專利名稱：黃芩總黃酮提取物及黃芩苷在抗骨質(zhì)疏松藥物制備中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松的藥物，具體的說涉及黃芩總黃酮提取物及黃芩苷在治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物制備中的用途。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥(有時(shí)也簡稱為骨質(zhì)疏松)是全身骨骼成分減少的一種骨骼疾病，主要表現(xiàn)為骨組織內(nèi)單位體積中骨量減少，骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)隨年齡的增加(或婦女絕經(jīng)后)等比例的減少，骨組織的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而致其骨組織的正常荷載功能發(fā)生變化。骨質(zhì)疏松在臨床上表現(xiàn)為腰背疼、病理性骨折、椎體變形、體態(tài)變形致“龜背”出現(xiàn)，伴有周身骨骼的疼痛等癥狀。
原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥占骨質(zhì)疏松癥的90％。它是老年人的一種常見病，一種全身性骨病。主要表現(xiàn)是骨組織的礦物質(zhì)和骨基質(zhì)均有減少、骨量低和骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)有破壞，導(dǎo)致骨的脆性增加和容易發(fā)生骨折。女性較男性多見，常見于絕經(jīng)后婦女和老年人，在輕微外傷或無外傷的情況下都容易發(fā)生骨折，75歲以上的婦女骨折發(fā)生率高達(dá)80％以上。
骨質(zhì)疏松癥是骨骼代謝異常的疾病，它的產(chǎn)生原因至今尚未明確，但醫(yī)學(xué)界認(rèn)為與下列因素有關(guān)內(nèi)分泌因素，其中雌激素降低是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要原因，此外與營養(yǎng)、遺傳、營養(yǎng)狀況、生活方式等密切相關(guān)。
目前臨床上用于治療骨質(zhì)疏松癥的主要藥物有維生素D類藥物、甲狀旁腺素(PHT)、氟化物、同化激素、雙磷酸鹽類等。這些藥物長期應(yīng)用均產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，同時(shí)一些患者因禁忌癥不能應(yīng)用這些藥物，因此研制安全、有效地治療骨質(zhì)疏松癥的天然藥物具有其重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
黃芩(Scutellaria baicalensi.s Georgi)為常用中藥之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效。其主要有效成分為黃酮類化合物。
目前從黃芩中已發(fā)現(xiàn)41種黃酮類化合物，其中含量較高并具有明顯藥理作用的是黃芩甙、黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩甙?，F(xiàn)代藥理研究證明黃芩不僅具有明顯的抗菌消炎、抗過敏、抗氧化、抗致癌和抗病毒的作用，而且對(duì)心血管也具有一定作用。目前，對(duì)其藥理學(xué)的具體研究如下1.抗氧化和清除自由基作用多數(shù)黃酮類化合物具有一定的抗氧化作用，黃酮結(jié)構(gòu)中的2，3雙鍵和4位羰基以及3或5位羥基對(duì)黃酮的抗氧化作用有重要貢獻(xiàn)。黃芩中已知的黃酮大都具有酚羥基結(jié)構(gòu)，因此是較好的抗氧化劑。黃芩素可抑制由鐵誘導(dǎo)的鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化，對(duì)前腦勻漿脂質(zhì)過氧化水平的抑制能力及二苯基苦味肼(DPPH)誘導(dǎo)的自由基的清除能力與槲皮素相當(dāng)。作為治療癲癇的日本和漢藥TJ一960中的成分之一，黃芩素是其中已知主要成分中最強(qiáng)的自由基清除劑。在鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化實(shí)驗(yàn)中，黃芩素減少了抗壞血酸與FeCL3體系中硫化巴比妥酸活性物質(zhì)(TBARs)的產(chǎn)生(Gao D，Sakuraik，kotohM，黃芩素鐵復(fù)合物對(duì)微粒體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用Biochem Mol Int.1996，39(2)215)，譚廷華等的研究表明(譚廷華、劉愛芳、王新英等，黃芩甙與蕓香甙對(duì)·OH的清除作用[J].西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，18(1)41～43)，黃芩給藥劑量為50和100mg·kg時(shí)均可顯著抑制cch所致小鼠肝脂質(zhì)過氧化損傷作用。黃芩苷對(duì)Fenton反應(yīng)生成的OH自由基清除率高于·OH自由基特異性清除劑甘露醇。漢黃芩素能夠抑制還原型輔酶II(NADPH)和Fe。黃芩甙可抑制大鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成，并對(duì)乙酰氨基酚和四氯化碳引起的肝脂質(zhì)過氧化損傷具有保護(hù)作用(參見張永欽，周井炎，徐輝碧.黃芩甙的抗氧化作用[J].華中理工大報(bào)，1999，27(4)111～113)。黃芩甲醇提取物可明顯抑制肝脯氨酸和MDA的生成，提示黃芩甲醇提取物可抑制由BDL或cch誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化和脂質(zhì)過氧化(參見Nan J X，Park EJ，Kim Y C，et al，黃芩對(duì)膽管結(jié)扎及四氯化碳大鼠誘導(dǎo)的肝臟纖維化的抑制作用[J].Pharmacy and pharmacology，2002，54(4)555～563)。
2.抗菌、抗病毒作用黃芩具有廣譜的抗菌和抗病毒作用。呂小迅等(參見呂小迅、周玉珍、呂華沖，黃芩、黃精抗真菌作用活性部位實(shí)驗(yàn)研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，11(3)180～182)研究了黃芩醇溶性部分和水溶性部分的抗真菌作用，發(fā)現(xiàn)黃芩的醇溶性部分對(duì)Tr的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)其他供試菌種抑制作用則較弱；其水溶性部分對(duì)Tr，Tg，Ef，Cn和Ca等5種供試菌種均有較強(qiáng)抑制作用；同時(shí)證明黃芩的有效成分主要存在于其水溶性部分。
1988年陳鴻珊等首次發(fā)現(xiàn)，黃芩甙與黃芩素對(duì)人免疫缺陷病毒(HIV)逆轉(zhuǎn)錄酶的活性有抑制作用，并觀察到黃芩甙在H9細(xì)胞培養(yǎng)中能抑制HIV-1的復(fù)制，此研究結(jié)果引起了學(xué)者們的關(guān)注。近幾年來，最令人感興趣的是黃芩甙和黃芩素的抗艾滋病病毒作用。趙晶的研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素抑制HIV-RT活性較黃芩甙強(qiáng)(參見趙晶，兩種抗人免疫缺陷病毒天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)修飾的研究[D].北京中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，1998[13])。從黃芩中提取的異黃芩素.8-甲醚能顯著抑制流感病毒。黃芩甙對(duì)人T細(xì)胞白血病病毒I型(HTLV-I)的抑制呈劑量效應(yīng)關(guān)系。因此，黃芩黃酮類化合物有望開發(fā)成為新的抗艾滋病藥物。
Nagai發(fā)現(xiàn)(參見Nagai T.黃芩根中抗流感A(H3N2)和B病毒的黃酮類成分5，7，4′ 三羥基8甲氧基黃酮F 36[J].國外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè)，1996，18(3)46)，黃芩黃酮F36(5，7，4 trihydrox-y-8-methoxyflavone)可抗流感病毒A和B。永井隆之(參見永井隆之.生物中類黃酮藥抗流感病毒活性產(chǎn)生的作用機(jī)制(2)[J].國外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè)，1995，17(6)40～42)認(rèn)為，F(xiàn)36對(duì)流感病毒(IFV)的唾液酸酶有特異的抑制活性，可有效抑制小鼠感染IFV，并抑制IFV的膜融合及脫殼。
3.抗炎、抗變態(tài)作用致病菌激活宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生各種炎性介質(zhì)，如IL-113、PGE2和LTB4，它們與牙齦炎和牙槽骨吸收有著非常密切的關(guān)系。Chung評(píng)價(jià)了黃芩甲醇提取物及其黃酮類化合物的消炎和激活齦成纖維細(xì)胞作用，提示黃芩甲醇提取物、黃芩甙、黃芩素和漢黃芩素均無細(xì)胞毒性，可使脂多糖誘導(dǎo)的IL-18的合成降低50％以上。這3種黃酮類化合物對(duì)炎癥的抑制作用幾乎與作為標(biāo)準(zhǔn)抗炎類固醇的強(qiáng)的松龍一樣強(qiáng)。Lin和Shieh E報(bào)道(參見Lin CC，ShiehDE，The anti-inflammatory activity of Scutellaria rivularis extracts and itsactivator and plas minogen activator-1 prodution in cultured human umbilical veinendothelial cells[J].phytother Res，1997，11(5)363)，黃芩提取物中的3種主要黃酮(黃芩素、黃芩甙、漢黃芩甙)對(duì)由角叉藻膠誘導(dǎo)的爪水腫有強(qiáng)烈的抗炎活性。
4抗腫瘤作用Shinichi I等(參見Shinichi Ikemoto，kaiunobu Sugimuka，Naomasa Yoshida，et al.黃芩根及其主要成分黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素對(duì)膀胱癌細(xì)胞珠的抗腫瘤作用[J].Urology，2000，55(6)951-955)研究了黃芩及其化合物黃芩素、黃芩甙、漢黃芩甙對(duì)膀胱癌細(xì)胞鏈的抗腫瘤作用。結(jié)果證實(shí)，所有藥物均可抑制癌細(xì)胞的增殖，且存在量效依賴關(guān)系，黃芩素表現(xiàn)出最大的抗增殖活性。在活體實(shí)驗(yàn)中，C3H/HeN老鼠每天每只口服黃芩甙10mg，可顯著抑制腫瘤增長，預(yù)示中草藥可能成為治療膀胱癌的有潛力和有前途的藥物。袁榴娣等(參見袁榴娣，徐紅，杜肇宗.黃芩甙對(duì)艾氏腹水瘤細(xì)胞影響的初步探討[J].南京鐵道醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，16(4)231～233)的研究結(jié)果顯示，黃芩甙可增強(qiáng)小鼠的體液和細(xì)胞的免疫功能，抑制荷瘤小鼠腹水脂加氧酶活性。抑制艾氏腹水瘤細(xì)胞的生長；但無論是在體內(nèi)還是體外，對(duì)生長后期的瘤細(xì)胞的抑制作用均不明顯。
5.免疫藥理作用賀海平等(參見賀海平、秦菁、陳明等.一種新的黃芩類黃酮3，5，6，7四羥基2，8二甲氧基黃酮的體外免疫作用[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17(3)353～355；賀海平、秦箐、陳明.黃芩類黃酮對(duì)人免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)光及淋巴細(xì)胞增殖的影響[J].中國免疫學(xué)雜志，2000，16(2)84～86)分別對(duì)新發(fā)現(xiàn)的一種黃芩類黃酮3，5，6，7-四羥基-2，8-二甲氧基黃酮(TDF)和黃芩中純化的3，5，6，7-四羥基2，8-二甲氧基黃酮、2，5-二羥基6，6，7，8-四甲氧基黃酮、5，7，8-三羥基黃酮、(2R，3R)-2，3，5，6，7-五羥基黃烷醇、黃芩甙和黃芩酮6種類黃酮成分的免疫藥理作用進(jìn)行了研究，該實(shí)驗(yàn)j結(jié)果顯示黃芩素對(duì)PKC有特異性抑制作用，還可改善由右旋糖苷硫酸鹽誘導(dǎo)的大腸炎的所有炎性癥狀。
綜上所述，黃芩及其所含黃酮有其廣泛的藥理作用，但對(duì)其抗骨質(zhì)疏松的研究，在國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，均無抗骨質(zhì)疏松及其相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供化合物黃芩苷在制備治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物中的用途；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供黃芩總黃酮提取物在制備治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物中的用途。
黃芩苷即Baicalin，C21H18O11，分子量為446，為5，6-二羥基黃酮-7-O-葡糖糖醛酸苷。
黃芩總黃酮提取物，即從黃芩中經(jīng)水提、有機(jī)溶劑提取(乙醇、甲醇)的總黃酮提取物或在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步經(jīng)過精制(如大孔樹脂、酸堿方法、萃取方法)等所得的總黃酮提取物，其主要成分是黃芩苷(baicalin)、黃芩素(baicalein)、漢黃芩素(wogonin)、漢黃芩苷wogonoside)、黃芩新素(neobaicalein)等。
成骨細(xì)胞是參與骨代謝的重要細(xì)胞，它與破骨細(xì)胞共同維持著骨代謝重建的平衡。骨質(zhì)疏松發(fā)生的機(jī)制是骨形成落后于骨溶解，在骨的重建過程中無法完全修復(fù)破壞的骨質(zhì)，使其骨量不斷減少、骨質(zhì)量下降。因此，治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵措施之一是促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨過程，緩解破骨細(xì)胞的破骨過程。
對(duì)骨組織的溶解吸收是破骨細(xì)胞主要的生理功能。體外培養(yǎng)一定時(shí)間的破骨細(xì)胞可在骨片上形成吸收陷窩，吸收陷窩的數(shù)量可反映破骨細(xì)胞溶解吸收的能力。采用甲苯胺蘭染色技術(shù)對(duì)骨片上產(chǎn)生的吸收陷窩進(jìn)行顯示，可以定量這種溶解吸收能力。
本發(fā)明實(shí)施例1觀察了黃芩苷及黃芩總黃酮提取物對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞增殖及分化的影響，探討該藥是否存在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增殖的作用。
結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，10％黃芩總黃酮提取物血清及5％黃芩苷血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與對(duì)照組相比，20％黃芩總黃酮提取物血清及10％黃芩苷血清對(duì)成對(duì)成骨細(xì)胞增殖具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；10％、20％含藥血清中黃芩總黃酮組及5％、10％的黃芩苷對(duì)成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶具有顯著促進(jìn)作用(P＜0.01)。
本發(fā)明在成功培養(yǎng)出成骨細(xì)胞基礎(chǔ)上，觀察了大鼠灌胃給藥后得到的血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化的影響。AKP約40％～75％由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，其活性可反映成骨細(xì)胞功能的強(qiáng)弱，也是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志之一。結(jié)合成骨細(xì)胞的生長及分化指標(biāo)對(duì)供試品藥物進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果是黃芩苷和黃芩總黃酮提取物對(duì)成骨細(xì)胞的增殖及分化均有顯著的促進(jìn)作用。
本發(fā)明實(shí)施例2觀察了黃芩苷及黃芩總黃酮提取物新生大鼠破骨細(xì)胞功能的影響，探討該藥是否存在抑制破骨細(xì)胞功能的作用。
與對(duì)照組相比，20％黃芩總黃酮提取物血清及10％黃芩苷血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；10％、20％中黃芩總黃酮血清組及5％、10％的黃芩苷血清對(duì)成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶具有顯著促進(jìn)作用(P＜0.01)；本發(fā)明利用原代培養(yǎng)的破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收試驗(yàn)。結(jié)果顯示黃芩苷和黃芩總黃酮提取物對(duì)破骨細(xì)胞功能有一定劑量依賴性的抑制作用。
以上通過黃芩苷和黃芩總黃酮提取物對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的研究，表明對(duì)成骨細(xì)胞的增殖及分化均有顯著促進(jìn)作用及對(duì)破骨細(xì)胞功能有一定劑量依賴性的抑制作用。從而通過促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨過程，緩解破骨細(xì)胞的破骨過程。
本發(fā)明的另一方面，以黃芩苷及黃芩總黃酮提取物為藥效成分，添加藥學(xué)上可接受的藥用輔料，并通過常規(guī)方法可以制備藥物組合物或單體制備成藥物制劑時(shí)，藥物制劑的劑型可以是口服給藥的劑型諸如片劑、膠囊(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊和微囊)、粉劑、顆粒劑和糖漿劑；非口服給藥的劑型諸如注射劑、栓劑、丸劑、凝膠劑和貼劑。除這些常規(guī)劑型外，還可以將口服的速釋固體制劑(例如片劑、顆粒劑等)和用于口服或非口服給藥的緩釋制劑(片劑、顆粒、精細(xì)顆粒、丸劑、膠囊、糖漿、乳劑、懸浮液、溶液)。本發(fā)明中的制劑可以是包衣或未包衣的形式，視需要而定。
本發(fā)明中的藥用輔料包括用于固體制劑的賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑、包衣劑等，或用于半固體制劑、液體制劑的溶劑、增溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩沖劑、潤膚劑、乳化劑等，此外，也可以根據(jù)需要使用其它藥用添加劑諸如防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑和調(diào)味劑等。


圖1為采用甲苯胺蘭染色技術(shù)對(duì)骨片上產(chǎn)生的吸收陷窩進(jìn)行顯微放大拍照?qǐng)D。原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)1周，細(xì)胞成多角狀。
圖2為采用甲苯胺蘭染色技術(shù)對(duì)骨片上產(chǎn)生的吸收陷窩進(jìn)行顯微放大拍照?qǐng)D。原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)3周，可見骨節(jié)結(jié)形成。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。
實(shí)施例1黃芩苷及黃芩總黃酮提取物對(duì)大鼠成骨細(xì)胞生長、分化的影響
1.試驗(yàn)材料(1)受試藥物供試樣品黃芩苷(大于95％，HPLC法)、黃芩總黃酮提取物I(含量70％，uv法，大孔樹脂制備方法)、黃芩總黃酮提取物II(含量50％，uv法，酸堿制備方法)、黃芩總黃酮提取物III(含量30％，uv法，乙醇提取)、黃芩總黃酮提取物IV(含量25％，uv法，水提取)。
性狀均為淺黃色粉末，氣微，味苦保存條件避光、密閉配制方法稱取一定量待試藥物，用1％羧甲基纖維素鈉溶液制成混旋液。
(2)動(dòng)物品系SD大鼠來源上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)體重200g(三月齡)性別雌雄各半等級(jí)清潔級(jí)合格證號(hào)中科動(dòng)管第004號(hào)；許可證號(hào)SCXK(滬)2002-0010飼料中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
生產(chǎn)合格證號(hào)中科滬動(dòng)管字第99-0010號(hào)飼養(yǎng)場所第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心等級(jí)清潔級(jí)合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)字第02-64號(hào)。
2、試驗(yàn)方法(1)含藥血清的制備參見(劉建民、張依山、馬錦富，活絡(luò)骨康丸對(duì)成骨細(xì)胞作用的研究，中醫(yī)正骨，2004，16(9)3-4； 張巧艷、秦路平、田野萍等，蛇床子素對(duì)新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞的作用，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21(10)935-937)。
選擇SD 3月齡大鼠，按體重隨機(jī)分為8組，即為對(duì)照組(CMC)、尼爾雌醇組、強(qiáng)骨膠囊組、黃芩苷組、黃芩總黃酮提取物I組、黃芩總黃酮提取物II組、黃芩總黃酮提取物III組、黃芩總黃酮提取物IV組。尼爾雌醇組、強(qiáng)骨膠囊組。分別給予1％CMC、200mg/kg的黃芩總黃酮提取物組I、220mg/kg黃芩總黃酮提取物II、230mg/kg黃芩總黃酮提取物III、250mg/kg黃芩總黃酮提取物IV、100mg/kg的黃芩苷組、強(qiáng)骨膠囊90mg/kg灌胃給藥，每日給藥2次，連續(xù)給藥1周；尼爾雌醇1mg/kg每周給藥一次，末次給藥1h后，心臟采血，2500r/min離心20min，合并收集同組血清，56℃水浴滅活30min，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们芭囵B(yǎng)基稀釋，過濾膜除菌(濾膜孔徑為0.22mm)。
(2)細(xì)胞培養(yǎng)參見(王永東、武曉蓉，黃芪對(duì)成骨細(xì)胞成骨能力的血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，20(5)512-514)。
新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法。24小時(shí)內(nèi)出生的新生SD大鼠拉頸處死，75％酒精浸泡后取頭蓋骨，剔除軟組織后剪碎，加入0.2％的I型膠原酶，消化5個(gè)循環(huán)，每次20min，收集第3、4、5次消化的細(xì)胞懸液，1000r/min離心10min，棄上清，沉淀的細(xì)胞用10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸，吹打均勻，接種至培養(yǎng)瓶，于37℃5％CO2孵箱孵育，24小時(shí)換液，待細(xì)胞60％～70％貼壁后，用0.25％胰酶消化，即為本實(shí)驗(yàn)的原代成骨細(xì)胞。原代細(xì)胞長成致密單層后，用0.25％胰蛋白酶進(jìn)行消化，以1∶3比例傳代，以后每2天換液1次，長成致密單層后用于實(shí)驗(yàn)。
(3)細(xì)胞鑒定倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)第2天大部分細(xì)胞貼壁，貼壁后主要為梭形、圓形或鱗片狀；3～4天時(shí)細(xì)胞突起伸展，相互搭連成片，長滿瓶底時(shí)，細(xì)胞為梭形及立方塊狀，排列緊密，并可見圓形及鱗片狀細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，可見成骨細(xì)胞呈多層生長。
(4)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)參見(任艷玲、鄭洪新、杜松，補(bǔ)腎健脾藥物血清對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖與分化的影響。中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(9)772-774)。
96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μl細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/ml)，在37℃，5％CO2孵育箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁，換含不同濃度、種類的含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，并于結(jié)束培養(yǎng)前4小時(shí)，每孔加入10mg/ml的MTT。培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，每孔加入100μl的DMSO，振搖15min，酶標(biāo)儀于490nm處檢測各空OD值。
(5)堿性磷酸酶活性測定參見(史鳳芹.于世鳳.體外破骨細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立.中華骨科雜志.1994，14(1)43-45)。
96孔培養(yǎng)板，每孔加入0.1ml細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/ml)，貼壁后加藥方法同前，細(xì)胞培養(yǎng)2d后，取細(xì)胞培養(yǎng)液50l，各孔均加堿性磷酸酶試劑盒新鮮配制的底物2.55ml，37℃孵育30min，雙蒸水空白調(diào)零，在722分光光度計(jì)520nm波長處檢測其吸光度A值。
3.統(tǒng)計(jì)處理各組結(jié)果以x±SD表示，采用ANOVA比較給藥前后各組間變化差值的顯著性。
4、結(jié)果4.1成骨細(xì)胞形態(tài)如圖1所示原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)1周，細(xì)胞成多角狀。
如圖2所示原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)3周，可見骨節(jié)結(jié)形成。
4.2供試藥物血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響從表1可以看出，與對(duì)照組相比，10％黃芩總黃酮提取物血清I、10％黃芩總黃酮提取物血清II、10％黃芩總黃酮提取物血清III、10％黃芩總黃酮提取物血清IV及5％黃芩苷血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與.對(duì)照組相比，20％黃芩總黃酮提取物血清I、20％黃芩總黃酮提取物血清II、20％黃芩總黃酮提取物血清III、20％黃芩總黃酮提取物血清IV及10％黃芩苷血清對(duì)成對(duì)成骨細(xì)胞增殖具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
表1.含供試藥物血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響A490nm(n＝7，x±SD)

*p＜0.05；**p＜0.01vs NS；從表2可以看出，與對(duì)照組相比，10％、20％含藥血清中黃芩總黃酮各組及黃芩苷對(duì)成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶具有顯著促進(jìn)作用(P＜0.01)，在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，與強(qiáng)骨膠囊的作用相似，比尼爾雌醇稍好。
表2.含供試藥物血清對(duì)成骨細(xì)胞AKP的影響A570nm(n＝7，x±s)

p＜0.05；**p＜0.01vs對(duì)照組本試驗(yàn)結(jié)合成骨細(xì)胞的生長及分化指標(biāo)對(duì)黃芩系列藥物進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示它們對(duì)成骨細(xì)胞的增殖及分化均有一定的促進(jìn)作用。
結(jié)論黃芩苷及黃芩總黃酮提取通過促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)骨質(zhì)疏松的防治具有積極意義。
實(shí)施例2黃芩苷及黃芩總黃酮提取物對(duì)對(duì)新生大鼠破骨細(xì)胞功能的影響1、試驗(yàn)材料(1)受試藥物供試樣品黃芩苷(大于95％，HPLC法)、黃芩總黃酮提取物(大于70％，uv法，大孔樹脂制備方法)、黃芩總黃酮提取物II(含量50％，uv法，酸堿制備方法)、黃芩總黃酮提取物III(含量30％，uv法，乙醇提取)、黃芩總黃酮提取物IV(含量25％，uv法，水提取)。
性狀淺黃色粉末，氣微，味苦保存條件避光、密閉配制方法稱取一定量待試藥物，用1％羧甲基纖維素鈉溶液制成混旋液(2)動(dòng)物品系SD大鼠來源上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)體重200g(三月齡)性別雌雄各半等級(jí)清潔級(jí)合格證號(hào)中科動(dòng)管第004號(hào)；許可證號(hào)SCXK(滬)2002-0010，飼料中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供生產(chǎn)合格證號(hào)中科滬動(dòng)管字第99-0010號(hào)飼養(yǎng)場所第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心等級(jí)清潔級(jí)合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)字第02-64號(hào)。
2、試驗(yàn)方法(1)骨磨片的制備取新鮮牛股骨，用鋸式切片機(jī)(Leitz 1600)切割成厚度約50mm的薄切片，剪成6mm×6mm大小，于滅菌的雙蒸水中超聲(SB2200，80W)清洗(50Hz×5min)，連續(xù)3次后，紫外燈照射8小時(shí)(每面4小時(shí))，備用。參見(張煒真、于世鳳、鄭麟蕃.大鼠破骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)和鑒定.解剖學(xué)報(bào).1995，26(3)291-293；史鳳芹.于世鳳.張潤荃.龐淑珍.大黃對(duì)破骨細(xì)胞性骨吸收作用的研究.現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志.1995，9(4)193-195)(2)含藥血清的制備選擇SD 3月齡大鼠12只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為5組，即為對(duì)照組(CMC)、黃芩苷、黃芩總黃酮提取物組、尼爾雌醇組、強(qiáng)骨膠囊組。分別給予1％CMC、200mg/kg的黃芩總黃酮提取物組I、220mg/kg黃芩總黃酮提取物II、230mg/kg黃芩總黃酮提取物III、250mg/kg黃芩總黃酮提取物IV、100mg/kg的黃芩苷組、強(qiáng)骨膠囊90mg/kg灌胃給藥，每日給藥2次，連續(xù)給藥1周；尼爾雌醇1mg/kg每周給藥一次，末次給藥1h后，心臟采血，2500r/min離心20min，合并收集同組血清，56℃水浴滅活30min，-20℃保存?zhèn)溆?。使用前培養(yǎng)基稀釋，過濾膜除菌(濾膜孔徑為0.22mm)。
(3)破骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)參見(任艷玲、鄭洪新、杜松，補(bǔ)腎健脾藥物血清對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖與分化的影響。中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(9)772-774)。
取1日齡SD大鼠，拉頸處死，75％酒精浸泡5min，無菌分離四肢長骨，剔凈軟組織，用MEM培養(yǎng)液清洗2次，用解剖刀縱向剖開骨干，將骨質(zhì)內(nèi)表面刮入培養(yǎng)液(MEM全培養(yǎng)液，含20％胎牛血清，100g/ml硫酸鏈霉素、100U/ml青霉素鈉，pH 7.2)。再以圓頭吸管吹打骨碎片5min，靜置30s，吸取上層細(xì)胞懸液均勻接種于預(yù)置有象牙薄片的24孔培養(yǎng)板中，37℃5％CO2孵箱孵育30分鐘，以MEM培養(yǎng)液沖去未貼壁的細(xì)胞，更換全培養(yǎng)液至每孔2ml，繼續(xù)培養(yǎng)，3天更換一次培養(yǎng)液。
(4)骨吸收陷窩觀察與計(jì)數(shù)培養(yǎng)8小時(shí)后，更換為加有含藥血清或?qū)φ昭宓呐囵B(yǎng)液，培養(yǎng)至第7天，取出所有象牙薄片，2.5％戊二醛固定，于0.25mol/L氫氧化銨超聲波清洗5min×3次，系列梯度酒精脫水，自然晾干，1％甲苯胺藍(lán)染液室溫染色，3～4min，蒸餾水清洗，于光鏡100倍下對(duì)整張象牙薄片上的吸收陷窩計(jì)數(shù)，結(jié)果以陷窩數(shù)/片計(jì)。
3統(tǒng)計(jì)處理各組結(jié)果以x±SD表示，采用ANOVA比較給藥前后各組間變化差值的顯著性。
4結(jié)果4.1供試品對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響從表3中可以看出，與對(duì)照組相比，20％含藥血清黃芩總黃酮提取物各組及10％黃芩苷對(duì)成對(duì)成骨細(xì)胞增殖具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；10％、20％含藥血清中黃芩總黃酮各組及5％、10％的黃芩苷對(duì)成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶具有顯著促進(jìn)作用(P＜0.01)；表3對(duì)骨片骨陷窩計(jì)數(shù)的影響(n＝6，x±s)

p＜0.05；**p＜0.01vs對(duì)照組結(jié)果與結(jié)論對(duì)骨組織的溶解吸收是破骨細(xì)胞主要的生理功能。體外培養(yǎng)一定時(shí)間的破骨細(xì)胞可在骨片上形成吸收陷窩，吸收陷窩的數(shù)量可反映破骨細(xì)胞溶解吸收的能力。采用甲苯胺蘭染色技術(shù)對(duì)骨片上產(chǎn)生的吸收陷窩進(jìn)行顯示，可以定量這種溶解吸收能力。破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞共同維持著骨代謝重建的平衡。骨質(zhì)疏松發(fā)生的機(jī)制是骨形成落后于骨溶解，在骨的重建過程中無法完全修復(fù)破壞的骨質(zhì)，使其骨量不斷減少、骨質(zhì)量下降。因此，治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵措施包括促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨過程，緩解破骨細(xì)胞的破骨過程等。
總之，成骨細(xì)胞是參與骨代謝的重要細(xì)胞，它與破骨細(xì)胞共同維持著骨代謝重建的平衡。骨質(zhì)疏松發(fā)生的機(jī)制是骨形成落后于骨溶解，在骨的重建過程中無法完全修復(fù)破壞的骨質(zhì)，使其骨量不斷減少、骨質(zhì)量下降。因此，治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵措施之一是促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨過程，緩解破骨細(xì)胞的破骨過程。
本試驗(yàn)在成功培養(yǎng)出成骨細(xì)胞基礎(chǔ)上，觀察了大鼠灌胃給藥后得到的血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化的影響。AKP約40％～75％由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，其活性可反映成骨細(xì)胞功能的強(qiáng)弱，也是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志之一。本試驗(yàn)結(jié)合成骨細(xì)胞的生長及分化指標(biāo)對(duì)黃芩系列藥物進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示黃芩總黃酮及黃芩苷對(duì)成骨細(xì)胞的增殖及分化均有一定的促進(jìn)作用。
對(duì)骨組織的溶解吸收是破骨細(xì)胞主要的生理功能。體外培養(yǎng)一定時(shí)間的破骨細(xì)胞可在骨片上形成吸收陷窩，吸收陷窩的數(shù)量可反映破骨細(xì)胞溶解吸收的能力。采用甲苯胺蘭染色技術(shù)對(duì)骨片上產(chǎn)生的吸收陷窩進(jìn)行顯示，可以定量這種溶解吸收能力。
因此，治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵措施包括促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨過程，緩解破骨細(xì)胞的破骨過程等。
本研究利用原代培養(yǎng)的破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收試驗(yàn)。結(jié)果顯示黃芩總黃酮及黃芩苷對(duì)破骨細(xì)胞功能有一定劑量依賴性的抑制作用。說明其防治骨質(zhì)疏松作用，部分是通過抑制破骨細(xì)胞的功能實(shí)現(xiàn)的。
以上充分說明了黃芩總黃酮提取物及黃芩苷治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用，可開發(fā)成抗骨質(zhì)疏松新藥。
權(quán)利要求
1.黃芩苷在制備治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥藥物中的用途。
2.黃芩總黃酮提取物在制備治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及黃芩總黃酮提取物及黃芩苷在治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物制備中的用途。黃芩苷即5，6－二羥基黃酮－7－0－葡糖糖醛酸苷。黃芩總黃酮提取物其主要成分是黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷、黃芩新素等。通過對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞增殖及分化的影響和新生大鼠破骨細(xì)胞功能的影響的藥理試驗(yàn)研究，結(jié)果表明黃芩苷和黃芩總黃酮提取物對(duì)成骨細(xì)胞的增殖及分化均有顯著的促進(jìn)作用，對(duì)破骨細(xì)胞功能有一定劑量依賴性的抑制作用。
文檔編號(hào)A61P19/10GK1742746SQ200510036678
公開日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2005年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月25日
發(fā)明者嚴(yán)啟新, 趙金華, 張麗娟 申請(qǐng)人:深圳海王藥業(yè)有限公司