專利名稱：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽類，特別是雞的一種病毒性傳染病的預(yù)防用活疫苗，屬獸用生物制品領(lǐng)域。
禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒或禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖病病毒(REV)是一群可在多種鳥類誘發(fā)慢性腫瘤的反轉(zhuǎn)錄病毒。雖然該病毒不屬于國際獸醫(yī)局(OIE)列出的A或B類病毒，但近來國內(nèi)許多單位的研究都發(fā)現(xiàn)，REV感染在我國非常普遍。它是造成動物用疫苗污染的最常見的外源病毒，它與其它病毒共感染時可造成雞群的免疫抑制從而降低多種疫苗的免疫效力，也常與其它腫瘤病毒混合感染后大大提高了腫瘤的發(fā)病率。因此，REV感染已在我國養(yǎng)雞業(yè)中造成很大危害。然而迄今為止，國內(nèi)外均沒有預(yù)防控制REV感染的疫苗。
REV感染造成的危害最主要是由種雞的垂直感染(相應(yīng)雞胚造成的雞胚源疫苗污染的來源)或雛雞的早期感染，如果能讓種雞在開產(chǎn)前全部產(chǎn)生抗體從而不再有病毒血癥并可為雛雞提供母源抗體，就可以預(yù)防這一危害的發(fā)生。
本發(fā)明的目的是為研制出用于預(yù)防安全、高效的疫苗用于開產(chǎn)前的種雞，使種雞在開產(chǎn)前全部產(chǎn)生抗體從而不再有病毒血癥發(fā)生，并可為雛雞提供母源抗體。
本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是以用自患病雞分離到的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒野毒株經(jīng)過在SPF來源的雞胚成纖維細胞(CEF)上反復(fù)蝕斑純化后得到的致弱毒株，使其對健康雞致病性減弱或無致病性，制備成活疫苗，接種種雞，使種雞在開產(chǎn)前全部產(chǎn)生抗體從而不再有病毒血癥發(fā)生，并可為其雛雞提供母源抗體，從而抵御強毒的攻擊。
本發(fā)明的具體描述1毒株禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病致弱毒株REV-C99株是將一野毒株在SPF來源的雞胚成纖維細胞上經(jīng)反復(fù)蝕斑純化后得到的致弱毒株，經(jīng)用經(jīng)典的和分子病毒學(xué)方法檢測證明無其它已知病毒(該病毒已于2001年07月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.1429)。
2SPF CEF細胞制備按《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準》2001年版規(guī)定的方法制備SPF CEF細胞。
3弱毒株的生物學(xué)特性
3.1在飼養(yǎng)在隔離器內(nèi)的3周齡SPF雞的接種試驗證明，該克隆純化的毒株REV-C99病毒不引起明顯臨床癥狀，在3周內(nèi)可誘發(fā)很高的抗體，且無橫向傳播能力(同一隔離罩內(nèi)的對照雞在70天內(nèi)抗體仍是陰性)。肉用型父母代種雞在18周接種REV-C99病毒后，種雞沒有表現(xiàn)任何不良反應(yīng)，在增重、性成熟、開產(chǎn)期、產(chǎn)蛋高峰產(chǎn)蛋率都達到規(guī)定指標，對其它疫苗免疫后的抗體水平也沒有影響。
3.2所有接種REV-C99病毒的雞均在2周內(nèi)產(chǎn)生抗體，并至少持續(xù)9個月。
3.3接種REV-C99病毒的雞所產(chǎn)蛋的卵黃囊中均顯對REV的特異抗體。
3.4開產(chǎn)后不同時期所產(chǎn)蛋在孵化至10～12天時做細胞培養(yǎng)，在所檢的30個蛋中，沒有一個顯示垂直感染。
4安全性試驗試驗一SPF雞的安全性試驗用飼養(yǎng)在帶正壓過濾空氣裝置的隔離器內(nèi)的3周齡SPF雞的接種試驗證明(每只雞2×107TCID50/0.2ml)，該病毒不引起明顯臨床癥狀，在3周內(nèi)即可誘發(fā)很高的抗體，且無橫向傳播能力(同一隔離罩內(nèi)的對照雞在70天內(nèi)抗體仍是陰性)。
試驗二肉用型種雞的安全性試驗(1)不同劑量的安全性試驗在三組17周齡肉用型種雞(每組20只)分別接種3×107TCID50/0.3ml、0.6×107TCID50/0.3ml及1.2×106TCID50/0.3ml量的REV-C99病毒。觀察10天，三組雞在試驗觀察期內(nèi)均無不良反應(yīng)。
(2)中等劑量重復(fù)試驗500羽18周齡父母代肉用型種雞，每羽按中等劑量即0.6×107TCID50/0.3ml的REV-C99病毒。連續(xù)觀察108天。結(jié)果如下①臨床表現(xiàn)無任何臨床表現(xiàn)②對生產(chǎn)性能的影響按正常生產(chǎn)規(guī)程記錄生產(chǎn)性能，其開產(chǎn)前體重、開產(chǎn)期、產(chǎn)蛋高峰期、產(chǎn)蛋率、受精率及孵化率均達到AA肉雞生產(chǎn)手冊的標準。實際上達到了實施實驗的公司歷年來的最好記錄(正因為如此，實施公司主動要求提前做田間擴大試驗)。
③免疫雞群的REV垂直傳播狀態(tài)分別在開產(chǎn)(23周齡)，產(chǎn)蛋高峰前期(31周齡)和中期(35周齡)采集蛋，孵化至10～12天后，做成細胞培養(yǎng)。在7～10天后，用對REV的單抗做間接熒光抗體試驗。結(jié)果證明在三個時期采集的蛋中均無REV垂直感染，分別是0/24、0/17、0/12。
④對種雞腫瘤發(fā)病率的影響觀察至38周齡，未見腫瘤病例。證明該病毒在18周齡接種不會引起后期腫瘤。
5效力試驗將根據(jù)種雞對REV抗體的陽性率、預(yù)防垂直傳播、雛雞的母源抗體狀態(tài)、雛雞對REV攻毒的抵抗力來判斷。
5.1種雞的抗體動態(tài)不論用5倍量、1倍量和0.2倍量接種的所有60只雞，在10天均出現(xiàn)抗體，用REV antibody test kit(IDEXX loboratories，Inc.產(chǎn)品)檢測血清中對REV的抗體，其平均值分別為1.116、1.079、0.981(各為20只雞)，遠遠高于試劑盒說明規(guī)定的0.2的陽性標準。在接種后280天檢測，所有雞仍保持抗體陽性。
5.2雛雞的母源抗體免疫雞在開產(chǎn)后的產(chǎn)蛋孵出的小雞，在3天后采血清，用IDEXX試劑盒檢測REV抗體，100％陽性(20/20)。
5.3對REV垂直感染的預(yù)防作用如二(c)所述，檢測免疫雞在不同時期采集的53個蛋(24，17，12)，孵化至10～12天時，制成CEF，再培養(yǎng)5～7天后，用REV單抗做IFA檢測病毒，100％陰性。這表明，這些雞不僅沒有疫苗毒的垂直感染，在這些雞蛋中也沒有野毒垂直感染。
5.4雛雞對REV人工感染的抵抗力將分別從免疫種雞(100％呈現(xiàn)REV抗體)所產(chǎn)蛋孵出的雛雞及從非免疫同批種雞(但由于自然感染仍有10％左右已被感染過，呈現(xiàn)抗體陽性)孵出的雛雞各90羽，分別置于帶正壓過濾空氣的不同隔離罩中飼養(yǎng)(前二周)，同時在1日齡時分別接種低代次REV(106TCID50/0.2ml)。每組中分別保留16只不接種REV做對照。
經(jīng)REV免疫組種雞的后代在REV感染3周后的平均體重為610g，與未接種REV的對照雞無區(qū)別。未免疫對照種雞的后代在REV感染3周后平均體重為470g(同批未攻毒對照為610g)。兩組差異極顯著。這表明免疫后種雞為雛雞提供的母源抗體可有效地保護雛雞抵抗REV的早期感染。
6禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病活疫苗的制備以10～11日齡SPF雞胚制備CEF單層細胞，按0.1％質(zhì)量比將REV-C99病毒的種子混于細胞培養(yǎng)維持液中(含2％～4％犢牛血清的DMEM液，pH7.4)，37℃培養(yǎng)5～6天，收獲病毒細胞培養(yǎng)液；將收獲病毒細胞培養(yǎng)液充分混合后直接分裝成液體活苗，測定病毒TCID50，以≥107TCID50/mL為合格；將收獲病毒細胞培養(yǎng)液加入常用的凍干保護劑，充分混合后分裝后經(jīng)冷凍干燥而制成凍干活疫苗，測定病毒TCID50，以≥107.0TCID50/mL為合格。
7疫苗安全性測定取制備的活疫苗，腿部肌肉接種3周齡健康雞各5羽，按每只雞2×107TCID50/0.2ml的劑量(含20個使用劑量)，觀察10天，均未見不良反應(yīng)。
8疫苗免疫效力測定建議在16～20周齡(開產(chǎn)前3周)腿部肌肉接種免疫，劑量為每羽106TCID50/0.2ml。在免疫后2周內(nèi)，采10只雞血清用REV抗體ELISA檢測試劑盒檢測(IDEXX loboratories，Inc.產(chǎn)品)，應(yīng)全部為陽性。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明所涉及的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病活疫苗用于開產(chǎn)前的種雞，使用安全、有效，不僅使接種的種雞在開產(chǎn)前全部產(chǎn)生抗體從而不再有病毒血癥發(fā)生因而不會發(fā)生垂直感染，并可為雛雞提供足以抵御禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒感染的母源抗體。
權(quán)利要求
1一種用于雞網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病活疫苗及其制備方法，其特征是用由患病鴨分離到強毒株經(jīng)過人工誘變處理獲得的一株致弱的REV-C99株病毒，該病毒株已于2005年7月28日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCCNo.1429，將以上致弱毒株通過接種細胞單層細胞，37℃培養(yǎng)5～6天，收獲病毒細胞培養(yǎng)液；將收獲病毒細胞培養(yǎng)液充分混合后直接分裝成液體活苗測定病毒TCID50，以≥107TCID50/mL為合格；將收獲病毒細胞培養(yǎng)液加入常用的凍干保護劑，充分混合后分裝后經(jīng)冷凍干燥而制成凍干活疫苗，測定病毒TCID50，以≥107.0TCID50/mL為合格。
2按照權(quán)利要求1所述的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病活疫苗及其制備方法，其特征是制備雞網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病活疫苗所用人工誘變處理獲得的致弱禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病致弱的CGMCCNo.1429毒株，是通過在SPF雞胚成纖維連續(xù)傳代育成弱毒株，命名為REV-C99株。
3.一種雞網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病活疫苗的應(yīng)用，其特征是將本發(fā)明所制備的網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病活疫苗以每羽106TCID50/0.2ml的劑量腿部肌肉接種開產(chǎn)前3～4周齡種母雞，產(chǎn)生抗體并通過種雞蛋為下一代雛雞提供母源抗體，預(yù)防種雞開產(chǎn)后感染引發(fā)的垂直感染和雛雞早期橫向感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及用自禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病患病雞分離到的野毒株經(jīng)過人工誘變處理獲得一株弱毒病毒株，用SPF雞胚成纖維細胞制成預(yù)防禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病活疫苗，該活疫苗用于接種開產(chǎn)前的種雞，使種雞在開產(chǎn)前產(chǎn)生抗體從而不再發(fā)生病毒血癥，并可為雛雞提供母源抗體。
文檔編號A61P31/12GK1817368SQ200510126218
公開日2006年8月16日 申請日期2005年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月29日
發(fā)明者崔治中, 孫淑紅 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)