專利名稱：生物型脊髓支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于脊髓損傷修復(fù)治療的醫(yī)療裝置，屬植入類醫(yī)療器械。
背景技術(shù)：
脊髓損傷常引起癱瘓，至今未找到有效治療方法。以往一直認(rèn)為脊髓神經(jīng)是不能再生的，脊髓損傷是不治之癥。近年來(lái)，對(duì)中樞神經(jīng)及神經(jīng)干細(xì)胞的深入研究發(fā)現(xiàn)，包括脊髓神經(jīng)在內(nèi)的中樞神經(jīng)是可以再生的，關(guān)鍵是要有適于神經(jīng)組織再生和重建的臨時(shí)性基質(zhì)和良好的微環(huán)境。這里所謂臨時(shí)性基質(zhì)就是供神經(jīng)干細(xì)胞以及其分化形成的神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分裂、增殖和遷移的溫床。它可被降解吸收，為神經(jīng)細(xì)胞提供養(yǎng)分。所謂優(yōu)良微環(huán)境是指有利于誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞和促進(jìn)這些細(xì)胞分裂、增殖和遷移的物質(zhì)環(huán)境和新組織生長(zhǎng)的空間。組織工程習(xí)慣將這些可作為組織重建的臨時(shí)性基質(zhì)和微環(huán)境，簡(jiǎn)單化地稱為“支架”，雖不很確切，勝在簡(jiǎn)單。但現(xiàn)有技術(shù)還沒(méi)有這樣的支架。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物相容性好、可被降解吸收的生物型脊髓支架及其制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是生物型脊髓支架，由心體、包裹在心體外的半透膜、固定在半透膜外的螺旋骨架以及包裹在螺旋骨架外的外膜組成，其中心體、半透膜及外膜分別由通過(guò)非醛類固定劑交聯(lián)固定和活潑試劑及強(qiáng)氫鍵試劑去除抗原的動(dòng)物脊髓、動(dòng)物膜組織制成。
動(dòng)物組織易被微生物降解或分解，需用固定劑使之交聯(lián)固定，傳統(tǒng)上使用戊二醛作固定劑，有殘留毒性，我們選用非醛類固定劑，如環(huán)氧化物、二酰二胺、二異氰酸酯、聚乙二醇或碳化二亞胺，就沒(méi)有這一缺點(diǎn)。以環(huán)氧化物為例，當(dāng)應(yīng)用環(huán)氧化物來(lái)代替醛類作固定試劑時(shí)，由于環(huán)氧化物很不穩(wěn)定，易發(fā)生開(kāi)環(huán)交聯(lián)反應(yīng)，控制反應(yīng)條件可以做到使其與膠原蛋白的交聯(lián)產(chǎn)物很穩(wěn)定，不輕易降解，只有在再生組織生長(zhǎng)、增殖需對(duì)其蠶蝕時(shí)，分泌出激肽釋放酶、纖溶酶、糖皮質(zhì)激素協(xié)同膠原酶作用下才能將其緩慢分解為多肽及氨基酸，并被吸收利用。這樣一種被動(dòng)式降解與組織的再生是同步的，是最有利于組織的再生性修復(fù)的，而且無(wú)醛類的殘留毒性；根據(jù)現(xiàn)代免疫學(xué)理論，動(dòng)物組織的抗原性主要是由蛋白質(zhì)中某些特殊位置的活性基團(tuán)及特異構(gòu)象引起的，這些活性基團(tuán)主要是-OH，-NH2，-SH等，而特異構(gòu)象則主要是由于蛋白質(zhì)分子螺旋鏈的某些持殊氫鍵引起，在處理動(dòng)物組織時(shí)，用一種或多種易與這些基團(tuán)起反應(yīng)的活潑試劑(如酸酐、酰氯、酰胺、環(huán)氧化物等)與這些基團(tuán)結(jié)合，將其封閉起來(lái)，去除其抗原，同時(shí)，還應(yīng)用強(qiáng)氫鍵試劑(如胍類化合物)，置換引起特異構(gòu)象的氫鍵，改變其構(gòu)象，從多方面有效的消除其抗原性。本發(fā)明中的心體是用去抗原的異種脊髓基質(zhì)制成，無(wú)抗原性，生物相容性好，可以作為神經(jīng)干細(xì)胞以及神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞寄居、分裂、增殖及遷移的優(yōu)良基質(zhì)和載體。半透膜和外膜是用豬、牛、羊、猴等動(dòng)物的膜組織經(jīng)系列生化處理得到的，具有脊髓軟、硬脊膜相似的組成和特性，生物相容性好。螺旋骨架可以由半透膜或外膜裁成細(xì)長(zhǎng)片條，在半透膜外螺旋盤(pán)繞粘貼多層而形成，除對(duì)支架起到支撐作用外，所形成的螺旋凹坑，還起到臨時(shí)性腦脊液通道腔的作用，類似于脊髓蛛網(wǎng)膜下腔的作用。
作為一個(gè)優(yōu)化的方案，就是對(duì)所述心體、半透膜及外膜分別通過(guò)偶聯(lián)劑偶合多肽及糖胺聚糖類活性組分到它們的表面，使之具有粘附生長(zhǎng)因子、促進(jìn)組織生長(zhǎng)的功能；對(duì)于半透膜及外膜，考慮到一些膜組織，力學(xué)強(qiáng)度還不能滿足應(yīng)用要求，而且在生化處理中常會(huì)引起力學(xué)性能的損失，所以還設(shè)置了對(duì)膠原蛋白分子進(jìn)行接枝改性的處理步驟，如在膠原蛋白分子中適當(dāng)接枝聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸、聚羥乙酸等鏈段，來(lái)提高基材的力學(xué)強(qiáng)度和韌性，接枝的原料是用它們的預(yù)聚體，方法可以選用縮合、引發(fā)、輻射等高聚物接枝方法。
所述的多肽之一是由16個(gè)賴氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)縮聚而成的，所述的糖胺聚糖是透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角質(zhì)素。這些多肽或糖胺聚糖對(duì)生長(zhǎng)因子有廣譜粘附和富集作用，能激發(fā)未分化細(xì)胞定向分化，具有誘導(dǎo)機(jī)體組織的再生性修復(fù)的功能。
所述的半透膜為動(dòng)物的腸膜或其它經(jīng)過(guò)機(jī)械薄化處理的動(dòng)物膜組織；所述外膜為動(dòng)物心包膜或膈膜或脂肪網(wǎng)膜或胸膜或腹膜。
本發(fā)明的生物型脊髓支架的制備方法包括以下步驟(1)、選料收集新鮮動(dòng)物的脊髓以及膜組織，對(duì)脊髓小心剪去全部外膜取髓質(zhì)，剔除血管；對(duì)膜組織修剪去除多余雜質(zhì)及不規(guī)整部分，張力定型；(2)、堿處理使用堿溶液浸泡髓質(zhì)和膜組織；(3)、脫脂使用有機(jī)溶劑抽提髓質(zhì)及膜材中的脂肪及脂溶性雜質(zhì)；(4)、交聯(lián)固定使用非醛類固定劑交聯(lián)固定髓質(zhì)及膜材中的膠原蛋白分子；(5)、去除抗原使用活潑試劑封閉髓質(zhì)及膜材蛋白中引起抗原的特異活性基團(tuán)-OH，-NH2，-SH，并用強(qiáng)氫鍵試劑置換基材蛋白質(zhì)分子螺旋鏈中引起特異構(gòu)象的特殊氫鍵。
(6)、成品制備在棒狀模具上，用醫(yī)用膠將相應(yīng)尺寸的半透膜粘合成管狀體；另取上述任一膜材裁成規(guī)定寬度的長(zhǎng)片條，按一定間距螺旋盤(pán)繞粘貼在半透膜上，粘貼多層，形成螺旋骨架；再將外膜粘合在螺旋骨架的凸梁上形成管狀體；取出模具，用制好的去抗原異種髓質(zhì)小心填充管心，必要時(shí)加些膠原溶膠或蛋白膠作粘結(jié)劑，再冷凍干燥，即得成品。
作為一種優(yōu)化方案，心體、半透膜和外膜還包括通過(guò)偶聯(lián)劑偶聯(lián)特定多肽或糖胺聚糖活性組分的處理步驟，即在心體、半透膜和外膜的表面上通過(guò)偶聯(lián)劑偶聯(lián)可粘附生長(zhǎng)因子的多肽或糖胺聚糖活性組分。此外，對(duì)于半透膜和外膜還經(jīng)過(guò)增韌改性的處理步驟，即使用縮合、引發(fā)或輻射接枝的方法，在心體、半透膜和外膜的膠原蛋白分子中適當(dāng)接枝聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸或聚羥乙酸鏈段。
生物型脊髓支架的制備方法中所使用的堿溶液為NaOH、KOH或Ca(OH)2溶液。
生物型脊髓支架的制備方法中所述的非醛類固定劑為易與蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的試劑如環(huán)氧化物、二酰二胺、二異氰酸酯、聚乙二醇或碳化二亞胺試劑中的一種或兩種，這里的環(huán)氧化物可以是單環(huán)氧化物 也可以是雙環(huán)氧化物 ，這里R＝CnH2n+1-，n＝0-10，還可以是低聚環(huán)氧化物如聚環(huán)氧丙烷。
生物型脊髓支架的制備方法中所述的活潑試劑是小分子有機(jī)酸酐、酰氯、酰胺或環(huán)氧化物，強(qiáng)氫鍵試劑為胍類化合物。
生物型脊髓支架的制備方法中所述的偶聯(lián)劑為二酰二胺、二酸酐、碳化二亞胺、雙環(huán)氧化物或其它能與-NH2，-OH，-COOH起縮合反應(yīng)的雙官能團(tuán)試劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是仿照人體脊髓的組成和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，心體類似于人脊髓的髓質(zhì)(灰質(zhì)和白質(zhì))，它是用去抗原異種脊髓基質(zhì)，引入可粘附神經(jīng)干細(xì)胞及有關(guān)生長(zhǎng)因子的活性組分制成，可征集神經(jīng)干細(xì)胞并誘導(dǎo)其定向分化，促進(jìn)脊髓組織的再生。半透膜類似于脊髓的軟脊膜，可透過(guò)脊液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。螺旋骨架除起支撐作用外，所形成的螺旋凹坑起到腦脊液流動(dòng)腔的作用。外膜類似于硬脊膜。所有的構(gòu)造都是天然生物材料制成，生物相容性好，可被降解吸收，可誘導(dǎo)組織再生。


附圖1為本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖；1、心體，2、半透膜，3、螺旋骨架，4、硬脊膜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例如圖1所示，生物型脊髓支架，由心體1、包裹在心體外的半透膜2、固定在半透膜2上的螺旋骨架3以及包裹在螺旋骨架3外的外膜4組成，其中心體1、半透膜2及外膜4分別由通過(guò)非醛類固定劑交聯(lián)固定、活潑試劑和強(qiáng)氫鍵試劑去除抗原及通過(guò)偶聯(lián)劑偶聯(lián)特定多肽或糖胺聚糖活性組分的處理步驟的動(dòng)物脊髓、動(dòng)物膜組織制成。
具體制備步驟如下一、心體材料的制備取新鮮的豬脊髓，小心剪除硬脊膜、蛛網(wǎng)膜及軟脊膜，取髓質(zhì)，小心剔除微血管，放入0.2～2％的NaOH溶液中浸泡2小時(shí)，取出，用水漂洗三次。取出瀝干水分，用有機(jī)溶劑抽取其中脂肪及脂溶性雜質(zhì)。取出，除去溶劑后，用碳鏈環(huán)氧化物與之進(jìn)行交聯(lián)固定反應(yīng)。取出，洗凈，冷凍干燥，用乙酸酐或丁酸酐與之反應(yīng)，封閉抗原基因；再用鹽酸胍的Tris緩沖溶液處理，改變引起抗原的特異構(gòu)象。取出，洗凈，用碳化二亞胺(R-N＝C＝N-R)作偶聯(lián)劑將由16個(gè)賴氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)縮聚而成的多肽或糖胺聚糖偶合到髓質(zhì)的膠原分子上，洗凈，即得心體材料，置于生理鹽水中低溫保存?zhèn)溆谩?br> 二、半透膜2和外膜4的制備分別取牛心包或豬心包或豬胸膜及豬腸膜，洗凈，小心除去多余組織和雜質(zhì)，取堅(jiān)實(shí)平整的膜體，洗凈，用0.1～2％濃度的KOH溶液浸泡處理2小時(shí)。取出，用水漂洗三次以上，取出瀝干水分，用有機(jī)溶劑抽取其中脂肪及脂溶性雜質(zhì)。取出，除去溶劑后，用碳鏈環(huán)氧化物與之進(jìn)行交聯(lián)固定反應(yīng)。取出，洗凈，冷凍干燥，用乙酸酐或丁酸酐與之反應(yīng)，封閉抗原基因；再用鹽酸胍的Tris緩沖溶液處理，改變引起抗原的特異構(gòu)象。取出洗凈，冷凍干燥，用P2O5作脫水縮合劑將聚羥基乙酸的預(yù)聚體接枝到膜材的膠原分子上。用碳化二亞胺(R-N＝C＝N-R)作偶聯(lián)劑將由16個(gè)賴氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)縮聚而成的多肽或透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角質(zhì)素偶合到上述膜材的膠原分子上，洗凈，置于生理鹽水中低溫保存?zhèn)溆?。半透?選用最薄滲透性最好的豬腸膜，外膜4選用較厚的豬、牛心包或豬隔膜。
三、生物型脊髓支架的制備在設(shè)定直徑的圓棒模具上，用醫(yī)用膠將相應(yīng)尺寸的半透膜2邊邊粘合形成圓管狀體。另取上述任一膜裁成規(guī)定寬度的長(zhǎng)片條，用醫(yī)用膠將長(zhǎng)片條按一定間距螺旋盤(pán)繞粘貼到軟脊膜的管壁上，繞粘數(shù)層，形成有一定支撐力的螺旋骨架3，再用醫(yī)用膠將外膜4粘合到螺旋骨架3的凸梁上，自身再邊邊粘合成圓管體。脫出圓棒模具，小心將制好的心體材料充填到管心的圓柱腔內(nèi)形成心體1，必要時(shí)加少量醫(yī)用蛋白膠作賦形劑。充填密度不宜太緊，也不宜太松，以適中為好，填好后冷凍干燥以定型，至此，生物型脊髓支架便整體制成。用生理鹽水作保存液密封包裝，用鈷-60輻射滅菌，即得到產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種生物型脊髓支架，其特征在于它由心體(1)、包裹在心體(1)外的半透膜(2)、固定在半透膜(2)上的螺旋骨架(3)以及包裹在螺旋骨架(3)上的外膜(4)組成，其中心體(1)、半透膜(2)及外膜(4)分別由通過(guò)非醛類固定劑交聯(lián)固定和用活潑試劑及強(qiáng)氫鍵試劑去除抗原處理的動(dòng)物脊髓、動(dòng)物膜組織制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物型脊髓支架，其特征在于所述心體(1)、半透膜(2)及外膜(4)分別由通過(guò)偶聯(lián)劑偶合多肽及糖胺聚糖類活性組分處理的動(dòng)物脊髓、動(dòng)物膜組織制成，制成半透膜(2)及外膜(4)的動(dòng)物膜組織還通過(guò)增韌改性處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物型脊髓支架，其特征在于所述的多肽之一是由16個(gè)賴氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)縮聚而成的，所述的糖胺聚糖是透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角質(zhì)素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的生物型脊髓支架，其特征在于所述的半透膜(2)為動(dòng)物的腸膜或者其它經(jīng)過(guò)機(jī)械薄化處理的動(dòng)物膜組織；所述外膜(4)為動(dòng)物心包膜、膈膜、脂肪網(wǎng)膜、胸膜、腹膜；所述螺旋骨架(3)由所述半透膜(2)或外膜(4)裁成的小長(zhǎng)片條螺旋粘貼制成。
5.一種權(quán)利要求1所述的生物型脊髓支架的制備方法，其特征在于它包括以下步驟a、選料收集新鮮動(dòng)物的脊髓以及膜組織并修剪去除多余雜質(zhì)及不規(guī)整部分，得純凈髓質(zhì)及堅(jiān)實(shí)膜材；b、堿處理使用堿溶液浸泡髓質(zhì)及膜材；c、脫脂使用有機(jī)溶劑抽提髓質(zhì)及膜材中的脂肪及脂溶性雜質(zhì)；d、交聯(lián)固定使用非醛類固定劑交聯(lián)固定髓質(zhì)及膜材中的膠原蛋白分子；e、去除抗原使用活潑試劑封閉髓質(zhì)及膜材蛋白質(zhì)中引起抗原性的特異活性基團(tuán)-OH，-NH2，-SH，并用強(qiáng)氫鍵試劑置換基材蛋白質(zhì)分子螺旋鏈中引起特異構(gòu)象的特殊氫鍵；f、成品制備在棒狀模具上，用醫(yī)用膠將相應(yīng)尺寸的半透膜(2)粘合成管狀體；另取上述任一膜裁成規(guī)定寬度的長(zhǎng)片條，按一定間距螺旋盤(pán)繞粘貼在半透膜(2)上，形成螺旋骨架(3)；再將外膜(4)粘合在螺旋骨架(3)的凸梁上形成管狀體；取出模具，將只好的髓質(zhì)小心充填中心空腔形成心體(1)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于它在e和f步驟之間還設(shè)有通過(guò)偶聯(lián)劑偶聯(lián)特定多肽或糖胺聚糖活性組分的處理步驟，即在所述髓質(zhì)及膜材的表面上通過(guò)偶聯(lián)劑偶聯(lián)可粘附生長(zhǎng)因子的多肽或糖胺聚糖活性組分。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于對(duì)于膜材它在e和f步驟之間還設(shè)有增韌改性的處理步驟，即使用縮合、引發(fā)或輻射接枝的方法，在所述膜材的膠原蛋白分子中適當(dāng)接上聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸或聚羥乙酸鏈段。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的非醛類固定劑為易與蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的試劑，如環(huán)氧化物、二酰二胺、二異氰酸酯或碳化二亞胺試劑中的一種或兩種，這里的環(huán)氧化物可以是單環(huán)氧化物 ，也可以是雙環(huán)氧化物 ，這里R＝CnH2n+1-，n＝0-10，還可以是低聚環(huán)氧化物，如聚環(huán)氧丙烷。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的活潑試劑是小分子有機(jī)酸酐或酰氯或酰胺或環(huán)氧化物，強(qiáng)氫鍵試劑為胍類化合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的偶聯(lián)劑為二酰二胺、二酸酐、雙環(huán)氧化物、碳化二亞胺或其它能與-NH2，-OH，-COOH起縮合反應(yīng)的雙官能團(tuán)試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生物型脊髓支架及其制備方法，它由心體(1)、包裹在心體(1)外的半透膜(2)、固定在半透膜(2)上的螺旋骨架(3)以及包裹在螺旋骨架(3)上的外膜(4)組成，其中心體(1)、半透膜(2)及外膜(4)分別由通過(guò)非醛類固定劑交聯(lián)固定和用活潑試劑及強(qiáng)氫鍵試劑去除抗原處理的動(dòng)物脊髓、動(dòng)物膜組織制成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是仿照人體脊髓的組成和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，所有的構(gòu)造都是天然生物材料制成，生物相容性好，無(wú)免疫原性，可被降解吸收，可誘導(dǎo)組織再生。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1985776SQ200510120789
公開(kāi)日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日
發(fā)明者張慶俊, 徐國(guó)風(fēng) 申請(qǐng)人:廣州知光生物科技有限公司