專利名稱：異黃芩素苷在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及異黃芩素苷(ISOSCUTELLARIN 5，7，4’-三羥基黃酮-6-O-葡萄糖醛酸苷)的用途，尤其涉及在制藥領域中的用途。
背景技術：
黃芩素苷(SCUTELLARIN 5，6，4’-三羥基黃酮-7--O-葡萄糖醛酸苷)又稱燈盞乙素。具有擴張血管、增加腦血流量和心臟冠脈流量、降低血液粘度、改善微循環(huán)等作用[1]。臨床上主要用于治療腦血栓、腦梗塞、中風后癱瘓、冠心病、心絞痛等疾病。其現(xiàn)有制劑為普通片劑、注射劑和注射用粉針。但普通片劑口服生物利用度極低，只有0.4±0.19％[2]。普通注射液和粉針劑注射給藥半衰期短，體內(nèi)消除迅速[2-6]。目前國內(nèi)外研究均以提高含有化合物5，6，4’-三羥基黃酮-7-O-葡萄糖醛苷酸的制劑生物利用度及長效制劑為主。未見有關異黃芩素苷制備防治心腦血管、血栓性疾病的藥物的應用和兩種異構體在生物體內(nèi)的藥物動力學研究。其異黃芩素苷結構為 5，7，4’-三羥基黃酮-異黃芩素苷(異黃芩素苷ISOSCUTELLARIN)該化合物其分子式為C21H20O12，黃色粉末狀，分子量為464。易溶于低濃度的乙醇。根據(jù)文獻[7]可由梧桐科植物掌葉蘋婆Sterculia foetida或蘋婆Sterculia colorata的葉中提取制得。

發(fā)明內(nèi)容
1、本發(fā)明目的在于提供異黃芩素苷的新用途，即在制藥中的新應用。
2、本發(fā)明涉及異黃芩素苷作為制備治療和防治腦血栓形成、腦栓塞等腦血管意外疾病的藥物中的應用。
3、本發(fā)明涉及異黃芩素苷作為制備治療和防治腦血管疾病的藥物中的應用。
4、本發(fā)明建立了測定該化合物在人體內(nèi)血漿中的血藥濃度測定方法(LC/MS/MS)；并對異黃芩素苷進行了藥代動力學研究，本發(fā)明通過對異黃芩素苷和黃芩素苷的人體動力學研究發(fā)現(xiàn)，口服黃芩素苷后血漿濃度＜5ng/ml，且消除快不規(guī)則。而異黃芩素苷在人體的血漿維持較高的血藥濃度，療效優(yōu)于黃芩素苷；同時，在臨床試驗中，未觀察到臨床不良反應現(xiàn)象。
為了更好的理解本發(fā)明的實質，下面將用異黃芩素苷的藥理試驗及結果來說明其在制藥領域中的新應用。
采用梧桐科植物掌葉蘋婆Sterculia foetida或蘋婆Sterculia colorata的葉100kg，用相當于葉重量的15倍的60％乙醇，回流提取40分鐘，回流提取2次。合并提取液，減壓濃縮乙醇后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。正丁醇部分用大孔吸附樹脂層析，依次用水、20％、60％、80％乙醇洗脫得到5個部位，其20％乙醇層用硅膠柱層析，用氯仿∶甲醇∶水(1∶2∶2)洗脫，再用Sephadex LH220層析，甲醇∶水(1∶2)洗脫，得化合物異黃芩素苷(300mg)。
將以上提取分離得到的異黃芩素苷，以聚乙二醇6000∶聚乙二醇4000(1∶2-6)混合液作為基質，冷卻劑選擇二甲基硅油∶液體石蠟(3∶2)，原料異黃芩酸苷100g與基質500g配比，藥液溫度為60-90℃的試驗方案為最佳試驗方案；以冷卻溫度為0～5℃，滴口內(nèi)外徑為4.5/7.0mm的滴頭，滴口距冷卻液面為2-6cm，滴速20-45滴/min的滴制條件，制成每丸含異黃芩素苷10mg的滴丸。
取提取分離得到的200mg，加注射用水至1000ml，混合均勻后，分裝成1mg/5ml/支濃度的注射液裝入藥瓶中密封，消毒制成產(chǎn)品備用。
1、小鼠急性毒性試驗A、靜脈給藥小鼠LD50的測定取健康小鼠50只，體重18g～22g，按體重隨機分為5組。每組10只，♀♂各半，試驗前12小時禁食。按低比稀釋法，配制受試藥物，經(jīng)預試驗確定，最高劑量為2000mg/kg，最低劑量1000mg/kg，組間公比r＝0.84，劑量分別為2000、1680、1411.2、1185.4、995.7mg/kg；i.v給藥容積為0.2ml/10g體重。
靜脈給藥后，動物出現(xiàn)劑量依賴性中毒癥狀，可見小鼠出現(xiàn)自發(fā)活動量減少、腹臥、抽搐、掙扎等癥狀。1185.4mg/kg以上劑量組出現(xiàn)死亡動物，Bliss法計算LD50值為1509.9±142.7mg/kg，95％的可信限為1399.9～1685.3mg/kg。死亡動物及觀察結束時動物剖檢，未見明顯異常變化。給藥前、后體重變化。
靜脈注射小鼠LD50

給藥前、后體重變化表

B、經(jīng)口給藥小鼠LD50的測定預試結果顯示，試驗藥物2500和5000mg/kg給藥后連續(xù)觀察3天未見死亡動物。表明本品毒性較低，其LD50難以測出，故進行最大耐受量試驗。
給藥后，試驗組小鼠除自發(fā)活動量有所減少、腹臥外，未見明顯中毒癥狀，持續(xù)觀察7天亦未見動物死亡。給藥前、后體重變化。

C、最大耐受量試驗取健康小鼠20只，體重18∽22g，♀♂各半，試驗前12小時禁食，自由飲水。試驗設5000mg/kg試驗組，給藥濃度12.5％，給藥容積0.4ml/10g體重。
結果顯示，一次靜脈給予小鼠實驗藥物后可見小鼠出現(xiàn)自發(fā)活動量減少、腹臥、抽搐、掙扎等中毒癥狀，動物死亡呈劑量依賴性，經(jīng)Bliss法計算，LD50值為1509.9±142.7mg/kg，95％的可信限為1399.9～1685.3mg/kg。經(jīng)口給予實驗藥物后當劑量達到5000mg/kg時，動物除腹臥、自發(fā)活動有所減少外，一般狀況良好，未見死亡動物。表明本品小鼠口服LD50＞5000mg/kg。
2、對大鼠局灶性腦缺血再灌注的治療作用大鼠在麻醉的情況下，分離暴露兩側頸總動脈，用動脈夾加閉雙側頸總動脈，產(chǎn)生雙側腦缺血。缺血一定時間后可按試驗要求重新開啟動脈夾進行腦再灌流。取健康SD大鼠，雌雄各半，體重260-290克。隨機分為3組，每組15只，分別灌胃給予5％羧甲基纖維素鈉(溶媒組)、黃芩素苷20mg/kg(對照組)和異黃芩苷20mg/kg(試驗組)，每天1次，連續(xù)10天，10天后用2％的戊巴比妥鈉(40mg/kg)ip.麻醉，作頸部正中切口，用動脈夾夾閉雙側頸總動脈20min，松夾后直視血管再通，縫合皮膚切口，放回原條件進行飼養(yǎng)，統(tǒng)計各組動物腦缺血后24h死亡率。結果溶媒組死亡8只，死亡率53.3％；黃芩素苷組死亡3只，死亡率20％；異黃芩苷組死亡1只，死亡率6.6％。因此黃芩苷、異黃芩素苷對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有較強的保護作用，但異黃芩苷與黃芩苷相比有更好的保護作用。
其目的是阻斷支配腦組織的血管，可模擬與人腦卒中相近似的病理模型，以評價藥物的有效性。
3、對凝血系統(tǒng)的影響(1)對小鼠凝血時間的影響取昆明種小鼠105只，雌雄各半，20±2g，隨機均分為4組，分別給予生理鹽水和黃芩素苷(對照組)、異黃芩素苷(試驗組)分別以20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg的劑量進行灌胃，連續(xù)灌胃一周，于末次給藥后1h，以毛細玻管自小鼠眼內(nèi)眥球后靜脈從內(nèi)取血。自血液流入管內(nèi)開始計時，血液注滿后取出毛細管平放于桌上，每隔10s折斷毛細管約0.5cm，至凝血絲出現(xiàn)為止，所歷時間即為血凝時間，毛細管兩端數(shù)據(jù)的平均值為該鼠的血凝時間。
對小鼠凝血時間的影響(毛細管法)(X-±SD)

注與空白組相比，**P＜0.01
對小鼠凝血試驗表明黃芩素苷組和異黃芩素苷組都有抗凝血作用，而且尤以異黃芩素苷組作用明顯。
(2)對兔凝血酶原時間的影響取健康家兔靜脈血，與(38mg/ml)枸椽酸鈉溶液1∶9混合抗凝，3000r/min離心10min，取上清待測。測定時采用空白與不同濃度的黃芩素苷、異黃芩素苷藥液分別加入兔腦粉浸出液，生理鹽水各0.1ml，再加入兔血漿0.1ml，混勻后放人37℃水浴中溫育30s，加入0.025mol/LCaCl2溶液0.1ml并開始計時，每隔5s傾斜試管1次，記錄纖維蛋白凝固(液面不動)所需時間。
對兔凝血酶原時間的影響 注與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01黃異素苷、異黃芩素苷能明顯延長凝血時間和凝血酶原時間，有利于防治血栓形成。
4、對異丙腎上腺素(ISO)誘導沙鼠急性心肌缺血的作用取健康沙鼠48只，體重(54±14)g，雌雄兼用，隨機分為六組，每組8只，分別為(1)生理鹽水對照組(NS)；(2)異黃芩素苷組(50mg/kg)，以上各組動物分別腹腔靜脈注射給藥，連續(xù)2d，第3d顯麻醉沙土鼠，建立靜脈給藥通道，在按上述各組的藥物及量分別靜脈緩推給藥，于末次給藥后5min給予ISO2.5ug/kg，于5min內(nèi)恒速靜脈注射，觀察并紀錄15min內(nèi)不同時間點的II導聯(lián)心電圖ST段變化；(3)異黃芩素苷靜脈給藥組(50mg/kg)；于篩選合格30min后，給藥后5min再靜脈恒速注射ISO2.5ug，觀察并記錄15min內(nèi)不同時間點的II導聯(lián)心電圖ST段變化；其結果見表1。
試驗結果表明，先腹腔注射異黃芩素苷預防性給藥2天，末次靜脈給藥，與靜脈注射一次，異黃芩素苷均有較短暫、輕度的減輕ISO誘導的急性心肌缺血的作用。其抗心肌缺血的機理可能與其迅速而持久地降壓，減輕了心臟負擔，從而降低了心肌耗氧量有關。異黃芩素苷能提高心肌SOD活性，降低MDA，減少自由基在心肌的集聚，減輕了ISO對心肌的損傷作用，提示其抗心肌缺血作用可能與其抗脂質過氧化作用有關。
5、異黃芩素苷的臨床研究黃芩素苷具有擴張血管、增強動脈流量、降低血液粘度、降低外周阻力、減少血小板凝集等作用[]。臨床主要用于治療冠心病、心絞痛、心肌缺血損傷及腦血栓等。其現(xiàn)有制劑有普通片劑、注射劑和注射用粉針。普通片劑口服生物利用度極低，只有0.4±0.19％[1]。普通注射液和粉針劑注射給藥半衰期短，體內(nèi)消除迅速[2-5]。而人體藥代動力學研究尚未見報道。
根據(jù)中華人民共和國藥典二部(2000年版)規(guī)定，分別測定20名健康受試者口服受試制劑血漿中黃芩素苷、異黃芩素苷的濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，求算藥物動力學參數(shù)；并分別根據(jù)制劑中異黃芩素苷的量，為異黃芩素苷滴丸人體生物利用度研究提供必要的試驗數(shù)據(jù)(見表2)結果分析20名受試者口服含異黃芩素苷80mg的滴丸，獲得如下結果血漿中異黃芩素苷的Tmax分別為7.7±1.7h；Cmax分別為178±142ng/ml，t1/2為3.26±1.78h；用梯形法計算，AUC0-t分別為1195±1136ngh/ml，AUC0-∞分別為1263±1271ng·h/ml。
而在對黃芩素苷的人體藥動學研究時發(fā)現(xiàn)，受試者口服黃芩素苷后主要成分黃芩素苷的血漿濃度＜5ng/ml，且消除快、不規(guī)則。很難進行藥代動力學評價。與文獻[2]報道beagle犬口服大劑量黃芩素苷后，在1-3h之間達血藥濃度峰值，絕對生物利用度在0.2％-0.75％之間，提示黃芩素苷口服幾乎不吸收；靜注消除半衰期均短的試驗結果相一致。
根據(jù)一般藥動學規(guī)律，異黃芩素苷相對黃芩素苷來講，有更好的藥效；同時，在臨床試驗中，未觀察到臨床不良反應現(xiàn)象。
基于以上結果可以得出本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)本發(fā)明對已知化合物異黃芩素苷發(fā)掘了新的醫(yī)藥用途，開拓了一個新的應用領域。
(2)本發(fā)明的異黃芩素苷安全無毒，藥理作用強，藥效好，預示著有很好的藥用前景。
(3)本發(fā)明的產(chǎn)品原料來源豐富、價廉、以葉作為提取部位能充分資源、制備工藝簡單，未見毒副作用。既可做成口服制劑如片劑、滴丸、膠囊劑等制劑；也可做成靜脈注射制劑如粉針劑、靜脈注射液等。
(4)本發(fā)明的產(chǎn)品制成的藥物具有能不同程度地降低腦含水量和MDA含量，提高SOD、CAT和GSH-Px活性、保護Na+，K+-ATP酶活性。提示異黃芩素苷可通過保護腦組織抗氧化酶的活性，抑制脂質過氧化反應，減輕自由基對腦組織的損害；能降低腦組織的含水量，抑制腦組織Na+，K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的降低。提示該藥可通過保護ATPase活性對缺血再灌注腦組織產(chǎn)生保護作用。其作用優(yōu)于黃芩素苷。
(5)本發(fā)明的產(chǎn)品制成的藥物能明顯改善尿激溶栓后血小板聚集的TXB2的變化，并升高血中組織型纖溶酶原激活物、抗凝血因子的濃度，降低纖溶酶原激活物的抑制物(PAI)濃度，提高急性冠狀動脈血栓形成時應用尿激素酶栓治療的再通率。可減少血小板數(shù)，降低血小板聚集，促進纖溶活性，抑制凝血酶活性等，具有抗凝及纖溶效應。其抗凝血作用優(yōu)于黃芩素苷。
(6)本發(fā)明的產(chǎn)品所制成的藥物具有抗心肌缺血的作用。能提高心肌SOD活性，降低MDA，減少自由基在心肌的集聚，減輕了ISO對心肌的損傷作用，提示其抗心肌缺血作用可能與其抗脂質過氧化作用有關。
(7)本發(fā)明的產(chǎn)品進行了臨床試驗，采用液相色譜-質譜-質譜聯(lián)用法測定了20名受試者口服異黃芩素苷后不同時刻血漿中的血藥濃度，繪制了血藥濃度-時間曲線。根據(jù)血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，采用梯形法計算AUC值以半對數(shù)作圖法，由消除相末端的濃度點計算t1/2，并求出主要藥物動力學參數(shù)。與其黃芩素苷比較，具有更好的藥物動力學參數(shù)。為藥物的臨床療效奠定了理論基礎。同時，在臨床試驗中，未觀察到臨床不良反應現(xiàn)象。
具體實施例方式
以下將描述本發(fā)明的幾個實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。
實施例1采用梧桐科植物掌葉蘋婆Sterculia foetida或蘋婆Sterculia colorata的葉100kg，用相當于葉重量的15倍的60％乙醇，回流提取40分鐘，回流提取2次。合并提取液，減壓濃縮乙醇后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。正丁醇部分用大孔吸附樹脂層析，依次用水、20％、60％、80％乙醇洗脫得到5個部位，其20％乙醇層用硅膠柱層析，用氯仿∶甲醇∶水(1∶2∶2)洗脫，再用Sephadex LH220層析，甲醇∶水(1∶2)洗脫，得化合物異黃芩素苷。以聚乙二醇6000∶聚乙二醇4000(1∶2-4)混合液作為基質，冷卻劑選擇二甲基硅油∶液體石蠟(3∶2)，原料異黃芩酸酐與基質以1∶4配比，藥液溫度為60-80℃，以冷卻溫度為0～5℃，滴口內(nèi)外徑為4.5/7.0mm的滴頭，滴口距冷卻液面為3-6cm，滴速25-35滴/min的滴制條件，制成每丸含異黃芩素苷10mg的滴丸。
實施例2取按實施例1的方法制備的異黃芩素苷1000g，加適量的注射用水，用碳酸鈉調(diào)PH值至7，攪拌溶解，再加相當于異黃芩素苷10-15％量注射用的甘露醇，除菌濾過，測定含量，分裝至10mg/支，封口，即得。
實施例3取實施例1的方法制備的異黃芩素苷，采取本技術領域公知的輸液劑制備方法，制備成異黃芩素苷氯化鈉注射液，其規(guī)格為250ml異黃芩素苷20mg與氯化鈉2.25g制備成異黃芩素苷葡萄糖注射液，其規(guī)格為250ml異黃芩素苷20mg與葡萄糖12.5g。
實施例4取實施例1方法制備的異黃芩素苷260g、乳糖460g、淀粉420g、滑石粉148g。采取本技術領域公知的片劑制備方法，在適宜容器中混合所有組分，制成顆粒，再加入硬脂酸鎂2g，混勻，用9/32時標準凹沖壓片，10片重量為1.3g，其規(guī)格為20mg/片。
實施例5取實施例1方法制備的異黃芩素苷l00g、10％羥丙甲基纖維素32ml。采取本技術領域公知的膠囊制備方法，制成1000粒膠囊，其規(guī)格為20mg/粒。
實施例6查閱國內(nèi)外相關文獻，未發(fā)現(xiàn)有異黃芩素苷臨床試驗的報道。本發(fā)明進行了人體藥代動力學研究，并用液相色譜-串聯(lián)質譜(LC/MS/MS)分析方法測定了人體中異黃芩素苷血漿濃度，并用異黃芩素苷的藥動學行為對其制劑進行療效評價。
血漿樣品的分析方法血漿樣品處理向500μl血漿中分別加入100μl甲醇，100μl內(nèi)標溶液(黃芩苷400ng/ml)和200μl水，混勻；加3ml提取溶劑乙酸乙酯，渦流混合1min，往復振蕩10min(240次/分)，離心5min(3500rpm)，分取上層有機相于另一試管中，于40℃氮氣流下吹干，殘留物加入150μl流動相溶解，渦流混合，取20μl進行LC/MS/MS分析。
色譜條件流動相為甲醇∶水∶甲酸(70∶30∶0.5，v/v/v)，流速為0.50ml/min，柱溫25℃。
質譜條件離子源為ESI源；源噴霧電壓為4kV；加熱毛細管溫度為320℃；鞘氣(N2)壓力25Arb；輔助氣(N2)流量3Arb；碰撞氣(Ar)壓力1.0mTorr；碰撞誘導解離(CID)電壓均為25eV；正離子方式檢測；掃描方式為選擇反應監(jiān)測(SRM)，用于定量分析的離子反應分別為m/z463→m/z287(SCUTELLARIN和ISOSCUTELLARIN)和m/z447→m/z271(黃芩苷)；掃描時間為0.3s。相應的二級全掃描質譜圖見

圖1。
結果分析20名受試者口服含異黃芩素苷80mg的受試制劑和參比制劑(黃芩素苷)后，獲得如下結果血漿中異黃芩素苷的Tmax分別為7.7±1.7h；Cmax分別為178±142ng/ml，t1/2為3.26±1.78h；用梯形法計算，AUC0-t分別為1195±1136ng.h/ml，AUC0-∞分別為1263±1271ng.h/ml。而黃芩素苷的血漿濃度＜5ng/ml，且消除快、不規(guī)則。
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1.異黃芩素苷在制備治療或預防腦血栓、腦梗塞、腦溢血等所致的后遺癥藥物中的應用；
2.異黃芩素苷在制備治療或預防冠心病、心絞痛藥物中的應用；
3.異黃芩素苷在制備治療或防治心血管疾病的藥物中的應用。
4.為含異黃芩素苷或黃芩素苷藥品在人或動物體內(nèi)藥物動力學研究提供了可行的研究方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及異黃芩素苷(ISOSCUTELLARIN 5，7，4’－三羥基黃酮－6－O－葡萄糖醛酸苷)在制藥領域中的新用途。該產(chǎn)品具有擴張血管、增加動脈流量、降低血液粘度、降低外周阻力、減少血小板計數(shù)和抑制血小板凝集等作用。用于治療或預防冠心病、心絞痛、心肌缺血損傷及腦血栓形成、腦栓塞、腦溢血等所致后遺癥癱瘓病人等。
文檔編號A61P9/00GK1823798SQ20051000746
公開日2006年8月30日 申請日期2005年2月22日 優(yōu)先權日2005年2月22日
發(fā)明者史關正 申請人:史關正