xué)損傷的穩(wěn)定發(fā)展及重疊的復(fù)發(fā)和緩和。在某次復(fù)發(fā)后會(huì)立即有顯著的恢復(fù)，但在兩次復(fù)發(fā)之間癥狀逐漸惡化。PRMS占全部多發(fā)性硬化患者的5％左右。有些神經(jīng)學(xué)家認(rèn)為PRMS是PPMS的一種變體。
表述“有效量”指有效預(yù)防、改善或治療多發(fā)性硬化的抗體(或其它藥物)的量。這樣的有效量通常將導(dǎo)致MS的征候、癥狀或其它指標(biāo)有所改善，諸如降低復(fù)發(fā)率、防止勞動(dòng)能力喪失、減少腦MRI損傷的數(shù)目和/或體積、提高定時(shí)25步走、延長到達(dá)疾病發(fā)展情形的時(shí)間(例如使用擴(kuò)展的能力喪失標(biāo)度(Expanded Disability Status Scale，EDSS))等。
“抗體暴露”指接觸或暴露于在約1-20天的一段時(shí)間里施用的一個(gè)或多個(gè)劑量中的本文抗體。所述劑量可以一次性給予，或者在該暴露期內(nèi)以固定的或無規(guī)律的間隔給予。正如本文詳述的，初次和稍后(如第二次或第三)的抗體暴露彼此在時(shí)間上隔開。
術(shù)語“免疫抑制劑”在本文中用于輔助療法時(shí)指作用于抑制或掩蓋本文所治療哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這將包括抑制細(xì)胞因子生成、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)、或掩蓋MHC抗原的物質(zhì)。此類藥劑的實(shí)例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見美國專利4,665,077)；非類固醇抗炎藥(NSAID)；更昔洛韋(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid)諸如皮質(zhì)醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎藥諸如環(huán)加氧酶抑制劑、5-脂加氧酶抑制劑或白三烯受體拮抗劑；嘌呤拮抗劑，諸如硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酚酸嗎乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷化劑，諸如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；溴隱亭(bromocryptine)；達(dá)扎唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(如美國專利4,120,649中所述，它掩蓋MHC抗原)；針對(duì)MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體；環(huán)孢菌素A；類固醇，諸如皮質(zhì)類固醇或糖皮質(zhì)類固醇或糖皮質(zhì)激素類似物，如潑尼松(prednisone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；二氫葉酸還原酶抑制劑，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；羥氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；來氟米特(leflunomide)；細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素-α、-β或-γ抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體(infliximab或adalimumab)、抗TNF-α免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗腫瘤壞死因子-β抗體、抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；泛T(pan-T)抗體，優(yōu)選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結(jié)合域的可溶性肽(90年7月26日出版的WO 90/08187)；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T細(xì)胞受體(Cohen等人，美國專利5,114,721)；T細(xì)胞受體片段(Offner et al.，Science 251430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway，Nature341482(1989)；及WO 91/01133)；及T細(xì)胞受體抗體(EP 340,109)，諸如T10B9。
術(shù)語“胞毒劑”在用于本文時(shí)指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意欲包括放射性同位素(如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素或其片段。
“化療劑”指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊悾T如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物拓?fù)涮婵?topotecan))、苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycin)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲類，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類(enediyne)抗生素(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素ωI1(見例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186(1994)))；蒽環(huán)類(dynemicin)抗生素，包括dynemicin A；二碳磷酸鹽類(bisphosphonate)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(mitomycin)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培來霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、羥甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸；醋葡內(nèi)酯(aceglaone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羥吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安絲菌素(ansamitocin))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖復(fù)合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurinA、桿孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；噻替哌(thiotepa)；類紫杉醇(taxoid)，如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)、ABRAXANETM紫杉醇的不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造納米顆粒劑型(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨喋呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長春堿(vinblastine)；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine)；NAVELBINE長春瑞賓(vinorelbine)；諾安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依達(dá)曲沙(edatrexate)；柔紅霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希羅達(dá)(xeloda)；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維A酸，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；以及上述任何物質(zhì)的制藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。
該定義還包括作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抑制調(diào)節(jié)腎上腺中雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏羅唑(vorozole)、FEMARA來曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿納托唑(anastrozole)；及抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制涉及粘著性細(xì)胞增殖的信號(hào)途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Ralf和H-Ras；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑；ABARELIXrmRH；及上述任何物質(zhì)的制藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。
術(shù)語“細(xì)胞因子”指由一種細(xì)胞群釋放的、作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。此類細(xì)胞因子的例子是淋巴因子、單核因子；白介素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時(shí)，術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等效物，包括通過人工合成產(chǎn)生的小分子實(shí)體及其制藥學(xué)可接受的衍生物和鹽。
術(shù)語“激素”指多肽激素，通常由具有導(dǎo)管的腺器官分泌。激素包括例如生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素、和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；促乳素；胎盤催乳激素；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素(activin)；穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；及血小板生成素。在用于本文時(shí)，術(shù)語激素包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列激素的生物學(xué)活性等效物，包括通過人工合成產(chǎn)生的小分子實(shí)體及其制藥學(xué)可接受的衍生物和鹽。
術(shù)語“生長因子”指促進(jìn)生長的蛋白質(zhì)，包括例如肝生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子；血管內(nèi)皮生長因子；神經(jīng)生長因子，諸如NGF-β；血小板衍生生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor)；干擾素，諸如干擾素-α、-β和-γ；及集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)、和粒細(xì)胞CSF(G-CSF)。在用于本文時(shí)，術(shù)語生長因子包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列生長因子的生物學(xué)活性等效物，包括通過人工合成產(chǎn)生的小分子實(shí)體及其制藥學(xué)可接受的衍生物和鹽。
術(shù)語“整聯(lián)蛋白”指容許細(xì)胞結(jié)合和應(yīng)答胞外基質(zhì)且涉及多種細(xì)胞功能諸如傷口愈合、細(xì)胞分化、腫瘤細(xì)胞歸巢和凋亡的受體蛋白質(zhì)。它們是涉及細(xì)胞-胞外基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的細(xì)胞黏附受體大家族的一部分。功能性整聯(lián)蛋白由非共價(jià)結(jié)合的兩個(gè)跨膜糖蛋白亞基組成，稱為α和β。α亞基彼此都享有一定同源性，β亞基也是如此。受體總是含有一條α鏈和一條β鏈。例子包括α6β1、α3β1、α7β1、LFA-1、α4整聯(lián)蛋白等。在用于本文時(shí)，術(shù)語整聯(lián)蛋白包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列整聯(lián)蛋白的生物學(xué)活性等效物，包括通過人工合成產(chǎn)生的小分子實(shí)體及其制藥學(xué)可接受的衍生物和鹽。
本文中“整聯(lián)蛋白拮抗劑或抗體”的例子包括LFA-1抗體，諸如可從Genentech購買的efalizumab(RAPTIVA)；α4整聯(lián)蛋白抗體，諸如可從Biogen購買的natalizumab(TYSABRI)；二氮雜環(huán)苯丙氨酸衍生物(WO2003/89410)；苯丙氨酸衍生物(WO 2003/70709、WO 2002/28830、WO2002/16329和WO 2003/53926)；苯基丙酸衍生物(WO 2003/10135)；烯胺衍生物(WO 2001/79173)；丙酸衍生物(WO 2000/37444)；鏈烷酸衍生物(WO 2000/32575)；取代苯基衍生物(美國專利6,677,339和6,348,463)；芳香胺衍生物(美國專利6,369,229)；及ADAM解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域多肽(US2002/0042368)；針對(duì)αvβ3整聯(lián)蛋白的抗體(EP 633945)；氮橋二環(huán)氨基酸衍生物(WO 2002/02556)等。
為了本發(fā)明的目的，“腫瘤壞死因子-α(TNF-α)”指包含Pennica et al.，Nature 312721(1984)或Aggarwal et al.，JBC 2602345(1985)中所述氨基酸序列的人TNF-α分子。
“TNF-α抑制劑”在本文中指在一定程度上抑制TNF-α的生物學(xué)功能的藥劑，通常通過結(jié)合TNF-α和中和其活性。本文具體涵蓋的TNF抑制劑的例子是依那西普(etanercept)(ENBREL)、英夫利昔單抗(infliximab)(REMICADE)和阿達(dá)木單抗(adalimumab)(HUMIRATM)。
“減輕疾病的抗風(fēng)濕藥”或“DMARD”的例子包括羥氯喹、柳氮磺吡啶、甲氨喋呤、來氟米特、依那西普、英夫利昔單抗(加上口服和皮下甲氨喋呤)、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金(口服)、金(肌肉內(nèi))、米諾環(huán)素(minocycline)、環(huán)孢菌素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附，包括其鹽和衍生物等。
“非類固醇抗炎藥”或“NSAID”的例子是乙酰水楊酸、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)，包括其鹽和衍生物等。
“皮質(zhì)類固醇”指具有類固醇的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)，模擬或提高天然存在皮質(zhì)類固醇的效果的數(shù)種合成的或天然存在的物質(zhì)的任一種。合成的皮質(zhì)類固醇的例子包括潑尼松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)(包括甲潑尼龍(methylprednisolone))、地塞米松(dexamethasone)、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid)和倍他米松(betamethasone)。
“包裝插頁”用于指通常包括在治療性產(chǎn)品的商品包裝中的說明書，它們包含有關(guān)涉及此類治療性產(chǎn)品應(yīng)用的適應(yīng)征、用法、劑量、施用、禁忌癥、與該包裝產(chǎn)品聯(lián)合的其它治療性產(chǎn)品、和/或警告的信息。
II.治療本發(fā)明提供了在患有多發(fā)性硬化的受試者中治療該病的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體(優(yōu)選CD20抗體)。本文中待治療的MS包括原發(fā)進(jìn)行型多發(fā)型硬化(PPMS)、復(fù)發(fā)緩和型多發(fā)性硬化(RRMS)、繼發(fā)進(jìn)行型多發(fā)性硬化(SPMS)和進(jìn)行性復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化(PRMS)，但PPMS或RRMS的療法是本文中的優(yōu)選實(shí)施方案。
依照一個(gè)優(yōu)選的劑量給藥方案，所述方法包括對(duì)MS受試者施用有效量的CD20抗體，以提供約0.5至4克(優(yōu)選約1.5至2.5克)的初次抗體暴露，隨后是約0.5至4克(優(yōu)選約1.5至2.5克)的第二次抗體暴露，其中所述第二次暴露是直到距初次抗體暴露約16至60周時(shí)才提供的。為了本發(fā)明的目的，第二次抗體暴露指在初次抗體暴露后下次用CD20抗體處理受試者，其中在初次和第二次暴露之間沒有居間的CD20抗體處理或暴露。
初次和第二次或后續(xù)抗體暴露之間的間隔可以從初次抗體暴露的第一劑或第二劑測起，但優(yōu)選從初次抗體暴露的第一劑算起。
在本文的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體暴露間隔約24周或6個(gè)月；或者間隔約48周或12個(gè)月。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二次抗體暴露是直至距初次暴露約20至30周時(shí)才提供的，任選后續(xù)約0.5至4克(優(yōu)選約1.5至2.5克)的第三次抗體暴露，所述第三次抗體暴露是直至距初次暴露約46至60周(優(yōu)選約46至54周)時(shí)才施行的，然后，優(yōu)選直至距初次暴露至少約70-75周是也沒有提供更多的抗體暴露。
在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，所述第二次暴露是直至距初次暴露約46至60周時(shí)才提供的，且后續(xù)抗體暴露，若有的話，是直至距先前的抗體暴露約46至60周時(shí)才提供的。
可以作為單劑量的抗體或者作為兩個(gè)分開劑量(separate doses)的抗體(即包括第一劑和第二劑(a first dose and a second dose))給受試者提供本文中的任何一次或多次抗體暴露。每次抗體暴露所采用的具體劑數(shù)(無論是一劑或兩劑)取決于例如所治療MS的類型、所采用抗體的類型、是否采用第二藥物或采用哪種類型、及施用的方法和頻率。在施用兩個(gè)分開劑量時(shí)，優(yōu)選第二劑在距施用第一劑的時(shí)間約3-17天、更優(yōu)選約6-16天、且最優(yōu)選約13-16天時(shí)施用。在施用兩個(gè)分開劑量時(shí)，優(yōu)選第一劑和第二劑抗體為約0.5-1.5克，更優(yōu)選約0.75-1.3克。
在一個(gè)實(shí)施方案中，給受試者提供至少約3次、或至少約4次抗體暴露，例如約3-60次暴露，且更特別的是約3-40次暴露，最特別的是約3-20次暴露。優(yōu)選的是，此類暴露以每個(gè)約24周或6個(gè)月或者48周或12個(gè)月的間隔施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，每次抗體暴露是作為單一劑量的抗體提供的。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，每次抗體暴露是作為兩個(gè)分開劑量的抗體提供的。然而，不是每次抗體暴露都需要作為單一劑量或兩個(gè)分開劑量提供的。
抗體可以是裸抗體，或者可以偶聯(lián)另一分子，諸如胞毒劑，諸如放射性化合物。本文中優(yōu)選的抗體是Rituximab、人源化2H7(例如包含SEQ ID NO2和8中的可變區(qū)序列)或包含SEQ ID NO23和24中的可變區(qū)序列的人源化2H7、或HuMax-CD20(Genmab)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者先前從未用諸如免疫抑制劑等藥物處理以治療多發(fā)性硬化和/或先前從未用針對(duì)B細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體治療過(例如先前從未用CD20抗體治療過)。
所述抗體以任何合適方式施用，包括腸胃外、局部、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)和/或損傷內(nèi)施用。腸胃外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。還設(shè)想了鞘內(nèi)施用(參閱例如美國專利申請2002/0009444，Grillo-Lopez，A concerning intrathecal delivery of a CD20 antibody)。此外，還可合適的通過脈沖輸注來施用抗體，例如用劑量逐漸減少的抗體。優(yōu)選靜脈內(nèi)、皮下或鞘內(nèi)給藥，最優(yōu)選靜脈內(nèi)輸注。
雖然CD20抗體可以是為了治療多發(fā)性硬化而施用于受試者的唯一藥物，但是可任選伴隨著結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體(例如伴隨著CD20抗體)，施用第二藥物，諸如胞毒劑、化療劑、免疫抑制劑、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子拮抗劑或抗體、生長因子、激素、整聯(lián)蛋白、整聯(lián)蛋白拮抗劑或抗體(例如LFA-1抗體，諸如可從Genentech購得的efalizumab(RAPTIVE)或α4整聯(lián)蛋白抗體，諸如可從Biogen購得的natalizumab(TYSABRI))等。
在聯(lián)合療法的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體可聯(lián)合以下藥物干擾素類藥物，諸如IFN-β-1a(REBIF和AVONEX)或IFN-β-1b(BETASERON)；寡肽，諸如醋酸格拉默(glatiramer acetate)(COPAXONE)；胞毒劑，諸如米托蒽醌(NOVANTRONE)、甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤；靜脈內(nèi)免疫球蛋白(丙種球蛋白)；淋巴細(xì)胞消減性療法(例如米托蒽醌、環(huán)磷酰胺、Campath、抗CD4、克拉屈濱(cladribine)、全省照射、骨髓移植)；皮質(zhì)類固醇(例如甲潑尼龍、潑尼松、地塞米松或糖皮質(zhì)激素)，包括系統(tǒng)皮質(zhì)類固醇療法；非淋巴細(xì)胞消減性免疫抑制性療法(例如霉酚酸嗎乙酯(MMF)或環(huán)孢菌素)；“抑制素(statin)”類降低膽固醇的藥物，包括西立伐他汀(cerivastatin)(BAYCOLTM)、氟伐他汀(fluvastatin)(LESCOLTM)、阿托伐他汀(atorvastatin)(LIPITORTM)、洛伐他汀(lovastatin)(MEVACORTM)、普伐他汀(pravastatin)(PRAVACHOLTM)、辛伐他汀(simvastatin)(ZOCORTM)；雌二醇；睪酮(任選提高的劑量；Stuve et al.，Neurology 8290-301(2002))；激素代替療法；MS繼發(fā)的或相關(guān)的癥狀(例如痙攣、失禁、疼痛、疲勞)的治療；TNF抑制劑；減輕疾病的抗風(fēng)濕藥(DMARD)；非類固醇抗炎藥(NSAID)；血漿去除術(shù)；左旋甲狀腺素；環(huán)孢菌素A；促生長素抑制素類似物；細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑；抗代謝物；免疫抑制劑；康復(fù)性手術(shù)；放射碘；甲狀腺切除術(shù)；其它B細(xì)胞表面標(biāo)志拮抗劑/抗體；等。
第二藥物伴隨著CD20抗體的初次暴露和/或稍后暴露施用，此類聯(lián)合施用包括使用分開的配制劑或單一的藥用配制劑的共施用，以及任一次序的連續(xù)施用，其中優(yōu)選有一段時(shí)間所有兩種(或多種)活性劑同時(shí)發(fā)揮其生物學(xué)活性。
除對(duì)受試者施用抗體外，本申請?jiān)O(shè)想了通過基因療法來施用抗體。表述施用“有效量”的抗體涵蓋編碼抗體的核酸的此類施用。參見例如1996年3月14日出版的WO 96/07321，它關(guān)注通過基因療法來生成胞內(nèi)抗體。
有兩種主要方法使核酸(任選包含在載體中)進(jìn)入受試者的細(xì)胞，即體內(nèi)和回體(ex vivo)。對(duì)于體內(nèi)投遞，通常在需要抗體的部位將核酸直接注射到受試者體內(nèi)。對(duì)于回體治療，采集受試者的細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些分離的細(xì)胞，并將經(jīng)過修飾的細(xì)胞或是直接施用于患者，或是例如裝入多孔膜內(nèi)并植入受試者體內(nèi)(參見例如美國專利4,892,538和5,283,187)。有多種技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移至目的宿主的體外培養(yǎng)細(xì)胞還是體內(nèi)細(xì)胞而有所變化。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀法等。常用于回體投遞基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純皰疹病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。在有些情況中，希望與靶向靶細(xì)胞的試劑一起提供核酸源，諸如對(duì)細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞特異的抗體、靶細(xì)胞上受體的配體等。在采用脂質(zhì)體時(shí)，與胞吞作用相關(guān)細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)可用于靶向和/或促進(jìn)攝入，例如對(duì)特定細(xì)胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中進(jìn)行內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體、和靶向細(xì)胞內(nèi)定位和增加細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。例如Wu et al.，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987)；及Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 873410-3414(1990)中描述了受體介導(dǎo)的胞吞技術(shù)。關(guān)于目前已知的基因標(biāo)記和基因療法方案的綜述參見Anderson et al.，Science 256808-813(1992)。還可參見WO93/25673及其引用的參考文獻(xiàn)。
III.抗體的生產(chǎn)本發(fā)明的方法和制品使用或摻入結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體，尤其是結(jié)合CD20的抗體。因此，本文將描述用于生成此類抗體的方法。
將用于生成或篩選抗體的B細(xì)胞表面標(biāo)志可以是例如包含所需表位的可溶形式的所述標(biāo)志或其部分。或者/另外，在其細(xì)胞表面表達(dá)所述標(biāo)志的細(xì)胞可用于生成或篩選抗體?？捎糜谏煽贵w的其它形式的B細(xì)胞表面標(biāo)志對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是顯而易見的。
下面的描述例示了用于生產(chǎn)依照本發(fā)明使用的抗體的方法。
(i)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過在動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來生成。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烴基，將相關(guān)抗原與在待免疫的物種中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的，例如匙孔血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。
通過將例如100μg或5μg蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和，并將該溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位，由此將動(dòng)物針對(duì)抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進(jìn)行免疫。一個(gè)月后，通過多個(gè)部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中肽或偶聯(lián)物初始量的1/5-1/10對(duì)動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)化。7-14天后，采集動(dòng)物的血液，并測定血清的抗體滴度。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)化直到滴度達(dá)到穩(wěn)定。優(yōu)選的是，將動(dòng)物用相同抗原但與不同蛋白質(zhì)和/或通過不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進(jìn)行強(qiáng)化。偶聯(lián)物還可在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體是由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了在生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的變體外，這種變體通常以很少量存在。由此，修飾語“單克隆”表示抗體的特征，即不是分立的或多克隆的抗體的混合物。
例如，單克隆抗體可以通過最初由Kohler et al.，Nature 256495(1975)描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(美國專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物，諸如倉鼠，以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)。或者，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止缺乏HGPRT的細(xì)胞生長。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平生成抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠源骨髓瘤系，諸如可從Salk Institute CellDistribution Center(San Diege，California，USA)購得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的衍生系，以及可從American Type Culture Collection(Rockville，Maryland，USA)購得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications，51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
可對(duì)雜交瘤細(xì)胞正在其中生長的培養(yǎng)基測定針對(duì)抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。
單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如Munson et al.，Anal.Biochem.107220(1980)的Scatchard分析來測定。
在鑒定得到生成具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，所述克隆可通過有限稀釋流程進(jìn)行亞克隆，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。
可通過常規(guī)免疫球蛋白純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分開。
編碼單克隆抗體的DNA易于通過常規(guī)流程分離并測序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤細(xì)胞作為此類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，諸如不另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述性論文包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130151-188(1992)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從使用McCafferty et al.，Nature 348552-554(1990)所述技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson etal.，Nature 352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠源和人源抗體。后續(xù)出版物描述了通過鏈改組(Marks et al.，Bio/Technology 10779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids Res.212265-2266(1993))，生成高親和力(nM范圍)的人源抗體。由此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。
還可以修飾DNA，例如通過替代即用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替同源鼠源序列(美國專利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851(1984))，或通過共價(jià)接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列。
通常，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定區(qū)，或者用它們替代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，以產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體，它包含對(duì)一種抗原具有特異性的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)以及對(duì)不同抗原具有特異性的另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
(iii)人源化抗體本領(lǐng)域已經(jīng)描述了用于將非人抗體人源化的方法。優(yōu)選的是，人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變區(qū)。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 2391534-1536(1988))，通過用高變區(qū)序列替代相應(yīng)的人抗體序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中本質(zhì)上少于整個(gè)人可變區(qū)用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是其中一些高變區(qū)殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基替代的人抗體。
用于制備人源化抗體的人可變區(qū)的選擇，包括輕鏈和重鏈，對(duì)于降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體可變區(qū)序列對(duì)已知的人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims et al.，J.Immunol.1512296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈可變區(qū)亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.1512623(1993))。
更為重要的是，抗體在人源化后保持對(duì)抗原的高親和力以及其它有利的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，且為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進(jìn)行組合，從而獲得所需抗體特征，諸如對(duì)靶抗原的親和力提高。通常，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)的涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
(iv)人抗體作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.733(1993)；及美國專利5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty et al.，Nature 348552-553(1990))可用于在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因全集生成人抗體和抗體片段。根據(jù)這種技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因的讀碼框中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。由此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進(jìn)行；有關(guān)綜述參見例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3564-571(1993)。V基因區(qū)段的數(shù)種來源可用于噬菌體展示。Clackson et al.，Nature 352624-628(1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型V基因隨機(jī)組合文庫分離得到大量不同的抗噁唑酮抗體?？杀举|(zhì)上依照Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)或Griffith et al.，EMBO J.12725-734(1993)所述技術(shù)，由未免疫人供體構(gòu)建V基因全集，并分離針對(duì)大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利5,565,332和5,573,905。
還可通過體外激活B細(xì)胞(參見美國專利5,567,610和5,229,275)來生成人抗體。
(v)抗體片段已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimoto et al.，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24107-117(1992)和Brennan et al.，Science 22981(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體文庫分離抗體片段?；蛘?，可直接從大腸桿菌回收Fab′-SH片段，并通過化學(xué)方法偶聯(lián)形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab′)2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對(duì)熟練從業(yè)人員是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 1993/16185；美國專利5,571,894；和美國專利5,587,458?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如美國專利5,641,870中描述的抗體。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體指對(duì)至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。例示性的雙特異性抗體可結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的兩種不同表位。其它此類抗體可結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志且還結(jié)合第二種不同的B細(xì)胞表面標(biāo)志?；蛘撸笲細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合臂可與結(jié)合白細(xì)胞上觸發(fā)分子諸如T細(xì)胞受體分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受體(FcγR)，諸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂組合，使得細(xì)胞防御機(jī)制聚焦于B細(xì)胞。雙特異性抗體還可用于將胞毒劑定位于B細(xì)胞。這些抗體擁有B細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合臂以及結(jié)合胞毒劑(例如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-α、長春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab′)2雙特異性抗體)。
用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生成基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein et al.，Nature 305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩，且產(chǎn)物產(chǎn)量低。WO 93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.103655-3659(1991)中公開了類似的流程。
根據(jù)一種不同的方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。融合優(yōu)選使用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選的是，在至少一種融合物中具有包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比率沒有特別意義時(shí)，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一個(gè)載體。
在本方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異性分子中的存在提供了分離的便利途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于將所需雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法公開于WO94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的其它細(xì)節(jié)參見例如Suresh et al.，Methodsin Enzymology 121210(1986)。
根據(jù)美國專利5,731,168中描述的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子之間的界面，將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分CH3抗體恒定區(qū)。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生針對(duì)大側(cè)鏈的相同或相似大小的補(bǔ)償性“空腔”。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機(jī)制。
雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源偶聯(lián)”抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體建議用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利4,676,980)，和用于治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)?？墒褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法來制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，并且連同許多交聯(lián)技術(shù)一起公開于美國專利4,676,980。
文獻(xiàn)中還描述了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brennan et al.，Science 22981(1985)描述了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab′)2片段的方法。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TNB)衍生物。然后將Fab′-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab′-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab′-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。
還描述了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab′部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原而形成單體，然后重新氧化而形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)描述的“雙抗體”技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的替換機(jī)制。該片段包含通過接頭相連的輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段上的VH和VL區(qū)與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)VL和VH區(qū)配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber et al.，J.Immunol.1525368(1994)。
設(shè)想了具有超過兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt et al.，J.Immunol.14760(1991)。
IV.抗體的偶聯(lián)物和其它修飾任選將本文方法中所使用的或制品中所包含的抗體與胞毒劑偶聯(lián)。例如，可將抗體與WO 2004/032828中描述的藥物偶聯(lián)。
上文已經(jīng)描述了可用于生成此類抗體-胞毒劑偶聯(lián)物的化療劑。
本文還設(shè)想了抗體與一種或多種小分子毒素形成的偶聯(lián)物，諸如加利車霉素、美登素(美國專利5,208,020)、單端孢菌毒素和CC1065。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將抗體與一個(gè)和多個(gè)美登素分子偶聯(lián)(例如每個(gè)抗體分子偶聯(lián)約1個(gè)至約10個(gè)美登素分子)。例如可將美登素轉(zhuǎn)變?yōu)镸ay-SS-Me，后者可還原為May-SH3并與經(jīng)修飾抗體反應(yīng)(Chari et al.，Cancer Research 52127-131(1992))以產(chǎn)生美登木素生物堿-抗體偶聯(lián)物。
或者，將抗體與一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子偶聯(lián)。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？墒褂玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙?；?γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research 533336-3342(1993)和Lode et al.，Cancer Research 582925-2928(1998))。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(neomycin)和單端孢菌毒素(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日出版的WO 1993/21232。
本發(fā)明還設(shè)想了與具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)偶聯(lián)的抗體。
有多種放射性同位素可用于生成放射性偶聯(lián)抗體。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如3-(2-吡啶基二巰基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己胺-1-羧酸琥珀酰亞胺酯、亞氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸二甲基己二酰亞胺酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)重氮苯甲?；?己二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 2381098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari et al.，Cancer Research 52127-131(1992))。
或者，可例如通過重組技術(shù)或肽合成法來制備包含抗體和胞毒劑的融合蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將抗體與“受體”(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)，用于腫瘤的預(yù)定位，其中對(duì)受試者施用抗體-受體偶聯(lián)物，隨后使用清除劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與胞毒劑(例如放射性核苷)偶聯(lián)的“配體”(例如親合素)。
還可將本發(fā)明的抗體與前體藥物活化酶偶聯(lián)，后者將前體藥物(例如肽基化療劑，參見WO 81/01145)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚钥拱┧?。參見例如WO 88/07378和美國專利4,975,278。
此類偶聯(lián)物的酶成分包括能夠以這樣一種方式作用于前體藥物從而將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘募?xì)胞毒性形式的任何酶。
可用于本發(fā)明方法的酶包括但不限于可將含磷酸鹽/酯的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸鹽/酯的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的芳基硫酸酯酶；可將無毒5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榭拱┧幬?-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和L)；可轉(zhuǎn)化含D-氨基酸替代的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；可將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的碳水化合物切割酶類，諸如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；可將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的β-內(nèi)酰胺酶；及可將在其氨基氮處分別用苯氧乙?；虮揭阴；苌乃幬镛D(zhuǎn)變成游離藥物的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘?，可使用具有酶活性的抗體，本領(lǐng)域也稱作“抗體酶”，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x活性藥物(參見例如Massey，Nature 328457-458(1987))?？扇绫疚乃鲋苽淇贵w-抗體酶偶聯(lián)物，用于將抗體酶投遞至腫瘤細(xì)胞群。
可通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將本發(fā)明的酶與抗體共價(jià)結(jié)合，諸如使用上文討論的異雙功能交聯(lián)劑。或者，可使用本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建包含與本發(fā)明酶的至少功能活性部分連接的本發(fā)明抗體的至少抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白(參見例如Neuberger et al.，Nature 312604-608(1984))。
本文還設(shè)想了抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物中的一種連接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。與一個(gè)和多個(gè)PEG分子連接的抗體片段，諸如Fab’是本發(fā)明尤其優(yōu)選的實(shí)施方案。
本文公開的抗體還可配制成脂質(zhì)體。可通過本領(lǐng)域已知的方法來制備包含抗體的脂質(zhì)體，諸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774030(1980)；美國專利4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日出版的WO 97/38731中所述。美國專利5,013,556中公開了循環(huán)時(shí)間延長的脂質(zhì)體。
可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物通過反相蒸發(fā)法生成特別有用的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體擠過具有設(shè)定孔徑的濾器，以產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。可如Martin et al.，J.Biol.Chem.257286-288(1982)中所述，將本發(fā)明抗體的Fab’片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑。參見Gabizon et al.，J.NationalCancer Inst.81(19)1484(1989)。
設(shè)想了抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。通過將適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖円肟贵w核酸或通過肽合成法來制備抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列中的殘基刪除和/或插入和/或替代。只要最終的構(gòu)建物具有所需特性，可進(jìn)行刪除、插入和替代的任何組合以獲得最終的構(gòu)建物。氨基酸變化還可能改變抗體的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。
可用于鑒定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的一種方法稱作“丙氨酸掃描突變”，如Cunningham and Wells，Science 2441081-1085(1989)所述。這里，鑒定了一個(gè)或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它變體，推敲那些對(duì)替代顯示功能敏感性的氨基酸位置。由此，雖然引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。例如，為了分析在指定位點(diǎn)處的突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)突變，并對(duì)所表達(dá)的抗體變體篩選所需活性。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，長度范圍從一個(gè)殘基到包含上百或更多殘基的多肽，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括在抗體的N-或C-末端融合酶或提高抗體血清半衰期的多肽。
另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個(gè)氨基酸殘基用不同殘基替換。最感興趣在抗體中進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但也考慮了FR改變。保守替代在表1中顯示在“優(yōu)選替代”標(biāo)題下。如果此類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性的改變，那么可以引入表1中稱為“例示替代”的更實(shí)質(zhì)性改變，或如下文中關(guān)于氨基酸種類的進(jìn)一步描述，并篩選產(chǎn)物。
表1
對(duì)抗體生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修飾通過選擇在保持以下方面的效果上顯著不同的替代來完成(a)替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)其側(cè)鏈特性的相似性，可將氨基酸如下分組(A.L.Lehninger，在《Biochemistry》中，第2版，73-75，Worth Publishers，New York，1975)
(1)非極性的Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)(2)不帶電荷的、極性的Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性的Asp(D)、Glu(E)(4)堿性的Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，可將天然存在殘基如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的Asp、Glu；(4)堿性的His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro；(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。
非保守替代將需要用這些類別之一中的一個(gè)成員交換另一個(gè)類別的。
任何不涉及保持抗體正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可替代，通常用絲氨酸，以改進(jìn)分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。相反，可向抗體中添加半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)抗體是抗體片段諸如Fv片段時(shí))。
特別優(yōu)選的一類替代變體牽涉替代親本抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變體相對(duì)于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改進(jìn)的生物學(xué)特性。產(chǎn)生此類替代變體的一種便利方法是使用噬菌體展示進(jìn)行的親和力成熟。簡而言之，將數(shù)個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))突變，在各個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸替代。如此產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個(gè)顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開的對(duì)噬菌體展示的變體篩選其生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變來鑒定對(duì)抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，以鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。此類接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進(jìn)行替代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生此類變體，如本文所述對(duì)該組變體進(jìn)行篩選，可選擇在一種或多種相關(guān)測定法中具有優(yōu)良特性的抗體用于進(jìn)一步的開發(fā)。
抗體的另一類氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化樣式。此類改變包括刪除在抗體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物模塊，和/或添加抗體中不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。
多肽的糖基化通?；蚴荖-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。由此，多肽中這些三肽序列其中任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
向抗體中添加糖基化位點(diǎn)可通過改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)上文描述的三肽序列而便利的完成(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。這種改變還可通過向原始抗體的序列中添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來進(jìn)行(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。
在抗體包含F(xiàn)c區(qū)時(shí)，可改變附著其上的碳水化合物。例如，美國專利申請2003/0157108 A1(Presta，L.)中描述了具有成熟碳水化合物結(jié)構(gòu)的抗體，所述結(jié)構(gòu)缺乏附著于抗體Fc區(qū)的巖藻糖。還可參見US 2004/0093621 A1(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.)，它關(guān)注CD20抗體組合物。WO 03/011878(Jean-Mairet等人)和美國專利6,602,684(Umana等人)中提到了在附著于抗體Fc區(qū)的碳水化合物中具有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體。WO97/30087(Patel等人)中報(bào)告了在附著于抗體Fc區(qū)的寡糖中具有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體。關(guān)于附著于其Fc區(qū)的碳水化合物更改了的抗體還可參見WO 98/58964(Raju，S.)和WO 99/22764(Raju，S.)。
本文中的優(yōu)選糖基化變體包含F(xiàn)c區(qū)，其中附著于Fc區(qū)的碳水化合物結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖。此類變體具有改進(jìn)的ADCC功能。任選的是，F(xiàn)c區(qū)還包含進(jìn)一步改進(jìn)ADCC的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，例如Fc區(qū)位置298、333和/或334處的替代(Eu殘基編號(hào))。涉及“脫巖藻糖型”或“巖藻糖缺乏型”抗體的出版物的例子包括美國專利申請US 2003/0157108 A1，Presta，L.；WO2000/61739 A1；WO 2001/29246 A1；US 2003/0115614 A1；US 2002/0164328A1；US 2004/0093621 A1；US 2004/0132140 A1；US 2004/0110704 A1；US2004/0110282 A1；US 2004/0109865 A1；WO 2003/085119 A1；WO2003/084570 A1；WO 2005/035778；WO 2005/035586(描述巖藻糖化的RNA抑制(RNAi))；Okazaki et al.，J.Mol.Biol.3361239-1249(2004)；及Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87614(2004)。生成脫巖藻糖化抗體的細(xì)胞系的例子包括蛋白質(zhì)巖藻糖化缺陷的Lec13 CHO細(xì)胞(Ripka et al.，Arch.Biochem.Biophys.249533-545(1986)；美國專利申請US 2003/0157108 A1，Presta，L；及WO 2004/056312 A1，Adams et al.，尤其是實(shí)施例11)和敲除細(xì)胞系，諸如α-1，6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)UT8，敲除的CHO細(xì)胞(Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87614(2004))。
編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然存在氨基酸序列變體的情況中)，或者通過對(duì)早期制備的變體或非變體形式的抗體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備。
可能希望在效應(yīng)物功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如增強(qiáng)抗體的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。這可通過在抗體Fc區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代來實(shí)現(xiàn)。或者/另外，可在Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而使得在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)。參見Caron et al.，J.Exp.Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.1482918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff et al.，Cancer Research 532560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯(lián)劑來制備。或者，抗體可改造成具有雙重Fc區(qū)，并因此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見Stevenson etal.，Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。
WO 00/42072(Presta，L.)描述了在存在人效應(yīng)細(xì)胞時(shí)具有改進(jìn)的ADCC功能的抗體，其中所述抗體在其Fc區(qū)中包含氨基酸替代。優(yōu)選的是，具有改進(jìn)的ADCC的抗體在Fc區(qū)的位置298、333和/或334包含替代。優(yōu)選的是，改變的Fc區(qū)是在一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)這些位置處包含替代或由其組成的人IgG1 Fc區(qū)。
WO 99/51642、美國專利6,194,551 B1、美國專利6,242,195 B1、美國專利6,528,624 B1和美國專利6,538,124(Idusogie等人)中描述了具有改變的C1q結(jié)合和/和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的抗體。這些抗體在其Fc區(qū)的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334其中一個(gè)或多個(gè)處包含氨基酸替代。
為了提高抗體的血清半衰期，可如例如美國專利5,739,277中所述將補(bǔ)救受體結(jié)合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時(shí)，術(shù)語“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區(qū)中負(fù)責(zé)提高IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。WO 00/42072(Presta，L.)中也描述了在其Fc區(qū)中具有替代且血清半衰期提高了的抗體。
還設(shè)想了具有三個(gè)或更多(優(yōu)選四個(gè))功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的改造抗體(美國專利申請US 2002/0004587 A1，Miller等人)。
V.藥用配制劑制備依照本發(fā)明使用的抗體的治療用配制劑，即將具有所需純化程度的抗體與任選的制藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.編，1980)，以凍干配制劑或水溶液的形式貯存?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無毒的，還包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
例示性抗CD20抗體配制劑描述于WO 98/56418。該出版物描述了液體多劑量配制劑，其中含有40mg/mL Rituximab，25mM醋酸鹽，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨醇酯20，pH5.0，它在2-8℃具有最少2年的保存期。另一種感興趣的抗CD20配制劑在9.0mg/mL氯化鈉，7.35mg/mL二水合檸檬酸鈉，0.7mg/mL聚山梨醇酯80，和注射用無菌水，pH6.5中包含10mg/mL Rituximab。
適于皮下施用的凍干配制劑描述于美國專利6,267,958(Andya等人)。此類凍干配制劑可用合適的稀釋劑重建成高蛋白質(zhì)濃度，且重建后的配制劑可皮下施用于本文中待治療的哺乳動(dòng)物。
還設(shè)想了結(jié)晶形式的抗體。參見例如US 2002/0136719A1(Shenoy等人)。
本文中的配制劑還可含有所治療具體適應(yīng)癥所必需的超過一種活性化合物，優(yōu)選那些活性互補(bǔ)且彼此沒有不利影響的化合物。例如，可能還希望在配制劑中提供胞毒劑；化療劑；免疫抑制劑；細(xì)胞因子；細(xì)胞因子拮抗劑或抗體；生長因子；激素；整聯(lián)蛋白；整聯(lián)蛋白拮抗劑或抗體(例如LFA-1抗體，諸如可從Genentech購得的efalizumab/RAPTIVE，或α4整聯(lián)蛋白抗體，諸如可從Biogen購得的natalizumab/ANTEGREN)；干擾素類藥物，諸如IFN-β-1a(REBIF和AVONEX)或IFN-β-1b(BETASERON)；寡肽，諸如醋酸格拉默(COPAXONE)；胞毒劑，諸如米托蒽醌(NOVANTRONE)、甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥或硫唑嘌呤；靜脈內(nèi)免疫球蛋白(丙種球蛋白)；淋巴細(xì)胞消減性藥物，例如米托蒽醌、環(huán)磷酰胺、Campath、抗CD4或克拉屈濱；非淋巴細(xì)胞消減性免疫抑制性藥物，例如霉酚酸嗎乙酯(MMF)或環(huán)孢菌素；“抑制素(statin)”類降低膽固醇的藥物；雌二醇；睪酮；激素代替療法；治療MS繼發(fā)的或相關(guān)的癥狀(例如痙攣、失禁、疼痛、疲勞)的藥物；TNF抑制劑；減輕疾病的抗風(fēng)濕藥(DMARD)；非類固醇抗炎藥(NSAID)；皮質(zhì)類固醇(例如甲潑尼龍、潑尼松、地塞米松或糖皮質(zhì)激素)；左旋甲狀腺素；環(huán)孢菌素A；促生長素抑制素類似物；細(xì)胞因子拮抗劑；抗代謝物；免疫抑制劑；整聯(lián)蛋白拮抗劑或抗體(例如LFA-1抗體，諸如efalizumab或α4整聯(lián)蛋白抗體，諸如natalizumab)；或其它B細(xì)胞表面標(biāo)志拮抗劑/抗體等。此類其它藥劑的類型和有效量取決于例如配制劑中存在的抗體的量、所治療多發(fā)性硬化的類型、及受試者的臨床參數(shù)。這些通常以與上文所用相同的劑量和施用途徑或者迄今所用劑量的大約1-99％使用。
活性成分還可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、在膠狀藥物傳遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開于例如《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.編，1980。
可制備持續(xù)釋放配制劑。持續(xù)釋放配制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以定型產(chǎn)品的形式存在，如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)。
VI.制品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了裝有可用于治療上文所述多發(fā)性硬化的物質(zhì)的制品。優(yōu)選的是，該制品包含(a)裝有包含結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體(如CD20抗體)和制藥學(xué)可接受載體或稀釋劑的組合物的容器；及(b)附有說明書的包裝插頁，關(guān)于對(duì)患有多發(fā)性硬化的受試者施用所述組合物，以提供約0.5至4克的初次抗體暴露，隨后是約0.5至4克的第二次抗體暴露，所述第二次暴露是直到距初次暴露約16至60周時(shí)才提供的；或是關(guān)于對(duì)患有PPMS的受試者施用所述組合物。
所述制品包括容器和貼在所述容器上或與其相關(guān)的標(biāo)簽或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。所述容器可以用各種材料諸如玻璃或塑料制成。該容器裝有有效治療多發(fā)性硬化的組合物，且可具有無菌存取口(例如該容器可以是具有皮下注射針頭可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小管)。所述組合物中的至少一種活性劑是抗體。所述標(biāo)簽或包裝插頁表明該組合物用于在含有多發(fā)性硬化的受試者中治療該病，所述治療遵循關(guān)于所提供的抗體和任何其它藥物的劑量給藥數(shù)量和間隔的具體指示。該制品還可包括第二容器，其中裝有制藥學(xué)可接受的稀釋緩沖液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。該制品還可包括商業(yè)和使用者立場上所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
任選的是，本文中的制品還包括裝有除抗體之外用于治療的藥劑，且還包括用所述藥劑治療哺乳動(dòng)物的說明書，所述藥劑優(yōu)選是化療劑；免疫抑制劑；干擾素類藥物，干擾素類藥物，諸如IFN-β-1a(REBIF和AVONEX)或IFN-β-1b(BETASERON)；寡肽，諸如醋酸格拉默(COPAXONE)；胞毒劑，諸如米托蒽醌(NOVANTRONE)、甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥和硫唑嘌呤；靜脈內(nèi)免疫球蛋白(丙種球蛋白)；淋巴細(xì)胞消減性藥物，例如米托蒽醌、環(huán)磷酰胺、Campath、抗CD4或克拉屈濱；非淋巴細(xì)胞消減性免疫抑制性藥物，例如霉酚酸嗎乙酯(MMF)或環(huán)孢菌素；“抑制素(statin)”類降低膽固醇的藥物；雌二醇；激素代替療法；治療MS繼發(fā)的或相關(guān)的癥狀(例如痙攣、失禁、疼痛、疲勞)的藥物；TNF抑制劑；減輕疾病的抗風(fēng)濕藥(DMARD)；非類固醇抗炎藥(NSAID)；皮質(zhì)類固醇，例如甲潑尼龍、潑尼松、地塞米松或糖皮質(zhì)激素；左旋甲狀腺素；環(huán)孢菌素A；促生長素抑制素類似物；細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑；抗代謝物；免疫抑制劑；整聯(lián)蛋白拮抗劑或抗體，例如LFA-1抗體，諸如efalizumab或α4整聯(lián)蛋白抗體，諸如natalizumab；其它B細(xì)胞表面標(biāo)志拮抗劑/抗體；等等。
下面的非限制性實(shí)施例闡明了本發(fā)明的更多細(xì)節(jié)。將說明書中所有引用的公開內(nèi)容明確引入本文作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1原發(fā)進(jìn)行型多發(fā)性硬化(PPMS)的治療在此實(shí)施例中用CD20抗體治療診斷患有McDonald et al.，Ann.Neurol.50121-7(2001)定義的PPMS的受試者。
Rituximab，可從Genentech購買，配制用于靜脈內(nèi)施用，即9.0mg/mL氯化鈉，0.7mg/mL聚山梨醇酯80，7.35mg/mL無水檸檬酸鈉和注射用無菌水(pH 6.5)中的無菌產(chǎn)品。
第一個(gè)療程將包括在第1天和第15天各自靜脈內(nèi)(IV)施用一劑1gRituximab。受試者在每次輸注開始之前30-60分鐘將經(jīng)口腔接受醋氨酚(1g)和鹽酸苯海拉明(diphenhydramine HCl)(50mg)或等效物。
后續(xù)療程將在第24周(第169天)、第48周(第337天)和第72周(第505天)開始施用。后續(xù)療程的第二次輸注將在第一次輸注后的第14±1天。
發(fā)生第一次復(fù)發(fā)的受試者可通過靜脈內(nèi)或口服皮質(zhì)類固醇接受補(bǔ)救治療?？捎貌怀^MS復(fù)發(fā)治療適合的暴露量或持續(xù)時(shí)間的攝生法施用系統(tǒng)皮質(zhì)類固醇。復(fù)發(fā)定義為以下所有各項(xiàng)●持續(xù)至少24小時(shí)的神經(jīng)學(xué)異常的急性發(fā)作；
●不可歸因于發(fā)熱、感染、外傷、伴隨的藥物治療或其它病因的變化；●在不知情檢測人員所進(jìn)行的檢查中具有客觀變化的結(jié)果，包括下列一項(xiàng)或多項(xiàng)FS衡量標(biāo)準(zhǔn)最小1個(gè)點(diǎn)的變化錐體、顱神經(jīng)、小腦、感覺、視覺或步態(tài)。
可使用以下皮質(zhì)類固醇攝生法每日靜脈內(nèi)施用1克甲潑尼龍，持續(xù)3天，隨后每日60mg潑尼松，持續(xù)5天，之后以每天10mg的降幅減少施用量。如果不能施用靜脈內(nèi)甲潑尼龍，那么可用持續(xù)3天每日靜脈內(nèi)150mg地塞米松替代。對(duì)于病情惡化只應(yīng)施用一個(gè)療程的皮質(zhì)類固醇。皮質(zhì)類固醇攝生法完成后至少4周，應(yīng)進(jìn)行后續(xù)免疫學(xué)研究和MRI掃描?？墒褂闷べ|(zhì)類固醇吸入器(通過口和鼻)或關(guān)節(jié)內(nèi)注射。
任選與CD20抗體組合的其它治療方法包括IFN-β、醋酸格拉默、甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺或米托蒽醌。
主要功效結(jié)果測量是證實(shí)疾病發(fā)展的時(shí)間。疾病發(fā)展定義為如果基線擴(kuò)展的傷殘狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)(Expanded Disability Status Scale，EDSS)(Kurtzke J.，Neurology 33(11)1444-52(1983))在2.0和5.5點(diǎn)之間(含)，則距基線EDSS有≥1.0個(gè)點(diǎn)的增加，或者如果基線EDSS≥5.5個(gè)點(diǎn)(含)，則增量≥0.5個(gè)點(diǎn)，且有關(guān)變化不可歸因于別的病因(例如發(fā)熱、并發(fā)疾病、MS復(fù)發(fā)或惡化、或伴隨的藥物治療)?？稍诔醮尾∏榘l(fā)展后至少12周(84天)時(shí)進(jìn)行有規(guī)律的定期巡診，證實(shí)疾病的發(fā)展。
次要功效結(jié)果測量包括-腦部MRI掃描呈現(xiàn)的基線至第96周的T2損傷總體積的變化；-腦部MRI掃描呈現(xiàn)的基線至第96周的腦體積的變化。
任選的是，以下任何一項(xiàng)或多項(xiàng)的改善-多發(fā)性硬化功能綜合標(biāo)準(zhǔn)(Multiple Sclerosis Functional CompositeScale，MSFCS)；-EDSS；-根據(jù)EDSS的測定，在第96周時(shí)證實(shí)疾病有發(fā)展的受試者比例；-上肢功能，根據(jù)9孔栓測試法(9-Hole Peg Test)(MSFCS的子標(biāo)準(zhǔn))測量；-走動(dòng)，根據(jù)定時(shí)25步行走法(Timed 25-Foot Walk)(MSFCS的子標(biāo)準(zhǔn))測量；
-認(rèn)知，根據(jù)步調(diào)聽覺連續(xù)增加測試(Paced Auditory Serial Addition Test)(只有3秒；MSFCS的子標(biāo)準(zhǔn))；-MRI掃描中腦T2損傷的總體積(第48周和第122周)；-MRI掃描中腦T1損傷的總體積；-MRI掃描中頸部脊髓的橫切面；-MRI掃描的腦體積(第48周和第122周)。
依照以上任何一項(xiàng)或多項(xiàng)效果測量，如本文所述用Rituximab治療的受試者將顯示出PPMS的征候、癥狀或其它指標(biāo)的改善。
實(shí)施例2復(fù)發(fā)緩和型多發(fā)性硬化的治療在此實(shí)施例中用CD20抗體治療患有McDonald et al.，Ann.Neurol.50121-7(2001)定義的RRMS的受試者，其中抗體暴露相隔約6個(gè)月。
Rituximab，可從Genentech購買，配制用于靜脈內(nèi)施用，即9.0mg/mL氯化鈉，0.7mg/mL聚山梨醇酯80，7.35mg/mL無水檸檬酸鈉和注射用無菌水(pH 6.5)中的無菌產(chǎn)品。
第一個(gè)療程將包括在第1天和第15天各自靜脈內(nèi)(IV)施用一劑1gRituximab。受試者在每次輸注開始之前30-60分鐘將經(jīng)口腔接受醋氨酚(1g)和鹽酸苯海拉明(50mg)或等效物。
后續(xù)療程將在第24周(第169天)、第48周(第337天)和第72周(第505天)開始施用。后續(xù)療程的第二次輸注將在第一次輸注后的第14±1天。
優(yōu)選的是，Rituximab是為治療RRMS而施用的唯一藥劑。然而，受試者可任選接受靜脈內(nèi)或口服皮質(zhì)類固醇、IFN-β、醋酸格拉默、甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺或米托蒽醌。
發(fā)生第一次復(fù)發(fā)的受試者可通過靜脈內(nèi)或口服皮質(zhì)類固醇接受補(bǔ)救治療。可用不超過MS復(fù)發(fā)治療適合的暴露量或持續(xù)時(shí)間的攝生法施用系統(tǒng)皮質(zhì)類固醇。復(fù)發(fā)在此實(shí)施例中定義為在神經(jīng)學(xué)狀態(tài)已相對(duì)穩(wěn)定或改善至少30天的受試者中，符合MS的新的或復(fù)發(fā)的神經(jīng)學(xué)癥狀持續(xù)超過48小時(shí)。神經(jīng)學(xué)癥狀的改變必須伴隨著符合如下標(biāo)準(zhǔn)的客觀神經(jīng)性惡化EDSS增加至少半級(jí)，或者恰當(dāng)?shù)墓δ荏w系評(píng)分(functional system scores，F(xiàn)SS)之一增加至少兩個(gè)點(diǎn)，或者兩項(xiàng)或多項(xiàng)適當(dāng)?shù)腇SS增加1個(gè)點(diǎn)。所述變化必須由檢查的調(diào)查人員證實(shí)，且必須影響選定的FS標(biāo)準(zhǔn)(即錐體、步態(tài)、小腦、腦干、感覺或視覺)。癥狀必須持續(xù)≥24小時(shí)，且應(yīng)不可歸因于混雜的臨床因素(例如發(fā)熱、感染、受傷、對(duì)伴隨的藥物治療的不良反應(yīng))。突發(fā)癥狀的單一事件(例如強(qiáng)直性痙攣)不是復(fù)發(fā)，但突發(fā)癥狀多次出現(xiàn)的新發(fā)作超過至少24小時(shí)，如果伴隨著新的、相應(yīng)的客觀表現(xiàn)，則可能是復(fù)發(fā)。沒有臨床檢查變化的感覺癥狀、疲乏、情緒變化、或膀胱或腸急迫或失禁都不足以確定為復(fù)發(fā)。
主要功效結(jié)果測量是釓增強(qiáng)性損傷的MRI終點(diǎn)，或者證實(shí)疾病有發(fā)展(定義為比基線擴(kuò)展的傷殘狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)(EDSS)增加≥1.0個(gè)點(diǎn)；Kurtzke J.，Neurology 33(11)1444-52(1983))的時(shí)間。主要功效終點(diǎn)可以是第12、16、20和24周時(shí)在腦部連續(xù)MRI掃描上觀察到的釓增強(qiáng)性T1損傷的總數(shù)。
次要功效結(jié)果測量包括復(fù)發(fā)的頻率；腦部MRI掃描呈現(xiàn)的基線至第96周的T2損傷總體積的變化(例如從篩選至第24和36周腦部MRA掃描呈現(xiàn)的T2損傷總體積的變化)；腦部MRI掃描呈現(xiàn)的基線至第96周的腦體積的變化；多發(fā)性硬化功能綜合標(biāo)準(zhǔn)(MSFCS)及其子標(biāo)準(zhǔn)；上肢功能，根據(jù)9孔栓測試法(MSFCS的子標(biāo)準(zhǔn))測量；走動(dòng)，根據(jù)定時(shí)25步行走法(MSFCS的子標(biāo)準(zhǔn))測量；認(rèn)知，根據(jù)步調(diào)聽覺連續(xù)增加測試(MSFCS的子標(biāo)準(zhǔn))；多發(fā)性硬化生活質(zhì)量-54(Multiple Sclerosis Quality of Life-54，MSQOL-54)調(diào)查表；MRI掃描中腦T1損傷的總體積(例如第20、28和36周時(shí)腦部連續(xù)MRA掃描中釓增強(qiáng)性T1損傷的總數(shù))；MRI掃描中頸部脊髓的橫切面；到第24周(即在第0周和第24周之間)和第36周(即在第0周和第36周之間)復(fù)發(fā)受試者的比例；第24周和第36周時(shí)的綜合單項(xiàng)活動(dòng)測量(CombinedUnique Activity Measure，CUAM)。
如上所述用Rituximab治療的受試者將在以上任何一項(xiàng)或多項(xiàng)效果測量中呈現(xiàn)出有改善。
實(shí)施例3復(fù)發(fā)緩和型多發(fā)性硬化的治療在此實(shí)施例中用CD20抗體治療患有McDonald et al.，Ann.Neurol.50121-7(2001)所定義的RRMS的受試者，其中抗體暴露相隔約1年。
Rituximab，可從Genentech購買，配制用于靜脈內(nèi)施用，即9.0mg/mL氯化鈉，0.7mg/mL聚山梨醇酯80，7.35mg/mL無水檸檬酸鈉和注射用無菌水(pH 6.5)中的無菌產(chǎn)品。
第一個(gè)療程將包括在第1天和第15天各自靜脈內(nèi)(IV)施用一劑1gRituximab。受試者在每次輸注開始之前30-60分鐘將經(jīng)口腔接受醋氨酚(1g)和鹽酸苯海拉明(50mg)或等效物。
后續(xù)療程將在第48周和第96周開始施用。后續(xù)療程的第二次輸注將在第一次輸注后的第14±1天。
優(yōu)選的是，Rituximab是為治療RRMS而施用的唯一藥劑。然而，受試者可任選接受靜脈內(nèi)或口服皮質(zhì)類固醇、IFN-β、醋酸格拉默、甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺或米托蒽醌。
發(fā)生第一次復(fù)發(fā)的受試者可通過靜脈內(nèi)或口服皮質(zhì)類固醇接受補(bǔ)救治療。可用不超過MS復(fù)發(fā)治療適合的暴露量或持續(xù)時(shí)間的攝生法施用系統(tǒng)皮質(zhì)類固醇。復(fù)發(fā)在此實(shí)施例中定義為在神經(jīng)學(xué)狀態(tài)已相對(duì)穩(wěn)定或改善至少30天的受試者中，符合MS的新的或復(fù)發(fā)的神經(jīng)學(xué)癥狀持續(xù)超過48小時(shí)。神經(jīng)學(xué)癥狀的改變必須伴隨著符合如下標(biāo)準(zhǔn)的客觀神經(jīng)性惡化EDSS增加至少半級(jí)，或者恰當(dāng)?shù)墓δ荏w系評(píng)分(FSS)之一增加至少兩個(gè)點(diǎn)，或者兩項(xiàng)或多項(xiàng)適當(dāng)?shù)腇SS增加1個(gè)點(diǎn)。所述變化必須由檢查的調(diào)查人員證實(shí)，且必須影響選定的FS標(biāo)準(zhǔn)(即錐體、步態(tài)、小腦、腦干、感覺或視覺)。癥狀必須持續(xù)≥24小時(shí)，且應(yīng)不可歸因于混雜的臨床因素(例如發(fā)熱、感染、受傷、對(duì)伴隨的藥物治療的不良反應(yīng))。突發(fā)癥狀的單一事件(例如強(qiáng)直性痙攣)不是復(fù)發(fā)，但突發(fā)癥狀多次出現(xiàn)的新發(fā)作超過至少24小時(shí)，如果伴隨著新的、相應(yīng)的客觀表現(xiàn)，則可能是復(fù)發(fā)。沒有臨床檢查變化的感覺癥狀、疲乏、情緒變化、或膀胱或腸急迫或失禁都不足以確定為復(fù)發(fā)。主要功效結(jié)果測量是釓增強(qiáng)性損傷的MRI終點(diǎn)，或者證實(shí)疾病有發(fā)展(定義為比基線擴(kuò)展的傷殘狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)(EDSS)增加≥1.0個(gè)點(diǎn)；Kurtzke J.，Neurology 33(11)1444-52(1983))的時(shí)間。主要功效終點(diǎn)可以是第12、16、20和24周時(shí)在腦部連續(xù)MRI掃描上觀察到的釓增強(qiáng)性T1損傷的總數(shù)。
次要功效結(jié)果測量包括復(fù)發(fā)的頻率；腦部MRI掃描呈現(xiàn)的基線至第96周的T2損傷總體積的變化(例如從篩選至第24和36周腦部MRA掃描呈現(xiàn)的T2損傷總體積的變化)；腦部MRI掃描呈現(xiàn)的基線至第96周的腦體積的變化；多發(fā)性硬化功能綜合標(biāo)準(zhǔn)(MSFCS)及其子標(biāo)準(zhǔn)；上肢功能，根據(jù)9孔栓測試法(MSFCS的子標(biāo)準(zhǔn))測量；走動(dòng)，根據(jù)定時(shí)25步行走法(MSFCS的子標(biāo)準(zhǔn))測量；認(rèn)知，根據(jù)步調(diào)聽覺連續(xù)增加測試(MSFCS的子標(biāo)準(zhǔn))；多發(fā)性硬化生活質(zhì)量-54(MSQOL-54)調(diào)查表；MRI掃描中腦T1損傷的總體積(例如第20、28和36周時(shí)腦部連續(xù)MRA掃描中釓增強(qiáng)性T1損傷的總數(shù))；MRI掃描中頸部脊髓的橫切面；到第24周(即在第0周和第24周之間)和第36周(即在第0周和第36周之間)復(fù)發(fā)受試者的比例；第24周和第36周時(shí)的綜合單項(xiàng)活動(dòng)測量(CUAM)。
如上所述用Rituximab治療的受試者將在以上任何一項(xiàng)或多項(xiàng)效果測量中呈現(xiàn)出有改善。
實(shí)施例4人源化2H7變體此實(shí)施例描述了可用于本文所公開的方法的人源化2H7抗體變體。人源化2H7抗體優(yōu)選包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)下列CDR序列CDR L1序列RASSSVSYXH，其中X是M或L(SEQ ID NO18)，例如SEQID NO4(圖1A)，CDR L2序列SEQ ID NO5(圖1A)，CDR L3序列QQWXFNPPT，其中X是S或A(SEQ ID NO19)，例如SEQID NO6(圖1A)，CDR H1序列SEQ ID NO10(圖1B)，CDR H2序列AIYPGNGXTSYNQKFKG，其中X是D或A(SEQ ID NO20)，例如SEQ ID NO11(圖1B)，及CDR H3序列VVYYSXXYWYFDV，其中位置6的X是N、A、Y、W或D，而位置7的X是S或R(SEQ ID NO21)，例如SEQ ID NO12(圖1B)。
上述CDR序列通常存在于人源輕鏈和重鏈可變區(qū)框架序列內(nèi)，諸如主要是人輕鏈κ亞類I(VκI)的人共有FR殘基，和主要是人重鏈亞類III(VHIII)的人共有FR殘基。還可參見WO 2004/056312(Lowman等人)。
重鏈可變區(qū)可連接人IgG鏈恒定區(qū)，其中所述區(qū)可以是例如IgG1或IgG3，包括天然序列和變體恒定區(qū)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類抗體包含SEQ ID NO8的重鏈可變區(qū)序列(v16，如圖1B所示)，任選還包含SEQ ID NO2的輕鏈可變區(qū)序列(v16，如圖1A所示)，它任選在重鏈可變區(qū)的位置56、100和/或100a處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，如D56A、N100A或N100Y、和/或S100aR，及在輕鏈可變區(qū)的位置32和/或92處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，如M32L和/或S92A。優(yōu)選的是，所述抗體是包含SEQ ID NO13或16的輕鏈氨基酸序列和SEQ ID NO14、15、17、22或25的重鏈氨基酸序列的完整抗體。
一種優(yōu)選的人源化2H7抗體是ocrelizumab(Genentech)。
本文中的抗體還可在Fc區(qū)中包含至少一個(gè)改進(jìn)ADCC活性的氨基酸替代，諸如在位置298、333和334處的氨基酸替代，優(yōu)選S298A、E333A和K334A，使用Eu重鏈殘基編號(hào)。還可參見美國專利6,737,056 B1(Presta)。
任何這些抗體可在Fc區(qū)中包含至少一個(gè)改進(jìn)FcRn結(jié)合或血清半衰期的替代，例如在重鏈位置434處的替代，諸如N434W。還可參見美國專利6,737,056 B1(Presta)。
任何這些抗體還可在Fc區(qū)中包含至少一個(gè)提高CDC活性的氨基酸替代，例如在位置326處包含至少一個(gè)替代，優(yōu)選K326A或K326W。還可參見美國專利6,528,624 B1(Idusogie等人)。
有些優(yōu)選的人源化2H7變體是那些包含SEQ ID NO2的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO8的重鏈可變區(qū)的抗體，包括那些在Fc區(qū)(如果存在的話)中具有或沒有替代的抗體，和那些包含在SEQ ID NO8中具有改變N100A；或是D56A及N100A；或是D56A、N100Y及S100aR的重鏈可變區(qū)和在SEQID NO2中具有改變M32L；或是S92A；或是M32L及S92A的輕鏈可變區(qū)的抗體。
2H7.v16重鏈可變區(qū)中的M34已經(jīng)鑒定為抗體穩(wěn)定性的潛在來源，且是替代的另一個(gè)潛在候選位置。
在本發(fā)明的一些各種優(yōu)選實(shí)施方案的總結(jié)中，基于2H7.v16的變體的可變區(qū)包含v16的氨基酸序列，除了下表所示氨基酸替代的位置。除非另有說明，2H7變體將具有與v16相同的輕鏈。
例示性人源化2H7抗體變體
一種優(yōu)選的人源化2H7包含2H7.v16輕鏈可變區(qū)序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO2)；和2H7.v16重鏈可變區(qū)序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO8)。
若人源化2H7.v16抗體是完整抗體，則它可包含輕鏈氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO13)；和重鏈氨基酸序列SEQ ID NO14或EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO22)。
另一種優(yōu)選的人源化2H7抗體包含2H7.v511輕鏈可變區(qū)序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO23)；和2H7.v511重鏈可變區(qū)序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO24)。
若人源化2H7.v31抗體是完整抗體，則它可包含輕鏈氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO16)；和重鏈氨基酸序列SEQ ID NO17或EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO25)。
權(quán)利要求
1.在受試者中治療多發(fā)性硬化的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的CD20抗體，以提供約0.5至4克的初次抗體暴露，隨后是約0.5至4克的第二次抗體暴露，所述第二次暴露是直到距初次暴露約16至60周時(shí)才提供的，且每次抗體暴露是以一劑或兩劑向受試者提供抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二次暴露是直到距初次暴露約20至30周時(shí)才提供的。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述初次和第二次抗體暴露是各自以約1.5至2.5克的量提供的。
4.權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)的方法，還包括對(duì)所述受試者施用有效量的所述CD20抗體，以提供約0.5至4克的第三次抗體暴露，所述第三次暴露是直到距初次暴露約46至60周時(shí)才提供的。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述第三次抗體暴露是以約1.5至2.5克的量提供的。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中所述第三次暴露是直到距初次暴露約46至55周時(shí)才提供的。
7.權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)的方法，其中直到距初次暴露至少約70-75周時(shí)沒有提供再次的抗體暴露。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二抗體暴露是直到距初次暴露約46至60周時(shí)才提供的。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中每次抗體暴露是作為單劑抗體提供給受試者的。
10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中每次抗體暴露是作為兩劑抗體提供給受試者的，其中所述兩劑包括第一劑和第二劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述第二劑是在距施用第一劑約3至17天時(shí)施用的。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述第二劑是在距施用第一劑約6至16天時(shí)施用的。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述第二劑是在距施用第一劑約13至16天時(shí)施用的。
14.權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)的方法，其中所述第一劑和第二劑抗體是各自約0.5至1.5克。
15.權(quán)利要求10-14任一項(xiàng)的方法，其中所述第一劑和第二劑抗體是各自約0.75至1.3克。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)受試者施用三次或更多次抗體暴露。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)受試者施用四次或更多次抗體暴露。
18.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的方法，其中伴隨著初次暴露或稍后暴露，施用第二藥物，其中所述CD20抗體是第一藥物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述第二藥物選自干擾素、醋酸格拉默、胞毒劑、化療劑、米托蒽醌、甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、丙種球蛋白、Campath、抗CD4、克拉屈濱、皮質(zhì)類固醇、霉酚酸嗎乙酯(MMF)、環(huán)孢菌素、抑制素類降低膽固醇的藥物、雌二醇、睪酮、激素代替藥物、TNF抑制劑、減輕疾病的抗風(fēng)濕藥(DMARD)、非類固醇抗炎藥(NSAID)、左旋甲狀腺素、環(huán)孢菌素A、促生長素抑制素類似物、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑、抗代謝物、免疫抑制劑、整聯(lián)蛋白拮抗劑或抗體、LFA-1抗體、efalizumab、α4整聯(lián)蛋白抗體、natalizumab及其它B細(xì)胞表面標(biāo)志抗體。
20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，其中所述多發(fā)性硬化是復(fù)發(fā)緩和型多發(fā)性硬化(RRMS)。
21.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，其中所述多發(fā)性硬化是原發(fā)進(jìn)行型多發(fā)性硬化(PPMS)。
22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者先前從未用CD20抗體治療過。
23.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是裸抗體。
24.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體與另一分子偶聯(lián)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述另一分子是胞毒劑。
26.權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是靜脈內(nèi)施用的。
27.權(quán)利要求26的方法，其中每次抗體暴露的所述抗體是靜脈內(nèi)施用的。
28.權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是皮下施用的。
29.權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是鞘內(nèi)施用的。
30.權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的方法，其中所述CD20抗體是施用于所述受試者以治療多發(fā)性硬化的唯一藥物。
31.權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是Rituximab。
32.權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是包含SEQ ID NO2和8中可變區(qū)序列的人源化2H7。
33.權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是包含SEQ ID NO23和24中可變區(qū)序列的人源化2H7。
34.權(quán)利要求1-33任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者具有升高的抗髓磷脂堿性蛋白(MBP)、抗髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)、抗神經(jīng)節(jié)苷脂和/或抗神經(jīng)絲抗體水平。
35.權(quán)利要求1-34任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者的腦脊液(CSF)、多發(fā)性硬化損傷或血清中存在升高的B細(xì)胞水平。
36.制品，其包括(a)裝有CD20抗體的容器；和(b)附有關(guān)于在受試者中治療多發(fā)性硬化的說明書的包裝插頁，其中所述說明書指出對(duì)受試者施用一定量的抗體，它有效提供約0.5至4克的初次抗體暴露，隨后是約0.5至4克的第二次抗體暴露，所述第二次暴露是直到距初次暴露約16至60周時(shí)才施用的，且每次抗體暴露是作為單劑或兩劑抗體提供給所述受試者的。
37.權(quán)利要求36的制品，還包括裝有第二藥物的容器，其中所述CD20抗體是第一藥物，且還包括包裝插頁上關(guān)于用所述第二藥物治療受試者的說明書。
38.權(quán)利要求37的制成品，其中所述第二藥物選自干擾素、醋酸格拉默、胞毒劑、化療劑、米托蒽醌、甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、丙種球蛋白、Campath、抗CD4、克拉屈濱、皮質(zhì)類固醇、霉酚酸嗎乙酯(MMF)、環(huán)孢菌素、抑制素類降低膽固醇的藥物、雌二醇、睪酮、激素代替藥物、TNF抑制劑、減輕疾病的抗風(fēng)濕藥(DMARD)、非類固醇抗炎藥(NSAID)、左旋甲狀腺素、環(huán)孢菌素A、促生長素抑制素類似物、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑、抗代謝物、免疫抑制劑、及其它B細(xì)胞表面標(biāo)志抗體。
全文摘要
本發(fā)明描述了通過特殊的給藥方案用CD20抗體治療多發(fā)性硬化(MS)的方法及方案。還描述了用于所述方法的制品。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1993143SQ200580026602
公開日2007年7月4日 申請日期2005年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月4日
發(fā)明者保羅·A·弗羅納 申請人:健泰科生物技術(shù)公司