專利名稱：水凝膠用于培養(yǎng)軟骨細胞的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及纖維素水凝膠用于軟骨細胞的三維培養(yǎng)和在軟骨位點用于其植入的用途。
背景技術(shù)：
軟骨是一種特殊的非血管化、非神經(jīng)支配的堅固且彈性的支持性結(jié)締組織。其存在于肋骨、胸骨、鼻和耳中，也存在于關(guān)節(jié)中。軟骨包含被稱為軟骨細胞的特殊細胞和主要由膠原纖維和蛋白聚糖組成的胞外基質(zhì)(ECM)。
關(guān)節(jié)軟骨可能是炎性源(風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎)、創(chuàng)傷源或與衰老相關(guān)(關(guān)節(jié)病)的眾多損害的部位。這些軟骨病變的建立導(dǎo)致較長期的胞外基質(zhì)劣化和細胞性降低。不存在血管化和軟骨細胞增殖使得這些組織具有低修復(fù)能力，這導(dǎo)致這些分解代謝過程成為不可逆過程。由于人口的老化，這些退化性病變目前影響了很大一部分比例的人口，因而其成為了一個主要的公共健康問題。在這方面，多年來科學(xué)界對再生功能性軟骨組織的方法很感興趣。
已經(jīng)提出打磨軟骨成形術(shù)、微骨折或者海綿化(spongialisation)外科技術(shù)，目的是刺激軟骨的差的自發(fā)修復(fù)性能(Hunziker，2002)。這些使得軟骨下骨來源的血凝塊形成的技術(shù)導(dǎo)致形成保持纖維性和暫時性(transitoire)的軟骨組織(Shapiro等，1993)。同時也已經(jīng)研究了用于移植具有軟骨形成性質(zhì)的組織的技術(shù)。使用骨膜或軟骨膜自體移植和骨軟骨組織(自體骨軟骨鑲嵌移植成形術(shù))已經(jīng)可以在植入后新生軟骨類型的組織(Hunziker，2002)。這些技術(shù)的眾多局限性(移植物的不穩(wěn)定性、鈣化、臨床效果的低再現(xiàn)性)和它們對修復(fù)病灶損傷的適應(yīng)癥的限制最近促使開發(fā)研究了新的組織工程技術(shù)，該技術(shù)適用于軟骨的創(chuàng)傷病癥。
Brittberg等首先提出了基于自體軟骨細胞移植的修復(fù)方法(Brittberg等，1994)。該方法以三個步驟來進行首先從非承重區(qū)移出軟骨片段以分離軟骨細胞，其然后體外繁殖為單層，之后再植入損傷處的骨膜片下。其結(jié)果顯示出修復(fù)了軟骨缺損，但是患者必須忍受兩次大的外科手術(shù)操作。而且仍然要確定其單層擴增后的細胞表型。
也已經(jīng)研究了大量的植物或動物來源的三維基質(zhì)，例如膠原海綿、纖維蛋白、透明質(zhì)酸或藻酸鹽(Cancedda等，2003。與使用這些生物材料相關(guān)的病毒傳播的風(fēng)險以及在臨床前試驗期間觀察到的炎性反應(yīng)促使當(dāng)前研究朝著完全合成的生物材料的方向發(fā)展(Hunziker，2002)。已經(jīng)提出了使用聚合物，例如聚乳酸、聚乙醇酸、碳纖維、聚酯-氨基甲酸酯、達可綸和特氟隆，并且體外用于軟骨細胞或者間充質(zhì)細胞的3D培養(yǎng)。在軟骨位點植入后，這些合成聚合物中的一些已引起免疫響應(yīng)或炎癥(Cancedda等，2003)。
可注射的水凝膠組合物尤其描述于專利US 6,129,761中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人目前已經(jīng)證實了在隨著pH而自交聯(lián)的水凝膠中三維培養(yǎng)軟骨細胞以便在軟骨位點中植入的益處。
所用水凝膠是隨著pH而自交聯(lián)的水凝膠，它由羥乙基纖維素(HEC)或羥丙基甲基纖維素(HPMC)水溶液形成，在該羥乙基纖維素(HEC)或羥丙基甲基纖維素(HPMC)上接枝有允許在HEC或HPMC鏈之間形成共價鍵的硅烷基團。
在國際專利申請WO 97/05911中，這種類型的聚合物材料被描述為與無機填料相結(jié)合。
這種材料優(yōu)選由下述簡化式的聚合物組成(HEC或HPMC)-O-X-Si(OZ)3其可以通過羥乙基纖維素(HEC)或羥丙基甲基纖維素與式(1)化合物反應(yīng)而獲得
XSi(OZ)3(1)其中X表示鹵原子或具有環(huán)氧官能團的烴基，尤其是C2-20烴基，Z選自氫原子、堿金屬和烷基，尤其是C1-5烷基。
式(1)化合物例如可以是(3-縮水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷 在堿性介質(zhì)中，有機硅化合物接枝到HEC或HPMC上，環(huán)氧化物開環(huán)，并且甲氧基硅烷基團水解形成下述簡化式的聚合物 該聚合物優(yōu)選是硅烷化的HPMC聚合物。
這種聚合物在pH高于或等于約12.4的水溶液中是穩(wěn)定的。酸化該溶液導(dǎo)致粘度逐漸降低并且形成水凝膠。這種物理現(xiàn)象對應(yīng)于聚合物的交聯(lián)，該交聯(lián)通過下述步驟進行(i)將硅烷醇鹽基團轉(zhuǎn)化成硅烷醇基團 然后通過下述步驟形成三維網(wǎng)絡(luò)(ii)一個硅烷醇與另一個硅烷醇的縮合 和/或(iii)硅烷醇與纖維素醚或取代基的環(huán)上羥基的縮合 這種由于聚合物水溶液中pH降低而引起的共價類型的交聯(lián)是可逆的，當(dāng)介質(zhì)的pH增加時，水凝膠再溶解。因此，在使用前，合成的聚合物可以是可溶解于堿性氫氧化鈉溶液中的粉末的形式。凝膠化pH為7至12，這取決于所希望的交聯(lián)速率。
得到的凝膠通過高壓滅菌法滅菌(例如，在121℃下20分鐘)。
在生物利用之前，堿性水溶液中的聚合物在交聯(lián)之前也可以與生理學(xué)緩沖溶液混合。在整個混合物的交聯(lián)之前，最終混合物的pH因而適應(yīng)于所希望的處理時間。這個交聯(lián)時間可通過振蕩流變測定法測定，并且可以隨著這種混合物的參數(shù)(主要是pH和溫度)而在5分鐘至5天之間變化(Bourges等，2002a；Bourges等，2002b)。
為了提供用于特定應(yīng)用的適宜的交聯(lián)速率，希望硅烷醇鹽或者硅烷醇堿金屬或者銨鹽的前體類型的攜帶硅的側(cè)基占聚合物總干重的0.5％至5％。
本發(fā)明涉及隨著pH而自交聯(lián)的這種類型的硅烷化HEC或硅烷化HPMC水凝膠用于三維體外培養(yǎng)軟骨細胞的用途。
所使用的水凝膠尤其具有下述優(yōu)點-其與被整合(intégré)到其內(nèi)部的軟骨細胞是生物相容的；-軟骨細胞緊密地整合到水凝膠中；-通過單層擴增去分化的軟骨細胞在水凝膠內(nèi)再分化，并且保持軟骨細胞的特性；-所述交聯(lián)可通過添加到水凝膠和軟骨細胞的混合物中的生物緩沖液的pH來控制。
在水凝膠中培養(yǎng)的細胞優(yōu)選為人或動物的軟骨細胞，優(yōu)選患有軟骨損傷的患者的自體軟骨細胞。這些細胞可以是例如取自軟骨組織，例如來自關(guān)節(jié)軟骨或者來自鼻軟骨的一部分。
在水凝膠中培養(yǎng)的這些細胞也可以是能夠進行軟骨形成性分化的未分化細胞。因此也包括間充質(zhì)干細胞或來自脂肪組織的干細胞。前者特別地可以從骨髓中取出得到(通常通過使用注射器從骨小梁例如長骨、髂嵴抽吸)，后者通過吸脂作用得到(通常是真空抽吸脂肪物質(zhì))。
然后，在存在水凝膠和允許軟骨細胞表型誘導(dǎo)的條件下，培養(yǎng)這些未分化的細胞。這些條件優(yōu)選為在常規(guī)培養(yǎng)基(DMEM或MEM)中的培養(yǎng)物，如果需要，給其中加入谷氨酰胺和抗生物，優(yōu)選自體的、動物的或人類血清、或血清代用品和其它的軟骨形成添加劑。實例具體地包括胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、抗壞血酸、TGF-β、IGF-1、BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)、地塞米松、亞油酸、BSA(牛血清清蛋白)或丙酮酸酯。也可使用其它添加劑以誘導(dǎo)細胞的軟骨形成分化。培養(yǎng)物優(yōu)選在37℃下和濕潤條件下產(chǎn)生，并存在需要時可改變的氧濃度。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺氧是軟骨細胞表型產(chǎn)生的重要原因。
本發(fā)明還涉及一種用于制備在水凝膠中整合的細胞的復(fù)合物(complexe)的體外方法，該復(fù)合物用于注入軟骨位點中，其中所述方法包括在具有適合水凝膠交聯(lián)的pH的生物緩沖液中，在適合軟骨細胞，任選地由所述未分化細胞的分化得到的軟骨細胞在水凝膠中整合和三維培養(yǎng)的條件和時間周期下，將軟骨細胞或能夠進行軟骨形成性分化的未分化細胞與隨著pH變化而自交聯(lián)的硅烷化HEC或HPMC水凝膠進行體外混合。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用任意的生物緩沖液。實例包括磷酸鹽緩沖液(PBS，磷酸鹽緩沖鹽溶液)、HEPES或TRIS緩沖液。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意生物培養(yǎng)基，例如DMEM培養(yǎng)基或α-MEM培養(yǎng)基(α最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。
優(yōu)選地，所述方法包括下述的體外步驟-在固體載體例如培養(yǎng)皿上的軟骨細胞的單層擴增；-通過其單層擴增而去分化的擴增的軟骨細胞的收集；-在具有適合水凝膠交聯(lián)的pH的生物緩沖液中將去分化的擴增的軟骨細胞與水凝膠混合，導(dǎo)致軟骨細胞在水凝膠內(nèi)整合并導(dǎo)致其再分化。
由硅烷化HEC或HPMC形成的水凝膠的流變學(xué)性質(zhì)使得其能夠被注射到植入位點，由此促進了非損傷外科手術(shù)的軟骨細胞的向量化(vectorisation)。
在其中培養(yǎng)軟骨細胞的水凝膠可被植入通常被軟骨占據(jù)的損傷的位點。
目標損傷可以是與創(chuàng)傷后遺癥相關(guān)的病灶軟骨物質(zhì)的損失，或者更一般地是任意骨關(guān)節(jié)的或人造的(plastique)軟骨病狀或損失。
本發(fā)明可應(yīng)用于所有軟骨組織的工程，所述軟骨組織包括下述的類型-透明軟骨(存在于鼻中隔、喉、氣管環(huán)、關(guān)節(jié)、或者肋骨的胸骨端)；-纖維軟骨(存在于椎間盤、特殊的關(guān)節(jié)軟骨和恥骨聯(lián)合)；-彈性軟骨(存在于耳廓、外耳道、會厭、咽鼓管和喉軟骨)。
椎間盤的修復(fù)是特別希望的。腰痛的病因未知，但可能歸因于椎間盤和其不可避免的和衰老有關(guān)的退化。椎間盤是纖維軟骨結(jié)構(gòu)，其由四個位于相鄰錐體之間的同心組織組成。外層是外部纖維環(huán)，其由明顯定向的膠原纖維組成。內(nèi)部纖維環(huán)具有較低膠原密度，比外部環(huán)的組織結(jié)構(gòu)差一些。過渡區(qū)是將內(nèi)部環(huán)與髓核分開的薄的纖維組織區(qū)，髓核為形成核心的膠性中央?yún)^(qū)。椎間盤為低血管化(hypovascularisé)的，具有有限的神經(jīng)分布。在成年人中，椎間盤依靠營養(yǎng)物和代謝物的擴散來提供養(yǎng)料。椎間盤包含在主要由水、蛋白聚糖、膠原和非膠原蛋白組成的大量胞外基質(zhì)中內(nèi)含的相對少量的細胞。椎間盤的細胞合成這些大分子，并維護和修復(fù)這些胞外基質(zhì)。在成年人中，軟骨細胞是唯一的髓核細胞。內(nèi)部纖維環(huán)、過渡區(qū)和相鄰錐體的軟骨板也包含軟骨細胞，而外部環(huán)主要包含成纖維類型的細胞。在所有個體中都存在一定程度的椎間盤退化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了年齡與椎間盤退化之間的清楚的關(guān)聯(lián)性。從生命的第二個十年開始已經(jīng)觀察到了該退化。由于后天的和遺傳的因素，有椎間盤癥狀的人加速了正常衰老過程。
因此，本發(fā)明也涉及治療人體或動物體的方法，包括通過注入如上所述的水凝膠來給藥，該水凝膠例如通過使用上述方法事先已經(jīng)體外植入了軟骨細胞。
可以使用包括可殺菌注射器和配有一次性注射器內(nèi)芯的連接件的系統(tǒng)來進行注射，例如使用HAWE NEOS DENTAL銷售的注射器，其包括通過高壓滅菌法滅菌的注射器(標號440，注射器Hawe-Centrix C-RR，Mark III)和連接件(標號445)。
下述的附圖和實施例用于闡述本發(fā)明，但不限制其范圍。


圖1A至1C示出了在對照條件下(不存在水凝膠)、或者與si-HPMC水凝膠對照，或者在存在放線菌素D(5μg/ml)下培養(yǎng)24、48和72小時后軟骨細胞的MTS活性。SW1353(圖1A)、C28/I2(圖1B)和人類鼻軟骨細胞(圖1C)。在每個時期與對照組相比，*p＜0.001。
圖2A至2C示出了在對照條件下(不存在水凝膠)、或者與si-HPMC水凝膠對照，或者在存在放線菌素D(5μg/ml)下培養(yǎng)24、48和72小時后軟骨細胞的計數(shù)。SW1353(圖2A)、C28/I2(圖2B)和人類鼻軟骨細胞(圖2C)。在每個時期與對照組相比，*p＜0.001。
具體實施例方式
實施例實施例1水凝膠的制備材料-HPMC E4M(Colorcon-Dow Chemical，法國)-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)(Acros，比利時)-HEPES(Sigma-Aldrich，St Louis，USA)-NaOH(VWR Interna tional，F(xiàn)ontenay-sous-Bois，法國)-NaCl(VWR International)-HCl 0.1M(Sigma Aldrich).
-胎兒腓腸血清(FCS)(Dominique Dutscher，Brumath，法國).
a)硅烷化羥丙基甲基纖維素(Si-HPMC)粉末的合成以用量為240克的HPMC進行合成。所選的多糖是E4M。在6升燒瓶中，在有機溶劑中的非均相介質(zhì)中使用環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)進行合成(Bourges等，2002)。合成是在沸騰3小時下進行的。硅烷化HPMC首先用烘箱干燥1夜，然后冷凍干燥(Christ Alpha 1-4ST)。
b)硅烷化羥丙基甲基纖維素溶液的制備將6克Si-HPMC粉末溶解在200ml的0.2M的NaOH溶液中。攪拌該混合物48小時。然后在0.09M的NaOH溶液中透析Si-HPMC溶液16小時。之后，在0.09M NaOH溶液中再透析2小時。再將該3％Si-HPMC溶液等分并蒸汽滅菌(121℃，30分鐘)。
c)誘導(dǎo)水凝膠交聯(lián)在層流凈化罩下，通過混合7.5ml的Si-HPMC溶液和7.5ml的HEPES緩沖液，并加入10％的FCS來即刻制備用于細胞培養(yǎng)的水凝膠。HEPES緩沖液通過將3.1g的HEPES和0.8g的NaCl溶解在0.03M HCl溶液中來制備。然后將該溶液等分并蒸汽滅菌(121℃，30分鐘)。
渦旋攪拌該HEPES/Si-HPMC混合物15秒，然后以1200rpm離心2分鐘。將該混合物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中。1小時后加入培養(yǎng)基。
d)通過流變學(xué)物理表征水凝膠裝置和方法為了表征水凝膠的交聯(lián)，本發(fā)明人測量了兩個流變學(xué)參數(shù)分散模量G″(液體的特征)和保持模量G′(固體的特征)。通過使用裝備有直徑為60mm和角度為10的平面錐體(C60/1titan平面錐體，ThermoHaake)的流變儀來進行這種測量。切斷面與板之間的間距為0.053mm。在37℃的溫度下，在振蕩模式下以3種振蕩頻率(1Hz，3.2Hz和10Hz)并在1帕斯卡的強加應(yīng)力下測量，時間為1,200,000秒(13.8天)。結(jié)果用Pa表示。
結(jié)果在水凝膠的制備過程中，其具有粘性液體的特性。在其交聯(lián)期間，它的物理特性朝著凝膠的特性發(fā)展。在實施例1中呈現(xiàn)的根據(jù)優(yōu)選實施方案制備的水凝膠在其交聯(lián)過程完成以后(10天)由1.5％的干聚合物和98.5％的水(水含量與軟骨的水含量相當(dāng))組成。水凝膠的計算的網(wǎng)格(maille)尺寸(0.22μm)看來小于細胞的尺寸。
為了確定水凝膠的物理性質(zhì)，例如與交聯(lián)過程的開始相對應(yīng)的凝膠點、交聯(lián)時間和水凝膠的網(wǎng)格尺寸，用三種不同的頻率測定液體分量(G″)和彈性分量(G′)隨時間的變化。G′/G″對因而對應(yīng)于每個頻率。描繪每對的TanΔ，這三個曲線相交于一點凝膠點。水凝膠的交聯(lián)在其制備后33分鐘開始，完成于244小時(10天)后，在該完成時間，彈性分量(G1)穩(wěn)定在數(shù)值為310Pa的水平。彈性分量的這個數(shù)值使得我們可以計算水凝膠的網(wǎng)格尺寸。
ξ=(KTG′)1/3=(1.38×10-23×300310)1/3=(4,14×10-21310)=23.7]]>納米在上述制備條件下，水凝膠的平均統(tǒng)計網(wǎng)格尺寸(Xi)為0.023μm。
表13％Si-HPMC水凝膠的流變學(xué)表征的結(jié)果

實施例2水凝膠的細胞毒性試驗材料和方法2.1細胞培養(yǎng)a)軟骨細胞系材料-Dulbecco′s改性Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Invitrogen公司，Paisley，UK).
-Ham′s F12營養(yǎng)培養(yǎng)基(Invitrogen公司).
-青霉素/鏈霉素(Invitrogen公司)-L-谷氨酰胺(Invitrogen公司)-胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen公司)。
本發(fā)明人使用的人軟骨細胞系SW1353和C28/I2來自人軟骨肉瘤(Mengshol等，2000)和來自被類人猿病毒40的T抗原無限增殖化的人肋骨軟骨(Goldring等，1994)。在包含5％CO2的濕潤氣氛和37℃下，在DMEM和Ham′s F12體積/體積混合物中培養(yǎng)這些細胞，向該混合物中添加10％的FCS、1％的青霉素/鏈霉素和1％的L-谷氨酰胺(完全DMEM/F12)。
每隔一天全部更新培養(yǎng)基。一旦細胞達到80至90％的匯合，則用2ml的胰蛋白酶(0.025％)/EDTA(0.01％)處理它們。接著，在37℃下培養(yǎng)3分鐘，收集胰蛋白酶/EDTA溶液，在8ml的完全DMEM/F12培養(yǎng)基存在下進行離心處理(8分鐘，1200rpm)。在除去上清液后，用10ml的完全DMEM/F12重組細胞沉淀物(culot)。然后對細胞計數(shù)，并且以10,000細胞/cm2的密度分布于25cm2的瓶中。
b)初級軟骨細胞-人鼻軟骨細胞的分離材料-Hank′s平衡鹽(HBSS，Invitrogen公司)-蛋白酶(Pronase，Sigma-Aldrich)-IV型膠原酶(Sigma-Aldrich)。
得到經(jīng)過再造鼻整形術(shù)的患者通知許可后，取出人鼻軟骨。在層流凈化罩下，在Hank′s平衡鹽(HBSS)中洗滌鼻軟骨5次，切片。然后，于37℃下在包含1mg/ml蛋白酶的HBSS中培養(yǎng)軟骨切片30分鐘。隨后在HBSS中洗滌切片3次，再在包含0.625mg/ml的膠原酶的完全DMEM(10％FCS，1％青霉素/鏈霉素和1％L-谷氨酰胺)中攪拌培養(yǎng)4小時。將上清液以1400rpm離心5分鐘。在HBSS中洗滌沉淀物1次，離心(8分鐘，1200rpm)，并且再懸浮于10ml的完全DMEM中。對細胞計數(shù)，將細胞轉(zhuǎn)移到25cm2瓶中，細胞密度為10,000細胞/cm2。在37℃和含有5％CO2的濕氣氛中培養(yǎng)細胞。每隔一天更新培養(yǎng)基。一旦細胞達到80至90％的匯合，則用上面描述的胰蛋白酶/EDTA處理。
-兔關(guān)節(jié)軟骨細胞的分離材料-透明質(zhì)酸酶(Sigma-Aldrich)-胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)
-溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)的II型膠原酶(290U/mg，Sigma-Aldrich)-細胞篩(Falcon，F(xiàn)ranklin Lakes，USA)。
正如Ghayor等(2000)在以前所描述的，在麻醉后通過頸脫位法殺死12或13天齡的新生兔子。在層流凈化罩下，切下前爪和后爪，剝離它們的軟組織。然后使其膝關(guān)節(jié)和肩關(guān)節(jié)脫位。使用解剖刀將關(guān)節(jié)軟骨切成薄切片，得到的切片置于HBSS中。首先于37℃下在12ml包含0.05％透明質(zhì)酸酶的HBSS中培養(yǎng)這些切片10分鐘，然后于37℃下在6ml包含0.2％胰蛋白酶的HBSS中培養(yǎng)切片15分鐘。在HBSS中洗滌2次后，將切片轉(zhuǎn)移到包含0.2％膠原酶的HBSS中，在37℃下培養(yǎng)30分鐘。
在包含0.03％膠原酶的完全DMEM溶液中培養(yǎng)15小時，使切片經(jīng)過最后的消化(digestion)步驟。用細胞篩過濾消化產(chǎn)物，收集并離心(8分鐘，1200rpm)。再將細胞沉淀物懸浮于20ml的完全DMEM中。對細胞計數(shù)，將細胞轉(zhuǎn)移到25cm2瓶中，細胞密度為10,000細胞/cm2。最后，在37℃下和含有5％CO2的濕氣氛中培養(yǎng)細胞。每隔一天更新培養(yǎng)基。一旦細胞達到80至90％的匯合，則用上面描述的胰蛋白酶/EDTA處理。
2.2.水凝膠細胞毒性的研究a)試驗條件材料-Corning-Costar 24-孔培養(yǎng)皿(Corning BV，Schiphol-Rijk，荷蘭)。
-放線菌素D(Sigma-Aldrich)-DMSO(Sigma-Aldrich)-甲基四唑鹽(MTS)(Cell Titer 96 MTS，Promega公司，Madison，WI)。
-苯基甲基亞砜(PMS)(Sigma-Aldrich)。
-磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，Invitrogen公司)
為了確定水凝膠的細胞毒性，將人初級軟骨細胞，SW1353和C28/I2細胞分布于24-孔培養(yǎng)皿中，密度為10,000細胞/cm2。在37℃和含有5％CO2的濕氣氛中培養(yǎng)24小時后，在存在(500μl Si HPMC/孔)或不存在(500μl完全培養(yǎng)基)水凝膠下培養(yǎng)細胞24、48和72小時。在不存在水凝膠下培養(yǎng)的細胞還用放線菌素D(5μg/ml)或其賦形劑(DMSO)處理，得到陽性細胞毒性對照。
b)MTS試驗這種比色試驗用于測定活細胞的線粒體在甲中氧化四唑鹽MTS的能力。形成的有色產(chǎn)物與線粒體的脫氫酶活性成正比。因此，吸收度測定能夠定量細胞生存力。在上文描述的條件下培養(yǎng)24、48和72小時后，用完全培養(yǎng)基洗滌細胞，在37℃下，在包含48μg/ml PMS和2mg/ml MTS的100μl MTS試劑的存在下培養(yǎng)細胞1小時。用微量培養(yǎng)板讀出器(MRX，Dynatech Laboratories，VWR International)在490nm進行吸收度測定。結(jié)果以相對于對照條件(不存在水凝膠下培養(yǎng)的細胞)的MTS活性的百分數(shù)來表示。
c)細胞計數(shù)在上面規(guī)定的條件下培養(yǎng)24、48和72小時后，吸出含有或不含水凝膠的培養(yǎng)基，用200μl的胰蛋白酶/EDTA代替。在37℃下和含有5％CO2的濕氣氛中培養(yǎng)細胞2分鐘。然后收集細胞，并在2ml完全培養(yǎng)基中離心處理(8分鐘，1200rpm)。將沉淀物再懸浮于2ml完全培養(yǎng)基中。用臺盼藍溶液(在PBS中，0.04％)對Malassez細胞進行活體染色后，對細胞計數(shù)。結(jié)果以每孔的細胞總數(shù)表示。
結(jié)果2.3人類鼻軟骨細胞的表征為了表征分離的人類鼻軟骨細胞的表型，本發(fā)明人在分離之后和單層培養(yǎng)期間通過RT/PCR研究軟骨細胞表型的特定標記的表達。該研究表明新分離的鼻軟骨細胞(P0)表達膠原II、聚集蛋白聚糖和膠原X，以及膠原I。在不同的途徑中，本發(fā)明人觀察到這些各種基因表達的變體。在P0和P3之間，II型膠原的表達減少。在P0和P1之間，聚集蛋白聚糖的表達降低。新分離的軟骨細胞少量表達膠原X，在P3，不再能檢測到膠原X的表達。相反，在P2和P3之間，I型膠原的表達顯著增加。
這些結(jié)果表明新分離的鼻軟骨細胞表達膠原II、聚集蛋白聚糖和膠原X。在單層培養(yǎng)物中，這些軟骨細胞標記的表達下降，其與I型膠原表達的明顯增加相關(guān)聯(lián)。
2.4水凝膠的細胞毒性a)測定受到凝膠影響后培養(yǎng)的軟骨細胞的MTS活性為了確定水凝膠對軟骨細胞的細胞毒性效果，本發(fā)明人分析在Si-HPMC水凝膠影響下培養(yǎng)24小時、48小時和72小時后，SW1353和C28/I2細胞系和人類鼻軟骨細胞的MTS活性。
結(jié)果表明MTS活性沒有由于存在水凝膠而改變對于SW1353，C28/I2軟骨細胞和人類鼻軟骨細胞，在對照培養(yǎng)條件和在受到水凝膠影響后的培養(yǎng)條件之間，沒有觀察到明顯的不同。另一方面，在這種情況下作為陽性細胞毒性對照使用的轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D從24小時開始引起MTS活性顯著降低。在存在放線菌素D的24小時后，SW1353和C28/I2軟骨細胞和從人類鼻軟骨分離的軟骨細胞的MTS活性分別降低了72％、69％和86％(圖1A至1C)。
這些結(jié)果表明水凝膠不影響SW1353和C28/I2軟骨細胞的MTS活性，也不影響人類鼻軟骨細胞的MTS活性。
b)臺盼藍計數(shù)為了確定水凝膠對細胞增殖的影響，本發(fā)明人通過臺盼藍染色來進行細胞計數(shù)。這種染色使得能夠區(qū)分活細胞(白色)和死細胞(藍色)。于水凝膠中培養(yǎng)SW1353和C28/I2細胞系及人類鼻軟骨細胞24小時、48小時和72小時后進行計數(shù)(圖2A至2C)。
在對照條件下和在Si-HPMC影響下進行培養(yǎng)期間，SW1353和C28/12軟骨細胞及人類鼻軟骨細胞的數(shù)目沒有觀察到顯著的不同。另一方面，從24小時開始，放線菌素D引起細胞數(shù)目的明顯降低。用放線菌素D培養(yǎng)24小時后，SW1353軟骨細胞的數(shù)目降低了88％，C28/I2軟骨細胞的數(shù)目降低了81％。在用放線菌素D處理24小時后，人類鼻軟骨細胞降低了43％。
這些結(jié)果表明水凝膠沒有改變SW1353軟骨細胞、C28/I2軟骨細胞或人類鼻軟骨細胞的增殖。
實施例3在水凝膠中培養(yǎng)軟骨細胞3.1三維培養(yǎng)軟骨細胞的觀察材料和方法實驗條件材料-細胞示蹤綠(CTG)(分子探針，Leiden，荷蘭)。
-乙啡啶(ethidium)同型二聚體-1(EthD-1)(分子探針)。
以1百萬細胞/ml水凝膠的比例將兔關(guān)節(jié)軟骨細胞、SW1353和C28/I2細胞懸浮在水凝膠中。將500μl的這種混合物放置在24-孔培養(yǎng)基的孔中。然后，在完全培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)細胞48小時、96小時、1周和2周。同時，通過加入包含5μg/ml放線菌素D的溶液進行陽性細胞死亡對照。使用細胞示蹤綠(CTG)和乙啡啶同型二聚體1(EthD-1)觀察水凝膠內(nèi)培養(yǎng)的細胞。CTG是無色產(chǎn)品，其可自由地擴散經(jīng)過細胞膜。其隨后在細胞質(zhì)中通過谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化成不能離開細胞的熒光產(chǎn)物。在活細胞中，CTG產(chǎn)生綠色熒光。EthD-1是DNA插入試劑，與核酸結(jié)合后，其產(chǎn)生的熒光增加40倍。其僅能穿透具有細胞膜損傷的細胞。這兩類染色劑的組合使用可以使活細胞(綠色染色)和死細胞(紅色染色)共同定位(colocalisation)(Magne等，2003)。吸出培養(yǎng)基，用400μl的在完全培養(yǎng)基中的5μM的CTG溶液代替。在37℃下培養(yǎng)細胞1小時。然后，用完全培養(yǎng)基代替CTG溶液，再次在37℃下培養(yǎng)細胞30分鐘。用PBS洗滌后，在室溫下和在黑暗中，用400μl的在完全培養(yǎng)基中的1μMEthD-1溶液(不含F(xiàn)CS)處理細胞1小時。最后移除培養(yǎng)基，吸出水凝膠，將其放置于載玻片和蓋玻片之間。通過落射熒光顯微鏡法(Axioplan，Zeiss，Iena，德國)得到圖像，使用DC30數(shù)碼照相機記錄(Kappa opto-electronics Gmbh，Gleichen，德國)。
如上詳細說明的，在培養(yǎng)24、48和72小時后，還用激光掃描的反向共聚焦顯微鏡方法(IFR 26，Caroline Vignes-Colombeix)顯示凝膠中的細胞。共聚焦顯微鏡通過消除不屬于焦平面的信號而產(chǎn)生清晰的圖象。這種顯微鏡具有能沿著Z軸移動的載物臺，以允許焦平面改變，因而可顯示樣品的各個面。使用熒光素異硫氰酸酯檢測劑(FITCλex＝488nm；收集的λem＝490至560nm)追蹤CTG的熒光。通過玫瑰精檢測劑(TRITCλex＝568nm，收集的λem＝570至700mn)顯示EthD-1熒光。
結(jié)果為了觀察在水凝膠中三維培養(yǎng)期間軟骨細胞的變化，本發(fā)明人對SW1353和C28/I2軟骨細胞和兔關(guān)節(jié)軟骨細胞進行染色(CTG和EthD-1)。然后，他們用熒光顯微鏡方法觀察。在水凝膠內(nèi)，SW1353和C28/I2軟骨細胞或兔關(guān)節(jié)軟骨細胞是圓形的，被細胞示蹤綠染成明顯的綠色。很少有細胞顯示出染成紅色。在水凝膠中，SW1353、C28/I2和兔關(guān)節(jié)軟骨細胞三維發(fā)展，形成結(jié)節(jié)，其數(shù)目和尺寸隨培養(yǎng)時間而增加。
為了提供對水凝膠中培養(yǎng)的細胞的三維觀察，本發(fā)明人通過共聚焦顯微鏡方法輔助他們的觀察。在這些研究中，僅僅報道了對C28/I2細胞的觀察。共聚焦顯微鏡方法顯示了與以前采用常規(guī)熒光顯微鏡方法得到的相同結(jié)果。這些細胞以結(jié)節(jié)的形狀發(fā)展。用放線菌素D處理48小時后的細胞顯示出明顯的紅色染色。很少有細胞保持綠色染色。這些結(jié)果表明，在我們的培養(yǎng)條件下，細胞示蹤綠/乙啡啶同型二聚體-1雙重染色使得可以區(qū)分活細胞和死細胞。當(dāng)前正在分析SW1353軟骨細胞、人類鼻軟骨細胞和兔關(guān)節(jié)軟骨細胞的觀察結(jié)果。
所有這些結(jié)果表明在水凝膠中三維培養(yǎng)時，SW1353的C28/I2軟骨細胞及兔關(guān)節(jié)軟骨細胞保持它們的生存力。
3.2.軟骨細胞表型的分析為了分析軟骨細胞表型，用RT-PCR研究編碼特定軟骨細胞標記的信使的表達。
(a)實驗條件材料Trizol試劑(Invitrogen公司)。
為了表征從人類鼻軟骨分離的細胞的顯型，在存在Trizol(處理0，P0)下冷凍新分離的細胞的一部分。以10,000細胞/cm2的比例將其它部分的細胞分布于25cm2瓶中。每周在上述的條件下次培養(yǎng)細胞(項目a))。在一、二或三次處理后，在存在Trizol下于-80℃冷凍細胞(處理1(P1)，2(P2)和3(P3))。
從兔關(guān)節(jié)軟骨中新分離的軟骨細胞以1百萬細胞/ml水凝膠的比例分布，將2ml這種混合物放置在六孔培養(yǎng)皿的孔中。然后在存在Trizol下冷凍之前培養(yǎng)細胞3周。
(b)總RNA的提取材料-氯仿(VWR)-異丙醇(Sigma Aldrich)-乙醇(VWR)-瓊脂糖(Promega公司)-溴化乙錠(EtBr)(Promega公司)-三硼酸EDTA(TBE)(Invitrogen公司)從冰中解凍并刮取細胞然后收集Trizol溶液，在4℃下以12,000rpm離心10分鐘。移除上面的相；加入200μl氯仿，旋渦攪拌混合物15秒。室溫培養(yǎng)樣品10分鐘后，在4℃下以12,000RPM離心15分鐘。移除水相，在存在500μl異丙醇下離心分離(12,000rpm，15分鐘，4℃)沉淀總RNA。移除上清液，用75％的乙醇洗滌沉淀物，然后干燥?？俁NA被置于20μl水中。然后在260nm測定吸收率來評價RNA的分離的量。最后調(diào)節(jié)RNA的濃度至1μg/μl。為了檢查提取的RNA的完整性，在包含EtBr的TBE緩沖液中的1％瓊脂糖上電泳分離500ng的總RNA。在100V下遷移進行30分鐘。用UV透照儀顯示總RNA。
(c)通過RT-PCT的轉(zhuǎn)錄物的分析-DNA酶處理材料-脫氧核糖核酸酶I(DNA酶I)5U/μl(Invitrogen公司)-DNA酶I緩沖液10X(Invitrogen公司)-乙二胺四乙酸(EDTA)25mM(Invitrogen公司)。
移出2μg的RNA；加入1μl的DNA酶I 10X緩沖液和1μl的DNA酶I.(5U/μl)，用無菌水調(diào)節(jié)體積至10μl。然后，室溫下培養(yǎng)樣品15分鐘。加入1μl的25mM EDTA終止反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物在65℃下放置10分鐘。
-逆轉(zhuǎn)錄(RT)材料-脫氧核苷酸三磷酸酯(dNTP)10mM(Invitrogen公司)-0.5μg/μl六核苷酸引物(隨機六聚體，Promega公司六引物C1181)-禽成髓細胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)10U/μl(Promega公司)-AMV-RT緩沖液5X(Promega公司)-RNA酶抑制劑(RNAsin)400U/μl(Promega公司)。
預(yù)先用DNA酶處理的每個樣品中加入3μl的10mM dNTP、3μl的六核苷酸引物、6μl的AMV-RT緩沖液、1μl的AMV-RT和1μl的RNAsin；用無菌水調(diào)節(jié)體積至30μl。用熱周期計(EppendorfMastercycler，VWR)在下述條件下進行逆轉(zhuǎn)錄在25℃下10分鐘，在42℃下50分鐘，在95℃下10分鐘。然后，在-20℃下保存如此得到的單鏈互補DNA溶液(cDNA)，直到其被用于PCR反應(yīng)。
-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)
材料-特定的低聚物引物(MWG Biotech，Courtaboeuf，法國)-Taq聚合酶緩沖液10X(Invitrogen公司)-Taq聚合酶5U/μl(Invitrogen公司)-MgCl250mM(Invitrogen公司)。
通過使用向其中加入了0.5μl正義引物和0.5μl反義引物的2μl的cDNA溶液、5μl的Taq聚合酶緩沖液、1.5μl的MgCl2、0.5μl的Taq聚合酶和40μl的水來進行PCR。在下述條件下用熱周期計(Eppendorf Mastercycler)進行PCR反應(yīng)在94℃變性3分鐘，然后在94℃(變性)進行20秒的30次循環(huán)，在60℃(雜交)20秒和在72℃伸長(élongation)20秒。通過在72℃伸長10分鐘來完成PCR反應(yīng)。該研究的結(jié)果表明得到的PCR產(chǎn)物處于指數(shù)式擴增階段。引物的序列、雜交溫度和擴增子的大小具體列在表2中(下文)。
表2參考基因的引物序列、雜交溫度和擴增子的大小

(d)在瓊脂糖凝膠上的分離在三硼酸EDTA緩沖液(TBE)1X中于2％瓊脂糖凝膠上進行PCR擴增產(chǎn)物的電泳分離。使用UV透照儀通過溴化乙錠顯示區(qū)帶。擴增子的大小顯示在表2中。
(d)瓊脂糖凝膠的半定量密度測量分析使用Leica Q500軟件(Leica Imagine Systems，Cambridge，UK)估計在2％瓊脂糖凝膠上得到的區(qū)帶的強度，所述軟件使得能夠在各種試驗條件下對擴增的轉(zhuǎn)錄物進行半定量的密度測量分析。結(jié)果表示為任意單位的相關(guān)基因/參考基因之比。
結(jié)果為了檢驗在水凝膠內(nèi)三維培養(yǎng)時兔關(guān)節(jié)軟骨細胞的表型的保持，他們通過RT-PCR來評估編碼II型膠原、聚集蛋白聚糖和膠原X的轉(zhuǎn)錄物的表達。同時也檢驗I型膠原的表達。
在單層培養(yǎng)期間，本發(fā)明人觀察到II型膠原、聚集蛋白聚糖和膠原X的表達減少。三周后，II型膠原仍只有少量表達，而再也檢測不到X型膠原和聚集蛋白聚糖。同時，我們的結(jié)果表明，在三周單層培養(yǎng)后，I型膠原的表達增加。
相反，當(dāng)在水凝膠中三維培養(yǎng)細胞3周時，II型膠原、聚集蛋白聚糖和X型膠原的表達得以保持。I型膠原的表達不再受到刺激。
這些結(jié)果表明兔關(guān)節(jié)軟骨細胞的三維培養(yǎng)使得軟骨細胞標記(膠原II、聚集蛋白聚糖和膠原X)的表達得以保持。
實施例4三維培養(yǎng)中軟骨細胞的再分化的研究為了研究在實施例1中制備的水凝膠中三維培養(yǎng)軟骨細胞的再分化，單層培養(yǎng)新分離的人和兔鼻和關(guān)節(jié)軟骨細胞4周，然后在水凝膠中三維培養(yǎng)并且同時單層培養(yǎng)4周。
在單層培養(yǎng)和三維培養(yǎng)2、3、4周后的每個處理中抽取總RNA。用RT-PCR檢測II型膠原和聚集蛋白聚糖、軟骨細胞表型的特殊標記和I型膠原、軟骨細胞分化的標記。
結(jié)果表明新分離的軟骨細胞表達II型膠原、I型膠原和聚集蛋白聚糖。在單層培養(yǎng)期間，這些標記的表達發(fā)生了改變；在各種處理期間，II型膠原和聚集蛋白聚糖的表達降低，直到其在三次處理結(jié)束時消失，而從第一次處理開始，I型膠原的表達明顯增加，并且在各種處理的過程中保持著明顯的表達。因此，在單層培養(yǎng)的三次處理結(jié)束時，軟骨細胞看起來是去分化的。然后，在水凝膠中三維培養(yǎng)軟骨細胞期間，結(jié)果表明II型膠原和聚集蛋白聚糖的表達增加，而且I型膠原的表達降低。這些結(jié)果說明在水凝膠中細胞具有恢復(fù)的軟骨細胞表型。
這些結(jié)果表明所用的水凝膠可使以前去分化的軟骨細胞再分化。統(tǒng)計試驗所有的試驗都進行三份。每個試驗進行兩次。用平均+/-標準偏差表示結(jié)果。使用Anova試驗進行平均水平的比較研究。對于p＜0.05，結(jié)果被認為是具有顯著差異。
實施例5鼻軟骨細胞的皮下植入按照前述實施例中的描述制備水凝膠，其整合了來自鼻軟骨(HNC)的人軟骨細胞。然后，將它們皮下植入裸鼠中，并保留3周。
在下述5個條件下進行試驗(1)植入前，在水凝膠中三維培養(yǎng)人類鼻軟骨細胞15天；(2)在通過水凝膠植入前，單層培養(yǎng)人類鼻軟骨細胞15天。
(3)新分離的人類鼻軟骨細胞，并通過水凝膠植入。
(4)在通過水凝膠植入前，單層培養(yǎng)人包皮成纖維細胞。
(5)僅僅水凝膠。
在回收植入劑期間，本發(fā)明人注意到植入后3周植入劑仍清楚可見。因此，在這三周中，水凝膠沒有被再吸收。組織學(xué)分析表明對于包含HNC的三種條件(條件1、2和3)來說，存在陽性軟骨細胞沉淀物，這是因為阿爾新藍在水凝膠中染色。因此，所有這些結(jié)果向我們表明Si-HPMC水凝膠使得能夠在活體內(nèi)3周后新生軟骨類型的組織。
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1.隨著pH而自交聯(lián)的硅烷化羥乙基纖維素(HEC)或硅烷化羥丙基甲基纖維素(HPMC)水凝膠用于三維體外培養(yǎng)軟骨細胞的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中水凝膠可通過HEC或HPMC與式(1)化合物的反應(yīng)而獲得XSi(OZ)3(1)其中X表示鹵原子或具有環(huán)氧官能團的烴基，尤其是C2-20烴基，Z選自氫原子、堿金屬和烷基，尤其是C1-5烷基。
3.權(quán)利要求1或2所述的用途，其中HEC或HPMC攜帶占HEC或HPMC總干重的0.5％至5％的硅烷醇鹽側(cè)基或者硅烷醇堿金屬鹽或者銨鹽的前體。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的用途，其中水凝膠由下述簡化式的聚合物形成
5.一種用于制備在水凝膠中整合的細胞的復(fù)合物的體外方法，該復(fù)合物用于注入軟骨位點中，其中所述方法包括在具有適合水凝膠交聯(lián)的pH的生物緩沖液中，在適合軟骨細胞在水凝膠中整合和三維培養(yǎng)的條件和時間周期下，將軟骨細胞與隨著pH而自交聯(lián)的硅烷化羥乙基纖維素(HEC)或硅烷化羥丙基甲基纖維素(HPMC)水凝膠進行體外混合。
6.一種用于制備在水凝膠中整合的細胞的復(fù)合物的體外方法，該復(fù)合物用于注入軟骨位點中，其中所述方法包括在具有適合水凝膠交聯(lián)的pH的生物緩沖液中，在適合由所述未分化細胞的分化得到的軟骨細胞在水凝膠中整合和三維培養(yǎng)的條件和時間周期下，將能夠進行軟骨形成性分化的未分化細胞與隨著pH而自交聯(lián)的硅烷化羥乙基纖維素(HEC)或硅烷化羥丙基甲基纖維素(HPMC)水凝膠進行體外混合。
7.權(quán)利要求5的方法，包括下述的體外步驟-在固體載體上的軟骨細胞的單層擴增；-通過其單層擴增而去分化的擴增的軟骨細胞的收集；-在具有適合水凝膠交聯(lián)的pH的生物緩沖液中將去分化的擴增的軟骨細胞與水凝膠混合，導(dǎo)致軟骨細胞在水凝膠內(nèi)整合并導(dǎo)致其再分化。
8.權(quán)利要求5至7中任一項的方法，其中水凝膠可通過HEC或HPMC與式(1)化合物的反應(yīng)而獲得XSi(OZ)3(1)其中X表示鹵原子或具有環(huán)氧官能團的烴基，尤其是C2-20烴基，Z選自氫原子、堿金屬和烷基，尤其是C1-5烷基。
9.權(quán)利要求5至8中任一項的方法，其中HEC或HPMC攜帶占HEC或HPMC總干重的0.5％至5％的硅烷醇鹽側(cè)基或者硅烷醇堿金屬鹽或者銨鹽的前體。
10.權(quán)利要求5至9中任一項的方法，其中水凝膠由下述簡化式的聚合物形成
全文摘要
本發(fā)明涉及隨著pH而自交聯(lián)的硅烷化羥乙基纖維素(HEC)或硅烷化羥丙基甲基纖維素(HPMC)水凝膠用于三維體外培養(yǎng)軟骨細胞的用途。
文檔編號A61L27/50GK1897989SQ200480038360
公開日2007年1月17日 申請日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月4日
發(fā)明者P·韋斯, J·古伊克斯, G·德古爾西, G·格里曼迪, C·維納蒂埃爾 申請人:國家健康醫(yī)學(xué)研究所, 南特大學(xué)