專利名稱：非甾族氨基磺酸酯化合物在制備用于治療腫瘤的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一類化合物。
本發(fā)明特別涉及一類非甾族化合物和涉及含有該非甾族化合物的藥物組合物。
背景技術：
證據(jù)提示在內分泌依賴性組織，例如乳房和子宮中，雌激素在涉及促進腫瘤生長中是重要的促細胞分裂劑。雖然在患乳腺癌和沒有乳腺癌的婦女的血漿中雌激素濃度相近，但是在乳腺腫瘤中雌酮和雌二醇水平明顯高于在正常乳房組織或血液中的水平。認為雌激素的原地合成是使腫瘤中雌激素達高水平做重要貢獻，因此，雌激素生物合成的特殊抑制劑具有用于內分泌依賴性腫瘤治療的潛在重要性。
過去的二十多年中，對芳構化酶途徑的抑制劑的發(fā)展有極大的關注，該途徑將雄性激素前體雄二酮轉變?yōu)榇仆Ｈ欢?，現(xiàn)在有證據(jù)雌酮硫酸酯酶(E1-STS)途徑，即雌酮硫酸酯水解為雌酮(E1S轉至E1)，與芳構化酶途徑相反，在乳房腫瘤中是雌激素的主要來源1，2。這一理論通過絕經(jīng)后患乳房癌用芳構化酶抑制劑，例如氨基苯乙哌啶酮和4-羥基雄二酮治療的婦女有節(jié)制地降低血漿雌激素濃度支持3，4，還通過在這些芳構化酶抑制劑治療的病人保持相對高的血漿E1S濃度的事實證實。在血漿中E1S的長的半衰期(10-12h)與未連接的雌激素(20min)5和肝中甾體硫酸酯酶活性的高水平6，以及正常和惡性乳房組織比較，也支持這一理論。
PCT/GB92/01587指明新型甾體硫酸酯酶抑制劑和含有它們的藥物組合物在雌激素依賴性腫瘤，特別是乳腺癌的治療上的應用。這些甾體硫酸酯酶抑制劑為氨基磺酸酯，如N，N-二甲基雌酮-3-氨基磺酸酯，優(yōu)選雌酮-3-氨基磺酸酯(或稱為“EMATE”)。
EMATE是一個有效的E1-STS抑制劑，因為0.1μM的EMATE在整體MCF-7細胞中它顯示超過99％的抑制E1-STS活性。EMATE還以時間依賴的方式和濃度依賴的關系抑制E1-STS酶，顯示它起著活化點-方向失活劑7，8的作用。雖然EMATE原來是設計為抑制E1-STS，但它還抑制脫氫表雄酮硫酸酯酶(DHA-STS)，該酶為確信在調節(jié)雌激素甾體雄甾二醇的生物合成中起關鍵作用8，9?，F(xiàn)在還有證據(jù)提示雄甾二醇作為乳腺腫瘤生長的促進劑可能更為重要10。EMATE在體內也有活性，幾乎完全抑制鼠肝E1-STS(99％)和DHA-STS(99％)的活性，服藥方式既可以口服，亦可以皮下注射11。另外，EMATE還表明增強鼠的記憶作用14。對鼠的研究提示DHA-STS活性與調節(jié)部分免疫應答之間有關系，認為這一點也可能發(fā)生在人類15，16。在EMATE中氨基磺酸酯基的3-O-原子橋對于抑制活性是重要的。因此，當3-O-原子被其它雜原子(圖1)替換，如雌酮-3-N-氨基磺酸酯(4)和雌酮-3-S-氨基磺酸酯(5)，這些類似物是較弱的非時間依賴的失活劑12。
雖然對于E1-STS的抑制的最佳效能在EMATE上可能已經(jīng)獲得，但是在硫酸酯酶抑制期間可能釋放雌酮，并且EMATE和它的雌二醇同類物可能具有雌激素活性13。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明尋找提供合適抑制E1-STS的化合物，但是該化合物不具有雌激素作用，或者具有較小的雌激素作用。
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供適合于作為雌酮硫酸酯酶抑制劑的非甾族氨基磺酸酯化合物，其中該化合物具有至少第一個環(huán)和第二個環(huán)的多環(huán)結構；其中第一個環(huán)和第二個環(huán)模仿雌酮的A環(huán)和B環(huán)；以及其中多環(huán)結構不是四氫萘酚。
不論是第一個環(huán)，還是第二個環(huán)，優(yōu)選含有一個α，β-不飽和內酯基團。
優(yōu)選第一個環(huán)為苯酚環(huán)。
優(yōu)選化合物具有雙環(huán)結構。
優(yōu)選化合物具有通式(A)(見圖8)。在通式(A)中，R1-R6獨立選自H，鹵素，羥基，氨基磺酸酯、烷基和各種取代物或它們的鹽；但其中R1-R6中至少1個為氨基磺酸酯基團；以及其中X為O，S，NH，取代的N，CH2，或取代的C中任何1個。
優(yōu)選X為O。
若化合物的氨基磺酸酯基可被硫酸酯基替換形成硫酸酯化合物，那么優(yōu)選該硫酸酯化合物可被具有甾體硫酸酯酶(E.C.3.1.6.2)活性的酶水解。
在高度優(yōu)選的具體實例中，該化合物不可被具有甾體硫酸酯酶(E.C.3.1.6.2)活性的酶水解。
根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供非甾族化合物，其中該化合物具有通式(B)(見圖8)。在通式(B)中，R1-R6獨立選自H，鹵素，羥基，氨基磺酸酯，烷基和各種取代物或它們的鹽；但其中R1-R6中至少1個為氨基硫酸酯基。
根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供化合物4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯。
根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，提供根據(jù)本發(fā)明的非甾族化合物作為藥物的應用。
根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，提供根據(jù)本發(fā)明的非甾族化合物用于抑制雌酮硫酸酯酶。
根據(jù)本發(fā)明的第六個方面，提供含有根據(jù)本發(fā)明的非甾族化合物以及藥用可接受的載體，賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的第七個方面，提供根據(jù)本發(fā)明的非甾族化合物在用于抑制雌酮硫酸酯酶的藥品生產(chǎn)中的應用。
根據(jù)本發(fā)明的第八個方面，提供用于制備根據(jù)本發(fā)明的化合物的方法，該方法包括香豆素的硫酸酯化。
根據(jù)本發(fā)明的第九個方面，提供用于制備根據(jù)本發(fā)明的化合物的方法，該方法包括香豆素的氨基磺酸酯基化。
通式(A)或通式(B)中的烷基可為任何適合的直鏈或支鏈烷基，該烷基可為飽和的或不飽和的和/或取代的或非取代的。烷基甚至可為環(huán)烷基。例如，R1-6中至少兩個鍵合形成另外環(huán)基團。
優(yōu)選R1-R5各自獨立選自H，烷基和鹵代烷基；優(yōu)選其中R1-R5各自獨立選自H，C1-6烷基和C1-6鹵代烷基。
優(yōu)選R1-R5為獨立選自H，C1-3烷基和C1-3鹵代烷基。
優(yōu)選的R1-R5獨立選自為H，甲基和鹵代甲基。
優(yōu)選的R6為OSO2NH2。
優(yōu)選的化合物為如圖2中表明的化合物12-16的化合物中的任何1個。
優(yōu)選的化合物為4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯。
在通式(A)或通式(B)中，R1-R6中的兩個或多個可鍵合在一起形成另一個環(huán)結構。這一化合物的典型實例具有通式(C)(見圖其中R3-R6中任何1個為氨基磺酸酯基，并且其中n為整數(shù)。典型的R6為氨基磺酸酯基。典型的氨基磺酸酯基為-OS(O)(O)-NH2。優(yōu)選的n為從3至10的整數(shù)，優(yōu)選從3至7。通式(C)的基團(CH2)n隨意可為取代的烷基鏈。
通式C范圍內的典型的化合物為如圖9中顯示的化合物(D)(其中n＝3)，化合物(E)(其中n＝4)，化合物(F)(其中n＝5)，化合物(G)(其中n＝6)，化合物(H)(其中n＝7)。對于這些化合物，R6為通式-OS(O)(O)-NH2的氨基磺酸酯基，并且R3-R5中的每一個為H。
這里使用的術語“氨基磺酸酯”包括氨基磺酸，或氨基磺酸N-取代的衍生物的酯，或它們的鹽。因此，該術語包括通式-O-S-(O)(O)-N(R7)(R7)的功能基，其中R7和R8為獨立選自H，鹵素，直鏈的或支鏈的飽和的或不飽和的和/或取代的或非取代的烷基，芳基，或任何其它合適的基團。優(yōu)選R7和R8中至少1個為H。在優(yōu)選的具體實例中，R7和R8都為H。
這里使用的術語“模仿的”是指它的正常意義-即具有不同的結構，但具有類似功能作用。
本發(fā)明的非甾族化合物的關鍵優(yōu)勢在于它在體內有效，并具有較小的雌激素活性，因此，可以認為是“非雌激素化合物”。這里使用的術語“非雌激素化合物”是指不顯示或實際上不顯示雌激素活性的化合物。
因此，本發(fā)明提供減小了雌激素活性的非甾族化合物。基于這一點，本發(fā)明的非甾族化合物作為E1-STS抑制劑。
另一個優(yōu)勢是這類化合物不可被代謝為顯示或誘導激素活性的化合物。
本發(fā)明的化合物還具有口服活性的優(yōu)勢。
本發(fā)明的化合物進一步的優(yōu)勢在于它們可能具有不可逆轉的作用。
本發(fā)明的化合物進一步的優(yōu)勢在于它們還可以抑制DHA-STS。
因此，在優(yōu)選的具體實例中，該非甾族化合物用于治療乳腺癌。另外，該非甾族化合物用于非惡性病例的治療，例如自身免疫疾病的預防，尤其是當從早年需要服用藥物時。
特別優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的非甾族化合物為4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯。該化合物的特殊優(yōu)勢在于它以類似于EMATE的方式作為時間依賴和濃度依賴的抑制劑起作用。該非甾族化合物的另一個關鍵優(yōu)勢在于它是一個具有不可逆轉的口服活性的化合物。另外，它不代謝為具有激素活性的化合物。
因此本發(fā)明的高度優(yōu)選的具體實例涉及含有4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯以及藥用可以接受的載體，賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。
因此本發(fā)明涉及適于作為硫酸酯酶抑制劑使用的非甾族化合物。
除了是體內有效的，硫酸酯酶抑制劑之外，本發(fā)明的化合物降低雌激素活性，或甚至降低至最小或降低至沒有。
許多研究表明，本發(fā)明的氨基磺酸酯以劑量依賴的方式，以類似于EMATE的效力抑制在完整的MCF-7細胞中的酶E1-ETS。
優(yōu)選的香豆素氨基磺酸酯中，4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯與香豆素-7-0-氨基磺酸酯一起在體內顯出最大活性。在這一點上，10μM 4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯在整體MCF-7乳腺癌細胞中抑制E1-STS 93.3％，IC50為380nM。這種失活被表明是類似于EMATE的方式的時間依賴和濃度依賴的抑制劑。10μM 4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯還抑制胎盤微粒體的脫氫表雄酮硫酸酯酶93.6％。該化合物還顯示降低的雌激素活性，這一點通過在治療卵巢切除大鼠的子宮重量缺乏明顯增加觀察到。
該化合物還具有口服活性的效力。
本發(fā)明的非甾族化合物，特別是優(yōu)選的香豆素硫酸酯酶代表了非甾族硫酸酯酶抑制作用最佳化的重要化合物。還相信該化合物除了用于內分泌依賴的癌癥治療外，還具有一些治療用途，例如自身免疫疾病的治療。


現(xiàn)在本發(fā)明僅僅通過伴有繪圖的參考實例描述，其中圖1說明雌激素(1)，雌激素硫酸酯(2)，EMATE(3)和甾體氨基磺酸酯(4-5)的已知結構；圖2說明了7-羥基香豆素(11)，7-(次硫酸(Sulphoxy))-4-甲基香豆素(12)和香豆素氨基磺酸酯(13-16)的結構；圖3說明了7-羥基-4-甲基香豆素的硫酸化；吡啶/SO3-吡啶復合物；NaOH在甲醇中(路線a)；圖4說明了7-羥基-4-甲基香豆素的氨磺?；籒aH/DMF，H2NSO2Cl在甲苯中(路線b)；圖5說明了用香豆素-7-0-氨基磺酸酯(13)，4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯(14)，3，4，8-三甲基-香豆素-7-0-氨基磺酸酯(15)和4-(三氟甲基)香豆素-7-0-氨基磺酸酯(16)在完整的MCF-7乳腺癌細胞中雌酮硫酸酯酶的劑量依賴性抑制作用；圖6說明了用4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯(14)對雌酮硫酸酯酶的時間依賴和濃度依賴性失活作用。
圖7為曲線圖。
圖8代表通式(A)，(B)和(C)；以及圖9代表通式(D)，(E)，(F)，(G)和(H)。
具體實施例方式
實施例本發(fā)明的化合物可用包括Packman合成步驟的方法制備。Packman合成是技術人員已知的。
香豆素的氨磺?；愣顾匕被酋；耐ǚㄈ缦?。合適的香豆素的無水DMF溶液(每克香豆素在40ml DMF中)與氫化鈉(60％分散體；1當量)在0℃，N2氣氛下進行反應，停止氫氣的放出后，加入氨磺酰氯的甲苯溶液(大約0.68M，1.5當量)，在室溫下保溫過夜后將反應混合物傾到水中，然后粗產(chǎn)品淬火。乙酸乙酯(150ml)中的有機成分徹底用飽和食鹽水洗滌、干燥(MgSO4)、過濾、蒸發(fā)。得到的粗產(chǎn)品用閃式柱層析純化，隨后重結晶得到相應的氨基磺酸酯。所有新化合物用光譜和燃燒分析徹底定性。圖4說明4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯的合成。
按照這一通法制備化合物13-16(如圖2說明)即得豆素-7-0-氨基磺酸酯(13)，4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯(14)，3，4，8-三甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯(15)和4-(三氟甲基香豆素)-7-0-氨基磺酸酯。這些化合物更詳細的合成如下。
下面還討論化合物12的合成(如圖2說明的)香豆素-7-0-氨基磺酸酯(13)的制備按照上述提到的通法，7-羥基香豆素(500mg，3.082mmol)得到粗產(chǎn)品(605mg)，該粗產(chǎn)品在硅膠(200g)柱上用氯仿/丙酮(8∶1，500ml；4∶1，1000ml，然后2∶1，500ml)梯度洗脫純化。蒸發(fā)，第二部分得奶黃色殘留物(389mg，52.3％)，該殘留物用乙酸乙酯/己烷(1∶1)重結晶得灰白色結晶(13)(239mg)。
分析數(shù)據(jù)如下M.p.170.0-171.5℃；Rfs＝0.48(乙醚)，0.67(乙酸乙酯)，0.19(氯仿/丙酮，4∶1)；νmax(KBr)3360，3210，3060，1720，1615，1370，1125cm-1；δH(DMSO-d6/CDCl3，ca.1∶25)6.415(1H，d，JC-4-H，C-3-H＝9.7Hz，C-3-H)，7.285(1H，dd，JC-8-H，C-6-H＝2.3Hz and JC-5-H，C-6-H＝8.5Hz，C-6-H)，7.379(1H，d，JC-6-H，C-8-H＝2.2Hz，C-8-H)，7.508(2H，br s，D2O交換的，-NH2)，7.543(1H，d，JC-6-H，C-5-H＝8.4Hz，C-5-H)and 7.760(1H，d，JC-3-H，C-4-H＝9.7Hz，C-4-H).MSm/z(E.I.，相對強度)241.0(10)，162.0(97)，134.0(100)，105.0(23).Acc.MSm/z 241.0068，C9H7NO5S要求241.0045.實測值C，44.8；H，2.89；N，5.82.C9H7NO5S要求C，44.81；H，2.92；N，5.81％.
4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯(14)的制備按照上述通法，7-羥基-4-甲基香豆素(500mg，2.753mmol)得粗產(chǎn)品(633mg)，該粗產(chǎn)品層析硅膠(200g)，用氯仿/丙酮(8∶1，500ml；4∶1，1000ml，2∶1，500ml，然后用1∶1，500ml)梯度洗脫。蒸發(fā)后，第二部分得奶黃色殘留物(425mg，60.5％)，該殘留物用丙酮/氯仿(3∶5)重結晶得無色菱形結晶(14)(281mg)。
分析數(shù)據(jù)如下
M.p.165-167℃；Rfs＝0.48(乙醚)，0.29(乙醚/己烷8∶1)，0.26(氯仿/丙酮，4∶1)；νmax(KBr)3320，3180，3080，1700，1620，1560，1380，1125cm-1；δH(丙酮-d6)2.507(3H，s，-CH3)，6.339(1H，s，C-3-H)，7.299(2H，m，C-6-H和C-8-H)，7.390(2H，br s，D2O交換的，-NH2)和7.850(1H，d，JC-6-H，C-5-H＝9Hz，C-5-H).MSm/z(+ve ion FAB in m-NBA，相對強度)542.2(15)，511.1[45，(2M+H)+]，461.2(20)，409.1[60，(M+H+NBA)+]，393.3[60，(M+H+NBA-16)+]，329.2[10，(M+H+NBA-80)+]，256.1[100，(M+H)+].MSm/z(-ve ion FAB in m-NBA，rel.intensity)421.0(20)，407.1[15，(M-H+NBA)-]，335.1(14)，254[100，(M-H)-]，175.1[32，(M-H-79)-]，121.0(17).實測值C，47.2；H，3.56；N，5.51.C10H9NO5S要求C，47.06；H，3.55；N，5.49％.
3，4，8-三甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯(15)的制備按照上述通法，7-羥基-3，4，8-三甲基香豆素(1.0g，4.896mmol)得粗產(chǎn)品(1.33g)，該粗產(chǎn)品用熱乙酸乙酯重結晶得238mg原料香豆素。蒸發(fā)母液，得到的白色殘留物(1.13g)在硅膠(200g)上用乙醚純化。收集第二部分，蒸發(fā)，得到的殘留物(519mg，37.4％)用丙酮/己烷(1∶2)重結晶得淡黃色結晶(15)(312mg)。
分析數(shù)據(jù)如下M.p.197-202℃；Rfs＝0.50(乙醚)，0.69(乙酸乙酯)；νmax(KBr)3310，3040，1680，1600cm-1；δH(丙酮-d6)2.176，2.383和2.458(9H，three s，3×CH3)，7.374(1H，d，JC-5-H，C-6-H＝8.8Hz，C-6-H)，7.390(2H，br s，D2O交換的，-NH2)和7.682(1H，d，JC-6-H，C-5-H＝8.8Hz，C-5-H).MSm/z(E.I.，相對強度)283.1(10)，204.1(45)，176.1(40)，161.1(22)，69.1(56)，57.1(40)，43.1(100).Acc.MSm/z 283.0497，C12H13NO5S要求283.0514.實測值C，50.86；H，4.63；N，4.97.C12H13NO5S要求C，50.88；H，4.63；N，4.94％.
4-(三氟甲基)香豆素-7-0-氨基磺酸酯(16)的制備按照上述通法，7-羥基-4-(三氟甲基)-香豆素(0.90g，3.911mmol)得粗產(chǎn)品(1.20g)，該粗產(chǎn)品在硅膠(200g)上用乙醚/氯仿(1∶4)純化。從第三組分得到的殘留物(392mg)進一步在硅膠(100g)上用乙醚純化。然后收集第一組分得殘留物(295mg，24.4％)該殘留物用乙酸乙酯/己烷(1∶3)重結晶得白色針形結晶(16)(160mg)。
分析數(shù)據(jù)如下M.p.165-168℃；Rfs＝0.67(乙醚)，0.24(乙醚/氯仿，1∶4)；νmax(KBr)3360，3240，3100，1720，1620，1380，1160cm-1；δH(丙酮-d6)6.995(1H，s，C-3-H)，7.461(1H，dd，JC-8-H，C-6-H＝2.8Hz和JC-5-H，C-6-H＝8.1Hz，C-6-H)，7.478(1H，s，C-8-H)，7.53(2H，br s，D2O交換的，-NH2)和7.89(1H，m，C-5-H).1H-(16)的1HNMR譜DMSO-d6/CDCl3(ca.1∶15)表明部分分散為原料香豆素MSm/z(E.I.，相對強度)309.0(2.6)，230.0(77)，202.0(100)，183.5(5)，173.0(10)，69.0(33).Acc.MSm/z 308.9874，C10H6F3NO5S要求308.9919.實測值C，38.8；H，1.85；N，4.53.C10H6F3NO5S要求C，38.84；H，1.96；N，4.53％.
7-(次硫酸(Sulphoxy))-4-甲基香豆素鈉鹽(12)的制備在N2氣氛下[圖3]往7-羥基-4-甲基香豆素(1.0g，5.676mmol)的無水吡啶(20ml)溶液中加入三氧化硫-吡啶復合物(1.8g，11.35mmol，2當量)，反應混合物攪拌過夜。除去吡啶后，得到的奶油狀糖漿中加入甲醇(20ml)，得到的淺黃色溶液中滴加氫氧化鈉的甲醇溶液(1M，ca.18ml)堿化pH～8。形成的亮黃色懸浮液過濾，沉淀用較多的甲醇洗滌。然后濾液濃縮至30-40ml，分次加入乙醚(總量120ml)直到完全沉淀。收集淺米色沉淀(711mg)，其中的582mg用甲醇/乙醚(1∶1)重結晶得淺奶黃色結晶(12)(335mg)。
分析數(shù)據(jù)如下M.p.172-175℃(分解)；Rfs＝0.51(甲醇/乙酸乙酯，1∶3)，0.67(甲醇/乙醚，1∶3)；νmax(KBr)3500(br)，3080，1680，1610，1560，1300，1260，1050cm-1；δH(DMSO-d6)2.407(3H，s，-CH3)，6.269(1H，s，C-3-H)，7.20(2H，m，C-6-H和C-8-H)，a和7.695(1H，d，JC-6-H，C-5-H＝8.8Hz，C-5-H).MSm/z(+ve離子FAB in m-NBA，相對強度)176(100，NBA+Na+).MSm/z(-ve離子FABm-NBA，相對強度)175.1(14，M-Na+-SO3)，255.0(100，M-Na+)，408.0(8，M-Na++NBA)，431.0(15，M+153)，444.0(20)，533.0(15).230.0(77)，202.0(100)，183.5(5)，173.0(10)，69.0(33).Acc.MSm/z(-ve離子FAB甘油，相對強度)254.9982(25)，C10H7O6S 要求s 254.9963.實測值C，40.3；H，2.92.C10H7O6NaS·H2O要求C，40.55；H，3.06％.HPLC[Spherisorb ODS5，25×4.6mm；流動相MeOH/H2O(70∶30)，流速1ml/min；λmax316nm]tR＝1.5min，c.f.7-羥基-4-甲基香豆素，3.6min.
其它數(shù)據(jù)如下化合物(12)在堿中，例如氫氧化鈉的甲酸溶液中穩(wěn)定，但在酸性條件中不穩(wěn)定，此外，反應混合物用氫氧化鈉的甲醇溶液(小于3當量)不完全堿化可導致(12)的分解。需要2當量氫氧化鈉消耗過量的三氧化硫-吡啶復合物得中性的硫酸鈉。因此，氫氧化鈉的不足量會導致酸性的硫酸氫鈉的形成?；衔?2顯示對高溫的不穩(wěn)定性，因為一個實驗已經(jīng)表明在90℃加熱固體(12)4小時后完全分解為7-羥基-4-甲基香豆素。
體外實驗大致如前面描述的，用整體MCF-7乳腺癌細胞或胎盤微粒體(100,000g片段)檢測上述提到的香豆素氨基磺酸酯抑制E1-STS活性的能力。
為了檢驗化合物(12)是否能夠作為E1-STS的基質起作用，100μg的該化合物與胎盤微粒體在沒有EMATE或在EMATE的存在下(10μM)孵育1小時。孵育結束時形成的未連接的香豆素用乙醚萃取，蒸發(fā)除去溶劑后，用TLC檢測殘留物，用乙酸乙酯/甲醇(80∶20)為洗脫劑，在該洗脫劑下，香豆素硫酸酯(12)和7-羥基-4-甲基香豆素的Rf值分別為0.79和0.95。在化合物(12)與胎盤微粒體孵育后，只檢測到未連接的7-羥基-4-甲基香豆素。含有EMATE的反應混合物降低了化合物(12)通過E1-STS的水解，表明香豆素硫酸酯的確是硫酸酯酶的底物。
從圖5可知香豆素-7-0-氨基磺酸酯(13)，4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯(14)。3，4，8-三甲基-香豆素-7-0-氨基磺酸酯(15)和4-(三氟甲基)香豆素-7-0-氨基磺酸酯(16)在整體MCF-7乳腺癌細胞的雌酮硫酸酯酶的劑量依賴性的抑制。大致如前面描述的完成檢測。(7，8)在25cm3燒瓶中單層整體MCF-7細胞在37℃與[3H]雌酮硫酸酯(2nM)和0.1-10μM香豆素氨基磺酸酯孵育20小時。用測定形成的3H-標記的雌酮和雌二醇的總量檢測雌酮硫酸酯酶活性。在未處理的細胞中硫酸酯酶活性為100～200fmol/20h/106細胞。每一點代表3次測量的平均值±S.D值。
所有制備的香豆素氨基磺酸酯的游離母體香豆素檢測至多10μM時顯示低的或不顯示E1-STS抑制活性。然而，相反，所有四種香豆素氨基磺酸酯(化合物13-16)以劑量依賴的方式抑制雌酮硫酸酯酶抑制活性(圖5)，并且10μM時的抑制作用為自化合物(16)的71.5％至化合物(14)的93.3％。用整體的MCF-7細胞測量化合物14(最有效的抑制劑)對E1-STS的抑制作用的IC50為380nM。
從圖6可知，4-甲基-香豆素-7-0-氨基磺酸酯(14)使雌酮硫酸酯酶時間依賴和濃度依賴性的失活作用。在37℃胎盤微粒體(200μg)與(14)預孵育0-30分鐘(對照，●；0.5μM，△以及10μM，★)，隨后在4℃與葡聚糖-炭孵育10分鐘。離心沉淀葡聚糖-炭，然后上清液部分在37℃與[3H]雌酮硫酸酯(20μM)孵育1小時以確定其余的硫酸酯酶活性。在每一個濃度點重復實驗，但在每一個實驗中在不同時間進行測定殘留的活性。
在二相式中，化合物14與EMATE抑制E1-STS活性是以時間和濃度依賴方式的(圖6)，顯示類似的作用機制(兩個活化位點的可能的化學修飾)。10μM時，用抑制劑預孵育酶20分鐘后化合物14降低了原來E1-STS活性的95％。
另一實驗揭示，在相同濃度時化合物14抑制胎盤微粒體DHA-STS活性的93.6％。
體內實驗為了檢測是否化合物14具有雌激素活性，以及也檢測其在體內抑制E1-STS的能力，在大鼠進行卵巢切除14天后給它服藥(皮下注射1mg/kg，在丙二醇中，5天)。
化合物14的服用不造成這些大鼠子宮重量上任何明顯增加(沒有說明數(shù)據(jù))，說明化合物14顯示降低雌激素激動性質。從這些動物中得到的子宮中的E1-STS活性與在未處理的動物中的活性比較抑制為89.4％。
初步數(shù)據(jù)還證明，在大鼠中化合物14有效的口服活性，類似于對EMATE觀察到的活性。
除這些體內結果外，其它一系列大鼠(每只重量大約200g)服用4-甲基香豆素-7-0-氨基磺酸酯(化合物14)，以丙二醇溶液方式口服，或以單一劑量(SD)，或每天服用，共服7天(多劑量，MD)。
確定SD或MD后收集的白血細胞(wbcs)中硫酸酯酶活性的抑制，用標記的雌酮硫酸酯作為底物，并測定雌酮的釋放，測定硫酸酯酶活性。
圖7說明了結果，見下表劑量mg/kg ％抑制率SD MD0.1 72 651.0 85 8510.0 96 89用肝細胞發(fā)現(xiàn)類似的結果。
因此化合物14顯示有效的口服活性。
本發(fā)明的其它改進方案對于那些技術人員是顯而易見的。
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權利要求
1.非甾族氨基磺酸酯化合物在制備用于治療腫瘤的藥物中的應用，其中該化合物具有以下的通式(B) 其中R1-R6為獨立選自H、鹵素、羥基、氨基磺酸酯、C1-6烷基和C1-6鹵代烷基或它們的鹽；但其中R1-R5中至少1個為氨基磺酸酯基，且其中R1-R6中的任選兩個或以上鍵合在一起形成另一個環(huán)結構。
2.權利要求1所述的應用，其中R1-R6中的兩個或以上鍵合在一起形成另一個環(huán)結構。
3.權利要求1所述的應用，其中R1-R5獨立選自H、C1-6烷基和C1-6鹵代烷基。
4.權利要求1所述的應用，其中R1-R5獨立選自H、C1-3烷基和C1-3鹵代烷基。
5.權利要求1所述的應用，其中R1-R5獨立選自H、甲基和鹵代甲基。
6.權利要求1所述的應用，其中R6為OSO2NH2。
7.權利要求1-6中任一項所述的應用，其中所述化合物具有以下的通式(C) 其中n為3-10的整數(shù)。
8.權利要求1-6中任一項所述的應用，其中所述化合物選自具有以下通式的化合物
9.權利要求1所述的應用，其中所述化合物選自具有以下通式的化合物
10.權利要求1所述的應用，其中所述化合物為
全文摘要
本發(fā)明公開了非甾族氨基磺酸酯化合物在制備用于治療腫瘤的藥物中的應用，其中該化合物具有以上的通式(B)，其中R
文檔編號A61K31/37GK1701790SQ20051007589
公開日2005年11月30日 申請日期1997年2月17日 優(yōu)先權日1996年2月16日
發(fā)明者M·J·雷德, B·V·L·波特爾 申請人:斯特里克斯有限公司