專利名稱：包括含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物的內(nèi)窺鏡手術(shù)用粘膜膨脹液組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包括含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物的組合物。具體而言，涉及一種適合在EMR中局部注射到粘膜下，使包含病變部的粘膜膨脹的組合物。
背景技術(shù)：
由于近來內(nèi)窺鏡技術(shù)的發(fā)展，病變部的內(nèi)窺鏡切除術(shù)已經(jīng)適用于包括食道、胃和腸在內(nèi)的消化道的息肉或早期癌(被認(rèn)為沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表層癌)。雖然內(nèi)窺鏡粘膜切除術(shù)作為一種侵入性程度較低的手術(shù)方法，主要用于外科開腹手術(shù)困難的高齡者或具有嚴(yán)重并發(fā)癥的患者等，但從QOL層面考慮，其已成為應(yīng)用于普通患者的第一選擇。
EMR一般包括下述手術(shù)標(biāo)記病變部及其周圍區(qū)域、通過向包括標(biāo)記的病變部的粘膜下層注射高滲食鹽水溶液使病變部隆起，把持住要切除的部分并將其勒住，利用高頻電流切開包括病變部的組織，并回收切開的組織進行組織檢查(非專利文獻1)。
為了在EMR中安全進行粘膜切開，必需使病變部與固有肌層分離。為此，將高滲食鹽水溶液等液體(以下，在本文中稱作“粘膜膨脹液(或局部注射液)”)局部注射到粘膜下層。如果包括病變部的粘膜隆起不充分，則難以在目標(biāo)部位通過勒除進行切開，不能可靠地切除升高病變部，或存在于粘膜下的固有肌層也被切開而發(fā)生穿孔。因此，需要所需粘膜隆起水平可維持到切割完成的粘膜膨脹液。
此外，除穿孔外，在EMR中容易發(fā)生的其他并發(fā)癥是出血。因此，通常向高滲食鹽水溶液等中加入具有血管收縮作用的腎上腺素，以抑制出血量(非專利文獻2)。但是，即使通過加入腎上腺素抑制了出血量，麻煩的止血操作卻不可避免。此外，當(dāng)使用食鹽水溶液等低粘度液體作為粘膜膨脹液體時，有粘膜膨脹液體會通過局部注射針的進入部或切開的第一刀產(chǎn)生的間隙等漏出，而不能維持注射時的隆起水平的問題。
近來，為了解決上述問題，嘗試將葡萄糖或透明質(zhì)酸鈉等加入粘膜膨脹液體中來維持隆起。據(jù)報道，在用豬食道進行的動物實驗中，當(dāng)使用透明質(zhì)酸鈉時，膨脹持續(xù)時間延長至平均23分鐘左右(非專利文獻3)。然而，在實踐中，完成EMR所需的時間在1小時或以上，且有時需要數(shù)小時，因此，需要可進一步延長膨脹持續(xù)時間的粘膜膨脹液。而且，在正取代勒除法而成為主流的應(yīng)用、IT刀等的切開剝離法(ESD)中，在切開第一刀時的膨脹液體的流出是不可避免的。此外，即使可通過加入透明質(zhì)酸來延長膨脹持續(xù)時間至某種程度，但為了防止出血也需要另外添加腎上腺素等止血劑。
非專利文獻1林琢也等，“臨床與研究”，第72卷，笫5號，第52-55頁，1995年。
非專利文獻2《Endoscopic Surgery切開·剝離EMR》，小山恒男著，日本Medical Center發(fā)行，第30-31頁，2003年。
非專利文獻3Massimo Conio等，Gastrointestinal Endoscopy，Vol.56，p513-516(2002)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種粘膜膨脹液體(局部注射液)，與現(xiàn)有的膨脹液相比，其可在更長時間保持粘膜隆起，并可防止穿孔，提高了EMR的可靠性。本發(fā)明還提供一種可有效防止手術(shù)中或手術(shù)后的出血的粘膜膨脹液體。
為了解決上述問題，本發(fā)明人進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用包括含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物的組合物作為內(nèi)窺鏡手術(shù)的粘膜膨脹液體，可極長時間地維持粘膜隆起，同時得到了防止和抑制出血的效果。
即，本發(fā)明提供一種用于內(nèi)窺鏡手術(shù)的粘膜膨脹液體(局部注射液)組合物，其特征在于，包括含有糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的粘膜膨脹液組合物，由于含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物的粘性，可長時間(24小時或更長)保持粘膜隆起。而且，由于殘留的脫乙酰殼多糖衍生物包圍出血灶，還可明顯減少出血量。結(jié)果，本發(fā)明可同時解決EMR治療中的兩個主要問題穿孔和出血。
鑒于上述優(yōu)點，可將本發(fā)明的組合物在例如大腸息肉(內(nèi)窺鏡的大腸息肉切除術(shù))、腹腔鏡下的胃切除術(shù)、食道動脈瘤的處理等將內(nèi)窺鏡或腹腔鏡組合進行的遠程手術(shù)中，可應(yīng)用于除胃粘膜以外的消化道。因此，在本說明書中，術(shù)語內(nèi)窺鏡手術(shù)不限于包括EMR和ESD的胃粘膜切除術(shù)、還包括與內(nèi)窺鏡或腹腔鏡結(jié)合進行的所有遠程手術(shù)。


圖1是表示局部注射粘膜膨脹液體的粘膜周圍組織橫截面的簡圖。
圖2是表示將含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物水溶液(a)和食鹽水溶液(b)局部注射于粘膜下組織30分鐘后，粘膜周圍組織橫截面的顯微照片。
圖3是表示將含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物(a)和食鹽水溶液(b)局部注射到粘膜下層中，接著切割粘膜后，出血(失血)累積量的時間依賴性變化曲線圖。
圖4是表示局部注射(a)食鹽水溶液和(b)透明質(zhì)酸食鹽水溶液(b)30分鐘后，和局部注射含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物水溶液(c)并光照射24小時后粘膜周圍組織橫截面的顯微照片。
圖5是表示局部注射(a)食鹽水溶液、(b)透明質(zhì)酸水溶液、(c)含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物水溶液(無光交聯(lián))和(d)含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物水溶液(有光交聯(lián))后，接著切割粘膜后的出血量變化曲線圖。符號注釋1粘膜，2病變部，3粘膜膨脹液；4固有肌層具體實施方式
混合到本發(fā)明粘膜膨脹液中的含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物優(yōu)選通過向脫乙酰殼多糖骨架中導(dǎo)入乳糖等糖鏈而使其在中性pH下的水溶性提高的脫乙酰殼多糖衍生物。例如，作為本發(fā)明中優(yōu)選使用的含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物，例如國際專利公開WO00/27889小冊子中記載的那些。具體而言，這些衍生物具有在通常被稱作殼多糖/脫乙酰殼多糖的高分子骨架中導(dǎo)入了糖鏈和任選的光反應(yīng)性基團而成的結(jié)構(gòu)。其中，優(yōu)選至少一部分構(gòu)成脫乙?；臍ざ嗵?脫乙酰殼多糖的葡糖胺單元的至少一部分2-位氨基導(dǎo)入具有還原性末端的糖鏈、并優(yōu)選至少另外一部分2-位氨基導(dǎo)入光反應(yīng)性基團所形成的脫乙酰殼多糖衍生物。
通常，殼多糖/脫乙酰殼多糖是通過堿處理來源于蟹殼的殼多糖(聚-N-乙?；咸前?而獲得的脫乙?；乃峥扇苄圆糠?，且通常具有下式(1)和(2)表示的構(gòu)成單元[化1] 在殼多糖/脫乙酰殼多糖中，一些人將脫乙?；潭鹊?通常低于40％)的那些稱作“殼多糖”，將脫乙?；潭雀?通常40％或更高)的那些稱作“脫乙酰殼多糖”，但在本說明書中，將至少一部分脫乙酰化的殼多糖/脫乙酰殼多糖總稱為“脫乙酰殼多糖”。此外，在本發(fā)明中，脫乙酰殼多糖不限于天然來源的，還可以具有化學(xué)或基因工程合成的相似結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾的糖鏈。
這里，“脫乙?；潭取笔侵笜?gòu)成脫乙酰殼多糖(或聚-N-乙?；咸前?的糖單元2-位的乙酰氨基通過脫乙?；D(zhuǎn)化成游離氨基的基團的比例。在本說明書中，脫乙?；潭仁抢谩督】凳称芬?guī)格標(biāo)準(zhǔn)集(4)》，財團法人日本健康·營養(yǎng)食品協(xié)會(1996年)第55頁中記載的“膠體滴定法”定量的。
本發(fā)明使用的含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物通過進一步化學(xué)修飾其脫乙酰殼多糖骨架而進行了功能化，且用作原料的脫乙酰殼多糖的脫乙?；潭戎辽贋?0％，特優(yōu)選在60-100％的范圍，進一步優(yōu)選在65-95％的范圍。脫乙?；潭葹?00％的脫乙酰殼多糖只包括上式(1)的構(gòu)成單元，而不包括式(2)的構(gòu)成單元。
此外，對脫乙酰殼多糖的分子量沒有特別限制，可以根據(jù)脫乙酰殼多糖衍生物的最終使用目的，在很寬的范圍變化，但通常數(shù)均分子量在5,000-2,000,000，優(yōu)選在10,000-1,800,000，更優(yōu)選在40,000-1,500,000的范圍的合適的。
導(dǎo)入脫乙酰殼多糖骨架中的具有還原性末端的糖鏈包括，來自醛糖和酮糖的糖鏈，其中，優(yōu)選使用構(gòu)成糖單元個數(shù)為20個或以下，特別優(yōu)選1-7個的那些。具體地，可列舉例如戊糖或己糖如葡萄糖、果糖、半乳糖、巖藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、赤蘚糖、庚酮糖和己酮糖等；氨基糖如葡糖胺、N-乙?；咸前泛桶肴樘前返?；糖衍生物如糖醛酸、脫氧糖等；由結(jié)合上述單糖而成的糖鏈構(gòu)成的二糖或三糖如麥芽糖、異麥芽糖、乳糖、蜜二糖和麥芽三糖等；和各種寡糖等，其中中性二糖如麥芽糖、乳糖和蜜二糖等是優(yōu)選的。
還可用聚醚、多元醇等有機化合物替代上述糖鏈而導(dǎo)入脫乙酰殼多糖，考慮到生物適合性等，優(yōu)選使用天然糖鏈。
將糖鏈導(dǎo)入到脫乙酰殼多糖上式(1)的葡糖胺單元的2-位氨基本身可使用已知方法進行。包括例如，將糖的還原性末端羧基化，然后通過酰胺鍵與葡糖胺單元的2位氨基鍵合的方法(參照例如日本特開平10-120705號公報)，或?qū)⑻堑倪€原性末端醛化或羰基化，然后通過利用Schiff堿的還原烷基化法將其與葡糖胺單元的2位氨基鍵合的方法(參照例如殼多糖/脫乙酰殼多糖研究會編《殼多糖/脫乙酰殼多糖的應(yīng)用》53-56頁，1990年2月20日，技法堂出版發(fā)行)等。
在本發(fā)明中，導(dǎo)入脫乙酰殼多糖骨架中的糖不僅限于一種，還可將2種或以上組合而導(dǎo)入。
構(gòu)成本發(fā)明含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物的糖側(cè)鏈的具體例子可列舉下列糖鏈，但不限于這些。
(i)由乳糖衍生的糖鏈[化2]
(ii)由麥芽糖衍生的糖鏈[化3] (iii)由蜜二糖衍生的糖鏈[化4] (iv)由纖維素二糖衍生的糖鏈[化5] (v)由昆布二糖衍生的糖鏈[化6]
(vi)由甘露二糖衍生的糖鏈[化7] (vii)由N-乙?；鶜ざ茄苌奶擎淸化8] 在上述(i)-(vii)的糖側(cè)鏈中，左側(cè)記載的為利用糖的羧基與脫乙酰殼多糖的2位氨基的縮合而導(dǎo)入的殘基，而右側(cè)記載的為通過Schiff堿鍵合的殘基。
這樣，通過將脫乙酰殼多糖的葡糖胺單元的2位氨基用糖鏈取代，緩和了脫乙酰殼多糖依賴于酸的溶解性，實現(xiàn)了在中性區(qū)的溶解。
可根據(jù)最終脫乙酰殼多糖衍生物所需的物性等，改變糖側(cè)鏈對脫乙酰殼多糖的葡糖胺單元的2位氨基的取代程度，但取代程度通常在0.1-80％的范圍，特別優(yōu)選在0.5-60％的范圍，更優(yōu)選在1-40％的范圍。在此，糖側(cè)鏈的“取代程度”是構(gòu)成脫乙酰殼多糖的糖單元2位氨基被糖側(cè)鏈取代的程度，以取代氨基相對于構(gòu)成脫乙酰殼多糖的糖單元2位的游離氨基與取代氨基之和的比例表示。在本說明書中，糖側(cè)鏈的取代程度是通過“苯酚-硫酸法”測定的，其中所述“苯酚-硫酸法”是檢測糖鏈在硫酸中與苯酚反應(yīng)所致的特征發(fā)色在490nm的吸光度(參照J(rèn).E.Hodge，B.T.Hofreiter，“Methods in Carbohydrate Chemistry”，ed.by R.L.Whistler，M.L.Wolfrom，vol.1，p.388，Academic Press，NewYork(1962))。
本發(fā)明使用的含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物優(yōu)選構(gòu)成脫乙酰殼多糖的上式(1)的葡糖胺單元的2-位氨基的至少一部分另外導(dǎo)入光反應(yīng)性基團，由此使其具有光照射引發(fā)自交聯(lián)性質(zhì)。即，將其注射到粘膜下層后，通過紫外線等光照射形成不溶性水凝膠，從而進一步提高形狀保持性(維持粘膜膨脹能力)。
用于化學(xué)修飾脫乙酰殼多糖骨架的光反應(yīng)性基團包括通過紫外線，特別是包括約200-380nm的近紫外區(qū)的紫外線照射，該光反應(yīng)性基團彼此和/或與脫乙酰殼多糖中存在的氨基或羥基等反應(yīng)，形成交聯(lián)鍵的基團。可列舉例如由二苯酮、肉桂酸、疊氮化物、二烯和雙-蒽這樣的環(huán)狀不飽和化合物等衍生的那些，其中優(yōu)選具有羰基疊氮基、磺?；B氮基和芳香疊氮基的那些。
導(dǎo)入本發(fā)明含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物中的光反應(yīng)性基團的具體例子可列舉例如，為紫外線時，下式(A)-(D)表示的那些。式(A)的基團是由對疊氮基苯甲酸衍生的，式(B)的基團是由對疊氮基苯甲醛衍生的，式(C)的基團是由對苯甲酰基苯甲酸衍生的，式(D)的基團是由肉桂酸衍生的，式(E)的基團是由1-甲基-4-[2-甲酰基苯基]乙烯基]吡啶衍生的。

光反應(yīng)性基團可以是通過用約400-500nm左右的可見光照射而反應(yīng)的取代基。這種可見光反應(yīng)性基團包括，例如如下式表示的且在Journal of Polymer SciencePolymer Chemistry Edition，Vol.20，1419-1432(1982)中記載的甲?；揭蚁┗衔锏取?br> (上式中，Ar表示吡啶、烷基吡啶鹽、喹啉、烷基喹啉鹽等雜環(huán))光反應(yīng)性基團的導(dǎo)入本身可通過已知方法進行，可通過例如在縮合劑存在下，使具有羧基的疊氮化物與該2-位氨基鍵合的方法(參照日本特開平H10-120705號公報)；或通過酰氯基、醛基、N-羥基琥珀酰亞胺酯基或環(huán)氧基使疊氮化物與該2位氨基反應(yīng)的方法(參照殼多糖/脫乙酰殼多糖研究會編《殼多糖/脫乙酰殼多糖的應(yīng)用第》45-65頁，1990年2月20日，技報堂出版發(fā)行)等方法進行?？赏ㄟ^使上述甲酰基苯乙烯基化合物的甲?；c脫乙酰殼多糖的氨基偶聯(lián)而順利地導(dǎo)入。
可根據(jù)最終脫乙酰殼多糖衍生物中所需的基于交聯(lián)反應(yīng)的膠凝化(不溶性)程度等而改變這些光-反應(yīng)性官能團的取代程度，但希望光反應(yīng)性基團的取代程度在0.1％-80％，特別優(yōu)選在0.5-50％，進一步優(yōu)選在1-30％的范圍內(nèi)。這里，光反應(yīng)性基團的“取代程度”是用光反應(yīng)性感應(yīng)基團取代構(gòu)成脫乙酰殼多糖的糖單元2位氨基的程度，以取代氨基相對于構(gòu)成脫乙酰殼多糖的糖單元2位游離氨基與取代氨基之和的比例。在本說明書中，光反應(yīng)性基團如疊氮基的取代程度可根據(jù)由4-疊氮基苯甲酸在270nm的特征吸收獲得的校正曲線確定。
對本發(fā)明脫乙酰殼多糖衍生物中糖側(cè)鏈和光反應(yīng)性基團總的取代程度沒有特別限制，可在一個較大范圍變化，但通常在0.2-80％的范圍內(nèi)，優(yōu)選在1.5-65％的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在3-50％的范圍內(nèi)。
此外，對于本發(fā)明使用的含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物，可進一步將兩親基團導(dǎo)入構(gòu)成脫乙酰殼多糖骨架的上述式(1)糖單元的2-位氨基、式(1)或(2)糖單元的3位或6位羥基的至少一部分，由此可使交聯(lián)后的水凝膠的含水性大大提高。這些兩親基團是具有含疏水基團的疏水部分及含親水基團的親水部分的基團，且常具有表面活性劑功能。在這些中，優(yōu)選使用疏水單元(X)與親水部分(Y)的分子量比X∶Y＝1∶5-5∶1的那些，更優(yōu)選使用沒有解離性離子基團的非離子性基團。特別優(yōu)選由疏水性烷基部分和親水性聚氧化亞烷基部分構(gòu)成的分子量至少為90或以上的、更優(yōu)選為500-10,000的聚氧化亞烷基烷基醚。也可使用沒有疏水部分的聚醚，考慮到提高含水性，優(yōu)選同時具有疏水部分和親水部分的聚氧化亞烷基烷基醚。
將所述兩親基團導(dǎo)入脫乙酰殼多糖中可通過下列方法進行例如，將具有能夠與氨基反應(yīng)形成共價鍵的基團，如醛基或環(huán)氧基等的化合物導(dǎo)入兩親基團的親水部分或疏水部分的任意一方的末端，然后與脫乙酰殼多糖的葡糖胺2位氨基反應(yīng)的方法、在縮合劑存在下，具有羧基的聚氧化亞烷基烷基醚衍生物和脫乙酰殼多糖反應(yīng)的方法、或具有酰氯基的聚氧化亞烷基烷基醚衍生物與脫乙酰殼多糖的羥基或氨基反應(yīng)的方法。
例如，當(dāng)把末端具有環(huán)氧基的聚氧化亞烷基烷基醚基或末端具有醛基的聚氧化亞烷基烷基醚基導(dǎo)入脫乙酰殼多糖的氨基時，鍵合于脫乙酰殼多糖的側(cè)鏈由下式(a)或(b)表示。此外，當(dāng)將末端具有酰氯基的聚氧化亞烷基烷基醚基與脫乙酰殼多糖的3位或6位羥基鍵合時，鍵合于脫乙酰殼多糖骨架的側(cè)鏈由下式(c)表示。其中，在下式(a)-(c)中，n和m為1或以上的重復(fù)單元數(shù)。

CH3-(CH2)n-O-(CH2CH2O)m-CH2-CONH- (b)CH3-(CH2)n-O-(CH2CH2O)m-CH2-CO-CH2- (c)對在本發(fā)明脫乙酰殼多糖衍生物中導(dǎo)入兩親基團的程度沒有特別限制，但根據(jù)導(dǎo)入后脫乙酰殼多糖衍生物的重量變化，通常在5-70％，優(yōu)選在15-55％的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的粘膜膨脹液組合物可通過將上述含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物溶解于生理上可接受的介質(zhì)，如水或水-醇混合溶劑等中而制備為液體制劑。
通常，粘膜膨脹液體用23G左右的不銹鋼針局部注射于粘膜下層。因此，必須可容易通過針注射。此外，粘膜膨脹液體優(yōu)選具有足以抵抗因血流等導(dǎo)致的流散的粘度。此外，優(yōu)選通過EMR或ESD切除粘膜后，保留于粘膜下層。鑒于這些條件，本發(fā)明的組合物含有0.5-8.0重量％，優(yōu)選1.0-5.0重量％，更優(yōu)選2.0-3.0重量％，最優(yōu)選約2.5重量％含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物(分子量為1,000,000左右)。使用例如市售的旋轉(zhuǎn)粘度計(例如B型粘度計，TOKIMEC INC.(Tokyo，Japan))測定可知，以這樣的比例制備的膨脹液體具有約300cps(mPa·s)或更小，進一步約200cps或更小，或約100cps或更小的低粘度。
通過引入糖鏈，本發(fā)明優(yōu)選使用的含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物在中性區(qū)的水溶性好，可通過生理緩沖液等進行制劑，且可在不使藥物，例如蛋白質(zhì)等因酸或堿變性失活的情況下添加。
例如，本發(fā)明的組合物本身具有足夠的止血作用，但也可配合腎上腺素等具有止血作用的其他藥物使止血能力進一步提高，也可添加抗癌劑而使其具有促進治愈(或防止復(fù)發(fā))作用。
此外，當(dāng)使用導(dǎo)入光反應(yīng)性基團的含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物時，將制造的膨脹液注射粘膜下層后，通過光照射，其立即形成不溶性凝膠，粘膜膨脹可維持出乎意料的、很長一段時間。此外，通過光交聯(lián)形成的水凝膠可用作使配合的藥物等緩釋的基質(zhì)。
光交聯(lián)的條件可根據(jù)下述條件而變化，即導(dǎo)入所用光交聯(lián)性脫乙酰殼多糖衍生物中的光反應(yīng)性基團的種類和取代程度、溶解于組合物中的脫乙酰殼多糖衍生物的量、注射的組合物的量以及所需硬度等。通常，當(dāng)使用30μl左右含約2.5mg/ml左右可光交聯(lián)性的脫乙酰殼多糖衍生物的組合物時，用距離約2cm左右的光源的光照射約0.01-100秒，優(yōu)選約0.02-60秒，更優(yōu)選約0.1-30秒，最優(yōu)選數(shù)秒左右，由此形成具有足夠硬度的凝膠。對交聯(lián)反應(yīng)程度沒有特別限制，通常，有交聯(lián)反應(yīng)程度越高，所形成的水凝膠越硬的傾向。
光照射可以在注射本發(fā)明的膨脹液體組合物之后，切割病變部之前進行，也可在切開病變部之后，對暴露的組合物進行照射，使其凝膠化。在前者的情況下，可通過與注射膨脹液的針一體化的或單獨的光纖照射光而使組合物膠凝化。在后者的情況下，通過導(dǎo)入內(nèi)窺鏡的管道的光纖照射暴露的組合物。
由于物理化學(xué)引發(fā)，使局部注射的膨脹液體具有不溶化(固體化)的性質(zhì)(例如光交聯(lián)性)，通過注射后使其不溶化(固體化)從而提高在組織內(nèi)的置留性的概念目前還未提出，是由本發(fā)明首次完成的。
我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物在不用光照射的狀態(tài)也具有抑制出血的效果。認(rèn)為這是源自組合物的粘性和脫乙酰殼多糖的特性。另外，通過光照射形成的水凝膠顯示更好的止血效果。例如，在因肝素而使得正常止血變得困難的情況下，出血在10分鐘以內(nèi)停止。這意味著本發(fā)明的組合物，在不使用腎上腺素等止血劑時，在EMR中的抑制和防止出血的效果也很好。
此外，當(dāng)引入了兩親基團如聚氧化亞烷基烷基醚等時，光交聯(lián)的水凝膠的吸水性明顯提高(自身重量的100倍左右)，因此，其可吸收由傷口流出的血液，從而加速止血及愈合。
本發(fā)明的膨脹液組合物優(yōu)選以高壓釜滅菌的溶液形態(tài)提供。高壓釜滅菌也稱作高壓蒸汽滅菌，是一種使用具有規(guī)定溫度和壓力的飽和水蒸汽加熱的滅菌方法。例如，在《日本藥局方》中，列舉了115℃下30分鐘、121℃下20分鐘和126℃下15分鐘的滅菌條件。
本發(fā)明的組合物在以填充在容器中的溶液的狀態(tài)進行高壓釜滅菌時，它的性能不會變差，但粘度降低，由此提高了作為內(nèi)窺鏡手術(shù)用膨脹液的使用性。例如，即使在含有具有光反應(yīng)性基團的脫乙酰殼多糖衍生物時，也未發(fā)現(xiàn)光反應(yīng)性基團由于高壓釜滅菌而變性，且通過光照射而良好地凝膠化。因此，本發(fā)明的粘膜膨脹液體可以以現(xiàn)成的滅菌溶液的狀態(tài)提供。
下面，通過具體例更詳細說明本發(fā)明。但這些具體例不限定本發(fā)明的范圍。
實施例(實施例1)光交聯(lián)性含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物的制備按照WO00/27889所述方法合成光交聯(lián)性含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物(稱作“Az-CH-LA”)。具體而言，使用具有300-600kDa分子量、80％脫乙?；潭鹊拿撘阴ざ嗵?燒津水產(chǎn)化學(xué)工業(yè)(株)制)作為原料。通過與氨基的縮合作用將疊氮化物(對疊氮基苯甲酸)和乳糖(乳糖酸)導(dǎo)入上述脫乙酰殼多糖分子。所得脫乙酰殼多糖衍生物氨基的2.5％和2％分別被對疊氮基苯甲酸和乳糖酸取代。由于導(dǎo)入乳糖，所得衍生物在中性pH下是水溶性的。
制備Az-CH-LA的水溶液(20-30mg/ml)。用距離2cm的燈照射UV約10秒(UV-照射系統(tǒng)Spot Cure ML-251C/A，with a guide fiber unit(SF-101BQ)和250W燈(240-380nm)；Ushlo Electrics Co.Ltd.)，通過光交聯(lián)反應(yīng)，形成不溶性的水凝膠。
(實施例2)粘膜下層厚度的測量實驗使用Sprague-Dawley大鼠(15-18周，均為雄性，平均體重325±15g；SLC Japan)。整夜禁食后，用戊巴比妥(25mg/kg)麻醉大鼠，并在開腹手術(shù)后通過胃前壁造口術(shù)使腺胃粘膜暴露出來。通過25G不銹鋼針將2.5％的Az-CH-LA水溶液(0.3ml)或食鹽水溶液(0.3ml)注射到后壁粘膜下層中。注射后，觀察粘膜表面30分鐘，且通過施與過量麻醉劑處死每組各5只大鼠。對于其它大鼠，處理30分鐘后，將10ml生理食鹽水注射至皮下以防止干燥，并縫合胃部和腹部。在6小時(各組n＝5)和24小時后(各組n＝5)處死這些大鼠。然后，取出組織并在10％福爾馬林中固定2天。之后，通過顯微鏡觀察固定樣品的橫截面來測量粘膜下層的厚度。并將樣品用石蠟包埋、切片，并用蘇木精-曙紅(HE)試劑染色。
注射Az-CH-LA和食鹽水溶液后，粘膜表面同程度地隆起。但30分鐘后，注射Az-CH-LA的組隆起區(qū)域顯示與剛注射后同樣的大超度起伏，但注射食鹽水溶液的組30分鐘內(nèi)起伏顯著收縮(圖2)。經(jīng)過規(guī)定時間后的粘膜下層厚度如表1所示。表1的結(jié)果以平均值±S.E.表示，并使用顯著性水平為P＜0.05的Mann-Whitney U-檢測分析數(shù)據(jù)。
表1

數(shù)值是平均值±S.E.(mm)(各組n＝5)在24小時內(nèi)的任意時間點，注射Az-CH-La的粘膜下層明顯比注射食鹽水溶液的那些厚。由注射食鹽水溶液組厚度在30分鐘后沒有變化、說明30分鐘內(nèi)所有食鹽水溶液都流出了。組織學(xué)試驗表明Az-CH-LA，被曙紅均勻染色的A2-CH-La保留在粘膜下組織中。
(實施例3)出血量的測量在用與實施例2同樣的方法注射2.5％Az-CH-LA水溶液或食鹽水溶液之前，靜脈注射肝素(300單元)。用外科手術(shù)刀切開粘膜膨脹區(qū)域頂點周圍的粘膜(直徑5-6mm)。在Az-CH-La組中，使用上述UV-照射系統(tǒng)立即向切開的傷口照射UV光30秒(各組n＝10)。使用手術(shù)棉簽吸收從各大鼠胃部流出的血液，并根據(jù)棉簽重量的增加評價出血體積(各組n＝10)。出血量每5分鐘測量4次，然后通過過量施與麻醉劑處死動物。切除胃部進行組織學(xué)試驗。將取出的組織用10％福爾馬林固定2天，用石蠟包埋，切片，并用蘇木精-曙紅(HE)試劑染色。
在注射Az-CH-LA的組中，從切開的粘膜邊緣或粘膜邊緣與Az-CH-LA之間的空隙觀察到出血(照射前)。但是UV照射5-10分鐘后，出血完全停止，形成的凝膠起到堵塞開口部的漿糊的作用。在注射食鹽水溶液的組中，切開后經(jīng)過20分鐘仍在出血。
注射Az-CH-LA組的粘膜切開后前5分鐘的血液損失為63.1±14.2mg，與此相對，注射食鹽水溶液組為922.9±143.6mg(P＜0.01)(圖3)。注射Az-CH-LA組的累積體積在10分鐘時為93.2±10.5mg，15分鐘時為106.4±15.2mg，20分鐘時為113.0±15.5mg。注射食鹽水溶液組的相應(yīng)值分別為1268.0±105.5mg、1537.2±125.4mg、1682.3±95.2mg。將這些值(血液損失)對時間作圖，如圖3所示。注射Az-CH-LA組的血液損失明顯少于注射食鹽水溶液的組。樣品組織學(xué)觀察表明在注射Az-CH-LA組中，出血灶被脫乙酰殼多糖水凝膠完全包圍。
(實施例4)使用配合透明質(zhì)酸鈉的膨脹液進行與實施例2和3相同的測量。將其結(jié)果與實施例2和3的結(jié)果一起示于圖4和5。如圖4所示，即使使用含透明質(zhì)酸的膨脹液的情況(b)，注射30分鐘后已經(jīng)觀察到粘膜隆起縮小，而在使用本發(fā)明膨脹液的情況(c)中，24小時后仍然保持明顯的隆起形狀。此外，使用本發(fā)明的膨脹液時獲得了極佳的出血抑制效果(圖5)。
(實施例5)高壓釜滅菌導(dǎo)致的組合物粘度變化制備市售的Az-CH-LA(通過GPC測定的分子量約為10,000)的水溶液(濃度0.5重量％和1.0重量％的2種)。將這些溶液填充到15ml錐形試管中(FALCON公司制)，在下列條件下，進行高壓釜滅菌。
(1)121℃×20分鐘。
(2)118℃×30分鐘。
將滅菌后的各水溶液與未處理的水溶液比較，發(fā)現(xiàn)在所有溶液中均沒有觀察到沉淀，觀察到輕微可見程度的著色(淡黃色)。
使用單圓筒型旋轉(zhuǎn)粘度計，測定未處理和滅菌后水溶液的粘度，結(jié)果在下列表2中給出。
表2

由上述結(jié)果可知，通過高壓釜滅菌，水溶液的粘度顯著降低，從而使其更適于局部注射。
此外，通過UV光譜測定和FT-IR測定算出來處理和滅菌后樣品的疊氮基的量。結(jié)果，在滅菌后未觀察到光反應(yīng)性基團(疊氮基)分解，且殘存有與未處理樣品相同含量的疊氮基。
此外，當(dāng)對各樣品進行光照射使其固化時，所有樣品均可良好地膠凝化。
產(chǎn)業(yè)實用性用于本發(fā)明粘膜膨脹液組合物中的含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物，以及通過光交聯(lián)得到的水凝膠在對人皮膚成纖維細胞、人上皮細胞和人平滑肌細胞的培養(yǎng)試驗中未顯示任何細胞毒性。此外，針對生物的毒性試驗，包括誘變性和細胞毒性的那些，已經(jīng)證實了脫乙酰殼多糖衍生物及其水凝膠的安全性。因此，本發(fā)明的組合物特別適合作為EMR或ECD等內(nèi)窺鏡手術(shù)如中使用的粘膜膨脹液體(局部注射液)。
此外，由于使用高壓釜滅菌，可以提供在手術(shù)現(xiàn)場直接使用的產(chǎn)品。
此外，除了內(nèi)窺鏡手術(shù)，在切除組織表層的癌腫瘤或止血等普通的外科處理中，當(dāng)然也可使用本發(fā)明的膨脹液。
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)窺鏡手術(shù)用粘膜膨脹液組合物，其包括含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，它包括0.5-8.0重量％含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物是通過將具有還原性末端的糖鏈導(dǎo)入至少一部分殼多糖/脫乙酰殼多糖的葡糖胺單元2-位氨基形成的高分子，所述殼多糖/脫乙酰殼多糖含下式(I)表示的葡糖胺單元[化1]
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物是通過將具有還原性末端的糖鏈導(dǎo)入殼多糖/脫乙酰殼多糖的葡糖胺單元的至少一部分2-位氨基，并將光反應(yīng)性基團導(dǎo)入至少另一部分2-位氨基而成的高分子[化2]
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的組合物，其特征在于，該糖鏈選自包括葡萄糖、果糖、半乳糖、巖藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、赤蘚糖、庚酮糖和己酮糖等戊糖或己糖在內(nèi)的糖類；包括葡糖胺、N-乙?；咸前泛桶肴樘前返陌被穷悾话ㄌ侨┧岷兔撗跆堑奶茄苌铮挥蛇@些單糖組合而成的糖鏈構(gòu)成的包括麥芽糖、異麥芽糖、乳糖、蜜二糖和麥芽三糖的二糖或三糖，和低聚糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，該光反應(yīng)性基團選自羰基疊氮基、磺酰基疊氮基、芳香疊氮基、和甲?；揭蚁┗?。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的組合物，其特征在于，該含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物還含有兩親基團。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項所述的組合物，其特征在于，其用高壓釜滅菌。
9.一種內(nèi)窺鏡系統(tǒng)，其特征在于，其具有將權(quán)利要求1-8中任意一項所述的組合物局部注射到靶部位的裝置。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的內(nèi)窺鏡系統(tǒng)，其還具有對局部注射的組合物進行光照射的裝置。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于內(nèi)窺鏡手術(shù)的粘膜膨脹液組合物，其特征在于它包括含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物。將本發(fā)明的組合物用作內(nèi)窺鏡手術(shù)用的粘膜膨脹液時，可確保粘膜長時間隆起并防止穿孔，從而提高了內(nèi)窺鏡手術(shù)的可靠性。進一步，本發(fā)明組合物具有防止/抑制手術(shù)部分出血的效果。通過將光反應(yīng)性基團引入上述含糖鏈的脫乙酰殼多糖衍生物，可通過光交聯(lián)容易地形成水凝膠，使保持隆起能力和止血能力進一步提高。
文檔編號A61K9/08GK1929849SQ20048003834
公開日2007年3月14日 申請日期2004年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月21日
發(fā)明者林琢也, 石原雅之, 由良洋文 申請人:株式會社奈特克, 燒津水產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會社